XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI ADENOSIN và CORDYCEPIN TRONG CHẾ PHẨM CHỨA ĐÔNG TRÙNG hạ THẢO BẰNG PHƯƠNG PHÁP sắc ký LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (5.86 MB, 105 trang )
WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM
WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ QUẾ MAI
XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG
ĐỒNG THỜI ADENOSIN VÀ CORDYCEPIN
TRONG CHẾ PHẨM CHỨA ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
HÀ NỘI 2015
Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM
WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM
WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ QUẾ MAI
XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG
ĐỒNG THỜI ADENOSIN VÀ CORDYCEPIN
TRONG CHẾ PHẨM CHỨA ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 60720410
Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh
HÀ NỘI 2015
Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM
WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM
WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới cô giáo
PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh, người đã trực tiếp hướng dẫn, động viên và
giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin cảm ơn ban lãnh đạo viện thực phẩm chức năng và các đồng
nghiệp phòng hóa lý trung tâm kiểm nghiệm viện thực phẩm chức năng đã tạo
mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập và làm thực nghiệm
tại cơ sở.
Tôi xin chân thành cảm ơn ban giám hiệu, phòng đào tạo sau đại học,
các thầy cô đã tạo mọi điều kiện trong suốt quá trình học tập tại trường và thực
hiện luận văn này.
Cuối cùng tôi gửi lời thân thương nhất đến gia đình, bạn bè, tập thể lớp
CH18 đã luôn ở bên động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn
thành luận văn.
Hà Nội, ngày 28 tháng 8 năm
2015
Học viên
Nguyễn Thị Quế Mai
Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM
WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM
WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON
MỤC LỤC
Trang
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ……………………………………………………...
Chương 1. TỔNG QUAN…………………………………………..
1.1. Tổng quan về đông trùng hạ thảo……………………………...
1.1.1. Đặc điểm của đông trùng hạ thảo……………………………
1.1.2. Phân loại đông trùng hạ thảo………………………………...
1.1.3. Thành phần hóa học trong đông trùng hạ thảo………………
1.1.4. Tác dụng của đông trùng hạ thảo…………………………….
1.1.5. Một số chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo…………………..
1.2. Tổng quan về adenosin,
cordycepin……………………………
1.2.1. Công thức cấu tạo, đặc điểm vật lý hóa học…………………
1.2.2. Dược động học cordycepin và adenosin…………………….
1.2.3. Tác dụng của cordycepin, adenosin…………………………
1.3. Phương pháp xác định cordycepin và adenosin……………….
1.3.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng………………………………
1.3.2. Phương pháp đo màu………………………………………..
1.3.3. Phương pháp điện di mao quản……………………………..
1.3.4. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1HNMR…………...
1.3.5. Phương pháp sắc ký lỏng…………………………………….
1.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao……………………….
1.4.1. Nguyên lý chung của sắc ký lỏng……………………………
1.4.2. Một số thông số đặc trưng…………………………………...
1.4.3. Ứng dụng…………………………………………………….
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU….
2.1. Đối tượng nghiên cứu………………………………………….
2.2. Hóa chất, dung môi…………………………………………….
2.3. Phương tiện, thiết bị nghiên cứu……………………………….
2.4. Phương pháp nghiên cứu………………………………………
2.4.1. Nghiên cứu các cách chiết adenosin và cordycepin trong
mẫu
2.4.2. Khảo sát chọn điều kiện sắc ký thích hợp……………………
2.4.3. Đánh giá phương pháp phân tích……………………………
2.4.4. Áp dụng trên một số chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo……
Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
1
3
3
3
3
4
5
7
7
7
9
10
11
11
12
13
13
13
16
16
18
19
20
20
21
21
22
21
23
24
26
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM
WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM
WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON
2.4.5. Phương pháp xử lý số liệu…………………………………..
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU…………………………….
3.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký…………………………
3.1.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn…………………………………...
3.1.2. Khảo sát lựa chọn bước sóng phát hiện……………………..
3.1.3. Khảo sát lựa chọn pha động…………………………………
3.1.4. Khảo sát thể tích tiêm mẫu………………………………….
3.1.5. Khảo sát nhiệt độ cột………………………………………..
3.2. Khảo sát và lựa chọn quy trình xử lý mẫu…………………….
3.2.1. Khảo sát dung môi chiết...…………………………………..
3.2.2. Khảo sát số lần chiết……..………………………………….
3.2.3. Khảo sát phương pháp chiết…………………………………
3.2.4. Khảo sát nhiệt độ chiết………………………………………
3.2.5. Khảo sát thời gian chiết……………………………………..
3.3. Quy trình phân tích……………………………………………
3.3.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch thử…………………
3.3.2. Điều kiện sắc ký……………………………………………..
3.3.3. Đánh giá kết quả……………………………………………..
3.4. Đánh giá phương pháp…………………………………………
3.4.1. Độ thích hợp của hệ thống…………………………………..
3.4.2. Độ đặc hiệu…………………………………………………..
3.4.3. Xây dựng đường chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính….......
3.4.4. Khảo sát độ chính xác………………………………………..
3.4.5. Khảo sát độ đúng…………………………………………….
3.4.6. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)…..
3.5. Áp dụng phương pháp phân tích trên một số TPCN chứa
ĐTHT
3.5.1. Định tính……………………………………………………..
3.5.2. Định lượng…………………………………………………...
Chương 4. BÀN LUẬN…………………………………………….
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………...
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
26
27
27
27
27
28
30
31
33
33
35
35
37
38
39
39
40
41
41
41
42
47
48
51
53
54
54
56
58
64
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM
WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM
Từ viết tắt
ACN
AOAC
CE
DD
DMSO
ĐTHT
EtOH
HL
HPLC
MeOH
MS
PDA
ppm
r
RSD
SD
TB
TPCN
TLC
TLTK
UV
VIS
WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON
Tiếng Anh hoặc tên khoa học
Acetonitril
Association of Official
Analytical Chemists
Capillary electrophoresis
Tiếng Việt
Hiệp hội các nhà Hóa
phân tích
Điện di mao quản
Dung dịch
Dimethyl sulfoxide
Đông trùng hạ thảo
Ethanol
High Performance Liquid
Chromatography
Methanol
Mass spectrometry
Photo diode array
Parts per million
Relative standard deviation
Standard deviation
Thin layer chromatography
Ultraviolet
Visible
Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
Hàm lượng
Sắc ký lỏng hiệu năng
cao
Khối phổ
Dãy diod quang
Phần triệu
Hệ số tương quan
Độ lệch chuẩn tương đối
Độ lệch chuẩn
Trung bình
Thực phẩm chức năng
Sắc ký lớp mỏng
Tài liệu tham khảo
Tử ngoại
Khả kiến
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM
WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM
WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Độ tan của adenosin trong một số dung môi [8]…………………
9
Bảng 1.2. Một số phương pháp sắc ký lỏng phân tích adenosin, cordycepin
13
Bảng 2.3. Chế phẩm chứa ĐTHT dạng rắn…………………………………
20
Bảng 2.4. Chế phẩm chứa ĐTHT dạng lỏng………………………………..
20
Bảng 2.5. Các hóa chất dung môi sử dụng trong quá trình thí nghiệm……..
21
Bảng 3.6. Khảo sát thành phần pha động…………………………………...
28
Bảng 3.7. Khảo sát chương trình gradient nồng độ…………………………
29
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát số lần chiết (n = 3)……………………………..
35
Bảng 3.9. Kết quả độ thích hợp của hệ thống ……………………………...
42
Bảng 3.10. Kết quả khảo sát tính tuyến tính giữa nồng độ adenosin,
cordycepin và diện tích pic………………………………………………….
47
Bảng 3.11. Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp với mẫu R1…………...
49
Bảng 3.12. Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp với mẫu L1……..
49
Bảng 3.13. Kết quả độ chính xác trung gian ……...………………………..
50
Bảng 3.14. Kết quả khảo sát độ đúng mẫu R1……………………………...
52
Bảng 3.15. Kết quả khảo sát độ đúng mẫu thử L1………………………….
52
Bảng 3.16. Kết quả S/N của các mẫu thêm chuẩn………………………….
53
Bảng 3.17. Kết quả thời gian lưu pic adenosin và cordycepin các mẫu thử
và chuẩn hỗn hợp……………………………………………………………
55
Bảng 3.18. Kết quả định lượng các mẫu thử………………………………..
57
Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM
WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM
WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Trang
Hình 1.1. Cấu tạo một số nucleotid trong đông trùng hạ thảo [28]……..
5
Hình 1.2. Công thức cấu tạo cordycepin [14]…………………………..
8
Hình 1.3. Công thức cấu tạo adenosin [8]……………………………....
8
Hình 1.4. Con đường chuyển hóa của adenosin ở động vật có vú [28]...
10
Hình 1.5. Phổ hấp thụ hỗn hợp màu được tạo thành với thuốc thử anthron
của cordycepin, adenosin, glucose và deoxyadenosin [15]……..............
12
Hình 1.6. Sơ đồ cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao…………...
18
Hình 3.7. Phổ hấp thụ tử ngoại của adenosin (a) và cordycepin (b)………
28
Hình 3.8. Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp tiêm 5 µl (a), 10 µl (b), 20 µl (c), 40
µl (d)…………………………………………………………………….
31
Hình 3.9. Sắc ký đồ mẫu chuẩn hỗn hợp (a) và mẫu thử (c) ở điều kiện
nhiệt độ cột 40oC, mẫu chuẩn hỗn hợp (b) và mẫu thử (d) ở điều kiện
nhiệt độ cột 25oC………………………………………………………...
32
Hình 3.10. Kết quả khảo sát dung môi chiết đối với mẫu R1 (n = 3)…..
34
Hình 3.11. Kết quả khảo sát dung môi chiết đối với mẫu L1 (n = 3)…..
34
Hình 3.12. Kết quả khảo sát phương pháp chiết đối với mẫu R1 (n = 3)
36
Hình 3.13. Kết quả khảo sát phương pháp chiết đối với mẫu L1 (n = 3)
36
Hình 3.14. Kết quả khảo sát nhiệt độ chiết đối với mẫu R1 (n = 3)……
37
Hình 3.15. Kết quả khảo sát nhiệt độ chiết đối với mẫu L1 (n = 3)……
37
Hình 3.16. Kết quả khảo sát thời gian chiết đối với mẫu R1 (n = 3)…..
38
Hình 3.17. Kết quả khảo sát thời gian chiết đối với mẫu L1 (n = 3)…....
39
Hình 3.18. Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu phương pháp……………….
44
Hình 3.19. So phổ adenosin của mẫu R1 (A) và mẫu L1 (C), so phổ
cordycepin của mẫu R1 (B) và mẫu L1 (D)…………………………….
Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
46
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM
WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM
WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON
Hình 3.20. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp hàm lượng mỗi chất từ
1- 40 µg/ml (pic adenosine tR = 20,1 phút, pic cordycepin tR = 22,2
phút)…………..........................................................................................
47
Hình 3.21. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ (µg/ml) và diện
tích pic (mAU.s) của adenosin (a) và cordycepin b)……………………....
48
Hình 3.22. Sắc ký đồ mẫu placebo 1 thêm chuẩn (0,25 µg/ml mỗi chất)
54
Hình 3.23. Sắc ký đồ mẫu R2 (a), L2 (b)……………………………….
55
Hình 3.24: So phổ adenosin (a) và cordycepin (b) của mẫu thử R2 và
mẫu chuẩn tương ứng…………………………………………………..
Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
56
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM
WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM
WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON
ĐẶT VẤN ĐỀ
Đông trùng hạ thảo là tên gọi một dạng cộng sinh giữa loài nấm có tên
khoa học là Cordyceps sinensis với ấu trùng của một loại côn trùng thuộc chi
Hepialus, thường gặp nhất là sâu non của loài Hepialus armoricanus.
Là một loại nấm dược liệu quý hiếm từ lâu đã được cả thế giới biết đến,
đông trùng hạ thảo cùng tam thất, linh chi, nhân sâm tạo thành bộ tứ thần dược.
Sách y học cổ truyền Trung Quốc từ xa xưa đã coi đông trùng hạ thảo là vị
thuốc dùng để bồi bổ sức khỏe cho người và hỗ trợ điều trị hàng loạt bệnh như
bệnh tim, thận, huyết áp, tiểu đường, nhiễm khuẩn, nhiễm virus, ung thư. Mặt
khác các nghiên cứu y học cổ truyền hiện đại đều xác định đông trùng hạ thảo
hầu như không có tác dụng phụ đối với cơ thể người. Các nghiên cứu Tây y
trên thế giới đều khẳng định đông trùng hạ thảo không chỉ nâng cao hiệu quả
hệ miễn dịch còn giải độc thận, tăng cường chức năng gan, khả năng tình dục
[2]. Đông trùng hạ thảo có hơn 350 loài khác nhau tuy nhiên hai loài chính
người ta đi sâu nghiên cứu và đưa vào nuôi trồng là Cordyceps sinensis và
Cordyceps militaris [2].
Việc sử dụng ngày càng nhiều chế phẩm chứa thành phần đông trùng hạ
thảo đòi hỏi cần có các phương pháp đánh giá chất lượng chúng. Dược điển
Trung Quốc 2010 mới chỉ đưa ra chuyên luận đánh giá dược liệu đông trùng hạ
thảo Cordyceps và viên Bailing capsule với thành phần đánh giá định lượng là
adenosin [30]. Tuy nhiên loài Cordyceps militaris lại có thành phần cordycepin
khá cao chưa được đánh giá. Hiện nay tại Việt Nam chưa có phương pháp chuẩn
hóa để đánh giá chất lượng dược liệu đông trùng hạ thảo cũng như chế phẩm
chứa thành phần đông trùng hạ thảo, việc xây dựng phương pháp đánh giá hai
thành phần này trong dược liệu và chế phẩm là vô cùng cần thiết.
Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xây dựng
phương pháp định tính, định lượng đồng thời adenosin và cordycepin trong chế
Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM
WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM
WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON
phẩm chứa đông trùng hạ thảo bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”
với các mục tiêu sau:
- Xây dựng phương pháp định tính, định lượng adenosin và cordycepin
trong chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo (dạng lỏng, dạng rắn) bằng phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.
- Ứng dụng phương pháp để phân tích một số chế phẩm chứa đông trùng
hạ thảo đang lưu hành trên thị trường.
Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM
WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM
WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON
Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về đông trùng hạ thảo:
1.1.1. Đặc điểm của đông trùng hạ thảo
Đông trùng hạ thảo (Cordyceps) là một loại đông dược quý có bản chất là
dạng ký sinh của loài nấm Ophiocordyceps sinensis thuộc nhóm nấm
Ascomycetes trên cơ thể ấu trùng của một vài loài bướm trong chi Thitarodes
trước đây phân loại trong chi Hepialus.
Tên gọi “đông trùng hạ thảo” (tiếng Trung dongchungxiacao) xuất phát từ
quan sát thực tế khi thấy vào mùa hè nấm Ophiocordyceps sinensis mọc chồi
từ đầu con sâu nhô lên khỏi mặt đất. Vào mùa đông thì nhìn cặp cá thể này
giống con sâu (côn trùng), đến mùa hè thì chúng giống như một loài thực vật.
Dược liệu đông trùng hạ thảo thu hái gồm phần sâu non dài 2,5 – 3 cm, đường
kính 3 – 5 mm màu vàng nâu hay xám nâu. Sâu có 8 đôi chân, 4 đôi chân ở
giữa thân sâu là trông rõ nhất. Thân nấm hình trụ mọc ra từ đầu con sâu, thân
nấm thường dài 3 – 6 cm. Khi nấm đạt đến độ trưởng thành nhất, nó tiêu thụ
đến 99% chất dinh dưỡng từ thân sâu biến sâu thành xác khô. Nấm quả thể
thành thục sẽ phát tán các bào tử ra xung quanh. Cơ chế nhiễm nấm C. sinensis
vào sâu hiện nay chưa biết rõ. Vào mùa đông sâu bị nhiễm bào tử nấm do ăn
phải bào tử nấm hoặc qua hơi thở của sâu. Nấm phát triển bằng chất dinh dưỡng
của sâu, khi sử dụng hết chất dinh dưỡng của sâu làm sâu chết khô. Đến mùa
hè nấm phát triển thành cây mọc ra từ đầu sâu vươn ra khỏi mặt đất. Thời gian
để nấm phát triển thành dạng quả thể trong cơ thể sâu kéo dài từ các tháng mùa
đông đến cuối xuân đầu hè. Tại Trung Quốc, đông trùng hạ thảo thường gặp ở
vùng rừng ẩm ướt thuộc các tỉnh Tứ Xuyên, Vân Nam, Tây Khang, Tây Tạng
và nhiều nhất ở Tứ Xuyên và Tây Khang [2], [4].
1.1.2. Phân loại đông trùng hạ thảo
Chi nấm Cordyceps có hơn 350 loài khác nhau, riêng ở Trung Quốc đã
tìm thấy 60 loài tuy nhiên cho đến nay hai loài được nghiên cứu nhiều nhất và
Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM
WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM
WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON
đưa vào nuôi trồng là Cordyceps sinensis (Berk) Sacc. và Cordyceps militaris
(L. ex Fr) Link [2], [29], [30].
1.1.3. Thành phần hóa học trong đông trùng hạ thảo
Đông trùng hạ thảo chứa nhiều hoạt chất có hoạt tính sinh học như: các
ribonucleotid, mannitol, sterol, các acid hữu cơ, các loại đường mono- , di-,
oligosaccharid và polysaccharid, các protein, polyamin, vitamin (E, K, B1, B2,
B12…) và rất nhiều khoáng chất (K, Na, Ca, Mg, Cu, Mn, Zn, Se, Si…) trong
đó nhóm hoạt chất có tác dụng quan trọng là HEAA (hydroxyl ethyl adenosin
analogs).
a.
Các nucleotid:
Các nucleotid là một trong những thành phần có hoạt tính trong đông trùng
hạ thảo, trong đó adenosin, cordycepin được sử dụng là hoạt chất để đánh giá
chất lượng của đông trùng hạ thảo. Ngoài ra trong đông trùng hạ thảo còn nhiều
loại nucleotid khác như uridin, 2’-3’ – dideoxyadenosin (cấu trúc này được đưa
vào các hợp chất có hoạt tính antiretrovirus điều trị cho bệnh nhân nhiễm HIV
như didanosin, hydroxyethyladenosin, guanidin, deoxyguanidin…, những hoạt
chất này không thể tìm thấy ở trong các dược liệu khác trong tự nhiên.
b.
Các polysaccharid
Đây cũng là thành phần chính góp phần vào các tác dụng sinh học của
đông trùng hạ thảo. Bản đồ saccharid của dược liệu này có vai trò trong đánh
giá chất lượng. Một số monosaccharid có trong đông trùng hạ thảo như
rhamnose, ribose, arabinose, glucose, mannitol, fructose…
c.
Các sterol
Các phytosterol trong đông trùng hạ thảo (cholesterol, campesterol, β
sitosterol) đóng vai trò quan trọng trong điều trị ung thư vú, tuyến tiền liệt và
ung thư trực tràng.
d.
Các nhóm hoạt chất khác
Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM
WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM
WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON
Đông trùng hạ thảo có chứa các acid amin thiết yếu như acid glutamic,
acid aspartic, arginin… và các hợp chất kiểu polyamin như cadaverin,
spermidin, spermin…, các cyclodipeptid như cordycedipeptid A. Các hợp chất
này có hoạt tính chống viêm, chống nhiễm khuẩn, kháng virus [25], [37].
Cordycepin
Adenosin
Guanosin
Cytidin
Uridin
Thymidin
Hình 1.1. Cấu tạo một số nucleotid trong đông trùng hạ thảo [28].
1.1.4. Tác dụng của đông trùng hạ thảo
Đông trùng hạ thảo là một vị thuốc được ghi vào tài liệu thuốc đông y từ
giữa thế kỷ 18 trong bộ “bản thảo cương mục thập di” (1765). Theo tài liệu cổ,
đông trùng hạ thảo có vị ngọt, tính ôn, quy vào 2 kinh phế và thận, tác dụng ích
Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM
WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM
WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON
phế, thận, bổ tinh tủy, cầm máu, hóa đờm, dùng chữa hư lao sinh ho, ho ra máu,
liệt dương, lưng gối đau mỏi, di tinh.
a. Tác dụng tăng cường sức khỏe
Các nghiên cứu cho thấy dịch chiết cao đông trùng hạ thảo có tác dụng tăng
cường hoạt động các enzym superoxid dismutase, glutathion peroxidase và
catalase (các enzym tham gia loại bỏ gốc tự do trong cơ thể), giảm quá trình
peroxide lipid do đó có tác dụng chống lại các nhân tố có hại như căng thẳng,
tuổi tác.
b. Tác dụng miễn dịch
Các nghiên cứu thực nghiệm đã chứng minh đông trùng hạ thảo có khả năng
tăng cường hoạt động miễn dịch tế bào cũng như miễn dịch dịch thể. Cụ thể là
tác dụng nâng cao hoạt tính của đại thực bào và tế bào miễn dịch tự nhiên
(natural killer cell), điều tiết phản ứng của tế bào lympho B, tăng cường một
cách có chọn lọc hoạt tính của tế bào T ức chế, làm tăng nồng độ các kháng thể
IgG, IgM trong huyết thanh.
c. Tác dụng chống oxy hóa
Dịch chiết cao đông trùng hạ thảo cho tác dụng chống oxy hóa tương tự như
quá trình peroxide chất béo, men xanthin oxidase.
d. Tác dụng chống ung thư
Thành phần polysaccharides trong nấm đông trùng hạ thảo (cordyglucan (1 3)β – glucan) cũng như vài loài nấm khác được cho là có tác dụng ức chế khối u
do hai cơ chế: (1) trực tiếp gây độc cho tế bào ung thư; (2) gián tiếp ức chế
thông qua hệ miễn dịch tự miễn của cơ thể [9].
e. Tác dụng chống viêm
Đông trùng hạ thảo tác dụng ức chế việc sản sinh các tác nhân gây viêm như
gốc tự do NO, các cytokine TNF α và IL 12, ức chế sự mất hạt nhỏ và phát triển
của bạch cầu.
Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM
WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM
WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON
f. Tác dụng bảo vệ thận, phổi, gan
Đông trùng hạ thảo có công dụng nhanh trong việc phục hồi và làm giảm các
triệu chứng viêm thận mãn, suy thận, liệt dương, di tinh, mệt mỏi, đau lưng,
các vấn đề của đường hô hấp: ho, đờm, suyễn, viêm/ hen phế quản, lao
phổi…Tác dụng bảo vệ gan thông qua việc làm tăng hoạt tính của các men
AST, ALT, γ GTP, ALP, LDH [7], [23], [25], [37].
1.1.5. Một số chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo
Hiện nay không thể thống kê được có bao nhiêu chế phẩm chứa đông trùng hạ
thảo được bán trên thị trường. Đông trùng hạ thảo được đưa vào trong chế phẩm
một thành phần hoặc kết hợp với một số dược liệu bổ, quý hiếm khác như nhân
sâm, tam thất, tổ yến. Các dạng bào chế thường gặp là dạng rắn (viên nang,
viên hoàn, gói bột) và dạng lỏng (nước uống, cao lỏng). Có thể kể tên một vài
chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo như sau:
- Dạng rắn: viên nang Pure cordyceps capsule, viên Đông trùng hạ thảo Tenken,
bột Cordyceps extract…
- Dạng lỏng: cao lỏng đông trùng hạ thảo tam thất, nước Yến Đông trùng hạ
thảo, nước uống Đông trùng hạ thảo He Yuan Tang – King of cordyceps, nước
cốt gà Đông trùng hạ thảo…
1.2. Tổng quan về adenosin, cordycepin
1.2.1. Công thức cấu tạo, đặc điểm vật lý hóa học
Cordycepin và adenosin đều được cấu tạo bởi nhân purin liên kết với đường
ribose (ribofuranose) bằng liên kết β –N9 – glucosid [14], [33].
Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM
WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM
WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON
1.2.1.1. Cordycepin
Hình 1.2. Công thức cấu tạo cordycepin [14].
Tên khoa học: 9-(3-deoxy-β-D-ribofuranosyl) adenin
Công thức phân tử: C10H13N5O3
Trọng lượng phân tử: 251,24
Phân tử cordycepin tính kiềm, dạng bột hoặc tinh thể bông tuyết.
Điểm chảy: 228 – 231oC
Độ tan: tan trong DMSO, methanol, ethanol
Bước sóng hấp thụ cực đại 259,0 nm [14].
1.2.1.2. Adenosin
Hình 1.3. Công thức cấu tạo adenosin [8].
Tên khoa học: 9 - β-D-ribofuranosyl adenin
Công thức phân tử: C10H13N5O4
Trọng lượng phân tử: 267,24
Adenosin dạng bột tinh thể màu trắng.
Nhiệt độ nóng chảy: 234 – 235oC.
Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM
WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM
WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON
Độ tan:
Bảng 1.1. Độ tan của adenosin trong một số dung môi [8].
Dung môi
Nước
Methanol
Ethanol
1 – propanol
2 – propanol
1- butanol
Ethylen glycol
Phổ hấp thụ UV:
Độ tan (mg/ml)
5
6
13
20
13
9
8
Trong dung dịch nước, HCl 0,1N, NaOH 0,1N adenosin có phổ hấp thụ UV
tương tự nhau, bước sóng hấp thụ cực đại 259 nm với ε = 15185 [8].
1.2.2. Dược động học cordycepin và adenosin
Cordycepin là chất cấu tạo tương tự adenosin nên có con đường chuyển
hóa tương tự. Khi nghiên cứu dùng adenosin cho động vật có vú, ở bên ngoài
tế bào, adenosin nhanh chóng bị loại nhóm amin bởi men adenosin deaminase
trong huyết tương tạo thành hypoxanthinosin, mặt khác sau khi vận chuyển vào
trong tế bào, adenosin được phosphoryl hóa bởi adenosin kinase tạo thành ATP.
Nếu tế bào không cần dùng adenosin, nó sẽ tiếp tục được loại nhóm amin bởi
adenosin deaminase trong tế bào. Dạng hypoxanthinosin không hoạt tính được
tiếp tục biến đổi tạo acid uric thải trừ qua thận. Tương tự như vậy, cordycepin
cũng nhanh chóng bị loại nhóm amin bởi men adenosin deaminase tạo
hypoxanthinosin [28].
Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM
WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM
WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON
Hình 1.4. Con đường chuyển hóa của adenosin ở động vật có vú [28].
1.2.3. Tác dụng của cordycepin, adenosin
a. Tác dụng của cordycepin
* Ức chế sinh tổng hợp purin, ADN/ARN và tín hiệu mTOR
Khi vào trong tế bào, cordycepin chuyển hóa thành dạng 5’ mono, di và
tri phosphate ức chế các enzyme như ribose phosphate pyrophosphokinase và
5 – phosphoribosyl – 1 – pyrophosphate amidotransferase trong tổng hợp purin.
Do cấu trúc gần giống adenosin nên trong quá trình phiên mã tổng hợp ARN,
enzyme kết hợp cordycepin, gây rối loạn tổng hợp ARN. Các nghiên cứu cũng
chỉ ra cordycepin có thể hoạt hóa AMP activated kinase, do đó ức chế di truyền,
sinh trưởng phát triển tế bào [17].
* Tác dụng chống sự di căn
Sự di căn thông thường là sự tách tế bào ung thư khỏi vị trí ban đầu, xâm
lấn vào các khối ngoại bào khác. Cordycepin có tác dụng ức chế các enzyme
metalloproteinase (bản chất là endopeptidase phụ thuộc kẽm và calci, vai trò
chính trong phân hủy tổ chức ngoại bào) [10].
* Tác dụng chống viêm
Phản ứng viêm là phản ứng có liên quan đến quá trình ung thư. Các tế
bào ung thư sinh nhiều cytokine, chemokine và các receptor của chúng, các
Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM
WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM
WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON
chất này gây ra phản ứng viêm. Cordycepin được cho rằng làm giảm các tác
nhân gây viêm như NO, PGE2, TNF α và IL 1β [33].
* Tác dụng giảm đường huyết:
Li Ma và cộng sự nghiên cứu tác dụng cordycepin trên chuột gây tiểu
đường bởi alloxan. Kết quả cho thấy cordycepin không làm tăng nồng độ
insulin trong máu nhưng làm giảm hàm lượng glucose máu thông qua tác dụng
làm tăng nồng độ glycogen tại gan. Đồng thời cordycepin có tác dụng bảo vệ
thận và giảm chấn thương lách do tiểu đường [22].
b. Tác dụng của adenosin
* Tác dụng chống viêm
Adenosin được chứng minh là một chất có khả năng kháng viêm tại thụ
thể của adenosin A2A. Nồng độ adenosin ngoại bào ở tế bào bình thường khoảng
300 nM. Tuy nhiên khi tế bào bị tổn thương nồng độ này nhanh chóng nâng lên
600 – 1200 nM.
* Tác dụng trên tim
Adenosin trực tiếp kiểm soát các chức năng mô tim, tác dụng giãn mạch
vành, giãn mạch ngoại biên, giảm lực co cơ tim, ức chế nút xoang và dẫn truyền
nút nhĩ thất. Adenosin được dùng làm thuốc điều trị rối loạn nhịp tim.
* Tác dụng trên phổi, thần kinh trung ương
Adenosin có khả năng điều chỉnh chức năng các tế bào có liên quan đến
bệnh viêm đường hô hấp như bạch cầu, tế bào lympho… Ngoài ra adenosin có
tác dụng tốt đối với một số bệnh rối loạn thần kinh như thiếu máu cục bộ, thoái
hóa thần kinh…[11], [27].
1.3. Phương pháp xác định cordycepin và adenosin
1.3.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng
MA King Wah và các cộng sự đã tiến hành xác định cordycepin và 7
nucleoside khác trong Cordycepin sinensis bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng
sử dụng kỹ thuật rửa giải gradient. Dịch chiết nước của 11 sản phẩm chứa đông
Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM
WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM
WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON
trùng hạ thảo được phân tích trên bản mỏng silicagel GF254 được xử lý bằng
hỗn hợp Na2HPO4 0,05M : carboxymethyl cellulose (4 : 1) sau đó đặt vào tủ
sấy 8 phút ở 60oC để hoạt hóa. Dung môi triển khai là hỗn hợp cloroform:
ethylacetat : isopropanol : nước (8 : 2 : 6 : 0,6 theo thể tích) với 2 giọt amoniac
cho mỗi 10 ml hỗn hợp. Quãng đường triển khai dung môi 18 cm, chạy lượt hai
9 cm trong hỗn hợp dung môi cloroform : ethylacetat : isopropanol : nước :
dimethylfomamid (10 : 2 : 8 : 0,5 : 2 theo thể tích), phát hiện chất phân tích tại
bước sóng 254 nm. Phương pháp cho độ thu hồi cordycepin 98,09%, độ thu hồi
của adenosin là 97,88% [21].
1.3.2. Phương pháp đo màu
Nicholas M. Kredich và Armand J. Guarino đã nghiên cứu chỉ ra phương
pháp đo màu định lượng cordycepin sử dụng thuốc thử anthron để tạo hợp chất
có màu đỏ cherry. 5,0 ml thuốc thử anthron (0,2 g anthron trong 100 ml H2SO4
90%) phản ứng với 1,0 ml dung dịch thử có lượng cordycepin từ 1 – 135 μg/ml,
trộn đều và đặt trong nước đá. Mẫu trắng tiến hành tương tự thay 1,0 ml nước
cho 1,0 ml dung dịch thử. Sau đó các ống nghiệm được đặt trên cách thủy 100 oC
trong 10 phút, làm nguội, đo màu bằng thiết bị đo màu sử dụng kính lọc số 52,
hỗn hợp màu tạo thành bền sau vài giờ phản ứng [15].
Hình 1.5. Phổ hấp thụ hỗn hợp màu được tạo thành với thuốc thử anthron của
cordycepin, adenosin, glucose và deoxyadenosin [15].
Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM
WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM
WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON
1.3.3. Phương pháp điện di mao quản
Yerra Koteswara Rao và cộng sự đã định tính và định lượng cordycepin
trong Cordyceps militaris bằng phương pháp điện di mao quản với điều kiện:
dung dịch đệm borat 0,02 M với 28,6% methanol, pH = 9,5, điện thế 20 kV,
nhiệt độ 25oC, bước sóng 254 nm. Đường chuẩn xây dựng từ 20 – 100 μg/ml,
độ thu hồi từ 82% đến 107% [24].
1.3.4. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR
Seul Gi Lee và cộng sự đã định lượng cordycepin trong Cordyceps
militaris bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân, sử dụng chất chuẩn
nội muối natri của acid 3 – (trimethylsilyl) – propionic – 2,2,3,3 – d4. Các tác
giả so sánh phương pháp định lượng này với phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao, kết quả cho thấy không có sự khác biệt kết quả định lượng cordycepin
giữa 2 phương pháp này [18].
1.3.5. Phương pháp sắc ký lỏng
Bảng 1.2. Một số phương pháp sắc ký lỏng phân tích adenosin, cordycepin.
Cột
Pha động
C18 (250 x Đệm phosphat pH 6,5 :
4,6 mm)
methanol (17 :3)
C18 (250 x Methanol (A) và Nước (B)
4,6 mm)
0 – 2 phút: 100 – 85% B; 2
– 5 phút: 85 – 70% B; 5 –
10 phút: 70 – 55% B; 10 –
12 phút: 55 – 85% B; 12 –
15 phút: 85 – 100% B
Eclipse
A: dung dịch NaH2PO4
XDB-C18 0,02M và Na2HPO4 0,02 M
(250 x 4,6 B: methanol
mm, 5 µm) 0 – 5 phút: 0% A
5 – 15 phút: 0 – 5% A
15 – 40 phút: 5 – 40% A
40 – 50 phút: 40% A
Shimadzu
A: dung dịch amoni acetat
VP-ODS
0,04M pH 5,2
B: methanol
Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
Tốc độ dòng Detector TLTK
1,0 ml/phút UV 260 [31]
nm
1,0 ml/phút UV 260 [1]
nm
1,0 ml/phút
UV
nm
260 [32]
0,2 ml/phút
ESI-MS
[34]
+
[M + H]
tại
m/z
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM
WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM
WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON
150 x 2,0 0 – 6 phút: 85% A
127, 136,
mm
6 – 12 phút: 85 – 80% A
268, 252
12 – 17 phút: 80% A
và 302
17 – 20 phút: 95% A
ProtoSIL
Methanol : H2O (20 : 80)
1,0 ml/phút UV 254
250 x 4,6
nm
mm, 5 µm
Waters
Methanol : H2O (8 : 92)
1,0 ml/phút UV 254
Sheild RP
nm
18 (150 x
4,6 mm, 5
µm)
Eclipse
A: nước có 0,1% acid 0,8 ml/phút UV 260
XDB-C18 acetic
nm
(150 x 4,6 B: acetonitril có 0,1% acid
mm, 5 µm) acetic
0 – 2,5 phút: 2% B
2,5 – 12,5 phút: 2 – 12% B
2,5 – 14 phút: 12 – 96% B.
C18 (150 x Methanol : H2O (30 : 70)
0,5 ml/phút UV 260
4,6 mm, 5
nm
µm)
Zorbax
A: H2O
1,0 ml/phút UV 260
300SB–
B: Methanol
nm
C18 250 x 0 – 3 phút: 2% B
4,6 mm, 5 3 – 10 phút: 2 – 10% B
µm
10 – 22 phút: 10 – 22% B
22 – 30 phút: 22% B
30 – 40 phút: 22 - 100% B
40 – 41 phút: 100 – 2% B
41 – 50 phút: 2% B
Theo dược điển Trung Quốc 2010, dược liệu đông trùng
[16]
[12]
[26]
[32]
[35]
hạ thảo được
đánh giá hàm lượng adenosin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Dược liệu được chiết tách bằng đun hồi lưu 30 phút trong dung môi methanol
90%. Chuyên luận yêu cầu hàm lượng adenosin không ít hơn 0,01% đối với
dược liệu khô kiệt [31].
Jian – Ping Yuan và cộng sự đã tiến hành định lượng 7 nucleosid và 7
nucleobase trong một số loài nấm bằng phương pháp sắc ký lỏng detector PAD.
Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM
WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM
WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON
Phương pháp sử dụng pha động gradient với hai thành phần A (methanol) và B
(đệm phosphat: natri dihydro phosphat 0,02M và dinatri hydro phosphat
0,02M). Đường chuẩn xây dựng 5 – 300 μg/ml. Giới hạn phát hiện và giới hạn
định lượng của cordycepin và adenosin là 0,01 μg/ml và 0,03 μg/ml. Độ thu hồi
của phương pháp đối với cordycepin là 98,3%, với adenosin là 100,6% [36].
Jian – Wei Xie và cộng sự đã tiến hành định lượng các nucleosid chính trong
Cordyceps sinensis (thymin, adenine, adenosin, cordycepin) bằng phương pháp
sắc ký lỏng khối phổ LC/ESI – MS. Phương pháp sử dụng pha động A (amoni
acetat 0,04M pH 5,2) và B (methanol). Đường chuẩn cordycepin xây dựng từ
0,5 – 107,5 μg/ml, adenosin 0,6 – 114,0 μg/ml . Độ thu hồi của cordycepin 99,3
– 104,0%, độ thu hồi adenosin 98,0 – 101,5% [34].
Lei Huang và đồng nghiệp đã nghiên cứu, tối ưu hóa điều kiện phân tích
adenosin và cordycepin trong dược liệu ĐTHT loài C. sinensis và C. militaris.
Phương pháp cho kết quả pha động tối ưu methanol và nước tỷ lệ 92 : 8, bước
sóng phát hiện 254 nm. Đường chuẩn của cordycepin được xây dựng từ 2,85
đến 130 μg/ml, của adenosin từ 2,50 – 120 μg/ml, giới hạn phát hiện cordycepin
là 0,25 μg/ml, của adenosin là 0,30 μg/ml [12].
Jiang – Feng Song cùng đồng nghiệp đã nghiên cứu tối ưu cách chiết xuất
cordycepin từ loài Cordyceps militaris bằng phần mềm tối ưu hóa, phân tích
bằng phương pháp sắc ký lỏng. Pha động sử dụng A (nước có 0,1% acid acetic)
và B (acetonitril có 0,1% acid acetic) theo tỷ lệ gradient. Kết quả tối ưu hóa
chiết xuất cho điều kiện chiết: dung môi chiết ethanol 20,21%, thời gian chiết
101,88 phút, tỷ lệ dung môi chiết/dược liệu: 33,13 ml/g [26].
Li Yu và đồng nghiệp đã nghiên cứu định lượng đồng thời 11 nucleosid
trong dược liệu ĐTHT được thu hái tại Trung Quốc. Pha động sử dụng dung
môi methanol và nước theo chương trình gradient. Mẫu dược liệu được chiết
tách bằng dung môi methanol 70% theo phương pháp siêu âm 15 phút ở nhiệt
Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM
WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM
WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON
độ phòng. Giới hạn phát hiện của phương pháp đối với adenosin và cordycepin
là 0,057 và 0,099 µg/ml [35].
1.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
1.4.1. Nguyên lý chung của sắc ký lỏng
Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn
và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn). Mẫu phân tích được chuyển lên
cột tách dưới dạng dung dịch. Cơ chế của quá trình sắc ký lỏng là hấp phụ, phân
bố, trao đổi ion hay loại trừ theo kích cỡ.
Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao, mẫu phân tích được tiêm qua buồng
tiêm và được đi vào cột nhờ pha động, các thành phần trong mẫu phân tích
được tách ra trên pha tĩnh chứa trong cột rồi đi qua detector để phát hiện và cho
các tín hiệu được ghi trên sắc đồ.
a. Pha tĩnh trong sắc ký lỏng
Pha tĩnh hay dùng nhất trong sắc ký lỏng hiệu năng cao là pha tĩnh mà
trong đó các nhóm silanol trên bề mặt hạt silicagel (chất mang) đã được liên
kết với các nhóm hóa học khác nhau tạo nên các hợp chất siloxan có độ phân
cực khác nhau tùy theo nhóm liên kết:
- Si-O-Si -R
Khi R là các nhóm ít phân cực như octyl (C8), octadecyl (C18), phenyl
và pha động phân cực, ta có sắc ký pha đảo (RP-HPLC).
Khi R là nhóm khá phân cực như alkylamin hay alkylnitril, pha động là
dung môi ít phân cực, ta có sắc ký pha thuận (NP-HPLC). Hiện nay, kỹ thuật
RP-HPLC được sử dụng rộng rãi vì tách tốt được nhiều hợp chất khác nhau,
thành phần chính của pha động là nước nên rất kinh tế. Cột thông dụng là cột
ODS (RP18), C8 với cỡ hạt 5 hay 10m. Để cải thiện khả năng tách, tiết kiệm
dung môi và thời gian, gần đây người ta đã đưa sắc ký lỏng nhanh (UPLC) vào
Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM
