Nghiên cứu tổng hợp tạp chất a của terazosin dùng trong kiểm nghiệm

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
-----  ------

TRỊNH VĂN MẠNH
Mã sinh viên: 1201375

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP TẠP
CHẤT A CỦA TERAZOSIN DÙNG
TRONG KIỂM NGHIỆM
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI – 2017


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
-----  ------

TRỊNH VĂN MẠNH
Mã sinh viên: 1201375

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP TẠP
CHẤT A CỦA TERAZOSIN
DÙNG TRONG KIỂM NGHIỆM
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Người hướng dẫn:
ThS. Đỗ Thị Thanh Thủy
Nơi thực hiện:
Bộ môn Hóa Dƣợc

HÀ NỘI – 2017


LỜI CẢM ƠN
Sau một thời gian nghiên cứu, tìm hiểu và thực hiện đề tài với rất nhiều cố
gắng, thời điểm hoàn thành khóa luận là lúc tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn
chân thành với những người đã dạy dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời
gian qua.
Với lòng biết sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS. Đỗ Thị Thanh
Thủy giảng viên Bộ môn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, người thầy đã
trực tiếp hướng dẫn và tận tình chỉ bảo tôi trong thời gian thực hiện khóa luận này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy giáo, cô giáo và các anh chị kỹ thuật
viên của Bộ môn Hóa Dược, Bộ môn Hóa Lý - trường Đại học Dược Hà Nội đã
luôn giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Tôi xin được cảm ơn các anh chị, các bạn và các em trong nhóm nghiên cứu
kiểm nghiệm và tổng hợp tại bộ môn Hóa Dược đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong thời
gian thực hiện đề tài.
Cuối cùng tôi xin được gửi lời cám ơn sâu sắc đến gia đình, bố mẹ, các anh chị,
bạn bè đã quan tâm, khích lệ, động viên tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên
cứu.
Hà Nội, ngày 18 tháng 05 năm 2017
Sinh viên

Trịnh Văn Mạnh


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC HÌNH
DANH MỤC CÁC BẢNG
ĐẶT VẤN ĐỀ

1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN

2

1.1. Terazosin

2

1.1.1. Một số thông tin chung về terazosin

2

1.1.2. Chỉ định

2

1.1.3. Một số thành phẩm chứa terazosin trên thị trường

3

1.2. Tạp chất A của terazosin theo USP 37

3

1.2.1. Thông tin chung về tạp chất A của terazosin

3

1.2.2. Nguyên nhân phát sinh tạp A

4

1.2.3. Các phương pháp xác định giới hạn tạp chất A của terazosin

4

1.3. Một số phương pháp hóa lý sử dụng trong nghiên cứu đề tài

6

1.3.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)

6

1.3.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

8

1.3.3. Phương pháp sắc ký cột

11

1.3.4. Phương pháp đo phổ hồng ngoại (IR)

12

1.3.5. Phương pháp phân tích khối phổ (MS)

13

1.3.6. Phương pháp đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

13

1.3.7. Phương pháp phân tích nhiệt trọng lượng (TGA)

14

1.4. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam và trên thế giới

15

1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới

15

1.4.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

17

CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
18

2.1. Nguyên liệu

18

2.2. Thiết bị

18

2.3. Nội dung nghiên cứu

19

2.4. Phương pháp nghiên cứu

19


2.4.1. Tổng hợp tạp chất A của terazosin

19

2.4.2. Tinh chế sản phẩm thô

20

2.4.3. Khẳng định cấu trúc của sản phẩm

21

2.4.4. Xác định giới hạn tạp chất

21

2.4.5. Xác định hàm ẩm của sản phẩm

22

2.4.6. Xác định hàm lượng sản phẩm

22

2.4.7. Xác định giới hạn tạp chất A trong nguyên liệu terazosin bằng phương
pháp HPLC theo USP 37
22
CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Tổng hợp tạp chất A của terazosin

23
23

3.1.1. Khảo sát lựa chọn dung môi phản ứng

24

3.1.2. Khảo sát nhiệt độ phản ứng

24

3.1.3. Khảo sát tỷ lệ mol phản ứng

25

3.1.4. Khảo sát thời gian phản ứng

26

3.1.5. Quy trình tổng hợp tạp A của terazosin

27

3.1.6. Kiểm tra độ tinh khiết của IAT thô

28

3.1.7. Tinh chế tạp A của terazosin

29

3.2. Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng TLC và nhiệt độ nóng chảy

30

3.2.1. Xác định nhiệt độ nóng chảy

30

3.2.2. Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng TLC

31

3.3. Khẳng định cấu trúc sản phẩm

32

3.3.1. Định tính HCl kết hợp

32

3.3.2. Đo phổ IR của sản phẩm tạp A

32

3.3.3. Đo phổ khối của sản phẩm tạp A

33

3.3.4. Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân của sản phẩm tạp A

33

3.4. Xác định hàm ẩm sản phẩm

35

3.5. Xác định giới hạn tạp chất sản phẩm tạp A

35

3.5.1. Xác định giới hạn tạp chất trong sản phẩm IAT bằng TLC

35

3.5.2. Xác định giới hạn tạp chất của sản phẩm IAT bằng phương pháp HPLC
36
3.6. Xác định hàm lượng sản phẩm

39

3.6.1. Xác định hàm lượng bằng phương pháp chuẩn độ thể tích

39

3.6.2. Xác định hàm lượng sản phẩm bằng phương pháp HPLC

40


3.7. Sử dụng sản phẩm thu được làm chất đối chiếu để xác định giới hạn tạp chất
A trong nguyên liệu terazosin bằng phương pháp HPLC theo USP 37
41
CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN

45

4.1. Quy trình tổng hợp

45

4.2. Quy trình tinh chế

46

4.3. Khẳng định cấu trúc của IAT tinh chế được

46

4.4. Xác định giới hạn tạp chất trong sản phẩm

47

4.5. Xác định hàm lượng sản phẩm

47

4.6. Sử dụng IAT làm chất chuẩn trong phòng thí nghiệm để xác định tạp chất
trong terasosin
48
4.7. Tính mới và hiệu quả kinh tế
CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

48
49

5.1. Kết luận

49

5.2. Kiến nghị

49

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
Tiếng Anh
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
ACDQ
BuOH

:4-Amino-2-cloro-6,7dimethoxyquinazolin
: n-Butanol

CTCT
CTPT

: Công thức cấu tạo
: Công thức phân tử

DMF
DMSO

: N,N- Dimethylformamid
: Dimethyl sulfoxid

DCM
IAM
GC (Gas chromatography)

: Diclomethan
: Isoamyl ancol
: Sắc ký khí

HPLC (High performance liquid

: Sắc ký lỏng hiệu năng cao

chromatography)
HSQC (Heteronuclear multiple quantum
correlation)
IR (Infrared)
IAT

: Phổ tương tác dị hạt nhân
qua 1 liên kết
: Hồng ngoại
: Impurity A of terazosin

KTCL

: iểm tra chất lượng

MeCN
MeOH
MS (Mass spectrum)
NMR (Nuclear magnetic resonance)
PA (Pure analysis)
RSD (Relative standard deviation)
TB

TEZ
TLC
TLTK
TGA
USP (United State pharmacopoeia)

: Acetonitril
: Methanol
: Phổ khối lượng
: Cộng hưởng từ hạt nhân
: Tinh khiết phân tích
: Độ lệch chuẩn tương đối
: Trung bình
: Terazosin
: Sắc ký lớp mỏng
: Tài liệu tham khảo
: Phân tích nhiệt trọng lượng
: Dược điển Mỹ


DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của terazosin

2

Hình 1.2. Một số biệt dược của terazosin

3

Hình 1.3. Công thức cấu tạo tạp chất A của terazosin

4

Hình 1.4. Sơ đồ phát sinh tạp A của terazosin

4

Hình 1.5. Sơ đồ quy trình phản ứng theo phương pháp 1

15

Hình 1.6. Sơ đồ quy trình phản ứng theo phương pháp 2

16

Hình 1.7. Sơ đồ quy trình phản ứng theo phương pháp 3

16

Hình 2.1. Sơ đồ tổng hợp tạp A của terazosin

20

Hình 3.1. Nguyên tắc tổng hợp tạp A của terazosin

23

Hình 3.2. Sắc ký đồ khảo sát tỷ lệ mol phản ứng

26

Hình 3.3. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của IAT thô

29

Hình 3.4. Sắc ký đồ phân đoạn của quá trình tinh chế cột

30

Hình 3.5. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của IAT

31

Hình 3.6. Phổ HSQC của IAT

34

Hình 3.7. Giản đồ nhiệt TGA của IAT

35

Hình 3.8. Sắc ký đồ mẫu trắng

37

Hình 3.9. Sắc ký đồ mẫu thử IAT

37

Hình 3.10. Sắc ký đồ mẫu đối chiếu IAT

37

Hình 3.11. Sắc ký đồ mẫu trắng xác định giới hạn tạp chất A trong terazosin
Hình 3.12. Sắc ký đồ mẫu đối chiếu xác định giới hạn tạp chất A trong
terazosin
Hình 3.13. Sắc ký đồ mẫu nguyên liệu terazosin

42
43
43


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Một số thành phẩm chứa terazosin trên thị trường

3

Bảng 1.2. Các phương pháp xác định giới hạn tạp chất A của terazosin

5

Bảng 1.3. Danh sách một số công ty có thiết lập tạp chuẩn A

16

Bảng 3.1. Kết quả khảo sát dung môi phản ứng

24

Bảng 3.2. Kết quả khảo sát nhiệt độ phản ứng

25

Bảng 3.3. Hiệu suất phản ứng khi khảo sát các tỷ lệ mol phản ứng

25

Bảng 3.4. Hiệu suất phản ứng khi khảo sát thời gian tổng hợp

26

Bảng 3.5. Kết quả xác định hiệu suất tổng hợp sản phẩm thô

28

Bảng 3.6. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy của IAT thô

28

Bảng 3.7. Bảng kết quả hiệu suất tinh chế và toàn bộ quá trình tổng hợp

30

Bảng 3.8. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy IAT tinh khiết

31

Bảng 3.9. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của IAT

32

Bảng 3.10. Kết quả phân tích phổ 1H-NMR

33

Bảng 3.11. Kết quả phân tích phổ 13C-NMR

34

Bảng 3.12. Kết quả xác định hàm ẩm của IAT

35

Bảng 3.13. Kết quả đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc ký
Bảng 3.14. Một số các thông số của các pic tạp trên sắc ký đồ khi xác định
giới hạn tạp chất của IAT bằng HPLC

36

Bảng 3.15. Kết quả xác định giới hạn tạp chất trong IAT bằng HPLC

39

Bảng 3.16. Kết quả xác định hàm lượng sản phẩm bằng chuẩn độ thể tích

40

Bảng 3.17. Kết quả xác định hàm lượng IAT bằng phương HPLC

40

Bảng 3.18. Đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc ký

42

Bảng 3.19. Kết quả xác định giới hạn tạp chất A trong nguyên liệu terazosin

43

38


ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những năm gần đây, cùng với các bệnh khác, các bệnh tuổi già ở nam giới
như phì đại lành tính tiền liệt tuyến và tăng huyết áp là vấn đề mà các nhà khoa học
trong và ngoài nước đang quan tâm. Theo thống kê phì đại lành tính tiền liệt tuyến
ảnh hưởng đến 50-90% số nam giới độ tuổi từ 50-85 tuổi [12], [30], [33]. Terazosin
là một trong những thuốc thuộc nhóm chẹn thụ thể α1-adrenergic đóng vai trò quan
trọng trong chữa bệnh tuổi già ở nam giới với hai tác dụng dược lí cơ bản là điều trị
phì đại lành tính tiền liệt tuyến và tăng huyết áp [9], [14], [37]. Kiểm tra chất lượng
nguyên liệu và thành phẩm thuốc là yêu cầu bắt buộc để đảm bảo chất lượng thuốc.
Khi tiến hành kiểm tra chất lượng nguyên liệu terazosin hydroclorid cũng như các
thành phẩm chứa terazosin hydroclorid, các dược điển đều quy định phải xác định
giới hạn tạp chất A của terazosin [18], [22], [34], [35]. Trong quá trình xác định chỉ
tiêu này phải sử dụng các dung dịch tạp chuẩn A của terazosin hydroclorid. Nhưng
tạp chuẩn này hiện chưa có sẵn tại Việt Nam, mà phải đặt mua ở nước ngoài với giá
thành cao và thời gian đặt hàng khá lâu. Do đó, công tác kiểm tra chất lương nguyên

liệu và thành phẩm chứa terazosin hydroclorid tại Việt Nam gặp nhiều khó khăn.
Nhận thấy được những khó khăn đó chúng tôi tiến hành tổng hợp và tinh chế tạp A
của terazosin, để tiến tới thiết lập tạp chuẩn A của terazosin, góp phần chủ động
trong công tác kiểm tra chất lượng thuốc. Đề tài “Nghiên cứu tổng hợp tạp chất A
của terazosin dùng trong kiểm nghiệm” được thực hiện với 2 mục tiêu cơ bản: [16
1. Nghiên cứu được phương pháp tổng hợp và tinh chế tạp chất A của terazosin
quy mô phòng thí nghiệm.
2. Xác định giới hạn tạp chất, độ ẩm, bước đầu hàm lượng sản phẩm và ứng dụng
trong kiểm nghiệm nguyên liệu terazosin.

1


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Terazosin
1.1.1. Một số thông tin chung về terazosin
- CTPT: C19H25N5O4.
- Phân tử lượng: 387,43.
- CTCT: hình 1.1.

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của terazosin
- Tên khoa học: (RS)-6,7-dimethoxy-2-[4-(tetrahydrofuran-2ylcarbonyl)
piperazin-1-yl]quinazolin-4-amin.
- Dạng dược dụng của terazosin được sử dụng là terazosin hydrochlorid ngậm
hai phân tử nước (TEZ.HCl.2H2O).
- Tính chất: tinh thể màu trắng, không mùi, tan tốt trong methanol, nước, ít tan
trong ethanol 96% và cloroform, không tan trong aceton và n-hexan, có khả năng
hấp thụ UV và IR [5].
1.1.2. Chỉ định
- Sử dụng đường uống để điều trị tăng huyết áp vừa và nhẹ ở người lớn [19],

[20]. Terazosin được Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ phê duyệt để
sử dụng điều trị tăng huyết áp năm 1987 [33]. Có thể sử dụng terazosin cùng các
thuốc lợi tiểu hay các thuốc điều trị tăng huyết áp khác hoặc sử dụng độc lập nếu
các phác đồ khác không hiệu quả hoặc không phù hợp. Tác dụng hạ huyết áp hiệu
quả nhất trên huyết áp tâm trương [30].
- Sử dụng để giảm triệu chứng trong phì đại lành tính tiền liệt tuyến [14], [17],
[23], [24], [27], [31].

2


1.1.3. Một số thành phẩm chứa terazosin trên thị trường
Terazosin là một thuốc được sử dụng rộng rãi ở các nước Asean và trên thế giới.
Với tác dụng điều trị tốt, terazosin được biết đến với nhiều biệt dược khác nhau
nhưng chủ yếu là sử dụng đường uống dạng viên nén hoặc viên nang với hàm lượng
1, 2, 5 và 10 mg.
Bảng 1.1. Một số thành phẩm chứa terazosin trên thị trường

STT

Biệt dược

Hàm lượng (mg)

Công ty

1

Hytrin

1, 2, 5, 10

Abbott

2

Terazosin

2, 5

Accord Healthcare Limited

3

Vicard-T

2

Abbott

4

Teradip

1

Glenmark Pharmaceuticals

5

Apo-Terazosin

2,10

Apotex

6

Terazosin hydrochlorid

2

Geneva Pharmaceuticals

Hình 1.2. Một số biệt dược của terazosin
1.2. Tạp chất A của terazosin theo USP 37
1.2.1. Thông tin chung về tạp chất A của terazosin
- CTPT: C14H19N5O2. 2HCl.
- Phân tử lượng: 362,25.
- CTCT: hình 1.3.
3


Hình 1.3. Công thức cấu tạo tạp chất A của terazosin
- Tên khoa học: 6,7-dimethoxy-2-(piperazin-1-yl)quinazolin-4-amin
dihydrochlorid.
1.2.2. Nguyên nhân phát sinh tạp A
Do ảnh hưởng của điều kiện môi trường, terazosin bị phân hủy tạo tạp chất A của
nó [16], [28]:

Hình 1.4. Sơ đồ phát sinh tạp A của terazosin
1.2.3. Các phương pháp xác định giới hạn tạp chất A của terazosin
Xác định chỉ tiêu tạp chất liên quan của terazosin có thể sử dụng các phương
pháp sau (bảng 1.2):

4


Bảng 1.2. Các phương pháp xác định giới hạn tạp chất A của terazosin
Phương
pháp

Điều kiện sắc ký

Tài liệu
tham khảo

- Silica gel 60 F254.
TLC

- Pha động: cloroform:toluen:methanol (9:1:6).

[22], [38]

- Phát hiện bằng UV hoặc phun KI.
- Cột Zorbax Rx C8 (15 cm x 4,6 mm; 5 μm) hoặc cột
μ-Bondapak C18 (30 cm x 3,9 mm; 10 μm) hoặc cột
Bakerbond C18 (15 cm x 4,6 mm; 5 μm).
- Pha động: acetonitril:isopropanol:đệm citrat 0,05 M

[18], [38]

(175:50:1775).
- Tốc độ dòng: 2,0 ml/phút.
- Detector UV 254 nm.
- Cột C18 (25 cm x 4,6 mm; 5 µm).
- Pha động: nước:acetonitril:methanol:acid acetic
băng:diethylamin (25:35:40:1:0,017).
HPLC

[38], [42]

- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút.
- Detector UV 254 nm.
- Cột C18 (25 cm x 4,0 mm; 5 µm).
- Pha động: đệm natri laurysulfat:acetonitril (600:400).
[23], [38]

- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút.
- Detector UV 210 nm.
- C18 (25 cm x 4,6 mm; 5 µm).
- Pha động: đệm citrat pH 3,2:acetonitril (1685:315).

[38], [41]

- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút.
- Detector UV 254 nm.

5

1.3. Một số phƣơng pháp hóa lý sử dụng trong nghiên cứu đề tài
1.3.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)
1.3.1.1. Nguyên tắc của phương pháp sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng là một phương pháp sắc ký dùng chất hấp thụ làm pha tĩnh trải
thành lớp mỏng trên tấm kính, nhựa hay kim loại. Pha động là một hệ dung môi đơn
hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định trong từng chuyên luận.
Trong quá trinh di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được
di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau. Kết
quả thu được là một sắc ký đồ trên lớp mỏng [1], [3], [4].
1.3.1.2. Ứng dụng của phương pháp sắc ký lớp mỏng
Định tính: Thường dựa trên giá trị Rf của chất phân tích và chất chuẩn khui
chấm trên cùng một sắc ký đồ.
Thử tinh khiết: Xác định giới hạn tạp chất trong thành phẩm và nguyên liệu
thuốc.
Định lượng: Có hai cách
- Cách 1: Tách chiết chất phân tích trong vết sắc ký bằng dung môi thích hợp.
Sau khi làm sạch dịch chiết, định lượng các chất bằng một kĩ thuật thích hợp (phổ
hấp thụ, huỳnh quang…).
- Cách 2: Định lượng trực tiếp trên bản mỏng: đo diện tích hay cường độ màu
của vết sắc ký bằng Densitometer hoặc xử lí ảnh với camera kĩ thuật số [3], [4].
1.3.1.3. Đại lượng đặc trưng của phương pháp sắc ký lớp mỏng
Hệ số lưu trữ Rf: Đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích. Rf có
giá trị dao động giữa 0 và 1 (tối ưu 0,2-0,8) [3].

Trong đó:
dR là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm).
dM là khoảng cách từ điểm cuất phát đến mức dung môi pha động
(đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm).
6

1.3.1.4. Một số ví dụ về xác định giới hạn tạp chất không định danh trong nguyên
liệu và thành phẩm thuốc bằng phương pháp TLC
Một trong những ứng dụng của TLC hay được sử dụng trong các dược điển là
xác định giới hạn tạp chất trong thành phẩm và nguyên liệu làm thuốc.
Ví dụ 1. Xác định giới hạn tạp chất trong viên nén acid mefenamic [3].

- Bản mỏng: silica gel 60 F254.
- Dung môi khai triển: acid acetic băng:1,4-dioxan:toluen (1:25:90).
- Dung dịch (1): Dung dịch bột viên nồng độ 25 mg/ml trong hỗn hợp
dicloromethan:methanol (3:1).

- Dung dịch (2): Lấy 0,1 ml dung dịch thử (1) pha loãng thành 50 ml bằng hỗn
hợp dicloromethan: methanol (3:1).

- Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 20 l mỗi dung dịch trên. Sau
khi triển khai, đặt bản mỏng vào bình thủy tinh kín chứa hơi iod trong 5 phút và
quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm.

- Đánh giá kết quả: Bất kỳ vết phụ nào trong sắc ký đồ thu được của dung dịch
(1) không được đậm hơn vết chính trong sắc ký đồ của dung dịch (2) (0,2%).
Ví dụ 2. Xác định giới hạn tạp chất trong nguyên liệu nicotinamid [34].

- Bản mỏng: silica gel 60 F254.
- Dung môi khai triển: nước:ethanol:cloroform (5:45:48).
- Dung dịch thử: Dung dịch 0,4 g chế phẩm trong 5,0 ml hỗn hợp dung môi
nước: ethanol (50:50).

- Dung dịch đối chiếu: Pha loãng 0,5 ml dung dịch thử thành 200 ml bằng hỗn

hợp nước: ethanol (50:50).

- Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 l mỗi dung dịch trên. Sau
khi triển khai, quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm.

- Đánh giá kết quả: Bất kỳ vết phụ nào trong sắc ký đồ thu được của dung dịch
thử không được đậm hơn vết chính trong sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (0,25%).

7


1.3.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
1.3.2.1. Nguyên tắc của phương pháp HPLC
HPLC là một kĩ thuật tách các chất dựa trên sự phân bố khác nhau của chúng
giữa hai pha không trộn lẫn, trong đó pha động là một chất lỏng chảy qua pha tĩnh
chưa trong cột. Quá trình sắc ký được tiến hành chủ yếu dựa trên cơ chế hấp phụ,
phân bố, trao đổi ion hoặc phân loại theo kích cỡ. Tùy theo bản chất của chất phân
tích mà sử dụng detector thích hợp. Hiện nay có nhiều loại detector như: UV-VIS,
huỳnh quang, tán xạ bay hơi, độ dẫn, MS… nhưng sử dụng nhiều nhất vẫn là
detector UV-VIS [1], [3], [4].
1.3.2.2. Ứng dụng của phương pháp HPLC
Định tính: Có thể sử dụng 2 cách
- Cách 1: Dựa vào sự giống nhau của thời gian lưu của chất phân tích trên sắc
ký đồ dung dịch chuẩn và dung dịch thử.
- Cách 2: Trên các máy HPLC có detector với DAD (diod array detector) có
thể vẽ phổ UV-VIS của pic chuẩn và pic thử rồi chồng 2 phổ lên nhau và đánh giá
tương đồng thông qua hệ số Match.
Định lượng: Sắc ký lỏng hiệu năng cao có ứng dụng rất lớn trong định lượng
chất trong hỗn hợp và xác định giới hạn tạp chất. Các phương pháp định lượng bằng
sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng độ của một chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện

tích pic của nó trên sắc ký đồ. [31]
Xác định giới hạn tạp chất:
- Với các tạp chất định danh: Xác định giới hạn tạp chất của thuốc hay nguyên
liệu dựa trên tạp chuẩn.
- Với các tạp chất không định danh: Dựa trên nguyên tắc hàm lượng phần trăm
của một chất trong hỗn hợp nhiều thành phần được tính bằng tỷ lệ phần trăm diện
tích pic của nó so với tổng diện tích của tất cả các pic trên sắc ký đồ [3]...
1.3.2.3. Các đại lượng đặc trưng trong HPLC
- Thời gian lưu (tR)
- Hệ số dung lượng k’
8


- Hệ số chọ lọc α
- Hiệu lực cột
- Hệ số bất đối AF
- Độ phân giải
1.3.2.4. Các kỹ thuật định lượng bằng HPLC
Phương pháp chuẩn ngoại (external standard method): Đây là phương pháp
định lượng cơ bản trong đó cả hai mẫu chuẩn và mẫu thử đều được tiến hành sắc ký
trong cùng điều kiện. Sau đó đem so sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic thu được từ
mẫu thử với pic của mẫu chuẩn đã biết nồng độ.
Phương pháp chuẩn nội (internal standard method): Là phương pháp cho thêm
những lượng giống nhau của chất chuẩn thứ hai có thời gian lưu và đáp ứng gần
giống mẫu thử vào cả mẫu chuẩn và mẫu thử rồi tiến hành sắc ký. Chất chuẩn thứ
hai gọi là chất chuẩn nội.
Phương pháp chuẩn hóa diện tích pic (area normalisation): Hàm lượng phần
trăm của một chất trong hỗn hợp nhiều thành phần được tính bằng tỷ lệ phần trăm
diện tích pic của nó so với tổng diện tích của tất cả các pic thành phần trên sắc ký
đồ. Phương pháp này có thể áp dụng để định lượng, ngoài ra phương pháp còn sử

dụng để xác định tạp chất liên quan: tính phần trăm tạp dựa vào tạp chuẩn, hoặc đối
với phép thử tạp chất liên quan khi không biết tên tạp chất hoặc không có tạp chuẩn
thì có thể tính phần trăm tạp chất dựa vào phần trăm diện tích pic của tạp đó so với
tổng diện tích các pic (gồm các pic tạp và pic chính) [1], [3].
1.3.2.5. Một số ví dụ về xác định giới hạn tạp chất không định danh trong nguyên
liệu và thành phẩm thuốc bằng phương pháp HPLC
Trong một số chuyên luận của các dược điển quy định cách thử giới hạn tạp chất
không định danh trong thành phẩm thuốc và nguyên liệu bằng phương pháp HPLC
như sau:
Ví dụ 1: Xác định giới hạn tạp chất trong viên nén roxithromycin [3]
Các dung dịch sắc ký:

- Dung dịch thử: dung dịch bột viên nồng độ 2 mg/ml.
9


- Dung dịch đối chiếu: Pha loãng 1,0 ml dung dịch thử bằng pha động đến vừa
đủ 100 ml.
Điều kiện sắc ký:

- Pha động: acetonitril:đệm phosphat (315:710).
- Cột: thép không gỉ (25 cm x 4,6 mm, 5 μm).
- Phát hiện: Detector UV 205 nm.
- Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút.
Cách tiến hành và đánh giá kết quả:

- Tiến hành sắc ký trong khoảng thời gian gấp 4 lần thời gian lưu của pic
roxithromycin.

- Trên sắc ký đồ thu được của dung dịch thử, diện tích của bất kỳ pic phụ nào

cũng không được lớn hơn 2,5 lần diện tích của pic chính trên sắc ký đồ của dung
dịch đối chiếu.
Ví dụ 2: Xác định giới hạn tạp chất trong nguyên liệu niclosamid [18], [34].
Các dung dịch sắc ký:

- Dung dịch thử: dung dịch chế phẩm nồng độ 1 mg/ml trong methanol.
- Dung dịch đối chiếu: Pha loãng 2000 lần 1 ml dung dịch thử với acetonitril.
Điều kiện sắc ký:

- Pha động: acetonitril:đệm phosphat (50:50).
- Cột: Thép không gỉ (12,5 cm x 4 mm, 5 μm).
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút.
- Phát hiện: Detector UV 230 nm.
Đánh giá kết quả: Trong sắc ký đồ thu được của dung dịch thử, tổng các diện tích
của các pic, ngoài pic tương ứng niclosamid và pic dung môi, không lớn hơn bốn
lần diện tích pic chính trên sắc ký đồ thu được dung dịch đối chiếu (0,2%).
Ví dụ 3: Xác định giới hạn tạp chất trong nguyên liệu oxybuprocain hydroclorid [40]
Các dung dịch sắc ký:

- Dung dịch thử: Dung dịch chế phẩm 0,4 mg/ml trong pha động.
10


- Dung dịch đối chiếu: Pha loãng 400 lần 1,0 ml dung dịch thử với MeCN.
Điều kiện sắc ký:

- Pha động: MeCN:đệm pH 2,5 (25:75).
- Cột: thép không gỉ (15 cm x 3,9 mm, 5 μm).
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút.
- Phát hiện: Detector UV 309 nm.

Cách tiến hành và đánh giá kết quả:

- Tiến hành sắc ký khoảng thời gian gấp 4 lần thời gian lưu của pic
oxybuprocain hydroclorid.

- Trên sắc ký đồ thu được của dung dịch thử, diện tích của bất kỳ pic phụ nào
cũng không được lớn hơn 0,4 lần diện tích của pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch
đối chiếu (0,1%) và tổng diện tích các pic không lớn diện tích pic chính của dung
dịch đối chiếu (0,25%).
1.3.2.6. Một số ví dụ xác định hàm lượng sản phẩm bằng phương pháp HPLC sử
dụng cách tính theo chuẩn hóa diện tích.
Trong một số đề tài khoa học, luận văn khi không có sẵn chất chuẩn, các chất được
định lượng bằng HPLC theo phương pháp chuẩn hóa diện tích.
- Nghiên cứu chiết xuất và tinh chế conessin từ dược liệu làm chất chuẩn đối
chiếu trong kiểm nghiệm thuốc [7].
- Nghiên cứu chiết xuất và tinh chế kaempferol từ dược liệu làm chất chuẩn
đối chiếu trong kiểm nghiệm thuốc [7].
- Nghiên cứu chiết xuất và tinh chế nuciferin từ dược liệu làm chất chuẩn đối
chiếu trong kiểm nghiệm thuốc [7].
- Bước đầu nghiên cứu tổng hợp và thiết lập tạp chuẩn captopril disulfid.
1.3.3. Phương pháp sắc ký cột
1.3.3.1. Nguyên tắc của phương pháp sắc ký cột
Sắc ký cột là phương pháp mà chất nhồi (pha tĩnh: hấp phụ, trao đổi ion, phân
bố) được nhồi vào cột, dùng để phân chia các chất trong hỗn hợp và tinh chế các
chất. Các chất được tách ra dựa trên sự phân bố khác nhau của các chất giữa pha
11


động và pha tĩnh. Trong sắc ký cột cổ điển, người ta thường dùng các cột thủy tinh
đường kính 1-5 cm dài 30-100 cm để nhồi pha tĩnh. Chất nhồi cột có kích thước từ

15-300 µm.

ích thước hạt càng lớn, dung môi qua cột càng dễ dàng nhưng hiệu

năng tách kém. Với vật liệu nhồi cột là silica gel dùng cho sắc ký cột, người ta
thường phân ra làm 3 loại là loại mịn (15-40 µm), loại vừa (40-63 µm) và loại thô
(63-200 µm). Lượng mẫu nạp lên cột thay đổi tùy theo tính chất phức tạp của mẫu
và khả năng tách của hệ thống. Tỷ lệ mẫu / pha tĩnh thường là 1/30-1/100 hay hơn.
Trong 1 vài kỹ thuật, tỷ lệ này có thể tăng tới 1/10 [3].
1.3.3.1. Ứng dụng của phương pháp sắc ký cột
Ứng dụng chủ yếu của phương pháp sắc ký cột là phân chia các chất ra khỏi hỗn
hợp và tinh chế các hợp chất hữu cơ. Phương pháp sắc ký cột thường được sử dụng
trong tinh chế mẫu dược liệu.
1.3.4. Phương pháp đo phổ hồng ngoại (IR)
1.3.4.1. Nguyên tắc phương pháp đo phổ hồng ngoại
Phổ hồng ngoại là phương pháp đo sự hấp thụ bức xạ hồng ngoại (IR) khi nó đi
qua một lớp chất cần thử ở các số sóng khác nhau. Xác định sự có mặt của các
nhóm chức trong phân tử dựa vào phổ IR để định tính các chất. Trong kiểm nghiệm
thuốc hầu hết các dược điển chủ yếu sử dụng IR vào việc định tính, ít được dùng
trong định lượng [2], [3].
1.3.4.2. Ứng dụng phương pháp đo phổ hồng ngoại
Xác định tính đồng nhất : Bằng cách so sánh với phổ của chất thử và chất chuẩn
về vị trí và trị số của cường đại hấp thụ hoặc dùng phổ chuẩn trong atlas hoặc thư
viện phổ.
Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất :
- Bộ khung phân tử
- Các nhóm chức
- Vị trí nhóm thế trên nhân thơm
- Phân biệt các đồng phân
Theo dõi diễn biến của phản ứng hóa học.

12


Nghiên cứu tương tác: các tương tác nội phân tử hay giữa các phân tử.
1.3.5. Phương pháp phân tích khối phổ (MS)
1.3.5.1. Nguyên tắc phương pháp phân tích khối phổ (MS)
Phương pháp phân tích khối phổ sử dụng chùm điện tử có năng lượng trung bình
để bắn phá phân tử hữu cơ ở chân không cao. Trong quá trình đó chất hữu cơ bị ion
hóa và vỡ ra thành từng mảnh. Ngoài ion phân tử, phổ MS còn có các pic ion mảnh
khác, dựa vào đó người ta có thể xác định được cơ chế phân mảnh và xác định lại
cấu trúc hóa học các hợp chất. Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng
một số vạch có cường độ khác nhau tập trung thành một khối phổ đồ [1], [2].
1.3.5.2. Ứng dụng phương pháp phân tích khối phổ (MS)
Xác định đồng vị: Các nguyên tử đồng vị của một nguyên tố có cùng số điện tích
hạt nhân chỉ khác nhau số neutron nên khối lượng nguyên tử khác nhau. Có thể dùng
MS để xác định thành phần đồng vị của các nguyên tố trong mẫu.
Định tính: Phân tích khối phổ có thể cho rất chính xác khối lượng các phân tử
(M+1)+, (M+2)+. Bên cạnh đó xem xét thêm các pic đồng vị, tỷ số cường độ của
chúng cùng với khối lượng của vài mảnh ion có thể xác định được công thức của
chất phân tích. Trong ngành dược thường sử dụng GC-MS, LC-MS so sánh với thư
viện phổ hoặc phổ chất đối chiếu để định tính mẫu.
Xác định công thức cấu tạo: Dùng kĩ thuật ion hóa thích hợp phân tích chất
nghiên cứu thành nhiều mảnh ion để làm rõ cấu tạo ghép nối của chúng. Việc biện
giải phổ nên kết hợp với phổ NMR và IR.
Định lượng: Thường dùng kết nối LC-MS hoặc GC-MS để làm tăng tính chọn
lọc, giới hạn định lượng cho phương pháp phân tích. Điểm nổi bật của phân tích
khối phổ là tính chọn lọc và độ nhạy cao, vì vậy nên kĩ thuật này thường dùng để
phân tích hàm lượng vết trong mẫu phức tạp [1], [2].
1.3.6. Phương pháp đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
1.3.6.1. Nguyên tắc phương pháp đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Nguyên lý chung của phương pháp phổ NMR là sự cộng hưởng của các tần số
khác nhau của các hạt nhân từ (1H,

13

C) dưới tác dụng của từ trường. Các tần số
13


cộng hưởng khác nhau được biểu diễn bằng độ dịch chuyển hóa học. Ngoài ra đặc
trưng của phân tử còn được xác định dựa vào các tương tác spin giữa các hạt nhân
từ với nhau [1], [2].
1.3.6.2. Các đại lượng đặc trưng trong phương pháp đo phổ NMR
Độ dịch chuyển hóa học δ: Là khoảng cách giữa vị trí hấp thụ của hạt nhân
hydro trên phổ NMR của mẫu phân tích và của chất chuẩn.
Sự tương tác spin-spin: Tương tác từ của các nhóm proton khác nhau cho biết số
lượng H ở nguyên tử C bên cạnh và mối tương quan của các nguyên tử H với nhau.
Hằng số tương tác spin-spin (Ј): là khoảng cách giữa các vạch của tín hiệu bội
được biểu hiện bằng δH, đặc trưng cho tương tác spin-spin. Trị số Ј phụ thuộc vào:
- Tương quan không gian.
- Mật độ electron ở vùng lân cận của 2 proton tương tác [1], [2].
1.3.6.3. Ứng dụng phương pháp đo phổ NMR
Đây là phương pháp phổ hiện đại và được dùng nhiều trong xác định cấu trúc hóa
học của các hợp chất hữu cơ nói chung. Với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ
NMR một chiều và hai chiều có thể xác định chính xác cấu trúc của hợp chất kể cả
cấu trúc lập thể của phân tử [2].
Phổ 1H-NMR: Xác định sự có mặt của các nhóm có proton, bộ khung của hợp chất,
số lượng proton ở C bên cạnh, số lượng tương đối của proton cho tín hiệu cộng hưởng,
phân biệt các dạng đồng phân, tính đồng nhất và sự có mặt của tạp chất.
Phổ 13C-NMR: Cho tín hiệu của vạch phổ carbon, mỗi nguyên tử carbon sẽ cộng

hưởng ở một trường khác nhau và cho một tín hiệu phổ khác nhau.
Phổ HSQC: Tương tác trực tiếp C-H được xác định nhờ vào các pic giao nhau
trên phổ HSQC. Trên phổ này, một trục là phổ 1H-NMR còn trục kia là 13C-NMR.
1.3.7. Phương pháp phân tích nhiệt trọng lượng (TGA)
1.3.7.1. Nguyên tắc phương pháp phân tích nhiệt trọng lượng
Là phương pháp dựa trên cơ sở xác định khối lượng của mẫu vật chất bị mất đi
(hoặc nhận vào) trong quá trình chuyển pha như là một hàm của nhiệt độ. Khi vật chất
bị nung nóng khối lượng của chúng sẽ bị mất đi từ các quá trình đơn giản như bay hơi
14


hoặc từ các phản ứng hóa học giải phóng khí. Một số vật liệu có thể nhận được khối
lượng do chúng phản ứng với không khí trong môi trường kiểm tra [8], [21].
1.3.7.2. Ứng dụng phương pháp phân tích nhiệt trọng lượng
Phép đo TGA nhằm xác định [12]:

- Khối lượng bị mất trong quá trình chuyển pha.
- Xác định định hàm ẩm dựa trên khối lượng bị mất theo thời gian và theo
nhiệt độ do quá trình khử nước hoặc phân ly.
1.4. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam và trên thế giới
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
1.4.1.1. Tình hình nghiên cứu tổng hợp tạp chất A và dẫn chất tương tự tạp A trên
thế giới
Tham khảo một số tài liệu về quy trình tổng hợp tạp A của terazosin và hợp chất
có cấu trúc tương tự IAT có một số phương pháp như sau:
Phương pháp 1: Tổng hợp tạp chất A
Cho vào bình cầu dung tích 250 ml 0,5 g (0,33 mol) 4-amino-2-cloro-6,7dimethoxyquinazolin (ACDQ) và 0,7 g (0,4 mol) của piperazin và 100 ml isoamyl
ancol, khuấy và hồi lưu trong 72 giờ, giảm nhiệt độ xuống 80oC, kết tinh lại bằng 2propanol thu được sản phẩm với độ tinh khiết 97,8% [25] (hình 1.5).

Hình 1.5. Sơ đồ quy trình phản ứng theo phương pháp 1

Phương pháp 2: Tổng hợp dẫn chất tương tự tạp A của terazosin
Tiến hành phản ứng tổng hợp 6,7-dimethoxy-2-(4-substituted piperazin-1yl)quinazolin-4-amin bằng phản ứng thế của ACDQ và dẫn chất piperazin trong
DMF, khuấy ở 100oC đến khi phản ứng xảy ra hoàn toàn [26].

15


Hình 1.6. Sơ đồ quy trình phản ứng theo phương pháp 2
Phương pháp 3: Tổng hợp dẫn chất tương tự tạp A của terazosin
Tổng hợp 6,7-dimethoxy-2-(4-substituted piperazin-1-yl)quinazolin-4-amin bằng
cách đun hồi lưu hỗn hợp ACDQ và C1-C4 alkylthio piperazin trong n-butanol,
khuấy 70- 150oC trong 25 giờ [15].

Hình 1.7. Sơ đồ quy trình phản ứng theo phương pháp 3
1.4.1.2. Tình hình thiết lập tạp chuẩn A của terazosin trên thế giới
Trên thị trường đã có tạp chuẩn A của terazosin do USP và một số công ty (bảng
1.3) thiết lập được nhưng phải đặt mua qua công ty thương mại khó khăn, thời gian
lâu và với giá rất cao (khoảng 500-1000 USD cho lọ cỡ vài chục miligam tạp chuẩn).
Phần lớn các công ty không công bố hàm lượng và quy trình tổng hợp, tinh chế và
thiết lập chuẩn của tạp chuẩn A.
Bảng 1.3. Danh sách một số công ty có thiết lập tạp chuẩn A
Khối lượng

Hàm lượng

STT

Công ty

Giá

1

USP

730 $

50

-

2

Crescent Chemical

991 $

50

-

3

Chemicalbook

-

50

-

4

Sincopharmachem

-

50

-

5

Clearsynth

-

16

(mg)

>98%