Chiết tách và phân tích định lượng một số lignan từ loài dó đất (Balanophora fungosa subsp. indica (Arn.) B. Hansen) (LV thạc sĩ)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

TRẦN THỊ HOÀNG QUYÊN

CHIẾT TÁCH VÀ PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG
MỘT SỐ LIGNAN TỪ LOÀI DÓ ĐẤT
(Balanophora fungosa subsp. indica (Arn.) B. Hansen)

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

THÁI NGUYÊN - 2017


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

TRẦN THỊ HOÀNG QUYÊN

CHIẾT TÁCH VÀ PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG
MỘT SỐ LIGNAN TỪ LOÀI DÓ ĐẤT
(Balanophora fungosa subsp. indica (Arn.) B. Hansen)
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. Bùi Hữu Tài

THÁI NGUYÊN - 2017

LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn TS.
Bùi Hữu Tài - Viện Hóa sinh Biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công Nghệ
Việt Nam đã tin tưởng giao đề tài, định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn
và tạo những điều kiện tốt nhất cho em hoàn thành luận văn thạc sĩ này.
Em xin chân thành cảm ơn tới TS. Dương Nghĩa Bang, TS. Phạm Thế
Chính cùng các thầy cô khoa Hóa học, Trường Đại Học Khoa Học - Đại Học
Thái Nguyên đã tạo điều kiện , giúp đỡ em trong quá trình triển khai nghiên
cứu thực hiện đề tài.
Em xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo cùng các thầy, cô, cán bộ kĩ
thuật viên Viện Hóa sinh Biển - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công Nghệ Việt
Nam đã tận tình chỉ dạy và hướng dẫn em trong quá trình học tập, thực
nghiệm và thực hiện đề tài.
Cuối cùng em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè lớp
Cao học Khoá 2015 - 2017 đã giúp đỡ và động viên em trong suốt quá trình
học tập và thực hiện luận văn này.
Tác giả luận văn

Trần Thị Hoàng Quyên

a


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .....................................................................................................a
MỤC LỤC .......................................................................................................... b
DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................... d
DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................... f
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................... g

ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................... 1
Chương 1. TỔNG QUAN .................................................................................. 2

1.1. Đặc điểm thực vật chi Balanophora và loài B. fungosa subsp indica ....... 2
1.1.1. Đặc điểm thực vật chi Balanophora ....................................................... 2
1.1.2. Đặc điểm thực vật loài B. fungosa subsp indica ..................................... 3
1.2. Một số nghiên cứu về hóa học và hoạt tính sinh học chi Balanophora......... 5
1.3. Phương pháp sắc ký trong phân tích, phân lập các hợp chất hữu cơ ....... 10
1.3.1. Sắc ký lớp mỏng.................................................................................... 11
1.3.2. Sắc ký cột .............................................................................................. 12
1.3.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao..................................................................... 13
1.4. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ .......... 15
1.4.1. Phương pháp phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều ......... 16
1.4.1. Phương pháp phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều ........... 17
Chương 2. THỰC NGHIỆM ........................................................................... 19

2.1. Nguyên liệu, hóa chất............................................................................... 19
2.2. Các phương pháp và thiết bị nghiên cứu ................................................. 19
2.2.1. Phương pháp và thiết bị nghiên cứu chiết xuất và phân lập các hợp chất ..... 19
2.2.2. Thiết bị nghiên cứu xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập.......... 20
2.2.3. Thiết bị phân tích hàm lượng của hợp chất trong mẫu dược liệu ......... 20
2.3. Thu thập và xử lý mẫu loài B. fungosa subsp. indica .............................. 21
2.4. Chiết xuất và phân lập một số hợp chất lignan từ loài B. fungosa
subsp indica............................................................................................. 21

b


2.6. Phân tích hàm lượng một số chất phân lập trong mẫu thực vật khô ........ 23
2.6.1. Chuẩn bị mẫu .................................................................................................. 23

2.6.2. Khảo sát điều kiện phân tích ........................................................................... 23
2.6.3. Xây dựng đường chuẩn và định lượng hợp chất trong dịch chiết tổng........... 23
2.6.4. Xử lý số liệu .................................................................................................... 24
Chương 3. KẾT QUẢ THẢO LUẬN ............................................................... 25

3.1. Mẫu thực vật............................................................................................. 25
3.2. Thông số vật lí của một số hợp chất phân lập được từ loài B.
Fungosa subsp indica.............................................................................. 26
3.3. Biện giải cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được từ loài B.
fungosa subsp. indica .............................................................................. 27
3.4. Phân tích hàm lượng một số hợp chất lignan trong loài B. fungosa
subsp. indica............................................................................................ 44
KẾT LUẬN...................................................................................................... 51
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 52
PHỤ LỤC ............................................................................................................

c


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Hình ảnh một số loài thuộc chi Balanophora ................................... 3
Hình 1.2. Một số hình ảnh về loài B. fungosa subsp. indica ............................ 4
Hình 2.1. Sơ đồ phân lập các hợp chất BF1-BF4 từ loài B. fungosa
subsp. indica ............................................................................... 22
Hình 3.1. Một số hình ảnh mẫu thu thập về loài B. fungosa subsp. indica .... 25
Hình 3.2. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất BF1 .... 27
Hình 3.3. Phổ 1H-NMR của hợp chất BF1 ..................................................... 29
Hình 3.4. Phổ 13C-NMR của hợp chất BF1 .................................................... 29
Hình 3.5. Phổ DEPT-135 của hợp chất BF1................................................... 30
Hình 3.6. Phổ HSQC của hợp chất BF1 ......................................................... 30

Hình 3.7. Phổ HMBC của hợp chất BF1 ........................................................ 31
Hình 3.8. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất BF2 .... 31
Hình 3.9. Phổ 1H-NMR của hợp chất BF2...................................................... 33
Hình 3.10. Phổ 13C-NMR của hợp chất BF2 .................................................. 33
Hình 3.11. Phổ HMQC của hợp chất BF2 ...................................................... 34
Hình 3.12. Phổ HMBC của hợp chất BF2 ...................................................... 34
Hình 3.13. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất BF3 .... 35
Hình 3.14. Phổ 1H-NMR của hợp chất BF3 ................................................... 38
Hình 3.15. Phổ 13C-NMR của hợp chất BF3 .................................................. 38
Hình 3.16. Phổ HSQC của hợp chất BF3 ....................................................... 39
Hình 3.17. Phổ HMBC của hợp chất BF3 ...................................................... 39
Hình 3.18. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất BF4 .... 40
Hình 3.19. Phổ 1H-NMR của hợp chất BF4 ................................................... 42
Hình 3.20. Phổ 13C-NMR của hợp chất BF4 .................................................. 42
Hình 3.21. Phổ HSQC của hợp chất BF4 ....................................................... 43

d


Hình 3.22. Phổ HMBC của hợp chất BF4 ...................................................... 43
Hình 3.23. Cấu trúc hóa học của một số hợp chất lignan (BF1-BF4) từ
loài B. fungosa subsp. indica ...................................................... 44
Hình 3.24. Phổ UV của các chất BF1 và BF3 ................................................ 45
Hình 3.25. Sắc ký đồ HPLC của dịch chiết methanol loài B. fungosa
subsp. indica ở điều kiện lựa chọn phân tích.............................. 45
Hình 3.26. Đường chuẩn định lượng của hợp chất BF1 ................................. 46
Hình 3.27. Đường chuẩn định lượng của hợp chất BF3 ................................. 49

e

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất BF1 và hợp chất tham khảo ......... 28
Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất BF2 và hợp chất tham khảo BF1 ........ 32
Bảng 3.3. Số liệu phổ NMR của hợp chất BF3 và hợp chất tham khảo ......... 37
Bảng 3.5. Phân tích HPLC của hợp chất BF1 ở các nồng độ khác nhau ....... 46
Bảng 3.6. Xác định giá trị giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định
lượng (LOQ) hợp chất BF1 .......................................................... 47
Bảng 3.7. Độ lặp lại và độ thu hồi của phép phân tích hợp chất BF1 ............ 47
Bảng 3.8. Hàm lượng hợp chất BF1 trong dịch chiết methanol mẫu B.
fungosa subsp. indica .................................................................... 48
Bảng 3.9. Phân tích HPLC của hợp chất BF3 ở các nồng độ khác nhau ....... 48
Bảng 3.10. Xác định giá trị giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định
lượng (LOQ) hợp chất BF3 .......................................................... 49
Bảng 3.11. Độ lặp lại và độ thu hồi của phép phân tích hợp chất BF3 .......... 49
Bảng 3.12. Hàm lượng hợp chất BF3 trong dịch chiết methanol mẫu B.
fungosa subsp. indica .................................................................... 50

f


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Viết tắt

Viết đầy đủ (Tiếng Anh)

Viết đầy đủ (Tiếng Việt)

13

Carbon-13 Nuclear Magnetic
Resonance
Proton Nuclear Magnetic

Cô ̣ng hưởng từ ha ̣t nhân cacbon
13
Cô ̣ng hưởng từ ha ̣t nhân proton

CC
DEPT

Resonance
Column chromatography
Distortionless Enhancement

Sắc kí cột
Distortionless Enhancement by

DMSO

by Polarisation Transfer
Dimethyl sulfoxide

Polarisation Transfer
Dimethyl sulfoxide

DPPH
ESI-MS

2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl
Electrospray Ionization Mass
Spectrometry

2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl
Phổ khố i lượng ion hóa phun
mù điê ̣n

EtOAc

Ethyl acetate

Etyl axetat

HMBC
HPLC

Heteronuclear mutiple Bond
Connectivity
High-performance liquid

Tương tác di ̣ha ̣t nhân qua
nhiề u liên kế t
Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HR-ESIMS
HSQC

chromatography
High Resolution Electrospray

Ionization Mass Spectrometry
Heteronuclear Single-

Phổ khối lượng phân giải cao
ion hóa phun mù điện
Tương tác di ̣ha ̣t nhân qua 1

LOD
LOQ
RP-18
TLC
TMS

Quantum Coherence
Limit of detection
Limit of quantitation
Reserve phase C-18
Thin layer chromatography
Tetramethylsilane

liên kế t
Giới hạn phát hiện
Giới hạn định lượng
Chất hấp phụ pha đảo C-18
Sắ c ký lớp mỏng
Tetramethylsilane

1

C-NMR

H-NMR

g


ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây thuốc và động vật làm thuốc đã và đang được nhiều dân tộc trên
thế giới sử dụng rộng rãi để điều trị các bệnh khác nhau. Theo thống kê sơ bộ,
ở một số nước châu Á và châu Phi, có tới 80 % dân số phụ thuộc vào y học cổ
truyền trong việc chăm sóc sức khỏe cơ bản. Ở nhiều nước phát triển, từ 70 %
đến 80 % dân số đã sử dụng các cây thuốc hoặc chế phẩm của nó. Các cây
thuốc sử dụng trong dân gian đã dần được chứng minh bởi các nghiên cứu
khoa học. Nó là một trong những cơ sở ban đầu của quá trình nghiên cứu phát
triển thuốc và đã tạo ra nhiều loại thuốc Tây. Trong vài thập kỉ qua, dựa trên
các bài thuốc dân gian, các dược liệu cổ truyền đóng vai trò là nguồn nguyên
liệu cung cấp cho thuốc Tây với hơn 40% tổng các loại thuốc. Hơn nữa việc
nghiên cứu hóa học của các loài cây thuốc có ý nghĩa vô cùng quan trọng
nhằm làm cơ sở khoa học cho việc sử dụng nguồn tài nguyên một cách hiệu
quả nhất, lý giải công dụng ngăn ngừa bệnh đã được sử dụng trong các bài
thuốc dân tộc, và phát hiện các hợp chất thể hiện hoạt tính giúp định hướng
trong bào chế và phát hiện các thuốc mới. Bên cạnh đó, đánh giá hàm lượng
hoạt chất trong dược liệu cũng là một yêu cầu quan trọng nhằm nâng cao giá
trị sử dụng và hiệu quả kinh tế của dược liệu.
Các dược liệu thuộc chi Balanophora (Dó đất) thường được biết đến
với tên gọi ‘Tỏa dương’ hay ‘nấm ngọc cẩu’. Theo kinh nghiệm dân gian,
công dụng của các loài thuộc chi Balanophora chủ yế là bổ dương, kích thích
ăn ngon miệng, phục hồi sức khỏe nhanh …. Một số loài bị săn tìm ráo riết để
phục vụ cho những bài thuốc tăng cường sinh lực nên có thể dẫn đến nguy cơ
cạn kiệt, một số loài nằm trong sách đỏ của Việt Nam. Do đó, việc nghiên cứu

thành phần hóa học và đánh giá hàm lượng hoạt chất của các loài thuộc chi
Balanophora ở nước ta nói chung và loài B. fungosa subsp. indica nói riêng
mang nhiều ý nghĩa khoa học và thực tiễn; vừa tạo cơ sở giải thích công dụng
dân gian của loài này vừa tạo cơ sở để đánh giá hiệu quả kinh tế của nó.

1


Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Đặc điểm thực vật chi Balanophora và loài B. fungosa subsp indica
1.1.1. Đặc điểm thực vật chi Balanophora
Chi Balanophora ở nước ta còn được gọi là chi Dó đất. Theo khóa phân loại
thực vật, chi Balanophora có vị trí phân loại như sau :
+ Ngành: Mộc lan - Magnoliophyta
+ Lớp : Hai lá mầm - Magnoliopsida
+ Bộ : Đàn hương - Santalales
+ Họ : Dó đất, Dương đài - Balanophoraceae
+ Chi : Dó đất - Balanophora
Các loài thuộc chi Balanophora thuộc loại thực vật có hoa đặc biệt,
không có diệp lục-sống ký sinh. Các loài này thường sống ký sinh trên rễ của
nhiều loài cây gỗ lớn trong rừng ẩm. Chúng có thân thoái hóa thành một “củ”
nhỏ có kích thước và hình dạng khác nhau. Thân thường gồm nhiều thùy, sần
sùi, màu nâu sẫm, không có lá hay chỉ có lá vẩy, đến khi sinh sản thì cụm hoa
của nó mới lộ ra trên mặt đất. Cụm hoa là một bông nạc. Tùy từng loài, cây
Dó đất hoặc có hoa đơn tính cùng gốc, hoặc khác gốc. Cụm hoa đực thường
dài 10 - 15 cm, gốc trục cụm hoa có một ít lá vẩy. Bao hoa có 4 - 7 thùy, nhị
có bao phấn hình móng ngựa. Cụm hoa cái ngắn hơn, có hình thoi hay hình
trứng dài 5 - 7 cm, mang rất nhiều hoa cực nhỏ, không có bao hoa. Mùa hoa
thường vào tháng 10 đến tháng 2, thụ phấn nhờ côn trùng. Quả nhỏ, khô, dạng
bầu dục dài 0,2 - 0,5 mm.

Trên thế giới, chi Bananophora đã ghi nhận có khoảng 120 loài, phân
bố ở vùng khí hậu ôn đới và nhiệt đới châu Á và châu Úc [1]. Ở Việt Nam,
chi Bananophora có khoảng 7 loài, trong đó một số loài gặp phổ biến như B.
cucphuongensis, B. fungosa subsp indica, B. latisepala, B. laxiflora, và B.
polyandra. Chúng đều là những cây thuốc dân gian ở nước ta. Người dân tộc
miền núi thường dùng cụm hoa làm thuốc bổ, có tác dụng mạnh gân cốt, giúp

2


cơ thể cường tráng, chữa đau bụng, nhức mỏi chân tay. Người dân thương
dùng dưới dạng thuốc sắc nước hoặc ngâm rượu (thái mỏng, sao qua rồi ngâm
rượu) [2].

B. laxiflora

B. cucphuongensis

B. fungosa subsp indica

B. latisepala

Balanophora polyandra
Hình 1.1. Hình ảnh một số loài thuộc chi Balanophora
1.1.2. Đặc điểm thực vật loài B. fungosa subsp indica
Loài B. fungosa subsp. indica ở nước ta có một số tên gọi như Dó đất,
Xà cô. Cây mọc trong các rừng thường xanh ở độ cao trải rộng từ 500-2.600

3

m. Loài này sống kí sinh trên rễ của nhiều loại cây thân gỗ, kể cả cả cây gỗ và
dây leo trong họ Nho hay nhiều cây họ Đậu. Mọc phổ biến ở các tỉnh vùng
tây nguyên nước ta. Loài này có thân thoái hóa thành một củ có nhiều dạng
khác nhau, thường gồm nhiều thùy. Củ thường có màu từ vàng cam tới nâu,
bề mặt hơi sần. Hoa thuộc loại đơn tính khác gốc. Cụm hoa đực dài, trục hoa
ở gốc có một ít lá (dạng vẩy), bao hoa chứa 4-7 thùy, nhị hoa có 4-7 bao phấn.
Cụm hoa cái ngắn, hoa không có bao hoa mà chỉ là những khối hình trứng có
chân và kéo dài bằng một sợi mảnh [3].

Hình 1.2. Một số hình ảnh về loài B. fungosa subsp. indica

4


1.2. Một số nghiên cứu về hóa học và hoạt tính sinh học chi Balanophora
Các nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới đã chỉ ra thành phần
hóa học chính của các loài thuộc chi Balanophora là các hợp chất dạng lignan
hay các hợp chất polyphenol có chứa các nhóm caffeoyl, coumaroyl, galloyl,
v/v. Có thể nói, nghiên cứu về thành phần hóa học chi Balanophora bắt đầu
vào giữa những năm 50 của thế kỉ 20, khởi đầu với công bố phân lập một số
hợp chất triterpen từ loài B. japonica [4].
Sau đó, cũng từ loài B. japonica, Mitsumasa và cộng sự đã thông báo phân
lập và xác định được một hợp chất neo-lignan, balanophonin (3), và 10 hợp
chất khác (4-13) thuộc lớp chất lignan và dẫn xuất phenolic acid [5].

Nghiên cứu khác về thành phần hóa học loài B. japonica, Jiang và cộng sự
người Nhật đã phân lập và xác định cấu trúc của 34 hợp chất phenolic (19-52)
có cấu trúc hóa học khá đặc biệt chỉ gồm một đơn vị đường liên kết qua cầu
ester với các phenolic acid khác nhau gồm caffeic acid, coumaroic acid,

galloic acid và hexahydroxydiphenoic acid [6].

5


Tuy chưa có các nghiên cứu về phân tích định lượng, các hợp chất 1952 đã sơ phân lập được với hiệu suất 0.0012- 0.7069% (các hợp chất 19, 20,
22, 24-27) so với khối lượng mẫu khô từ phần dưới mặt đất và hiệu suất
0.0014-0.2231% (các hợp chất 19-21, 23, 28-52) từ phần trên mặt đất loài B.
japonica [6].
Tiếp đó, Jiang và cộng sự tiếp tục công bố ba hợp chất,
balanophotannins

A-C

(53-55),

các

lignan

glycoside

(56-59);

balanophotannins D-G (60-63) từ loài B. japonica [7, 8]. Các kết quả đánh
giá hoạt tính gây độc tế bào đã phát hiện hợp chất balanophotannin E diệt tế
bào ung thư gan tốt nhất, với giá trị IC50 là 4.22 µM [8].

6

Trong thí nghiệm về sàng lọc hoạt tính chống oxi hóa (theo phương
pháp DPPH) của các dịch chiết từ các cây thuốc truyền thống, Wang và cộng
sự đã phát hiện dịch chiết 80% acetone từ loài B. polyandra thể hiện khả năng
thu dọn gốc tự do mạnh. Các nghiên cứu về thành phần hóa học loài này đã
phân lập được 2 hợp chất, balapolyphorins A-B (64-65), cùng với 20 hợp chất
dạng lignan hoặc phenolic (9, 20, 35, 37, 41, 42, 50-52, 54, 57, 66-74). Các
hợp chất này cũng đã được đánh giá hoạt tính DPPH, hầu hết các hợp chất
đều thể hiện khả năng thu dọn gốc tự do với giá trị thu dọn 50% số lượng gốc
tự do DPPH (SC50) từ 8.4-68.3 µM [9].

7


Từ hoa loài Balanophora laxiflora, Ho và cộng sự đã tiến hành nghiên
cứu các thành phần chống oxi hóa bằng hệ thống HPLC kết hợp DPPH. Trong
số các hợp chất phát hiện được, 5 hợp chất bao gồm: caffeic acid (6), 1-O-(E)caffeoyl-β-D-glucopyranose (20), 1-O-(E)-p-coumaroyl-β-D-glucopyranose
(19),

1-O-(E)-caffeoyl-4,6-(S)-hexahydroxydiphenoyl-β-D-glucopyranose

(46), và 1,3-di-O-galloyl-4,6-(S)-hexahydroxydiphenoyl-β-D-glucopyranose
(52) được xác định là thành phần chống oxi hóa chính của loài này [10]. Một
nghiên cứu khác của She cũng về tác dụng chống oxi hóa đã phân lập và xác
định cấu trúc của 2 hợp chất, balaxiflorins A- B (75, 76) cùng 17 hợp chất
phenolic khác (6, 20, 35, 37, 41, 48, 49, 52, 58, 68, 70, 71, 74, 77-80) [11].
Các hợp chất phenolic có chứa nhóm galloyl, cafeoyl, và (S)hexahydroxydiphenoyl (81-89) cũng được phát hiện thấy có trong thành phần
hóa học của loài B. tobiracola [12].

8

Từ loài B. harlandii, Wang và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc
của hợp chất, 1-O-[(E)-p-coumaroyl]-3-O-galloyl-β-D-glucopyranose (90) và
18 hợp chất (7, 20, 30, 37, 42, 68, 71, 81-83, 86, 87, 91-96). Các hợp chất này
đã được đánh giá hoạt tính chống oxi hóa DPPH, kết quả cho thấy một số hợp
chất mang khung dihydrochalcone và tannin thể hiện hoạt tính tốt nhất với
giá trị SC50 trong khoảng 8.2-16.2 µM [13].

Từ loài B. involucrata, Luo và cộng sự phân lập được ba hợp chất
phenolic đã biết (11, 71, 72) [14]. Một nghiên cứu khác về thành phần hóa học
loài B. papuana của các nhà khoa học Nhật Bản, Hosoya và cộng sự đã phân lập

9


được 2 hợp chất khác có khung dihydrochalcone, papuabalanols A-B (97, 98).
Các hợp chất này đã được đánh giá hoạt tính hạ huyết áp và ức chế enzyme
tyrosinase [15]. Kết quả cho thấy, hợp chất 97 (100 µM) phát hiện có tác dụng
làm giãn mạch trong khi hợp chất 98 lại có tác dụng ức chế hoạt động của enzym
tyrosinase (33-79%) ở các nồng độ thử nghiệm 12.5, 25, và 50 µM.

Từ kết quả tổng quan các nghiên cứu trên, có thể nhận thấy các nghiên
cứu chủ yếu xuất phát từ các nghiên cứu của các nhà khoa học Nhật Bản và
Trung Quốc. Thành phần hóa học của các loài thuộc chi Balanophora chủ yếu
là các hợp chất dạng ligan hoặc các phenolic có chứa các nhóm galloyl,
caffeoyl, và hexahydroxydiphenoyl. Tuy vậy, cho đến nay gần như chưa có
nghiên cứu về hóa học loài B. fungosa subsp. indica.
1.3. Phương pháp sắc ký trong phân tích, phân lập các hợp chất hữu cơ
Phương pháp sắc ký là một trong những phương pháp phổ biến và hữu

hiệu sử dụng để phân lập các hợp chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên
nhiên nói riêng. Cơ sở của phương pháp sắc ký dựa trên sự khác nhau về bản
chất hấp phụ và phân bố của các chất giữa hai pha: pha tĩnh và pha động. Tùy
theo bản chất của pha tĩnh hoặc pha động hay dựa trên cách thức triển khai
sắc ký mà người ta phân loại thành các phương pháp sắc ký khác nhau như
sắc ký khí, sắc ký lỏng, sắc ký điện di, sắc ký lọc gel, sắc ký trao đổi ion, sắc
ký giấy, sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột, sắc ký cột trọng lực, sắc ký cột trung áp,
sắc ký cột cao áp.... Tùy theo mục đích nghiên cứu và đối tượng cần phân lập

10


người ta lựa chọn những phương pháp sắc ký phù hợp. Thông thường để phân
lập một hợp chất cần có sự kết hợp của các phương pháp sắc ký khác nhau và
thường thấy là sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột trọng lực. Trong khi đó, để phân
tích định tính hay định lượng của một hợp chất trong thuốc, dược liệu thì cần
đến phương pháp sắc ký hiện đại như sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC),
HPLC gắn khối phổ.
1.3.1. Sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng (SKLM) hay còn gọi là sắc ký phẳng, dựa chủ yếu
vào hiện tượng hấp phụ của chất phân tích lên chất hấp phụ. SKLM thường
được sử dụng trong phân tích định tính hay sử dụng làm chỉ thị cho sắc ký
cột. Trong SKLM pha động sử dụng là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung
môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất hấp phụ trơ (thường gặp
là: silica gel hay nhôm oxit). Pha tĩnh được tráng thành một lớp mỏng, đều,
phủ lên nền phẳng như tấm kính hay tấm nhôm. Do chất hấp phụ được tráng
thành một lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng và
tấm kính/nhôm tráng chất hấp phụ gọi là bản mỏng.
Chất phân tích được hòa tan trong dung môi dễ bay hơi và đưa lên bản
mỏng thành một điểm gọn nhờ một mao quản (capillary) và sấy đuổi dung

môi. Tùy theo mục đích nghiên cứu mà lượng chất phân tích đưa lên bản
mỏng là khác nhau.
SKLM được triển khai trong một bình sắc ký bằng thủy tinh, hình dạng
đa dạng, có nắp đậy và bão hòa pha động. Pha động di chuyển chầm chậm
dọc theo bản mỏng, và lôi kéo mẫu chất phân tích đi theo nó. Tùy theo khả
năng hấp phụ-giải hấp phụ của mỗi chất mà chúng sẽ di chuyển với vận tốc
khác nhau và quãng đường khác nhau trên bản mỏng.
Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích trên bản
mỏng là hệ số di chuyển Rf. Hệ số này được tính bằng tỉ lệ giữa khoảng dịch
chuyển của chất phân tích và khoảng dịch chuyển của pha động trên bản

11


mỏng. Do vậy Rf sẽ có giá trị từ 0 đến 1 và mỗi hợp chất sẽ có một giá trị Rf
xác định đối với một hệ dung môi.
Dấu vết của các chất phân tích trên bản mỏng sau khi triển khai có thể
được quan sát bằng mắt thường (dựa trên màu sắc của chất phân tích) hay
hiện hình nhờ tia tử ngoại (thông thường sử dụng tia tử ngoại với bước sóng
254 và/hoặc 365 nm), hay bằng các phản ứng hóa học bằng cách phun các
dung dịch thuốc thử khác nhau tùy theo bản chất của chất phân tích. Chẳng
hạn ninhydrin phát hiện amino acid hay amin; 2,4-dinitrophenylhydrazin phát
hiện aldehyde hay ketone, Dragendorff phát hiện các hợp chất alkaloid… Với
các hợp chất hữu cơ thông thường có thể dùng dung dịch acid H2SO4 loãng
(khoảng 10%) và hơ nóng để phát hiện các vết chất trên bản mỏng.
SKLM có một số ưu điểm như chỉ cần một lượng rất ít mẫu để phân
tích, thực hiện dễ dàng cho kết quả nhanh với độ chính xác cao, có thể phân
tích đồng thời mẫu phân tích và chất chuẩn đối chứng. Tuy nhiên, SKLM chỉ
hiệu quả trong việc phân tích, định tính các hợp chất khó có tính khả thi trong
phân lập lượng lớn các hợp chất. Và do đó, người ta sử dụng SKLM chủ yếu

cho mục đích phân tích định tính hay sử dụng làm chỉ thị cho sắc ký cột để
phân lập các hợp chất hữu cơ.
1.3.2. Sắc ký cột
Sắc kí cột là phương pháp sắc ký phổ biến, đơn giản, và hay sử dụng
nhất trong phân lập các hợp chất hữu cơ từ nguồn tự nhiên. Trong sắc ký cột,
pha tĩnh được nạp trên các cột thủy tinh, pha động đi qua cột ở điều kiện áp
suất khí quyển nhờ lực hút của Trái đất do đó còn được gọi là sắc ký cột trọng
lực, sắc ký cột hở. Đồng thời pha tĩnh phải là các hạt có kích thước đủ lớn để
pha động có thể đi qua dễ dàng nhờ trọng lực. Thông thường kích thước hạt
trung bình từ 50-150 µM. Với chất hấp phụ silica gel, kích thước cỡ hạt trung
bình (40-63 µM) thường được sử dụng để phân lập các hợp chất tự nhiên. Pha
tĩnh được nạp lên cột sắc ký theo hai phương pháp khác nhau là nạp ướt và
nạp khô.

12


Trong phương pháp nạp khô, chất hấp phụ được đưa riêng lẻ, từ từ lên
cột, gõ nhẹ cho chất hấp phụ phân bố đều lên cột và ổn định cột bằng pha
động trước khi triển khai.
Ở phương pháp nạp ướt, chất hấp phụ được tẩm ướt hoàn toàn trong
pha động. Hỗn dịch gồm pha động và pha tĩnh sau đó được đưa lên cột sắc ký
và liên tục cho pha động chảy qua cột để ổn định cột sắc ký.
Hỗn hợp chất cần phân lập được đưa lên đầu cột, phía trên pha tĩnh.
Thông thường, trước khi đưa hỗn hợp chất phân tích lên cột sắc ký, hỗn hợp
này được trộn đều với chất hấp phụ theo phương pháp tẩm ướt (với chất hấp
phụ là silica gel) hay đưa trực tiếp lên cột bằng cách hòa tan hoàn toàn trong
thể tích tối thiểu pha động (với chất hấp phụ là pha đảo)
Hợp chất cần phân lập sau đó được rửa giải từ từ ra khỏi cột sắc ký
bằng pha động. Quá trình các hợp chất rửa giải ra khỏi cột sắc ký được theo

dõi bằng phân tích SKLM.
Quá trình sắc ký cột có thể được tiến hành lặp lại với các pha động
khác nhau, hay kết hợp vơi các phương pháp khác đến khi thu được hợp chất
có độ tinh khiết mong muốn.
1.3.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid
chromatography, HPLC) là một dạng của sắc ký cột trong đó các hợp chất cần
phân tích được rửa giải trên cột sắc ký bằng pha động là dung môi/hệ dung
môi được bơm ở áp suất cao. Pha tĩnh là các chất hấp phụ có cỡ hạt nhỏ
khoảng 5-10 µm, thường gặp là chất hấp phụ pha đảo octadecylsilane (ODS).
a) Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao

Hình 1.3. Mô phỏng của một hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao

13


Một hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao thường gồm các phần chính
sau: các bình cấp dung môi (pha động), các van và buồng trộn dung môi, bơm
cao áp, hệ thống tiêm mẫu phân tích, cột sắc ký (pha tĩnh), bộ phận phát hiện
(detector), máy tính (điều khiển, đọc, xuất tín hiệu dưới dạng các sắc ký đồ).
- Bình cấp dung môi: chứa các dung môi sử dụng làm pha động của
phép phân tích sắc ký.
- Các van chia và buồng trộn dung môi: chia dung môi từ các bình chứa
với tỉ lệ xác định và trộn đều thành một hệ dung môi pha động đồng nhất.
- Các bơm cao áp: bơm pha động qua cột sắc ký với tốc độ dòng nhất định.
- Hệ thống tiêm mẫu phân tích: có thể là tiêm mẫu tự động hoặc tiêm
mẫu bằng tay, đưa các mẫu phân tích lên cột sắc ký.
- Cột sắc ký: phân tách các chất phân tích, thường là các cột sắc ký đã
nhồi sẵn chất hấp phụ. Tùy theo mục đích phân tích mà sử dụng các loại cột

có kích thước hoặc chất hấp phụ khác nhau.
- Bộ phận phát hiện (Detector): theo dõi quá trình phân tách của các
chất phân tích trên cột sắc ký. Thường gặp là các detector UV, hoạt động dựa
trên độ hấp thụ của các hợp chất phân tích ở các bước sóng UV xác định
(200-400 nm) theo định luật hấp thụ Lambert-Beer. Detector có thể là loại
phát hiện với một bước sóng xác định (fixed-wavelength detector) hay là phát
hiện đồng thời ở nhiều bước sóng hoặc một dải sóng (multiple-wavelength
detector) thường được biết đến với tên gọi Photodiode array detector (PDA)
hay diode array detector (DAD).
- Hệ thống máy tính điều khiển: Điều khiển, đặt chương trình (hệ dung
môi, tốc độ dòng pha động, thời gian phân tích, hoạt động của detector) cho
quá trình phân tách, theo dõi quá trình sắc ký dưới dạng các sắc đồ.
b) Một số khái niệm quan trọng của sắc ký lỏng hiệu năng cao
- Pha động: là dung môi dùng để rửa giải chất cần phân tích ra khỏi cột
sắc ký. Pha động có thể là một dung môi, một hỗn hợp dung môi trộn theo
một tỉ lệ xác định theo thời gian (đẳng dòng-isocratic) hay tỉ lệ thay đổi theo
thời gian (gradient). Với mỗi hỗn hợp chất phân tích sẽ có các hệ pha động
riêng để có được hiệu quả phân tách tốt nhất. Pha động là một trong những
yếu tố quyết định đến hiệu suất tách của một hỗn hợp mẫu, ảnh hưởng đến

14


thời gian lưu, độ phân giải, độ rộng, và sự cân đối của pic sắc ký. Yêu cầu đối
với một pha động là:
+ Phải trơ đỗi với pha tĩnh
+ Hòa tan được chất cần phân tích
+ Bền vững theo thời gian
+ Có độ tinh khiết cao
+ Nhanh đạt các cân bằng trong quá trình sắc ký

+ Phù hợp với loại detertor dùng để phát hiện chất phân tích
+ Cho các pic sắc đồ có tính đối xứng cao.
+ Có tính kinh tế.
- Thời gian lưu (tR): là thời gian cần thiết để một phân tử cần thiết rửa
giải ra khỏi cột sắc kí. Nó có thể được tính bằng từ lúc tiêm mẫu vào cột tới
khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị nồng độ cực đại được phát hiện bởi detector.
Tùy theo tích chất lý hóa của phân tử mà mỗi phân tử lại có một thời gian lưu
khác nhau, và các giá trị này là hằng số trong cùng một điều kiện phân tích.
Do đó, giá trị thời gian lưu chính là một đại lượng để định tính các hợp chất
phân tích.
- Độ phân giải (RS): là đại lượng biểu thị mức độ phân tách của các chất
ra khỏi nhau trong một điều kiện phân tích. Độ phân giải của 2 chất có thể
được tính bằng tỉ lệ của hiệu số thời gian lưu với độ rộng trung bình đáy píc
chất phân tích đo ở khoảng cách 1/20 chiều cao của pic chất.
- Hệ số đối xứng (T): là đại lượng biểu thị mực độ cân đối của pic chất
phân tích trên sắc ký đồ. Nó được tính bằng một nửa của tỉ lệ giữa độ rộng
của đáy pic và độ rộng nửa trước của đáy pic đo tại 1/20 chiều cao pic chất
trên sắc ký đồ.
1.4. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ
Cấu trúc hóa học của hợp chất hữu cơ có thể được xác định nhờ vào các
tính chất lý hóa đặc trưng của chúng. Cách xác định cấu trúc hóa học của các
hợp chất hữu cơ hiện nay phổ biến là phân tích kết hợp một hay nhiều phương
pháp phổ như phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt
nhân (NMR), phổ khối lượng, nhiễu xạ tia X (X-Ray), …, hay tiến hành các
chuyển hóa hóa học. Tùy thuộc vào cấu trúc hóa học của từng chất mà người

15


ta sử dụng phương pháp phổ cụ thể. Cấu trúc càng phức tạp thì càng yêu cầu

phân tích kết hợp nhiều các phương pháp phân tích khác nhau. Với các hợp
chất có hấp thụ UV, phân tích phổ UV cho phép dự đoán về sự xuất hiện của
các nhóm mang màu, khung carbon của hợp chất phân tích. Trong khi đó phổ
IR lại cho các tín hiệu dao động của các nhóm chức, từ đó cho phép xác định
sự có mặt của các nhóm chức này trong cấu trúc hóa học của hợp chất phân
tích. Với các hợp chất có cấu trúc hóa học mới hoặc khó xác định được công
thức phân tử thì phổ khối lượng (đặc biệt là phổ khối lượng phân giải cao) và
phương pháp phân tích nguyên tố là những phương pháp cần thiết ban đầu
cho phép xác định chính xác công thức phân tử của hợp chất cần phân tích.
Trong trường hợp các hợp chất có cấu trúc lập thể bất đối xứng thì nhiều
trường hợp cần thiết phải phân tích phổ X-Ray hay phổ lưỡng sắc tròn (CD)
để xác định chính xác cấu trúc tuyệt đối, phân bố trong không gian của các
hợp chất này. Trong các phép phân tích phổ để xác định cấu trúc hóa học của
một hợp chất hữu cơ thì phổ NMR được sử dụng phổ biến và là một trong
những phép phân tích đòi hỏi cho việc xác định cấu trúc hóa học của các hợp
chất hữu cơ. Các kỹ thuật phân tích NMR được chia thành hai loại chính là
phân tích NMR một chiều và hai chiều.
1.4.1. Phương pháp phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều
Phân tích NMR một chiều hay gặp bao gồm phân tích cộng hưởng từ
hạt nhân proton (1H-NMR), cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 (13C-NMR),
và các kỹ thuật phân tích DEPT như DEPT-45, DEPT-90, DEPT-135.
- Phổ 1H-NMR: cho biết tín hiệu cộng hưởng của các proton có trong
phân tử hợp chất cần phân tích. Dựa vào bản chất liên kết giữa proton với
nguyên tử khác hay ảnh hưởng bởi các nguyên tử, nhóm nguyên tử gần cạnh
mà các proton cho các tín hiệu có độ chuyển dịch hóa học và sự phân tách
hình dạng tín hiệu khác nhau. Độ chuyển dịch hóa học của các proton được so
với hợp chất chuẩn nội TMS và thường nằm trong khoảng thang chia 0-14
ppm. Trên phổ 1H-NMR, tín hiệu cộng hưởng của một proton được phân tách
theo quy tắc N+1 trong đó N là số lượng các proton tương đương về tính chất

16