Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời adenosin và cordycepin trong chế phẩm TPCN dạng bột chứa đông trùng hạ thảo

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI


HÀ THỊ MAI HẠNH
XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH
LƢỢNG ĐỒNG THỜI ADENOSIN VÀ
CORDYCEPIN TRONG CHẾ PHẨM
TPCN DẠNG BỘT CHỨA
ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
HÀ NỘI - 2015
BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI



HÀ THỊ MAI HẠNH


XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH
LƢỢNG ĐỒNG THỜI ADENOSIN VÀ
CORDYCEPIN TRONG CHẾ PHẨM
TPCN DẠNG BỘT CHỨA
ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Ngƣời hƣớng dẫn:
1. PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh
2. DS. Nguyễn Thị Quế Mai

Nơi thực hiện:
Viện thực phẩm chức năng (VIDS)
HÀ NỘI - 2015



LỜI CẢM ƠN
Sau thời gian thực hiện đề tài với nhiều nỗ lực và cố gắng, thời điểm hoàn thành
khóa luận là lúc tôi xin phép bày tỏ lòng biết ơn của mình tới những ngƣời đã nhiệt
tình dạy dỗ, giúp đỡ tôi trong thời gian qua.
Trƣớc hết tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS.
Nguyễn Thị Kiều Anh, ngƣời đã giao đề tài và tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong
suốt quá trình thực hiện khóa luận này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn DS. Nguyễn Thị Quế Mai đã định hƣớng cho
tôi trong quá trình tìm tài liệu cũng nhƣ hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn cán bộ, công nhân viên Viện thực phẩm chức năng
(VIDS) đã tạo mọi điều kiện thuận lợi đề tôi hoàn thành đề tài.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trƣờng, các phòng ban,
cùng các giảng viên, nhân viên bộ môn Hóa phân tích – Độc chất và các bộ môn khác
trong Trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại
trƣờng.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã quan tâm động viên
tôi trong quá trình học tập và hoàn thiện khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 08 tháng 05 năm 2015
Sinh viên

Hà Thị Mai Hạnh

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN 2
1.1. Tổng quan về Đông trùng hạ thảo: 2
1.1.1. Đặc điểm của Đông trùng hạ thảo 2
1.1.2. Phân loại Đông trùng hạ thảo 2
1.1.3. Thành phần hóa học Đông trùng hạ thảo 2
1.1.4. Tác dụng Đông trùng hạ thảo 4
1.2. Tổng quan về adenosin, cordycepin 6
1.2.1. Công thức cấu tạo, đặc điểm vật lý hóa học 6
1.2.2. Dƣợc động học cordycepim và adenosin 6
1.2.3. Tác dụng của cordycepin, adenosine 7
1.3. Phƣơng pháp xác định cordycepin và adenosine 8
1.3.1. Một số nghiên cứu định lƣợng adenosin và cordycepin bằng phƣơng
pháp HPLC 8
1.3.2. Các nghiên cứu định lƣợng adenosin và cordycepin bằng phƣơng pháp
khác 12
1.4. Đại cƣơng về phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 13
1.4.1. Nguyên lý và các thông số đặc trƣng của sắc ký lỏng 13
1.4.2. Cấu tạo của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao 14
1.4.3. Ứng dụng 15
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị: 18
2.1.1. Thiết bị - dụng cụ 18
2.1.2. Hóa chất, dung môi 18

2.2. Nội dung nghiên cứu 18
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 19
2.3.1. Xử lý mẫu 19
2.3.2. Khảo sát chọn điều kiện sắc ký: 20
2.3.3. Thẩm định phƣơng pháp phân tích 21
2.3.4. Ứng dụng trên một số chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo 22
2.3.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu 22
Chƣơng 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23
3.1. Chuẩn bị mẫu 23
3.2. Lựa chọn điều kiện sắc ký 24
3.2.1. Khảo sát lựa chọn bƣớc sóng phát hiện 24
3.2.2. Khảo sát và lựa chọn pha động 25
3.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu 26
3.3.1. Khảo sát dung môi chiết 27
3.3.2. Khảo sát phƣơng pháp chiết 27
3.3.3. Khảo sát nhiệt độ chiết 28
3.3.4. Khảo sát thời gian chiết 29
3.3.5. Khảo sát số lần chiết 30
3.3.6. Điều kiện tối ƣu của quá trình xử lý mẫu 31
3.4. Thẩm định phƣơng pháp phân tích 32
3.4.1. Độ đặc hiệu 32
3.4.2. Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính và lập đƣờng chuẩn 33
3.4.3. Độ lặp lại 34
3.4.4. Độ đúng 35
3.5. Ứng dụng định lƣợng trên một số chế phẩm thực phẩm chức năng dạng bột
chứa Đông trùng hạ thảo. 36
3.6. Bàn luận 37
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42
PHỤ LỤC 45


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt
Tiếng Anh hoặc tên khoa học
Tiếng Việt
ACN
Acetonitril

AOAC
Association of Official Analytical
Chemists
Hiệp hội các nhà Hóa
phân tích
CE
Capillary electrophoresis
Điện di mao quản
DD

Dung dịch
DMSO
Dimethyl sulfoxide

ĐTHT

Đông trùng hạ thảo
EtOH
Ethanol

HL

Hàm lƣợng
HPLC
High Performance Liquid
Chromatography
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
MeOH
Methanol

MS
Mass spectrometry
Khối phổ
PDA
Photo diode array
Dãy diod quang
ppm
Parts per million
Phần triệu
r

Hệ số tƣơng quan
RSD
Relative standard deviation
Độ lệch chuẩn tƣơng đối
SOD
Superoxide Dismutase

SD

Standard deviation
Độ lệch chuẩn
TLC
Thin layer chromatography
Sắc ký lớp mỏng
UV
Ultraviolet
Tử ngoại
VIS
Visible
Khả kiến





DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Một số phƣơng pháp nghiên cứu xác định adenosine và cordycepin. 9
Bảng 2.1. Các hóa chất dung môi sử dụng trong quá trình thí nghiệm. 18
Bảng 3.1. Cách pha dãy dung dịch chuẩn 23
Bảng 3.2. Khảo sát thành phần pha động 26
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát chƣơng trình gradient 1, 2, 3 26
Bảng 3.4. Khảo sát số lần chiết 30
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ tuyến tính giữa nồng độ adenosin, cordycepin và
diện tích pic 33
Bảng 3.6. Kết quả đánh giá độ lặp lại của phƣơng pháp 35
Bảng 3.7. Kết quả đánh giá độ thu hồi adenosin và cordycepin của phƣơng pháp 36
Bảng 3.8. Kết quả phân tích các mẫu TPCN chứa Đông trùng hạ thảo đƣợc gửi tới
Viện TPCN 37

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Công thức cấu tạo một số nucleosid trong Đông trùng hạ thảo. 3
Hình 1.2. Công thức cấu tạo adenosin. 6
Hình 1.3. Công thức cấu tạo cordycepin 6
Hình 1.4. Con đƣờng chuyển hóa của adenosin ở động vật có vú 7
Hình 1.5. Sơ đồ cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao. 14
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình xử lý mẫu dự kiến 20
Hình 3.1. Phổ hấp thụ của adenosin 25
Hình 3.2. Phổ hấp thụ của cordycepin 25
Hình 3.3. Kết quả khảo sát dung môi chiết 27
Hình 3.4. Kết quả khảo sát phƣơng pháp chiết 28
Hình 3.5. Khảo sát nhiệt độ chiết 29
Hình 3.6. Khảo sát thời gian chiết 30
Hình 3.7. Quy trình phân tích mẫu thực 31
Hình 3.8. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn adenosin và cordycepin 32

Hình 3.9. Sắc ký đồ của mẫu trắng 32
Hình 3.10. Đƣờng chuẩn của adenosin ( nồng độ 1–40 µg/mL) 34
Hình 3.11. Đƣờng chuẩn của cordycepin ( nồng độ 1–40 µg/mL) 34







1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Đông trùng hạ thảo là một loại dƣợc liệu quý hiếm có từ rất lâu trên thế giới,
sách y học cổ truyền Trung Quốc từ xa xƣa đã coi Đông trùng hạ thảo là vị thuốc “cải
lão hoàn đồng”, “hồi xuân sinh lực”. Mặt khác, các nghiên cứu y học cổ truyền hiện
đại đều xác định Đông trùng hạ thảo hầu nhƣ không có tác dụng phụ đối với cơ thể
ngƣời. Trong Đông trùng hạ thảo có nhiều loại nucleosid, đây là thành phần có hoạt
tính chính, trong đó có adenosin và cordycepin là hai thành phần có vai trò quan
trọng trong quá trình chuyển hóa năng lƣợng của cơ thể nhƣ: giúp cải thiện tuần hoàn
ngoại biên và tim mạch, cải thiện năng lƣợng cơ bắp, giảm sinh trƣởng của tế bào
xấu, tăng lƣợng oxy trong máu… Vì vậy, trên thị trƣờng càng ngày càng có nhiều các
dòng sản phẩm Thực phẩm chức năng chứa loài dƣợc liệu quý hiếm này để phục vụ
cho nhu cầu chăm sóc sức khỏe của ngƣời dân.
Với việc sử dụng ngày càng nhiều các sản phẩm chứa Đông trùng hạ thảo đòi
hỏi có các phƣơng pháp đánh giá chất lƣợng của chúng bởi trên thực tế các sản phẩm
này có giá thành rất đắt nhƣng khi phân tích, chất lƣợng rất khác nhau. Trong Dƣợc
điển Trung Quốc đã đƣa ra chuyên luận đánh giá dƣợc liệu Đông trùng hạ thảo
Cordyceps sinensis với thành phần adenosin, nhƣng thành phần cordycepin chƣa
đƣợc đánh giá. Vì vậy việc xây dựng phƣơng pháp định lƣợng hai thành phần này

trong Thực phẩm chức năng chứa Đông trùng hạ thảo là vô cùng cần thiết.
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu để tài: “Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng
đồng thời adenosine và cordycepin trong chế phẩm TPCN dạng bột chứa Đông
trùng hạ thảo” nhằm góp phần kiểm soát chất lƣợng chế phẩm chứa Đông trùng hạ
thảo với các mục tiêu sau:
1. Xây dựng phương pháp định lượng adenosin và cordycepin trong chế phẩm
Thực phẩm chức năng dạng bột chứa Đông trùng hạ thảo bằng sắc ký lỏng hiệu
năng cao.
2. Ứng dụng phương pháp để phân tích một số chế phẩm Thực phẩm chức năng
dạng bột chứa Đông trùng hạ thảo lưu hành trên thị trường.

2

Chƣơng 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về Đông trùng hạ thảo:
1.1.1. Đặc điểm của Đông trùng hạ thảo
Nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps) đƣợc các nhà khoa học Trung Quốc xác
định mới đầu xuất hiện từ vùng núi cao nguyên Tây Tạng. Đây là loại đông dƣợc
quý hiếm có bản chất là dạng ký sinh của loài nấm Ophiocordyceps sinensisthuộc
nhóm nấm Ascomycetes trên cơ thể ấu trùng của một vài loài bƣớm trong chi
Thitarodes trƣớc đây phân loại trong chi Hepialus [32].
Tên gọi “ Đông trùng hạ thảo” (tiếng Trung: dongchungxiacao) là xuất phát từ
quan sát thực tế khi thấy vào mùa đông thì nhìn cặp cá thể này giống con sâu (côn
trùng), đến mùa hè thì chúng giống nhƣ một loài thực vật. Vào mùa đông sâu bị
nhiễm bào tử nấm do ăn phải bào tử nấm hoặc qua hơi thở của sâu. Đến khi sợi nấm
phát triển mạnh, chúng xâm nhiễm vào các mô của vật chủ, khi nấm đạt đến độ
trƣởng thành nhất, nó tiêu thụ đến 99% chất dinh dƣỡng từ thân sâu biến sâu thành
xác khô. Nấm quả thể thành thục sẽ phát tán các bào tử ra xung quanh. Thời gian để
nấm phát triển thành dạng quả thể kéo dài trong cơ thể sâu cả các tháng mùa đông
đến cuối xuân đầu hè, đến mùa hè nấm phát triển thành dạng cây và phát tán bào tử

[32].
Tại Trung Quốc, ĐTHT thƣờng gặp ở những rừng ẩm ƣớt các tỉnh Tứ Xuyên,
Vân Nam, Tây Khang, Tây Tạng, nhiều nhất ở Tứ Xuyên và Tây Khang [13].
1.1.2. Phân loại Đông trùng hạ thảo
Chi nấm Cordyceps có hơn 350 loài khác nhau, riêng ở Trung Quốc đã tìm
thấy 60 loài tuy nhiên cho đến nay hai loài đƣợc nghiên cứu nhiều nhất và đƣa vào
nuôi trồng là Cordyceps sinensis (Berk) Sacc. và Cordyceps militaris (L. ex Fr)
Link.
1.1.3. Thành phần hóa học Đông trùng hạ thảo
ĐTHT chứa nhiều hoạt chất có hoạt tính sinh học nhƣ : các nucleosid; sterol;
các acid hữu cơ; các loại đƣờng mono- , di-, oligosaccharid và polysaccharid; các
protein; polyamin; vitamin và rất nhiều khoáng chất.
3

Các nucleosid:

Guanosin

Uridin

Cytisin


Thymidin
Hình 1.1. Công thức cấu tạo một số nucleosid trong Đông trùng hạ thảo[30].
Các nucleosid là một trong những thành phần có hoạt tính trong ĐTHT, trong
đó adenosin, cordycepin đƣợc sử dụng là hoạt chất để đánh giá chất lƣợng của
ĐTHT. Có hơn 10 loại nucleosid và các chất tƣơng tự đƣợc tìm thấy trong ĐTHT tự
nhiên hay nuôi trồng nhƣng hàm lƣợng khác nhau [16]. Một nghiên cứu cho thấy
nồng độ adenosin đƣợc tìm thấy trong ĐTHT nuôi trồng cao gấp 6 lần so với tự

nhiên [32].
Các polysaccharid
ĐTHT chứa một lƣợng lớn polysaccarid, có thể chiếm khoảng 3 -8% [32].
Một số monosaccharid có trong ĐTHT nhƣ rhamnose, ribose, arabinose…Nghiên
cứu của Guoqinh Zhang và cộng sự [29] cho thấy các polysaccharid trong ĐTHT có
hiệu quả trong việc điều tiết đƣờng trong máu.


4

Các sterol
Có nhiều loại phytosterol trong ĐTHT nhƣ: cholesterol, ergosterol,
campesterol, β sitosterol… Trong đó ergosterol có hoạt tính quan trọng, có tác dụng
chống virus, chống loạn nhịp. Nồng độ của ergosterol trong ĐTHT nuôi trồng của
C.Militaris rất cao, chỉ thấp hơn so với ĐTHT tự nhiên ở Tây Tạng và cao hơn ở
Thanh Hải và Tứ Xuyên [32].
Protein và acid amin
ĐTHT có chứa 17 acid amin thiết yếu nhƣ acid glutamic, acid aspartic,
arginin… và các hợp chất kiểu polyamin nhƣ cadaverin, spermidin, spermin…, các
cyclodipeptid nhƣ cordycedipeptid A. Các hợp chất này có hoạt tính chống viêm,
chống nhiễm khuẩn, kháng virus [32].
Acid hữu cơ và khoáng chất
Acid hữu cơ là thành phần chính của chất béo, phospholipid và glycolipid;
chúng đƣợc phân loại thành acid béo bão hòa hay không bão hòa. Các acid béo
không bão hòa có chức năng: làm giảm lipid máu và chống lại bênh tim mạch.
Đồng thời ĐTHT còn chứa nhiều khoáng chất (K, P, Mg, Ca, B, Mo, Mn, Cd,
Pb, Se, Ni, Si…). Các nguyên tố Zn, Mg, Mn có ý nghĩa rất lớn đến sự phát triển và
duy trì chức năng của tuyến sinh dục [32].
Các nhóm hợp chất khác
Trong ĐTHT có các vitamin cần thiết cho cơ thể nhƣ vitamin B

12
, vitamin A,
vitamin C, ngoài ra còn có vitamin B
2
, vitamin E, vitamin K…
Ngoài ra còn có các hợp chất hydrocacbon, alcohol và aldehyd…
1.1.4. Tác dụng Đông trùng hạ thảo
ĐTHT là một vị thuốc đƣợc ghi vào tài liệu thuốc đông y vào giữa thế kỷ 18
trong bộ “bản thảo cƣơng mục thập di” (1765). Theo tài liệu cổ, ĐTHT có vị ngọt,
tính ấm quy vào 2 kinh phế và thận, có công năng dƣỡng phế, bổ thận, ích tinh đƣợc
dùng để trị phế hƣ khái xuyễn, liệt dƣơng, di tinh, đau lƣng mỏi gối.


5

Tác dụng chống oxy hóa, tăng cường sức khỏe
ĐTHT chứa nhiều chất chống oxy hóa cao, làm chậm quá trình lão hóa của cơ
thể [27].
Tác dụng chống ung thư
Các nghiên cứu lâm sàng đƣợc tiến hành tại Trung Quốc và Nhật Bản cho thấy
ĐTHT có tác dụng làm giảm kích thƣớc của khối u và chống lại ung thƣ [8].
Nâng cao khả năng miễn dịch
Các nghiên cứu thực nghiệm đã chứng minh ĐTHT có khả năng tăng cƣờng
hoạt động miễn dịch tế bào cũng nhƣ miễn dịch dịch thể. Cụ thể là tác dụng nâng
cao hoạt tính của đại thực bào và tế bào NK, điều tiết phản ứng của tế bào lympho
B, tăng cƣờng một cách có chọn lọc hoạt tính của tế bào T ức chế, làm tăng nồng độ
các kháng thể IgG, IgM trong huyết thanh [8].
Tác dụng chống viêm
ĐTHT tác dụng tăng sản xuất interleukin-10, giảm sản xuất interleukin-2, làm
tăng bạch cầu đơn nhân trong máu ngoại vi nên có tác dụng chống viêm, ức chế sự

mất hạt nhỏ [10], [31].
Tác dụng đối với hệ thống tuần hoàn tim, não
ĐTHT có tác dụng làm giãn mạch máu, làm tăng lƣu lƣợng tuần hoàn não và
tim, thông qua cơ chế hƣng phấn thực thể M ở cơ trơn thành mạch. Mặt khác ĐTHT
còn có khả năng điều chỉnh lipid máu, làm giảm lƣợng cholesterol và lipoprotein,
hạn chế quá trình tiến triển của tình trạng xơ vữa động mạch.
Tác dụng đối với thận, phổi, gan
ĐTHT có tác dụng đối với bệnh mãn tính: viêm gan mãn tính và các bệnh liên
quan đến gan, viêm thận mãn, suy thận, viêm khớp dạng thấp, hen suyễn [31].
Ở Trung Quốc, ĐTHT đƣợc sử dụng để bảo vệ phổi, thận, điều trị các bệnh hô
hấp, rối loạn chức năng thận, các bệnh về gan, bồi bổ cho ngƣời bị suy nhƣợc, mệt
mỏi.


6

1.2. Tổng quan về adenosin, cordycepin
1.2.1. Công thức cấu tạo, đặc điểm vật lý hóa học
Cordycepin và adenosin đều đƣợc cấu tạo bởi nhân purin liên kết với đƣờng
ribose (ribofuranose) bằng liên kết β –N9 – glucoside [23].

Hình 1.2. Công thức cấu tạo adenosin.
Tên khoa học:
9 - β-D-ribofuranosyl adenin
Công thức phân tử: C
10
H
13
N
5

O
4
Trọng lƣợng phân tử: 267,24g/mol
Điểm chảy: 234 – 235
o
C
Độ tan: tan tốt trong nƣớc, DMSO,
tan không đáng kể trong ethanol.



Hình 1.3. Công thức cấu tạo cordycepin
Tên khoa học:
9-(3-deoxy-β-D-ribofuranosyl) adenin
Công thức phân tử: C
10
H
13
N
5
O
3
Trọng lƣợng phân tử: 251,24g/mol
Phân tử cordycepin tính kiềm, dạng bột
hoặc tinh thể bông tuyết.
Điểm chảy: 228 – 231
o
C
Độ tan: tan trong DMSO, methanol,
ethanol.

Bƣớc sóng hấp thụ cực đại 259 nm.

1.2.2. Dược động học cordycepim và adenosin
Vì cấu tạo tƣơng tự nhau nên adenosin và cordycepin có con đƣờng chuyển
hóa tƣơng tự. Khi nghiên cứu dùng adenosin cho động vật có vú, ở bên ngoài tế
bào, adenosin nhanh chóng bị loại nhóm amin bởi men adenosindeaminase trong
huyết tƣơng tạo thành hypoxanthinosin, mặt khác sau khi vận chuyển vào trong tế
bào, adenosin đƣợc phosphoryl hóa bởi adenoinkinase tạo thành ATP. Nếu tế bào
7

không cần dùng adenosin, nó sẽ tiếp tục đƣợc loại nhóm amin bởi
adenosindeaminase trong tế bào. Dạng hypoxanthinosin không hoạt tính đƣợc tiếp
tục biến đổi tạo acid uric thải trừ qua thận [18].
Tƣơng tự nhƣ vậy, cordycepin cũng nhanh chóng bị loại nhóm amin bởi men
adenosin deaminase tạo hypoxanthinosin [7].

Hình 1.4. Con đường chuyển hóa của adenosin ở động vật có vú [18]
1.2.3. Tác dụng của cordycepin, adenosine
Tác dụng của cordycepin
Cordycepin có tác dụng ức chế sinh tổng hợp purin, ADN/ARN [31]. Khi vào
trong tế bào, cordycepin chuyển hóa thành dạng 5’ mono, di và tri phosphate ức chế
các enzym nhƣ ribose phosphate pyrophosphokinase và 5 – phosphoribosyl – 1 –
pyrophosphate amidotransferase trong tổng hợp purin. Do cấu trúc gần giống
adenosin nên trong quá trình phiên mã tổng hợp ARN, enzyme kết hợp cordycepin,
gây rối loạn tổng hợp ARN. Các nghiên cứu cũng chỉ ra cordycepin có thể hoạt hóa
AMP activated kinase, do đó ức chế di truyền, sinh trƣởng phát triển tế bào. Đồng
thời cordycepin có tác dụng chống viêm [31]. Cordycepin còn đƣợc chứng minh có
tác dụng ức chế thể hiện gen bệnh tiểu đƣờng [20].

8

Tác dụng của adenosine
Adenosin liều cao làm tăng dẫn truyền nhĩ – thất, giảm đƣợc hiện tƣợng “ tái
nhập” nhĩ – thất. Hồi phục đƣợc nhịp xoang ở ngƣời bị rối loạn nhịp nhanh trên thất
kịch phát [1]. Chức năng chính của adenosine là ngăn ngừa tổn thƣơng mô trong
trƣờng hợp thiếu oxy, thiếu máu cục bộ, co giật, tăng cƣờng tuần hoàn mạch vành,
mạch não và điều hòa nhịp tim. Đồng thời adenosin trực tiếp kiểm soát các chức
năng mô tim, tác dụng giãn mạch vành, giãn mạch ngoại biên, giảm lực co cơ tim,
ức chế nút xoang và dẫn truyền nút nhĩ thất do đó adenosin đƣợc dùng làm thuốc
điều trị rối loạn nhịp tim [10]. Adenosin cũng có tác dụng tốt với rối loạn thần kinh
nhƣ: thiếu máu não cục bộ, động kinh, các bệnh thoái hóa thần kinh và đau thần
kinh [9].
Adenosin còn có khả năng điều chỉnh chức năng của nhiều tế bào khác nhau
liên quan đến đƣờng hô hấp nhƣ bạch cầu trung tính, bạch cầu ƣa acid, tế bào
lympho và đại thực bào.
1.3. Phƣơng pháp xác định cordycepin và adenosine
1.3.1. Một số nghiên cứu định lượng adenosin và cordycepin bằng phương pháp
HPLC
Có nhiều phƣơng pháp phân tích adenosin và cordycepin nhƣng phƣơng pháp
HPLC đƣợc sử dụng nhiều nhất.

9

Bảng 1.1. Một số phương pháp nghiên cứu xác định adenosine và cordycepin.
Tài liệu
Mẫu
thử
Detector
Cột sắc ký

Pha động
Điều kiện sắc ký
Dung
môi/phƣơng
pháp chiết
Nguyễn Thị
Vân Anh.
(2014) [4]

Adenosin






TPCN
có chứa
ĐTHT
PDA
Cột C
18

Methanol (A) và Nƣớc
(B) theo chƣơng trình
gradient: 0 – 2 phút:
100 – 85% B; 2 – 5
phút: 85 – 70% B; 5 –
10 phút: 70 – 55% B;
10 – 12 phút: 55 – 85%

B; 12 – 15 phút: 85 –
100% B
- Bƣớc sóng: 260 nm
- Nhiệt độ cột: 40
o
C
- Tốc độ dòng:
1ml/phút
- Nhiệt độ cột: 40
o
C
- Thể tích tiêm mẫu:
20µL
Methanol:
H
2
O = 1 : 9
Jian – Ping
Yuan và
cộng sự
[28]

Một số
loài nấm
PDA
Cột ZORBAX
Eclipse XDB-C18
(4,6 mm × 250
mm, 5 µm) và
một cột bảo vệ

(4,6 mm × 12.5
mm,
5 µm)

Methanol (A) và DD
phosphate: natri
dihydro phosphat
0,02M và dinatri hydro
phosphat 0,02M (B)
theo chƣơng trình
gradient: 0 – 5 phút:
0% A; 5 – 15 phút: 0 –
5% A; 15 – 40 phút: 5
– 40% A; 40 – 50 phút:
40% A

- Bƣớc sóng: 260 nm
- Tốc độ dòng: 1,0
ml/ phút.
- Nhiệt độ cột : 30⁰C
- Thể tích tiêm mẫu:
20µL

H
2
O
10


Jian – Wei

Xie và cộng
sự [24]
ĐTHT
khô
MS
Cột VP-ODS
Shimadzu
(150mm × 4,6
mm × 5 µm)

DD Ammoni acetat
0,04M pH 5,2 (A) và
Methanol (B) theo
chƣơng trình gradient:
0 – 6 phút: 85% A; 6 –
12 phút: 85 – 80% A;
12 – 17 phút: 80% A;
17 – 20 phút: 95% A

- Chế độ ion hóa ESI
+
- MS lựa chọn ion [M
+ H]
+
tại m/z 127,
136, 268, 252 và 302
- Nhiệt độ 400
o
C
- Điện áp đầu dò là

4,5 KV
Methanol
Jiang –
Feng Song
và cộng sự
[21]
Cordycepin
ĐTHT
khô
DAD
Eclipse XDB-C18
(5 mm,
150 mm × 4.6
mm)
và một cột
Phenomenex C8
(4 mm x 3 mm, 5
mm)

Nƣớc có 0,1% acid
acetic (A) và
Acetonitril có 0,1%
acid acetic (B) theo
chƣơng trình gradient:
0 – 2,5 phút: 2% B; 2,5
– 12,5 phút: 2 – 12%
B; 12,5 – 14 phút: 12 –
96% B
- Bƣớc sóng : 260 nm
- Tốc độ dòng: 0,8

ml/ phút.
- Nhiệt độ cột : nhiệt
độ phòng



Ethanol
20,21%
Lan – Fang
Huang và
cộng sự
[12]

MS
Cột VP – ODS
(2,0 × 150 mm)
H
2
O : Methanol : Acid
formic = 85 : 14 :1
- Chế độ ion hóa ESI
+
- Lựa chọn ion [M +
H]
+
tại m/z là 136,
137, 268, 252, 302

Xiao Feng
Xue và

cộng sự
Sữa ong
chúa
UV
Cột C
18

Acid phosphoric 0,4%
và Methanol
- Bƣớc sóng: 257 nm

Ethanol :
H
2
O = 80 :
20
11

[25]
Adenosin

Li chen và
cộng sự
[15]

PDA
Cột Eclipse XDB
- CN
Methanol : H
2

O = 7 :
93
- Bƣớc sóng: 260 nm
H
2
O
Hemanth
Kumar, M.
Spandana
[14]
ĐTHT
khô
UV
Cột ProtoSIL C
18

(250mm × 4.6
mm × 5µm)
Methanol : H
2
O = 20 :
80
- Bƣớc sóng: 254 nm
- Tốc độ dòng:
1mL/phút
- Nhiệt độ cột: 30⁰C
- Thời gian rửa giải:
30 phút
Ethanol
Hardeep S.

Tuli và
cộng sự
[22]
ĐTHT
UV
Cột C18 RP (4,6
mm × 150 mm ×
5μm)
Methanol : H
2
O = 30 :
70

- Bƣớc sóng: 260 nm
- Tốc độ dòng: 0,5
mL/phút
- Nhiệt độ cột: 30⁰C
- Thời gian rửa giải:
30 phút


H
2
O
Lei Huang
và cộng sự
[13]
C.
sinensis
và C.

Militaris
khô
PDA
Waters Symmetry
Shield RP 18 (4.6
× 150
mm, 5 µm)
Methanol : H
2
O = 8 :
92

- Bƣớc sóng: 254 nm
- Tốc độ dòng: 1,0 ml
/ phút
- Thời gian rửa
giải:15 phút
- Nhiệt độ cột: 30⁰C
Methanol :
H
2
O = 5 : 5
12

1.3.2. Các nghiên cứu định lượng adenosin và cordycepin bằng phương pháp
khác
Phương pháp sắc ký bản mỏng
Nghiên cứu của MA King Wah và các cộng sự [17] tiến hành xác định
cordycepin và 7 nucleoside khác trong Cordycepin sinensis bằng phƣơng pháp sắc
ký lớp mỏng sử dụng kỹ thuật rửa giải gradient. Dịch chiết nƣớc của 11 sản phẩm

chứa Đông trùng hạ thảo đƣợc phân tích trên bản mỏng silicagel GF254 đƣợc xử lý
bằng hỗn hợp Na
2
HPO
4
0,05M : carboxymethyl cellulose (4 : 1) sau đó đặt vào tủ
sấy 8 phút ở 60
o
C để hoạt hóa. Dung môi triển khai là hỗn hợp cloroform :
ethylacetat : isopropanol : nƣớc = 8 : 2 : 6 : 0,6 (theo thể tích) với 2 giọt amoniac
cho mỗi 10 ml hỗn hợp. Bản mỏng chạy 18 cm, chạy lƣợt hai 9 cm trong dung môi
hỗn hợp cloroform : ethylacetat : isopropanol : nƣớc : dimethylfomamid (10 : 2 : 8 :
0,5 : 2 theo thể tích), phát hiện chất phân tích tại bƣớc sóng 254 nm. Phƣơng pháp
cho độ thu hồi cordycepin 98,09 %, của adenosin là 97,88 %.
Phương pháp điện di mao quản
Nghiên cứu của Koteswara Rao và cộng sự [19] đã định tính và định lƣợng
cordycepin trong Cordyceps militaris bằng phƣơng pháp điện di mao quản với điều
kiện: DD đệm borat 0,02M với 28,6 % methanol, pH 9,5, điện thế 20 kV, nhiệt độ
25
o
C, bƣớc sóng 254 nm. Đƣờng chuẩn xây dựng từ 20 – 100 μg/mL, độ thu hồi từ
82 % đến 107 %.
Nghiên cứu của Feng – Qing Yang và cộng sự [26] tiến hành xác định 12
nucleoside và nucleobase (cytosin, adenin, guanin, cytidin, cordycepin, adenosin,
hupoxanthin, guanosin, inosin, 2-deoxyuridin, uridin và thymidin) trong một số loài
ĐTHT bằng phƣơng pháp điện di mao quản khối phổ (CE-MS). Mẫu đƣợc hòa tan
bằng H
2
O 95⁰C, rung siêu âm ở nhiệt độ 75⁰C trong 30 phút. Sau đó đƣa dịch chiết
về nhiệt độ phòng, lọc qua màng 0,25 µm. Dịch chiết đƣợc bơm vào hệ thống CE-

MS với pha động là đệm formic 10 mM chứa 10 % methanol, tốc độ dòng 3
µL/phút. Phƣơng pháp cho kết quả hàm lƣợng nucleosid và nucleobase trong
13

Cordyceps sinensis là 9138 ± 4823 µg/g cao hơn so với C.militaris là 3722 ± 1446
µg/g.
1.4. Đại cƣơng về phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
1.4.1. Nguyên lý và các thông số đặc trưng của sắc ký lỏng
Nguyên lý:
Mẫu phân tích đƣợc hòa tan trong pha động. Pha tĩnh đƣợc cố định trong cột
hay trên bề mặt chất rắn. Các chất tan là thành phần của mẫu sẽ di chuyển qua cột
theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào tƣơng tác giữa pha tĩnh, pha động
và chất tan. Nhờ tốc độ di chuyển khác nhau tùy thuộc vào ái lực của chất phân tích
với hai pha dẫn đến sự tách, các thành phần của mẫu sẽ tách riêng biệt thành các
dải, làm cơ sở cho phân tích định tính và định lƣợng, sự tách này đạt đƣợc do quá
trình phân bố, hấp phụ, trao đổi ion… Các chất sau khi đƣợc rửa giải ra khỏi cột
đƣợc nhận biết bởi bộ phận phát hiện detector.
Các thông số đặc trƣng cho quá trình sắc ký [2]
- Thời gian lưu( t
R
): là thời gian cần thiết để chất tan di chuyển từ nơi tiêm
mẫu vào hệ thống sắc ký đến khi xuất hiện đỉnh của pic. t
R
là thông tin về mặt định
tính trên sắc ký đồ của một số chất tan trong điều kiện nhất định.
- Độ phân giải R
s
( Resolution): là đại lƣợng đặc trƣng cho mức độ tách của
hai chất ra khỏi nhau trên cùng một điều kiện sắc ký:
R

s
= =
Trong đó: t
R
: Thời gian lƣu ( phút).
W: Độ rộng đáy pic (phút).
W
1/2
: Độ rộng đáy pic ở ½ chiều cao pic (phút).
Khi: R
s
= 0,75 hai pic không tách tốt, còn xen phủ nhau nhiều.
R
s
= 1,0 hai pic tách khá tốt, còn xen phủ nhau 4 %.
R
s
= 1,5 hai pic tách gần hoàn toàn, chỉ xen phủ 0,3 %.
14

- Hệ số bất đối AF (Assymetry factor):cho biết mức độ cân đối của pic sắc
ký, đƣợc tính theo công thức: AF =
Trong đó: W
1/20
là độ rộng pic ở chiều cao 1/20.
a là khoảng cách từ đƣờng cao hạ từ đỉnh pic tới đƣờng
cong phía trƣớc của pic ở 1/20 chiều cao pic.
Trong phép định lƣợng, yêu cầu nằm trong khoảng 0,8 – 2.
1.4.2. Cấu tạo của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao gồm 3 phần chính:

- Phần đầu vào gồm pha động, bơm, hệ thống tiêm mẫu.
- Phần tách: gồm cột tách, lò cột, có thể có cột phụ trợ.
- Phần phát hiện và xử lý số liệu: gồm detector, bộ phận ghi tín hiệu (máy
tính) [5].

Hình 1.5. Sơ đồ cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Pha tĩnh trong sắc ký lỏng
Tùy theo bản chất của pha tĩnh, trong phƣơng pháp sắc ký lỏng pha liên kết
thƣờng chia làm 2 loại : sắc ký pha thƣờng (NP-HPLC) và sắc ký pha đảo (RP-
HPLC).
Hiện nay, kỹ thuật RP-HPLC đƣợc sử dụng rộng rãi vì tách và phân tích đƣợc
nhiều hợp chất có độ phân cực đa dạng, từ phân cực, ít phân cực đến không phân
cực. Đồng thời thành phần chính của pha động là nƣớc nên rất kinh tế.
15

Pha động trong sắc ký lỏng
Pha động đóng góp một phần rất quan trọng trong việc tách các chất phân tích
trong quá trình sắc ký nhất định. Mỗi loại sắc ký đều có pha động rửa giải riêng cho
nó để có đƣợc hiệu quả tách tốt.
Có thể chia pha động làm hai loại:
- Pha động có độ phân cực cao
- Pha động có độ phân cực thấp
Tuy nhiên pha động một thành phần đôi khi không đáp ứng đƣợc khả năng rửa
giải, ngƣời ta thƣờng phối hợp 2 hay 3 dung môi để có đƣợc dung môi có độ phân
cực từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích. Sự thay đổi thành phần pha động
theo thời gian gọi là rửa giải gradient nồng độ.
Detector trong sắc ký lỏng
Detector là bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phƣơng pháp. Có
nhiều loại detector khác nhau, tùy thuộc bản chất lý hóa của chất phân tích mà lựa
chọn detector cho phù hợp:

- Detector quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS: áp dụng cho các chất có khả
năng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại (UV) hoặc vùng khả kiến (VIS).
- Detector chuỗi diod (DAD) cho phép thay đổi bƣớc sóng theo chƣơng trình
đã đặt trong một quá trình sắc ký.
Ngoài ra, còn có tán xạ ánh sáng bay hơi (ELSD), huỳnh quang, khúc xạ (RI),
điện hóa, phổ khối (MS)
1.4.3. Ứng dụng
a. Định tính [3]
Sự giống nhau về thời gian lƣu của chất phân tích trên sắc ký đồ dung dịch
chuẩn và dung dịch thử là cơ sở của phép thử định tính. Với detector DAD hệ số
Match khi chồng 2 phổ của chuẩn và thử cũng đánh giá định tính chất phân tích.
Hệ số Match xấp xỉ 1,000 chỉ ra một phổ định tính giống nhau hoàn toàn.
Hệ số Match càng gần 1,000 thì sự tƣơng tự của phổ càng cao.
Hệ số Match > 0,900 chỉ ra 2 phổ tƣơng tự nhau.
16

Hệ số Match < 0,900 chỉ ra 2 phổ khác nhau.
Để kết luận dƣơng tính, kết quả phân tích HPLC của một dƣợc liệu phải cho
thấy nó chứa hoạt chất hay chất đánh dấu trong thành phần, khi so sánh với kết quả
HPLC trong cùng điều kiện thực nghiệm của các chất chuẩn hoạt chất hay các chất
đánh dấu tƣơng ứng
b. Định lượng[2]
Việc so sánh độ lớn tín hiệu của chất phân tích trong sắc ký đồ dung dịch
chuẩn và dung dịch thử (diện tích hoặc chiều cao pic) trong cùng một điều kiện sắc
ký xác định là cơ sở của phép định lƣợng. Các phƣơng pháp định lƣợng có thể áp
dụng:
Phƣơng pháp dùng chuẩn ngoại.
Phƣơng pháp dùng chuẩn nội.
Phƣơng pháp thêm chuẩn.
Phƣơng pháp chuẩn hóa diện tích .

Trong khuôn khổ khóa luận này, tôi xin trình bày cụ thể về phƣơng pháp
chuẩn ngoại. Đây là phƣơng pháp định lƣợng cơ bản, trong đó cả 2 mẫu chuẩn và
thử tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện, so sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của
mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) pic mẫu chuẩn sẽ tính đƣợc nồng độ của các
chất trong mẫu thử. Có thể sử dụng phƣơng pháp chuẩn hóa một điểm hoặc chuẩn
hóa nhiều điểm.

Chuẩn hóa một điểm
Chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ của mẫu thử. Tính nồng độ
của mẫu thử theo công thức:
Trong đó:
C
x
: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử.
C
s
: Nồng độ chất chất phân tích trong mẫu chuẩn.
S
x
(H
x
): Diện tích (chiều cao) của pic chất phân tích trong mẫu thử.
S
s
(H
s
): Diện tích ( chiều cao) của pic chất phân tích trong mẫu chuẩn.
17

Chuẩn hóa nhiều điểm

Cách tiến hành: Chuẩn bị một dãy mẫu chuẩn với các nồng độ chất chuẩn tăng
dần rồi tiến hành sắc ký. Các đáp ứng thu đƣợc là các diện tích hoặc chiều cao pic ở
mỗi điểm nồng độ chuẩn. Vẽ đồ thị biểu diễn sự tƣơng quan giữa diện tích S (hoặc
chiều cao H) của pic với nồng độ các chất chuẩn. Sử dụng đoạn tuyến tính của
đƣờng chuẩn để tính toán nồng độ của chất cần xác định. Có thể tính theo hai cách:
- Áp dữ liệu diện tích (hoặc chiều cao) pic của chất thử vào đƣờng chuẩn sẽ
suy ra đƣợc nồng độ của nó.
- Xây dựng phƣơng trình hồi quy tuyến tính mô tả quan hệ giữa diện tích pic
(hoặc chiều cao) với nồng độ của chất cần xác định.
Y = a + bC
Trong đó: Y: diện tích của pic của chất phân tích
a: giao điểm của đƣờng chuẩn với trục tung
b: là độ dốc của đƣờng chuẩn
C: nồng độ của chất phân tích
Dựa vào phƣơng trình hồi quy này ta tính đƣợc nồng độ của chất phân tích.