Phân tích khả năng tương tác phân tử của histone deacetylase 2 với ginenoside 20 (s) RH2 bằng tính toán mô phỏng

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ THƠM
Mã sinh viên: 1201582

PHÂN TÍCH KHẢ NĂNG TƯƠNG TÁC
PHÂN TỬ CỦA HISTONE
DEACETYLASE 2 VỚI GISENOSIDE
20(S)-RH2 BẰNG TÍNH TỐN MƠ
PHỎNG
KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2017


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ THƠM
Mã sinh viên: 1201582

PHÂN TÍCH KHẢ NĂNG TƯƠNG TÁC
PHÂN TỬ CỦA HISTONE
DEACETYLASE 2 VỚI GISENOSIDE
20(S)-RH2 BẰNG TÍNH TỐN MƠ
PHỎNG
KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. PGS.TS. Nguyễn Thị Lập
2. TS. Kim Thị Phương Oanh

Nơi thực hiện:
1. Bộ mơn Hóa sinh
2. Viện nghiên cứu hệ gen

HÀ NỘI - 2017


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn
Thị Lập - Bộ mơn Hóa sinh - Trường Đại học Dược Hà Nội, TS. Kim Thị Phương
Oanh - Viện nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, TS.
Lê Duy Mạnh - Viện Vật lý - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận
tình hướng dẫn, chỉ bảo, tạo điều kiện giúp tơi học tập và nghiên cứu để tơi có thể hồn
thành tốt khóa luận tốt nghiệp này.
Tơi cũng xin cảm ơn các anh, chị trong Viện nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã quan tâm giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tơi
thực hiện khóa luận thành cơng.
Tuy nhiên do thực hiện khóa luận tốt nghiệp trong một thời gian ngắn, nên bài
khóa luận khó tránh khỏi những thiếu sót. Tơi rất mong muốn nhận được sự đóng góp,
phê bình của các thầy cơ và các bạn để bài khóa luận tốt nghiệp được hồn chỉnh hơn.
Cuối cùng tơi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến bố mẹ, gia đình và bạn bè đặc biệt là
bạn Phương Thanh Hoa, Dương Tiến Anh và em Trần Thị Ngát đã ln ln ở bên
ở bên khích lệ, động viên, giúp đỡ tôi trong học tập cũng như trong cuộc sống.
Hà Nội, ngày 15 tháng 5 năm 2017.
Sinh viên.

Trần Thị Thơm


MỤC LỤC

Trang
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG, HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ......................................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ..........................................................................................................3
1.1.

Histon deacetylase (HDAC) ............................................................................. 3

1.1.1. Khái niệm ........................................................................................................ 3
1.1.2. Phân loại HDAC............................................................................................. 4
1.1.3. Cấu trúc phân tử của HDAC nhóm I. .......................................................... 7
1.1.4. Vai trị của điều hịa hoạt tính HDAC ........................................................... 9
1.2.

Các chất ức chế HDAC (HDACi) .................................................................. 12

1.2.1.

Phân loại các chất ức chế HDAC (HDACi) ............................................ 12

1.2.2.

Tác dụng dược lý....................................................................................... 12

1.2.3. Các chất tự nhiên có tiềm năng ức chế HDAC........................................... 13
1.3.

Một số phương pháp sử dụng trong sàng lọc và thiết kế thuốc. ................ 14

1.3.1. Nghiên cứu thiết kế thuốc dựa trên cơng cụ máy tính. .............................. 14
1.3.2. Phương pháp mơ phỏng phân tử bằng docking ......................................... 16
1.3.3. Phương pháp mô phỏng động lực học phân tử (MD) ................................ 19
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ..................................................................................................................................21
2.1. Nguyên liệu ......................................................................................................... 21
2.1.1. Cấu trúc của protein HDAC2 ...................................................................... 21
2.1.2. Cấu trúc của ginsenoside 20(s)-Rh2............................................................ 22


2.2. Thiết bị ................................................................................................................ 22
2.3. Nội dung nghiên cứu .......................................................................................... 23
2.4. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 23
2.4.1. Mô phỏng phân tử bằng chương trình AutoDock Vina ............................. 23
2.4.2. Mơ phỏng động lực học phân tử bằng chương trình Gromacs ................. 27
2.4.3. Phương pháp kiểm chứng (re-docking) ...................................................... 30
2.4.4. Phương pháp xác định vị trí tương tác ....................................................... 31
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ........................................32
3.1. Mô phỏng tương tác phân tử bằng phương pháp docking ............................ 32
3.1.1. Kết quả tính tốn năng lượng liên kết ......................................................... 32
3.1.2. Kết quả xác định vị trí bám của SAHA trên HDAC2 ................................. 35
3.1.3. Vị trí bám của ginsenoside trên HDAC2 ..................................................... 36
3.2. Mô phỏng động lực học phân tử (MD) ............................................................ 39
3.2.1. Kết quả chạy mô phỏng động lực học phân tử của HDAC2 và SAHA ..... 39
3.2.2. Kết quả chạy mô phỏng động lực học phân tử của HDAC2 và ginsenoside
20(s)-Rh2 ................................................................................................................. 41
3.3. Dự đoán vùng tương tác .................................................................................... 43

3.3.1. Vùng tương tác của SAHA .......................................................................... 44
3.3.2 Vùng tương tác của ginsenoside 20(s)-Rh2 ................................................. 46
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .....................................................................................................49
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADN

Acid desoxyribonucleic

CTCL

U da tế bào lympho T

FDA

Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ
(U.S. Food and Drug Administration)

HAT

Histone acetyltransferase

HDAC

Histone deacetylase

HDACi

Các chất ức chế HDAC
(Histone deacetylsae inhibitors)

IL

Interleukin

NAD+

Nicotinamid adenine dinucleotid

NMR

Cộng hưởng từ hạt nhân
(Nuclear Magnetic Resonance)

MD

Động lực học phân tử
Molecular Dynamics

RMSD

Độ lệch căn quân phương
(Root mean square deviation)

SAHA

Acid suberoylanilid hydroxamic

TNF

Yếu tố hoại tử khối u
(Tumor necrosis factor)

TSA

Trichostatin A

VPA

Acid valproic


DANH MỤC CÁC BẢNG, HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
Trang
Bảng 1.1. Phân loại, kích thước, vị trí trong tế bào và chức năng sinh lý của các HDAC
.......................................................................................................................................... 5
Bảng 1.2. Những thay đổi của protein HDAC và biểu hiện của các gen liên quan trong
ung thư.............................................................................................................................. 9
Bảng 3.1. Kết quả năng lượng liên kết giữa HDAC và các phối tử .............................. 32

Hình 1.1. Cấu trúc của nucleosome và vai trị của HAT và HDAC................................ 3
Hình 1.2. Phản ứng acetyl hóa và deacetyl hóa lysin ở đầu tận N của protein histone... 4
Hình 1.3. Cấu trúc bậc 2 của các HDAC nhóm I ............................................................ 7
Hình 1.4. Tương tác của HDAC8 với chất ức chế TSA ................................................. 8
Hình 1.5. Sơ đồ sàng lọc và thiết kế thuốc với sự hỗ trợ của máy tính ......................... 15
Hình 1.6. Docking một phối tử vào một protein .......................................................... 16
Hình 1.7. Các chương trình docking phân tử và tỷ lệ được sử dụng trong nghiên cứu 19
Hình 2.1. Cấu trúc bậc 3 của HDAC2. .......................................................................... 21

Hình 2.2. Cấu trúc hóa học của ginsenoside 20(s)-Rh2 ................................................ 22
Hình 2.3. Minh họa các đặc điểm của bản đồ lưới ........................................................ 24
Hình 2.4. Sơ đồ thực hiện mơ phỏng docking ............................................................... 26
Hình 2.5. Sơ đồ quy trình chạy mơ phỏng động lực học phân tử. ................................ 28
Hình 3.1. Mơ hình docking tốt nhất của SAHA và cấu trúc thực của SAHA. .............. 35
Hình 3.2. Vị trí tương tác của ginsenoside 20(s)-Rh2 với HDAC2 trong 9 mơ hình. .. 38
Hình 3.3. RMSD của HDAC2 và mơ hình 1 của SAHA. ............................................. 40
Hình 3.4. RMSD của HDAC2 và 3 mơ hình của Ginsenoside 20(s)-Rh2 .................... 42
Hình 3.5. Cấu trúc thực và vị trí liên kết của SAHA với HDAC2 sau 100 ns .............. 45
Hình 3.6. Vị trí liên kết của HDAC2 với mơ hình 2 của ginsenoside 20(s)-Rh2 sau 100
ns. ................................................................................................................................... 47


ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, với sự phát triển không ngừng của công nghệ thông tin, đặc biệt với sự
xuất hiện của các hệ thống siêu máy tính với tốc độ tính tốn nhanh đã mở ra một hướng
đi mới trong nghiên cứu phát triển thuốc đó là nghiên cứu, thiết kế thuốc với sự hỗ trợ
của cơng cụ máy tính (computer-aided drug design). Nhờ đó, chúng ta có thể mơ phỏng,
đánh giá, phân tích tương tác giữa thuốc và protein đích ở mức độ phân tử thơng qua
phương pháp mơ phỏng bằng máy tính. Phương pháp mơ phỏng bằng máy tính đã trở
thành cơng cụ hỗ trợ đắc lực giúp giảm thời gian tính tốn và mang lại hiệu quả cao trong
sàng lọc và thiết kế thuốc cũng như giảm thiểu khối lượng công việc của nghiên cứu thực
nghiệm [36].
Ung thư vẫn là một trong những bệnh nan y với tỷ lệ mắc bệnh ngày càng cao.
Việc nghiên cứu, điều chế các thuốc điều trị ung thư vẫn còn là thách thức đối với nhân
loại. Một số thuốc được nghiên cứu có tác dụng điều hồ hoạt tính của một vài protein
có biểu hiện bất thường trong bệnh ung thư. Histone deacetylase (HDAC), một trong số
các loại protein như vậy, được quan tâm và nghiên cứu khá kỹ. Sự biểu hiện tăng quá
mức của HDAC được ghi nhận ở nhiều loại ung thư [45]. Chính vì vậy, nghiên cứu và
phát triển các chất ức chế HDAC đang là một trong những hướng đi được chú trọng

trong điều trị ung thư.
Bên cạnh nghiên cứu các thuốc ức chế HDAC bằng con đường tổng hợp hóa học,
các nhà nghiên cứu cũng quan tâm đến các hoạt chất thiên nhiên, chiết xuất từ thảo dược.
Trong đó, ginsenoside 20(s)-Rh2, một saponin được chiết xuất từ rễ và thân rễ của các
loài nhân sâm, đã được chứng minh là một chất ức chế HDAC tiềm năng ở mức độ in
vitro và in vivo [22]. Tuy nhiên chưa có cơng trình nghiên cứu sâu nào về tương tác phân
tử giữa HDAC và ginsenoside 20(s)-Rh2 sử dụng phương pháp mơ phỏng bằng máy
tính.
Vì vậy, nhằm làm sáng tỏ cơ chế phân tử về sự tương tác giữa HDAC và
ginsenoside 20(s)-Rh2, tạo tiền đề cho các nghiên cứu về mô phỏng tương tác phân tử,
1


góp phần cho cơng tác nghiên cứu và ứng dụng khoa học máy tính trong nghiên cứu phát
triển thuốc, chúng tơi đã tiến hành đề tài: “Phân tích khả năng tương tác phân tử của
Histone Deacetylase 2 với ginsenoside 20(s)-Rh2 bằng tính tốn mơ phỏng” với mục
tiêu:
Đánh giá được khả năng tương tác phân tử của Histone Deacetylase 2 (HDAC2)
với chất ức chế tiềm năng ginsenoside 20(s)-Rh2 bằng phương pháp tính tốn mơ phỏng.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Histone deacetylase (HDAC)
1.1.1. Khái niệm
Trong tế bào nhân chuẩn, ADN được đóng gói thành chất nhiễm sắc (chromatin),
phức hợp protein-ADN có cấu trúc động và tính tổ chức cao. Tiểu đơn vị cơ bản của
chromatin là nucleosome. Mỗi nucleosome bao gồm một đoạn ADN (146 cặp
nucleotide) quấn quanh lõi 8 protein (octamer) hình đĩa của các histone (1 tetramer

H3/H4 và 2 dimer H2A/H2B) [4], [18], [39] .Các cặp protein histone có hai phần quan
trọng, đầu C nằm bên trong lõi, đầu N nằm ở bên ngoài nucleosome với acid amin tận
cùng là lysin. Đầu N đặc biệt ở H3 và H4 thường là đích biến đổi của nhiều q trình
trong phiên mã như methyl hóa, phosphoryl hóa hay acetyl hóa. Trong đó q trình acetyl
hóa được kiểm soát bởi hoạt động của các enzym histone acetyltransferase (HAT) và
histone deacetylase (HDAC) [14], [22] (Hình 1.1).

Hình 1.1. Cấu trúc của nucleosome và vai trò của HAT và HDAC [8]
HAT là nhóm các enzym có chức năng acetyl hóa nhóm ε-NH2 của lysin ở đầu
N tận của protein histone (Hình 1.2), làm mất điện tích dương của chúng, làm yếu liên

3


kết giữa histone và ADN [22], [37], [46], dẫn đến chromatin giảm cuộn xoắn, tham gia
vào các quá trình sao mã, phiên mã…
HDAC là các enzym có chức năng đối lập với HAT, chúng loại bỏ nhóm acetyl
từ lysin đã được acetyl hóa nằm ở đầu N của histone (Hình 1.2), qua đó chromatin đóng
xoắn và ức chế q trình phiên mã [22], [33], [37].

Hình 1.2. Phản ứng acetyl hóa và deacetyl hóa lysin ở đầu tận N của protein histone
[24]
Phản ứng acetyl hóa được xúc tác bởi enzym HAT chuyển nhóm acetyl từ acetyl
co-enzym A sang lysin. Ngược lại, HDAC xúc tác cho qua trình loại bỏ nhóm acetyl
khỏi lysin đã được acetyl hóa.

1.1.2. Phân loại HDAC
Trong bộ gen người, đã xác định được 18 loại HDAC và được phân làm 4 nhóm
(Bảng 1.1). Nhóm I, II và IV là những enzym phụ thuộc Zn2+ và được coi là những
HDAC “kinh điển”. Nhóm III là những enzym phụ thuộc nicotinamid adenine

dinucleotid (NAD+) [2], [29].

4


Bảng 1.1. Phân loại, kích thước, vị trí trong tế bào và chức năng sinh lý của các HDAC
[29]
Phụ thuộc Zn2+

Nhóm

Nhóm

Các

Số

thành

acid

viên

amin

HDAC1

483

Nhân

HDAC2

488

Nhân

HDAC3

428

Nhân

HDAC8

377

Nhân

HDAC4

1084

Nhân/tế bào chất

Vị trí trong tế bào

I

Chức năng sinh lý

Sự sống còn và tăng sinh của
tế bào
Tăng sinh tế bào, kháng
insulin
Sự sống còn và tăng sinh của
tế bào
Tăng sinh tế bào
Điều hịa sự hình thành xương
và tân tạo đường
Sự phát triển và chức năng tim

HDAC5

1122

Nhân/tế bào chất

Nhóm

mạch, tân tạo đường, chức
năng tế bào nội môi và tế bào
cơ tim

IIA
HDAC7

912

Nhân/tế bào chất

Biệt hóa tế bào tuyến ức, chức
năng nội mơi, tân tạo đường
Cân bằng nội mơi, biệt hóa tế

HDAC9

1069

Nhân/tế bào chất

bào tuyến ức, sự tăng trưởng
và chức năng tim mạch

5


Tính di động của tế bào, kiểm
Nhóm

HDAC6

1215

Tế bào chất

bào

IIB

Nhóm

IV

sốt hoạt động của màng tế

HDAC10

669

Tế bào chất

HDAC11

347

Nhân

Chuyển đoạn, tồn tại tế bào
trung gian qua tự thực,
Điều hòa miễn dịch-sao chép
AND

Phụ thuộc NAD+
Lão hóa, điều hịa q trình
SIRT1

747

Nhân, tế bào chất

oxy hóa-khử, sự sống còn của

tế bào, điều hòa hệ thống tự
miễn dịch

SIRT2

389

Nhân

Sự sống còn của tế bào-di căn
và xâm lấn tế bào
Chu trình ure, cân bằng oxy

Nhóm

SIRT3

399

Ti thể

hóa-khử,

điều

hịa

ATP,

chuyển hóa, chết tế bào theo

chường trình và tín hiệu tế bào

III

Chuyển hóa năng lượng, điều
SIRT4

314

Ti thể

hịa ATP, chuyển hóa, chết tế
bào theo chường trình và tín
hiệu tế bào
Chu trình ure, cân bằng năng

SIRT5

310

Ti thể

lượng, điều hịa ATP, chuyển
hóa, chết tế bào theo chường
trình và tín hiệu tế bào

6


SIRT6

355

Nhân

Điều hịa chuyển hóa

SIRT7

400

Nhân

Chết tế bào theo chương trình

1.1.3. Cấu trúc phân tử của HDAC nhóm I.
Cấu trúc bậc 1 và 2 của các HDAC nhóm I (HDAC1, HDAC2, HDAC3 và
HDAC8) được thể hiện trong hình 1.3. Các acid amin giống nhau giữa các HDAC có
màu xanh, tỉ lệ các acid amin giống nhau của HDAC1, HDAC2 và HDAC3 so với
HDAC8 lần lượt là 40%, 41%, 41%. Cấu trúc bậc 2 của các HDAC nhóm I gồm có các
xoắn α (α Helix), phiến β (β-atrand), các đoạn xoắn ngẫu nhiên (random coil) và các cấu
trúc vòng cung mà ở cấu trúc bậc 3 tạo thành các túi hay hố lõm trên bề mặt protein
(pocket forming loop) [38].

Hình 1.3. Cấu trúc bậc 2 của các HDAC nhóm I [38]

7


Cấu trúc bậc ba của các protein HDAC được xác định bằng phương pháp tinh thể

học tia X và có trong ngân hàng cơ sở dữ liệu Protein Data Bank. Nhìn chung, các HDAC
kinh điển có cấu trúc tương tự nhau, gồm kênh enzym và ion Zn2+ nằm ở đáy túi [38].
Ion Zn2+ là coenzym của HDAC, nằm dưới đáy kênh enzym và cũng là thành
phần tham gia liên kết mạnh nhất với phần đuôi histone qua liên kết phối trí. Trong phân
tử HDAC, ion Zn2+ có thể tạo 5 liên kết phối trí. Ví dụ như : trong tương tác của HDAC8
với các chất ức chê, ion Zn2+ sẽ tạo liên kết phối trí với oxy của nhóm carboxylat của
D178 (Asp178) và D267(Asp267), nguyên tử N𝞭1 của H180 (His180) và 2 liên kết phối
trí với nguyên tử oxy của nhóm carbonyl và hydroxyl của chất ức chế Trichostatin A
(TSA) của nhóm hydroxamat (Hình 1.4) [38].

Hình 1.4. Tương tác của HDAC8 với chất ức chế TSA [38]
Kênh enzym của HDAC có dạng túi hình ống hẹp, là nơi tương tác với cơ chất,
cấu tạo bởi các acid amin như: Phe, Tyr, Gly, Leu (Met ở HDAC8), His. Nó có cấu trúc

8


khá linh động có thể thay đổi kích thước để phù hợp với cơ chất. Miệng túi có một vài
vịng xoắn protein để tương tác với nhóm nhận diện bề mặt của HDAC [38].
1.1.4. Vai trò của điều hòa hoạt tính HDAC
Theo các nghiên cứu gần đây, thay đổi mức độ acetyl hóa và rối loạn chức năng
của HDAC có liên quan đến nhiều bệnh ở người trong đó có ung thư. Các nghiên cứu đã
cho thấy biểu hiện của HDAC tăng lên trong ung thư máu, các khối u rắn và có tương
quan với tiên lượng xấu của bệnh nhân. Các HDAC khơng chỉ liên quan đến deacetyl
hóa protein histone dẫn đến ức chế quá trình phiên mã, mà cịn liên quan đến các protein
khơng phải histone kiểm sốt các quá trình chết tế bào theo chương trình (apotosis), chu
trình tế bào và biệt hóa tế bào [2], [14], [25]. Những bất thường của HDAC sẽ ảnh hưởng
tới các quá trình này và dẫn tới ung thư. Sự thay đổi của HDAC, mức độ biểu hiện gen
mã hóa HDAC và các loại ung thư liên quan được tóm tắt trong bảng 1.2.
Bảng 1.2. Những thay đổi của protein HDAC và biểu hiện của các gen liên quan trong

ung thư [45]
Nhóm

Thành
viên

Loại biến đổi

Loại ung thư liên quan
Ung thư biểu mơ đường tiêu hóa
Ung thư biểu mơ tuyến tiền liệt

Biểu hiện quá mức

Ung thư biểu mô tuyến vú
Ung thư biểu mô tuyến đại tràng
Bạch cầu lympho bào mạn tính

HDAC1

Ung thư buồng trứng
Biểu hiện quá mức gen
HDAC1

Ung thư dạ dày
Bệnh u lympho Hodgkin
Ung thư tuyến tiền liệt

9

Điều hòa biểu hiện giảm gen Ung thư đại trực tràng
HDAC1
Ung thư tử cung
Biểu hiện quá mức

Ung thư cổ tử cung
Ung thư dạ dày

HDAC2

Biểu hiện quá mức gen

Ung thư buồng trứng
Bệnh u lympho Hodgkin

HDAC1
Đột biến mất đoạn gen
HDAC2

Ung thư ruột già
Ung thư nội mạc tử cung
Ung thư dạ dày
Ung thư ruột già

Biểu hiện quá mức

Bạch cầu lympho bào mạn tính

HDAC3

Biểu hiện quá mức gen

Đột biến gen HDAC4
Biểu hiện quá mức gen
HDAC4

Ung thư buồng trứng
Ung thư phổi

HDAC3
IIa

Bệnh u lympho Hodgkin

Ung thư vú
Ung thư đại trực tràng
Ung thư tuyến tiền liệt
Ung thư vú

HDAC4

Điều hòa biểu hiện giảm gen Ung thư ruột già
Ung thư phổi

HDAC4
HDAC5

Điều hòa biểu hiện giảm gen Ung thư đại trực tràng
HDAC5
Biểu hiện quá mức

HDAC7

Bạch cầu lympho bào mạn tính
Ung thư đại trực tràng

10


Biểu hiện quá mức gen

Ung thư tuyến tụy

HDAC7
HDAC9

Biểu hiện quá mức

IIb

Bạch cầu lympho bào mạn tính
Bạch cầu lympho bào cấp tính
Bệnh bạch cầu myeloid cấp tính
Ung thư vú
Bạch cầu lympho bào mạn tính

HDAC6

Biểu hiện quá mức

U lympho tế bào T ở da
Ung thư tế bào gan
Ung thư tế bào vảy
Ung thư buồng trứng
Ung thư bàng quang

HDAC10

Biểu hiện quá mức

III

Bạch cầu lympho bào mạn tính
Bệnh bạch cầu myeloid cấp tính
Ung thư da

Biểu hiện quá mức

Ung thư đại tràng
Ung thư tuyến tiền liệt

SIRT1

Bạch cầu lympho bào mạn tính
Điều hịa biểu hiện giảm gen Ung thư đại trực tràng
SIRT1
SIRT6
SIRT7

Biểu hiện quá mức

Bạch cầu lympho bào mạn tính

Điều hịa biểu hiện giảm

Ung thư gan

Biểu hiện quá mức

Ung thư vú

Bảng 1.2 cho thấy đa số trong các bệnh ung thư có sự biểu hiện qua mức của
HDAC và các gen mã hóa các protein này. Giảm hoạt động của các HDAC có liên quan

11


đến việc ức chế sự phát triển và tăng trưởng khối u. Vì vậy ức chế HDAC đã trở thành
đích quan trọng của nhiều liệu pháp điều trị ung thư người.
1.2. Các chất ức chế HDAC (HDACi)
1.2.1. Phân loại các chất ức chế HDAC (HDACi)
Các chất ức chế HDAC có thể được phân loại thành 4 loại theo cấu trúc hóa học:
Các hydroxamat: TSA chất đầu tiên thuộc nhóm acid hydroxamic được tìm thấy
có tác dụng ức chế HDAC, vorinostat (acid suberoylanilide hydroxamic, SAHA) đã được
FDA chấp thuận là chất ức chế HDAC đầu tiên cho điều u da tế bào lympho T (CTCL)
[6], belinostat (PXD-101), panobinostat (LBH589)…
Các acid béo mạch ngắn: Acid valproic (VPA), acid butyric và acid
phenylbutyric các chất ức chế yếu HDAC nhóm I và II.
Các benzamid: Entinostat (SNDX-275, MS-275) và mocetinostat (MGCD0103)
là các chất ức chế chọn lọc HDAC I và mocetinostat cũng ức chế HDAC nhóm IV.

Các tetrapeptid: Các chất ức chế HDAC nhóm I (romidepsin ức chế HDAC 4
và HDAC6): romidepsin (depsipeptid, FK228, FR901228), apicidin và trapoxinand.
1.2.2. Tác dụng dược lý
Việc ức chế HDAC có liên quan đến một loạt các q trình như tăng sinh, biệt
hóa, chết tế bào theo chương trình, sự hình thành mạch, miễn dịch/chống viêm… [26]
Tăng sinh, biệt hóa và chết tế bào theo chương trình (appotosis): Các chất ức
chế HDAC có hoạt tính chống ung thư ở một số loại ung thư. Khi điều trị với các chất
ức chế HDAC sẽ làm điều hòa lên p21, điều hòa xuống cyclin D, dẫn đến kết quả làm
giảm tăng sinh tế bào ung thư và ngừng chu kỳ tế bào. Ngoài ra, điều trị với các chất ức
chế HDAC cũng có thể làm thúc đẩy apoptosis thơng qua cả con đường nội tại và bên
ngoài. Các chất ức chế HDAC điều hòa lên biểu hiện gen của một số protein tiền apotosis
như Bax, Bak, Bim, Bad, Noxa, Puma, Bid, Apaf1 và làm giảm biểu hiện gen của một
số protein chống apotosis như Bcl-2, Bcl-xl, Mcl-1, làm tăng biểu hiện của các thụ thể

12


(receptor) của Fas và TRAIL (tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing
ligand) [26].
Sự hình thành mạch máu (Angiogenesis): Các chất ức chế HDAC có ức chế sự
tăng sinh mạch máu thơng qua việc ức chế các yếu tố tiền sinh mạch máu như: HIF1α,
VEGF, VEGF receptor, endothelial nitric oxid synthase và các cytokin như interleukin2 (IL-2) và interleukin-8 (IL-8), kích thích các yếu tố chống tăng sinh mạch máu như:
p53 và von Hippel-Lindau (VHL) [26].
Miễn dịch/chống viêm: Trên mơ hình động vật, các chất ức chế HDAC như TSA
và SAHA có thể ức chế các cytokin tiền viêm, bao gồm IL-12, TNFα, interferon (IFN)γ
and IL-23 [26].
1.2.3. Các chất tự nhiên có tiềm năng ức chế HDAC
Curcumin là thành phần chính của curcuminoid, chiết xuất từ củ nghệ thuộc họ
gừng. Curcumin được coi là một chất ức chế HDAC mới, có thể ức chế biểu hiện gen
của HDAC nhóm I (HDAC1, HDAC3 và HDAC8) ở tế bào Raji, là một tác nhân chống

ung thư tiềm năng [21].
Sulforaphan (1-isothiocyanato-4-methylsulfinylbutan) là một isothiocyanat tự
nhiên được tìm thấy trong nhiều loại rau cải, đã được chứng minh làm giảm hoạt tính
của HDAC ở mức độ in vivo [11].
Ginsenoside 20(s)-Rh2 là một saponin được chiết xuất từ rễ của các lồi nhân
sâm. Đã có nhiều báo cáo về việc ginsenoside 20(s)-Rh2 ức chế tăng trưởng của một số
loại tế bào ung thư bằng cách gây ngừng chu trình tế bào và gây chết tế bào theo chương
trình (apoptosis) [32], [43].
Gần đây, có bào cáo ginsenoside 20(s)-Rh2 ức chế tăng sinh dịng tế bào bạch cầu
ác tính bằng cách gây chết tế bào theo chương trình thơng qua con đường ti thể [44],
tăng cường khả năng chống lại bệnh tật và có tác dụng hiệp đồng với các thuốc điều trị
ung thư khác [31]. Ginsenoside 20 (s)-Rh2 có hiệu quả ngừng chu kỳ tế bào ở pha G0/G1
và gây chết tết bào theo chương trình ở tế bào K562 và KG1-α, giảm mức protein liên

13


quan đến tăng sinh tế bào (Cyclin D1, Bcl-2, ERK, p-ERK) và protein tiền apoptosis có
hoạt tính (Bax, p38, p-p38, JNK, p-JNK) thơng qua giảm hoạt tính của HDAC1, HDAC2,
HDAC6 ở mức độ in vitro và in vivo. Những kết quả trên đã cho thấy rằng ginsenoside
20(s)-Rh2 là một chất ức chế tự nhiên HDAC đầy tiềm năng cho hóa trị liệu bệnh bạch
cầu ác tính [22].
Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào về tương tác giữa ginsenoside 20(s)-Rh2 và
HDAC ở mức độ phân tử để có thể tìm hiểu sâu hơn khả năng liên kết và vị trí liên kết
của ginsenoside 20(s)-Rh2 với HDAC, để góp phần khẳng định được chắc chắn tác dụng
ức chế HDAC.
1.3. Một số phương pháp sử dụng trong sàng lọc và thiết kế thuốc.
1.3.1. Nghiên cứu thiết kế thuốc dựa trên công cụ máy tính.
Q trình nghiên cứu phát triển thuốc là một q trình rất khó khăn, rủi ro, tốn
kém thời gian và tiền bạc. Ước tính để đưa một hoạt chất mới ra thị trường cần thời gian

khoảng 15 năm với chi phí hơn một tỷ USD. Nhờ có sự phát triển của công nghệ thông
tin với các phương pháp trợ giúp bằng máy tính đã giúp giảm chi phí và khối lượng cơng
việc cho q trình này.
Thiết kế thuốc dựa trên cơng cụ máy tính đã được phát triển từ những năm 80 của
thế kỷ trước. 5/8/1981, trên tạp chí Fortune có bài “Cuộc cách mạng cơng nghiệp mới:
Thiết kế thuốc với cơng cụ máy tính ở Merck” “Next Industrial Revolution: Designing
Drugs by Computer at Merck” đánh dấu sự khởi đầu cho việc quan tâm đến nghiên cứu
thiết kế thuốc sử dụng sự hỗ trợ của cơng cụ máy tính [36].
Trong hơn ba thập kỷ qua đã có hàng nghìn cơng trình nghiên cứu ứng dụng máy
tính vào thiết kế thuốc được cơng bố trên các tạp chí khoa học uy tín. Một số ví dụ về
các loại thuốc đã được phê duyệt mà việc khám phá ra nó phần lớn dựa vào các cơng cụ
của máy tính bao gồm: chất ức chế Carbonic anhydrase dorzolamid được chấp thuận
năm 1995, thuốc ức chế men chuyển (ACE) captopril được chấp thuận vào năm 1981,
ba thuốc điều trị HIV: saquinavir được phê chuẩn vào năm 1995, ritonavir và indinavir

14


(cả hai được phê chuẩn vào năm 1996) và tirofiban, một chất đối kháng fibrinogen được
chấp thuận vào năm 1998.
Quy trình sàng lọc và thiết kế thuốc với sự hỗ trợ của máy tính được thể hiện ở
Hình 1.5.
Các phối tử (ligand)

Các protein đích đã biết

tiềm năng

Dự đốn tương tác và
sàng lọc bằng máy tính

Các chất có khả năng ảnh
hưởng đến protein đích

Kiểm chứng bằng thực nghiệm

Hình 1.5. Sơ đồ sàng lọc và thiết kế thuốc với sự hỗ trợ của máy tính
Từ những protein đích đã biết (có cấu trúc trong ngân hàng cơ sở dữ liệu Protein
Data Bank) đóng vai trị quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của nhiều loại bệnh, là đích
hướng đến của thuốc cần nghiên cứu và các phối tử tiềm năng-có thể tương tác với
protein đích (hoạt hóa hoặc ức chế). Người ta sẽ áp dụng các phương pháp mô phỏng sử
dụng máy tính (mơ phỏng docking, mơ phỏng động lực học phân tử…) để dự đoán tương
tác giữa chúng và lựa chọn các phối tử có khả năng tương tác cao với protein để tiếp tục
nghiên cứu thực nghiệm, khẳng định hoạt tính của các chất và ứng dụng vào trong phát
triển thuốc mới.

15


Trong thiết kế thuốc sử dụng công cụ bằng máy tính có rất nhiều phương pháp
được sử dụng để mơ phỏng phân tử nhưng trong giới hạn khóa luận này, chúng tôi chỉ
đề cập đến phương pháp mô phỏng phân tử bằng docking và phương pháp mô phỏng
động lực học phân tử.
1.3.2. Phương pháp mô phỏng phân tử bằng docking
Định nghĩa:
Docking là phương pháp để dự đoán sự định hướng tốt nhất của một phân tử này
với phân tử khác để khi gắn lại thì chúng sẽ tạo thành một phức hợp ổn định (Hình 1.6).
Sự hiểu biết về các định hướng tốt nhất đó cịn có thể sử dụng để dự đoán độ lớn liên kết
hay ái lực liên kết giữa hai phân tử bằng cách sử dụng các trường lực.

Hình 1.6. Docking một phối tử vào một protein
Trọng tâm của docking phân tử là mơ phỏng có tính tốn q trình tương tác giữa
các phân tử. Mục đích cuối cùng của nó là đạt được cấu hình tối ưu hóa cho cả protein,
phối tử (ligand) và sự định hướng tương đối giữa protein và phối tử sao cho năng lượng
tự do của cả hệ thống là cực tiểu [27].
Cơ chế của docking:
Để xuất một kết quả docking trên màn hình thì địi hỏi đầu tiên là cấu trúc của
protein cần khảo sát. Thông thường các cấu trúc này được xác định bằng các kỹ thuật
sinh học như nhiễu xạ tinh thể tia X, hoặc ít sử dụng hơn là phương pháp cộng hưởng từ
hạt nhân NMR (Nuclear Magnetic Resonance). Cấu trúc này của protein cùng với cơ sở
dữ liệu về các phối tử đóng vai trị là dữ liệu đầu vào của một chương trình docking.

16


Thành cơng của một chương trình docking phụ thuộc vào hai yếu tố là: thuật tốn tìm
kiếm và các trường lực.
Thuật tốn tìm kiếm: Sự tìm kiếm trong khơng gian về mặt lý thuyết bao gồm
tất cả các sự định hướng và các hình dạng có thể của protein kết hợp với phối tử. Tuy
nhiên trong thực tế với tài ngun máy tính hiện tại, thì khơng thể triệt để khảo sát khơng
gian tìm kiếm - điều này sẽ liên quan đến việc liệt kê tất cả các biến dạng có thể có của
mỗi phân tử và tất cả sự quay cũng như sự định hướng khả dĩ của phối tử liên quan đến
protein ở mức độ chi tiết cho trước. Hầu hết các chương trình docking cho phép sử dụng
phối tử linh hoạt, và cố gắng để tạo hình thụ thể protein linh hoạt. Kết quả là một chuỗi
các “tấm ảnh” mà mỗi “tấm ảnh” là một “tư thế” của phối tử và thụ thể.
Hàm loại trừ (Scoring function): là tập hợp các hàm số lấy các “tư thế” ở trên
như là các dữ kiện đầu vào và trả lại một số chỉ khả năng mà tư thế đó đại diện cho một
vị trí gắn tốt. Hầu hết các hàm loại trừ này là các trường lực vật lý giữa các phân tử dùng
để dự đoán năng lượng của các “tư thế” đó; trong đó, năng lượng thấp (âm) tương ứng
với một hệ thống ổn định và do đó tương ứng một vị trí gắn khả dĩ.

Cơng thức tính năng lượng liên kết [9]:
𝑳−𝑳
𝑷−𝑷
𝑷−𝑷
𝚫𝐆 = (𝑽𝑳−𝑳
𝒍𝒊ê𝒏 𝒌ế𝒕 − 𝑽𝒌𝒉ô𝒏𝒈 𝒍𝒊ê𝒏 𝒌ế𝒕 ) + (𝑽𝒍𝒊ê𝒏 𝒌ế𝒕 − 𝑽𝒌𝒉ô𝒏𝒈 𝒍𝒊ê𝒏 𝒌ế𝒕 )
𝑷−𝑳
+(𝑽𝑷−𝑳
𝒍𝒊ê𝒏 𝒌ế𝒕 − 𝑽𝒌𝒉ô𝒏𝒈 𝒍𝒊ê𝒏 𝒌ế𝒕 ) − 𝑻𝚫𝐒𝐜𝐨𝐧𝐟 )

Với L: Phối tử, P: Protein
Mỗi cặp năng lượng bao gồm sự ước tính về sự đẩy/hút, liên kết hydro, liên kết
tĩnh điện và sự desolvat hóa.
𝑽 = 𝑾𝒗𝒅𝒘 ∑𝒊,𝒋 (

𝑨𝒊𝒋
𝒓𝟏𝟐
𝒊𝒋

−

𝑩𝒊𝒋
𝒓𝟔
𝒊𝒋

) + 𝑾𝒉𝒃𝒐𝒏𝒅 ∑𝒊,𝒋 𝑬(𝒕) (
−

𝑾𝒅𝒆𝒔𝒐𝒍𝒗 ∑𝒊,𝒋(𝑺𝒊 𝑽𝒋 + 𝑺𝒋 𝑽𝒊 )𝒆

𝑪𝒊𝒋
𝒓𝟏𝟐
𝒊𝒋

−

𝑫𝒊𝒋
𝒓𝟏𝟎
𝒊𝒋

) + 𝑾𝒆𝒍𝒆𝒄 ∑𝒊,𝒋

𝒒𝒊 𝒒𝒋
𝜺(𝒓𝒊𝒋 )𝒓𝒊𝒋

+

𝒓𝟐
𝒊𝒋

𝟐𝝈𝟐

Các trọng số W được tối ưu hóa bằng cách sử dụng phương pháp phân tích hồi
quy tuyến tính để hiệu chỉnh năng lượng tự do bán thực nghiệm dựa trên tập hợp các

17


hằng số liên kết (binding constant) được xác định bằng thực nghiệm. Số hạng thứ nhất
là thế 6/12 đặc trưng cho tương tác đẩy. Các tham số dựa trên trường lực Amber. Số

hạng thứ hai là số hạng liên kết hydro trực tiếp dựa trên thế 10/12. Các tham số C và D
được quy định để độ sâu tối đa của giếng thế là 5 kcal/mol tại 1,9 Å đối với liên kết
hydro-oxy hay hydro-nitơ, và là 1 kcal/mol tại 2,5 Å đối với liên kết hydro với lưu huỳnh.
Hàm E(t) cung cấp sự định hướng dựa trên góc t từ liên kết hydro mẫu. Số hạng thứ ba
là thế chắn Coulomb tĩnh điện. Số hạng cuối cùng là thế desolvat hóa được tính dựa trên
thể tích của các ngun tử (V) xung quanh một nguyên tử cho trước và che cho nó khỏi
dung mơi., có trọng số được tính bởi tham số hòa tan (S) và số mũ với trọng số khoảng
cách σ = 3,5 Å.
Trong thực tế ứng dụng của luận văn này, protein được xem như vật thể rắn
𝑷−𝑷
𝑳−𝑳
𝑳−𝑳
(rigrid) 𝑽𝑷−𝑷
𝒍𝒊ê𝒏 𝒌ế𝒕 − 𝑽𝒌𝒉ô𝒏𝒈 𝒍𝒊ê𝒏 𝒌ế𝒕 = 𝟎 và 𝑽𝒍𝒊ê𝒏 𝒌ế𝒕 − 𝑽𝒌𝒉ô𝒏𝒈 𝒍𝒊ê𝒏 𝒌ế𝒕 = ∆𝑮𝒕𝒐𝒓 xem

là hằng số phụ thuộc số nối có thể xoay được trong phối tử. Đại lượng đặc trưng cho sự
mất mát entropy trên vị trí gắn cũng được bỏ qua, nên năng lượng cuối cùng được tính
là năng lượng gắn của phối tử trên protein.
∆G < 0 thì phối tử và protein có khả năng liên kết. Giá trị ∆G càng thấp thì khả
năng liên kết của phối tử với protein càng tốt.
Có nhiều chương trình docking phân tử như: DOCK, FRED, GLIDE, SURFLEX,
GOLD, AutoDock … (Hình 1.7). Phần mềm được dùng phổ biến nhất là AutoDock (từ
năm 1990 đến năm 2013). AutoDock lần đầu phát triển năm 1990 [12] và sau đó được
cải tiến dần qua các phiên bản từ 1 đến 4. AutoDock 4 là bản mới nhất được phát triển
từ năm 2009 [28] và được sử dụng cho đến nay. AutoDock Vina là chương trình được
phát triển sau của AutoDock có nhiều điểm ưu việt hơn AutoDock 4 [41]. Trong giới
hạn khóa luận này, chương trình được sử dụng để tiến hành docking là AutoDock Vina.

18