BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ BÍCH NGỌC
Mã sinh viên: 1201415
XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THÔNG SỐ
DƢỢC ĐỘNG HỌC CỦA ARTESUNAT
VÀ CHẤT CHUYỂN HÓA CÓ HOẠT
TÍNH DIHYDROARTEMISININ
TỪ HỆ TIỂU PHÂN NANO TRÊN CHÓ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
HÀ NỘI - 2017
BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ BÍCH NGỌC
Mã sinh viên: 1201415
XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THÔNG SỐ
DƢỢC ĐỘNG HỌC CỦA ARTESUNAT
VÀ CHẤT CHUYỂN HÓA CÓ HOẠT
TÍNH DIHYDROARTEMISININ
TỪ HỆ TIỂU PHÂN NANO TRÊN CHÓ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Ngƣời hƣớng dẫn:
TS. Nguyễn Thị Thuận
Nơi thực hiện:
1. Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia
2. Bộ môn Hóa Dược
HÀ NỘI - 2017
LỜI CẢM ƠN
Trước tiên cho phép tôi bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đối với
TS. Nguyễn Thị Thuận – người cô trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình cho
tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới PGS. TS. Nguyễn Ngọc Chiến,
Ths. Trần Ngọc Bảo cùng các thầy cô giáo, cán bộ kỹ thuật viên trực thuộc
bộ môn Hóa dược và Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia đã tạo mọi điều
kiện giúp tôi hoàn thành tốt khóa luận của mình.
Tôi chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường và phòng Đào tạo đã
quan tâm, nâng đỡ tôi trong suốt 5 năm học vừa qua.
Cuối cùng, tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình và bạn bè – những
người luôn đồng hành và tạo nguồn động lực to lớn để tôi có thể hoàn thành
khóa luận này.
Hà Nội, ngày 27 tháng 4 năm 2017
Sinh viên
Nguyễn Thị Bích Ngọc
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN........................................................................... 2
1.1. Đại cương về dược động học .................................................................... 2
1.1.1. Các thông số dược động học cơ bản ................................................... 2
1.1.2. Phương pháp xác định các thông số dược động học .......................... 4
1.2. Đại cương về artesunat và chất chuyển hóa dihydroartemisinin .............. 5
1.2.1. Vài nét về artemisinin – nguồn bán tổng hợp artesunat ..................... 5
1.2.2. Tính chất lý hóa .................................................................................. 6
1.2.3. Đặc điểm dược động học .................................................................... 7
1.2.4. Tác dụng dược lý .............................................................................. 10
1.2.5. Tác dụng không mong muốn ............................................................ 11
1.2.6. Chỉ định, chống chỉ định ................................................................... 11
1.2.7. Liều dùng .......................................................................................... 11
1.3. Đại cương về hệ tiểu phân nano polyme................................................. 11
1.3.1. Vài nét về hệ tiểu phân nano polyme ................................................ 11
1.3.2. Một số nghiên cứu về hệ tiểu phân nano artesunat – PLGA ............ 12
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......... 14
2.1. Hóa chất, thiết bị và động vật thí nghiệm ............................................... 14
2.1.1. Hóa chất ............................................................................................ 14
2.1.2. Thiết bị .............................................................................................. 14
2.1.3. Động vật thí nghiệm.......................................................................... 15
2.2. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................. 15
2.3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................... 16
2.4. Phương pháp nghiên cứu......................................................................... 16
2.4.1. Định lượng ART và DHA trong huyết tương ................................... 16
2.4.2. Phương pháp xử lý số liệu ................................................................ 21
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM ................................................ 22
3.1. Xác định các thông số dược động học của ART..................................... 22
3.1.1. Định lượng ART trong huyết tương ................................................. 22
3.1.2. Tính toán các thông số dược động học của ART ............................. 25
3.2. Xác định các thông số dược động học của chất chuyển hóa DHA ......... 27
3.2.1. Định lượng DHA trong huyết tương................................................. 27
3.2.2. Tính toán các thông số dược động học của DHA ............................. 30
CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN ............................................................................. 32
4.1. Bàn luận về thiết kế nghiên cứu dược động học ...................................... 32
4.1.1. Đối tượng thử nghiệm: ...................................................................... 32
4.1.2. Thời điểm lấy mẫu ............................................................................ 33
4.1.3. Thiết kế nghiên cứu........................................................................... 34
4.1.4. Phương pháp xử lý số liệu................................................................. 34
4.2. Bàn luận về kết quả xác định các thông số dược động học ..................... 35
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu
Chú thích
ACN
Acetonitril
ARN
Artemisinin
ART
Artesunat
AUC
Diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian
C18
Cột Octadecylsilan
Cl
Độ thanh thải của thuốc
Cmax
Nồng độ thuốc tối đa
DĐH
Dược động học
DHA
Dihydroartemisinin
ESI
Ion hóa bằng phun điện tử
EtOAc
Ethyl acetat
LLOQ
Giới hạn định lượng dưới
MeOH
Methanol
CN
Con người
P.A.
Tinh khiết phân tích
PEG
Poly ethylene glycol
PLGA
Poly(lactic-co-glycolic acid)
r
Hệ số tương quan
RSD
Độ lệch chuẩn tương đối
SD
Độ lệch chuẩn
T1/2
Thời gian bán thải
TB
Trung bình
TLTK
Tài liệu tham khảo
Tmax
Thời gian đạt thuốc đạt nồng độ tối đa
Vd
Thể tích phân bố
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Các thông số dược động học đường tiêm tĩnh mạch của ART ........ 8
Bảng 1.2: Các thông số dược động học đường uống của ART ........................ 9
Bảng 2.1: Danh mục chất chuẩn ..................................................................... 14
Bảng 2.2: Danh mục dung môi ....................................................................... 14
Bảng 2.3: Các thông số detector khối phổ ...................................................... 20
Bảng 3.1: Nồng độ ART trong huyết tương tại các thời điểm sau khi uống hỗn
dịch nano ART ................................................................................................ 22
Bảng 3.2: Nồng độ ART trong huyết tương tại các thời điểm sau khi tiêm tĩnh
mạch hỗn dịch nano ART ............................................................................... 24
Bảng 3.3: Thông số DĐH của ART từ nano ART đường uống ..................... 25
Bảng 3.4: Thông số DĐH của ART từ nano ART đường tiêm tĩnh mạch ..... 26
Bảng 3.5: Nồng độ DHA trong huyết tương tại các thời điểm sau khi uống
hỗn dịch nano ART ......................................................................................... 27
Bảng 3.6: Nồng độ DHA trong huyết tương tại các thời điểm sau khi tiêm tĩnh
mạch hỗn dịch nano ART ............................................................................... 29
Bảng 3.7: Thông số DĐH của DHA từ nano ART đường uống..................... 30
Bảng 3.8: Thông số DĐH của DHA từ nano ART đường tiêm tĩnh mạch..... 31
Bảng 3.9. Bố trí thử nghiệm theo phương pháp chéo đôi ............................... 34
Bảng 3.10: So sánh kết quả thực nghiệm của nano ART với TLTK .............. 35
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của artesunat ....................................................... 6
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của dihydroartemisinin ....................................... 7
Hình 2.1: Quy trình chiết mẫu phân tích ......................................................... 19
Hình 3.1: Đồ thị nồng độ ART trung bình theo thời gian của nano ART đường
uống ................................................................................................................. 23
Hình 3.2: Đồ thị nồng độ ART trung bình theo thời gian của nano ART đường
tiêm tĩnh mạch trên 4 chó 7, 9, 10, 12 ............................................................. 24
Hình 3.3: Đồ thị nồng độ DHA trung bình theo thời gian của nano ART
đường uống...................................................................................................... 28
Hình 3.4: Đồ thị nồng độ DHA trung bình theo thời gian của nano ART
đường tiêm tĩnh mạch trên 4 chó 7, 9, 10, 12 ................................................. 29
ĐẶT VẤN ĐỀ
Thông tin dược động học là nội dung quan trọng đối với bất kỳ thuốc
nào, cả dưới góc độ khoa học, quản lý hay lâm sàng. Ngoài giúp ích trong
việc quyết định liều lượng và khoảng cách đưa thuốc, các thông tin này còn
hỗ trợ định hướng cho quá trình nghiên cứu, cải tiến dạng bào chế [7]. Bộ Y
Tế quy định: hồ sơ đăng ký thuốc phải có thông tin dược động học.
Artesunat là một trong những dẫn chất của artemisinin – hoạt chất chiết
xuất từ cây Thanh hao hoa vàng Artemsia annua L. – được sử dụng rộng rãi
trong điều trị sốt rét do ký sinh trùng Plasmodium falciparum [3]. Ngoài tác
dụng chống sốt rét, nhiều nghiên cứu gần đây còn cho thấy khả năng ngăn
ngừa ung thư của artesunat trên tế bào biểu mô, tế bào thận hay bạch cầu [21],
[24], [33]. Tuy nhiên, nhược điểm độ ổn định và độ tan trong nước kém đã
hạn chế phần nào tác dụng của artesunat. Để khắc phục, hệ tiểu phân nano
được các nhà nghiên cứu tiếp cận như một giải pháp hữu hiệu nhằm cải thiện
các đặc tính sinh học của artesunat và tăng khả năng phân phối thuốc tới tế
bào ung thư.
Tại Việt Nam, nghiên cứu về hệ tiểu phân nano artesunat còn hạn chế,
đang tập trung chủ yếu vào phương pháp chế tạo và chưa có thông tin dược
động học.
Nắm bắt những thực tế trên, đề tài “Xác định một số thông số dƣợc
động
học
của
artesunat
và
chất
chuyển
hóa
có
hoạt
tính
dihydroartemisinin từ hệ tiểu phân nano trên chó” được triển khai với
mục tiêu: xác định các thông số dược động học Cmax, Tmax, AUC, T1/2 của
artesunat và chất chuyển hóa dihydroartemisinin từ liều đơn hệ tiểu phân
nano qua đường uống và đường tiêm tĩnh mạch.
1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Đại cƣơng về dƣợc động học
1.1.1. Các thông số dược động học cơ bản [6], [7], [14]
Dược động học (DĐH) là khái niệm phản ánh số phận của thuốc trong cơ
thể bao gồm 4 quá trình: hấp thu, phân bố, chuyển hóa và thải trừ. Những quá
trình này được biểu hiện qua các thông số dược động học, trong đó có 4 thông
số cơ bản có nhiều ý nghĩa nhất trong thực hành lâm sàng bao gồm:
- Diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian (AUC)
- Thể tích phân bố (Vd)
- Độ thanh thải (Cl)
- Thời gian bán thải (T1/2) .
1.1.1.1. Diện tích dưới đường cong (AUC)
Diện tích dưới đường cong (AUC) biểu thị tượng trưng cho lượng thuốc
vào được vòng tuần hoàn chung ở dạng còn hoạt tính sau một thời gian t.
Để tính AUC, người ta có thể sử dụng phương pháp tích phân:
∫
hoặc tính theo nguyên tắc hình thang:
(∑
)
Trong đó: + AUC là diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian.
+ Ci là nồng độ thuốc tại thời điểm ti.
+ Cn là nồng độ thuốc tại thời điểm cuối cùng.
+
là hằng số tốc độ thải trừ tính qua độ đốc đường thải trừ
của đồ thị logarit nồng độ - thời gian.
Từ giá trị AUC, ta có thể tính toán sinh khả dụng của thuốc bao gồm:
2
- Sinh khả dụng tuyệt đối (F%) là tỷ lệ sinh khả dụng của cùng một thuốc
đưa đường ngoài tĩnh mạch so với đường tĩnh mạch.
- Sinh khả dụng tương đối là tỷ lệ so sánh giữa 2 giá trị sinh khả dụng của 2
chế phẩm khác nhau cùng hoạt chất. Chế phẩm đối chiếu thường là một
thuốc có sinh khả dụng cao và ổn định như thuốc của hãng phát minh hay
thuốc có uy tín trên thị trường.
1.1.1.2. Thể tích phân bố (Vd)
Thể tích phân bố (Vd) là đại lượng biểu thị một thể tích cần phải có để
toàn bộ lượng thuốc được đưa vào cơ thể phân bố ở nồng độ bằng nồng độ
trong huyết tương.
Theo mô hình dược động học một ngăn, Vd được tính theo công thức:
Trong đó: + Vd là thể tích phân bố.
+ A là lượng thuốc được đưa vào cơ thể.
+ Cp là nồng độ thuốc trong huyết tương.
1.1.1.3. Độ thanh thải (Cl)
Độ thanh thải (Cl) hay còn gọi là độ thanh lọc của thuốc là thể tích tưởng
tượng, giả định của huyết tương hoặc huyết thanh được một cơ quan của cơ
thể (thường là gan và thận) loại bỏ hoàn toàn thuốc trong 1 đơn vị thời gian
(phút hoặc giờ). Có thể tính độ thanh thải qua công thức:
hoặc
3
Trong đó: + Cl là độ thanh thải
+ D là liều dùng
+ AUC là diện tích dưới đường cong
+ F là sinh khả dụng
+ vel là tốc độ bài xuất thuốc qua gan và hoặc/thận
1.1.1.4. Thời gian bán thải (T1/2)
Thời gian bán thải (T1/2) hay nửa đời thải trừ là thời gian cần thiết để
nồng độ thuốc trong máu giảm đi một nửa hay lượng thuốc đã vào cơ thể
giảm đi một nửa. Có thể tính thời gian bán thải từ hằng số tốc độ thải trừ ke
qua công thức:
1.1.2. Phương pháp xác định các thông số dược động học
Nhìn chung, phương pháp xác định các thông số dược động học cơ bản
giống phương pháp đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học.
Đối tượng thử nghiệm tốt nhất là trên người tình nguyện nhưng đối
tượng này chỉ được áp dụng với một số trường hợp hạn chế như thuốc đã
nghiên cứu hoàn chỉnh, có dạng bào chế ổn định, độc tính thấp... Trường hợp
thuốc đang trong giai đoạn nghiên cứu, thuốc độc tính cao, nồng độ trong máu
thấp cần tăng liều để định lượng, nghiên cứu dược động học được tiến hành
trên động vật thí nghiệm [4]. Các kết quả thu được từ nghiên cứu trên động
vật có thể giúp dự đoán các thông số DĐH trên người do sự tương quan về
mặt giải phẫu sinh lý giữa người và động vật từ đó định hướng mô hình thiết
kế nghiên cứu DĐH trên người [8].
Theo một số tài liệu tham khảo [4], [15], [51], các loài động vật hay
được sử dụng trong nghiên cứu DĐH và sinh khả dụng là:
- Thỏ: hiền lành, dễ nuôi giữ, dễ lấy máu nhưng đường tiêu hóa khác xa
người, chứa nhiều khí, thể tích máu ít, dễ bị mệt nếu lấy nhiều lần, khó
4
cho uống các chế phẩm dạng viên nguyên vẹn và chuyển hóa thuốc
nhanh hơn người.
- Khỉ: mô hình chuyển hóa thuốc qua đường tiêu hóa của khỉ giống
người nhưng nhược điểm là khó cho uống, khó lấy máu liên tục và chi
phí cao.
- Chó: đường tiêu hóa tương đối giống người. Các thuốc dùng cho người
đều có thể dùng cho chó, có thể lấy máu hoặc nước tiểu nhiều lần đủ
cho nghiên cứu, có thể lưu giữ để thực hiện nghiên cứu đa liều hay
nghiên cứu chéo.
Dựa trên các ưu nhược điểm đã nêu và điều kiện thực tế của đề tài, chúng
tôi đã lựa chọn chó làm đối tượng thử nghiệm.
Mẫu thử nghiệm có thể là máu, nước tiểu hay nước bọt… nhưng hay sử
dụng mẫu máu do quá trình thao tác dễ dàng, chủ động, có thể lấy được lượng
mẫu đủ cho phân tích.
Thời gian lấy mẫu phải kéo dài gấp 3 – 5 lần thời gian bán thải của thuốc
hoặc khi nồng độ trong máu thấp hơn 1/10 – 1/20 đỉnh Cmax [2], [4].
1.2. Đại cƣơng về artesunat và chất chuyển hóa dihydroartemisinin
1.2.1. Vài nét về artemisinin – nguồn bán tổng hợp artesunat
Vào những năm đầu của thập niên 70, các nhà khoa học Trung Quốc đã
chiết xuất được một hoạt chất có tác dụng điều trị sốt rét từ lá cây thanh hao
hoa vàng mang tên Quinghaosu hay còn gọi là artemisinin (ARN) [13]. Phát
kiến này có ý nghĩa rất lớn trong bối cảnh gia tăng tình trạng kháng thuốc với
các hoạt chất chống sốt rét phát hiện trước đó như chloroquin, pyrimethamin,
mefloquin… Mặc dù được chứng minh có hiệu quả điều trị tốt cho cả sốt rét
thể não và sốt rét kháng thuốc nhưng do độ tan trong nước kém, tác dụng điều
trị của artemisinin đã bị hạn chế. Để khắc phục, các nhà khoa học đã tiếp tục
nghiên cứu và bán tổng hợp ra một số dẫn chất mới từ artemisinin như
5
artesunat (ART), artemether, arteether… Các dẫn chất này có hiệu quả điều trị
cao hơn chất gốc và có thể sử dụng qua đường tiêm [13]. Trong đó, artesunat
(dạng muối natri) với đặc tính tan trong nước và hiệu quả gấp 5 lần
artemisinin là dẫn chất được sử dụng phổ biến nhất.
Tại Việt Nam, trên nền tảng tính sẵn có của dược liệu Thanh hao hoa
vàng, phương pháp chiết xuất artemisinin và bán tổng hợp dẫn chất của nó đã
được nghiên cứu từ năm 1989 [13]. Đến thời điểm hiện tại, ARN và ART
được coi là một trong những thuốc điều trị sốt rét cơ bản nằm trong danh mục
thuốc thiết yếu của Bộ Y Tế.
1.2.2. Tính chất lý hóa
1.2.2.1. Artesunat (ART)
Artesunat (C19H28O8) có tên khoa học là (3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 10S,
12R, 12aR) - decahydro - 3,6,9 - trimethyl - 3,12 - epoxy - 12H - pyrano [4,3 j] - 1,2 - benzodioxepin - 10 - ol, hydrogen sucinat, khối lượng phân tử bằng
384,425 g/mol.
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của artesunat
Dược chất tồn tại ở dạng bột kết tinh mịn, màu trắng, dễ tan trong
dicloromethan, aceton và ethanol 96 %, khó tan trong nước (độ tan trong
nước ở 25°C khoảng 56,2 mg/l) [2], [55]. Ngoài tính acid yếu (pKa = 4,35),
artesunat còn rất dễ bị thủy phân. Tốc độ thủy phân phụ thuộc vào nhiệt độ,
độ ẩm và mức độ kiềm [5], [55].
6
1.2.2.2. Dihydroartemisinin (DHA)
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của dihydroartemisinin
Dihydroartemisinin (DHA) có tên khoa học là (3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R,
12R, 12aR) - decahydro - 3,6,9 - trimethyl - 3,12 - epoxy - 12H – pyrano [4,3
- j] - 1,2 - benzodioxepin - 10 – ol, khối lượng phân tử bằng 284,352 g/mol.
Tương tự artesunat, DHA cũng có dạng bột kết tinh mịn, không mùi, khó
tan trong nước, hơi tan trong dicloromethan, acetonitril và ethanol [50]. Do
mang nhóm chức lacton nên DHA cũng dễ bị thủy phân trong môi trường
kiểm và acid mạnh [12].
1.2.3. Đặc điểm dược động học
Artesunat được dùng đường uống, tiêm bắp, tiêm tĩnh mạch hoặc đặt
trực tràng. Sau khi vào máu, hầu hết ART bị chuyển hóa thành dạng có hoạt
tính dihydroartemisinin (DHA), rồi chuyển hóa tiếp thông qua enzym
CYP3A4 và thải trừ qua nước tiểu. Quá trình chuyển hóa và thải trừ diễn ra
nhanh, do đó hoạt tính của ART được xác định gián tiếp thông qua DHA [3].
Với đường tiêm tĩnh mạch (bảng 1.1), nồng độ artesunat ban đầu rất cao
sau đó giảm nhanh, ước tính thời gian bán thải của ART < 15 phút, độ thanh
thải: 2 – 3 l/kg/giờ và thể tích phân bố (Vd) trung bình: 0,1 – 0,3 l/kg. Tương
ứng, các thông số dược động học của DHA lần lượt là: Tmax < 15 phút, T1/2 =
30 – 80 phút, Cl = 0,5 – 1,5 l/kg /giờ, Vd = 0,5 – 1,0 l/kg [23].
7
Bảng 1.1: Các thông số dược động học đường tiêm tĩnh mạch của ART
TL
TK
Liều
Đối
tƣợng
thử
Cmax
Tmax
T1/2
AUC
Cmax
Tmax
T1/2
AUC
[19]
120
mg
CN
13685
-
2,19
876
2192
8
36,7
1845
[22]
120
mg
CN
-
-
3,3
1269
1678
16
47
1393
[36]
2
mg/kg
CN
19420
-
14,5
1595
1286
9,6
69,0
1850
[41]
2,4
mg/kg
CN
29677
-
1,5
1042
3011
0,5
20,7
923
[42]
2,4
mg/kg
CN
130
-
13,2
49,2
605
15
20,4
418
[20]
120
mg
CN
-
-
2,73
1146
2648
9,0
40,2
2377
[48]
2,4
mg/kg
CN
3260
15
15
727
3140
8,4
78,6
3492
[37]
2,4
mg/kg
CN
28558
1,7
10,2
1879
2932
10,8
78
3543
[29]
10
mg/kg
Chuột
5784
5
34,5
2349
3849
5
31,6
1435
[56]
60 mg
Lợn
5308
1,5
18
-
937
10
26
-
[32]
10
mg/kg
Chó
Becgie
3559
-
16,8
3760
2400
-
43.2
1763
ART*
DHA*
“*”: Đơn vị Tmax (giờ), T1/2 (giờ), Cmax (ng/ml), AUC (ng.giờ/ml), “-“: không có dữ liệu
Với đường tiêm bắp, Cmax đạt được của ART thấp hơn, Tmax của DHA,
T1/2, Vd của ART cao hơn nhưng các thông số khác nói chung tương tự đường
tiêm tĩnh mạch. Sinh khả dụng đường tiêm bắp tính theo DHA đạt khoảng
86% [23].
8
Với đường uống (bảng 1.2), nồng độ ART đạt đỉnh trong vòng 1 giờ,
DHA đạt đỉnh trong vòng 2 giờ. Thời gian bán thải của ART vào khoảng 20 35 phút, DHA khoảng 0,5 - 1,5 giờ. Các thông số này gần tương tự ở đường
trực tràng ngoại trừ một số trường hợp có sự kéo dài Tmax và T1/2 [23].
Bảng 1.2: Các thông số dược động học đường uống của ART
Liều
Đối
tƣợng
thử
Cmax
Tmax
T1/2
AUC
Cmax
Tmax
T1/2
AUC
[18]
150
mg
CN
111,5
39
-
153,8
546
69
-
824,6
[19]
100
mg
CN
-
-
-
-
850,2
75
40,1
1160,2
[22]
150
mg
CN
-
-
-
-
568,7
70
46
1109
[46]
4
mg/kg
CN
231,8
37,2
-
206,4
844,5
66
87,6
2044,4
300
mg
a
397
15
31,8
406
500
90
106
1630
[38]
b
194
18,6
34,2
190,8
928
90
104
2600
[40]
200
mg
CN
256,3
39,6
29,4
119
873,7
55,8
-
1331
[53]
100
mg
CN
113,7
42,6
24,6
97,3
338,9
67,8
52,2
501,3
[39]
4
mg/kg
CN
-
-
-
-
519
42
44,4
657
[31]
200
mg
CN
65,5
60
21,6
94,5
900,1
90
70,2
1364,5
200
mg
CN
244
30
21,6
232
488
120
38,4
1074
100
mg
CN
148
60
32,4
189
270
90
39,6
601
[45]
150
mg
Chuột
713,1
5
-
316
2040
37,5
-
1241,7
[29]
10
mg/kg
Chuột
1334
25
68,3
540,6
3802
25
53,7
2593,3
TL
TK
[30]
CN
ART*
DHA*
“*”: Đơn vị Tmax (giờ), T1/2 (giờ), Cmax (ng/ml), AUC (ng.giờ/ml), “a”: ART
Guilin, “b”: ART Arenco, “-“: không có dữ liệu
9
1.2.4. Tác dụng dược lý
Artesunat có tác dụng chống sốt rét mạnh gấp 5 lần artemisinin. Mặc dù
không có tác dụng với thể giao tử và giai đoạn hồng cầu nhưng ART rất hiệu
quả trong việc diệt thể phân liệt của mọi ký sinh trùng sốt rét, đặc biệt với thể
não do chủng P. falciparum gây ra, kể cả trường hợp đã kháng chloroquin.
Bên cạnh tác dụng điều trị sốt rét, các nghiên cứu gần đây còn chỉ ra
nhiều bằng chứng về khả năng chống ung thư của ART.
Kết quả khảo sát trên 55 dòng tế bào của Effeth T. và cộng sự (2001) cho
thấy artesunat tác dụng mạnh nhất với ung thư bạch cầu và ung thư đại tràng.
So sánh với một số thuốc chống ung thư khác, ART có hiệu quả cao, độc tính
thấp và không xuất hiện sự kháng chéo trên các dòng tế bào [24].
Berger và cộng sự (2005) lần đầu tiên báo cáo về việc điều trị dài ngày
ART kết hợp với hóa trị liệu thông thường giúp kéo dài thời gian sống của 2
bệnh nhân u melanome [21].
Trong một thử nghiệm lâm sàng ngẫu nghiên – mù đôi khác về ung thư
trực tràng, quá trình tự chết theo chương trình của tế bào ung thư được tìm
thấy ở 67 % bệnh nhân được dùng artesunat. Theo dõi trong 42 tháng, chỉ 1
bệnh nhân trong nhóm dùng artesunat tái phát ung thư trực tràng thay vì 6
bệnh nhân ở nhóm dùng giả dược [33].
Cơ chế chống ung thư của artesunat hiện vẫn đang được nghiên cứu với
nhiều giả thuyết như tăng cảm ứng apoptosis (quá trình tự chết theo chương
trình) của tế bảo khối u, ức chế tăng sinh nội mạch máu, giảm phá hủy DNA,
ức chế sự tăng sinh Wnt/β-catenin/TCF (yếu tố dẫn đến ung thư đường tiêu
hóa) hay giảm sự xâm lấn/di căn khối u [25], [34], [35], [49], [57].
Các bằng chứng về tiềm năng chống ung thư của ART hiện chỉ dừng lại
ở quy mô nghiên cứu, chưa được FDA chấp thuận, do đó chống ung thư
không nằm trong chỉ định chính thức của artesunat.
10
1.2.5. Tác dụng không mong muốn
Tác dụng không mong muốn của ART thường nhẹ và thoáng qua. Các
phản ứng hay gặp bao gồm: phản ứng trên hệ tiêu hóa (buồn nôn, đau bụng, ỉa
chảy…); nhức đầu, chóng mặt; tăng enzym gan; giảm bạch cầu… [3].
1.2.6. Chỉ định, chống chỉ định
Artesunat được chỉ định điều trị sốt rét do tất cả các loại Plasmodium, kể
cả sốt rét nặng do P. falciparum đa kháng, chống chỉ định với các trường hợp
quá mẫn cảm với thuốc [3].
1.2.7. Liều dùng
Artesunat thường được dùng kết hợp cùng các thuốc chống sốt rét khác
như amodiaquin, mefloquin hoặc pyrimethamin – sulfadoxin với liều uống
cho người lớn và trẻ em là 4 mg/kg/ngày trong 3 ngày. Liều tiêm bắp hoặc
tiêm tĩnh mạch là 2,4 mg/kg, tiêm lặp lại sau 12 h, sau đó mỗi ngày tiêm một
lần với cùng liều 2,4 mg/kg. Với trẻ em < 5 tuổi, sử dụng viên đặt đơn liều 10
mg/kg cân nặng [3].
1.3. Đại cƣơng về hệ tiểu phân nano polyme
1.3.1. Vài nét về hệ tiểu phân nano polyme
Nano polyme là hệ tiểu phân rắn, có kích thước < 1 µm trong đó dược
chất có thể được hòa tan, bẫy, nang hóa, liên kết hóa học hoặc hấp phụ lên bề
mặt tiểu phân nano polyme [9], [1]. Hệ mang thuốc này sở hữu nhiều ưu điểm
như khả năng cải thiện độ tan, độ ổn định, kéo dài thời gian giải phóng, tạo
đặc tính hướng đích, cao hơn là kích hoạt giải phóng theo chu trình hay có
khả năng chẩn đoán, trị liệu [16].
Để bào chế nano polyme, người ta thường sử dụng các polyme phân hủy
sinh học như poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA), polylactic acid (PLA),
polycaprolacton (PCL) đơn độc hoặc kết hợp với polyme thiên nhiên
(chitosan, aginat…). Trong đó, PLGA là một trong số ít polyme được Cục
11
quản lý Dược phẩm và thực phẩm Hoa Kỳ FDA chấp thuận sử dụng trong bào
chế thuốc cho người do tính tương thích cao, thời gian thoái hóa dài, không
độc hại và có khả năng kéo dài giải phóng [26], [28].
Tuy nhiên, nhược điểm của PLGA là bề mặt sơ nước dẫn đến tăng khả
năng bị nhận diện bởi hệ thống miễn dịch của cơ thể. Do đó nhiều biện pháp
nhằm thay đổi đặc tính lý hóa bề mặt nano PLGA đã được thực hiện như sử
dụng kết hợp với polyme thân nước (PEG, chitosan… ) do tiểu phân thân
nước có thời gian lưu trữ trong máu lâu hơn và hạn chế tích lũy ở gan [1].
Thời gian lưu trữ trong máu kéo dài giúp nano thực hiện mục tiêu điều
trị ung thư tốt hơn thông qua việc tích tụ ở dịch kẽ, bất hoạt hoạt động của
mạch bạch huyết, từ đó ngăn cản sự thoát nước của mô, gây phù và giết chết
khối u [26].
1.3.2. Một số nghiên cứu về hệ tiểu phân nano artesunat – PLGA
Tại Việt Nam, nano ART – PLGA bước đầu đã được nghiên cứu và thu
được một số kết quả khả quan.
Nguyễn Hạnh Thủy và cộng sự (2014) đã tiến hành bào chế nano ART PLGA đồng thời thử tác dụng trên một số tế bào ung thư người. Nghiên cứu
tạo ra dạng nano với hiệu suất mang thuốc cao (83,4 %), thời gian giải phóng
kéo dài (48 giờ: 24 giờ đầu giải phóng nhanh 80 % dược chất, 24 giờ sau giải
phóng chậm) và khả năng ức chế tế bào ung thư tốt hơn dạng ART tự do [27].
Cùng hướng nghiên cứu trên, năm 2015, tác giả Hồ Hoàng Nhân tiến
hành tối ưu hóa công thức và đánh giá đặc điểm của nano ART – PLGA bao
chitosan. Kết quả cho thấy nano bao chitosan có khả năng giải phóng kéo dài
đến 48 giờ đồng thời hạn chế được sự giải phóng dược chất ồ ạt trong 24 giờ
đầu. Độc tính trên tế bào ung thư MCF – 7 và A549 tăng và hiệu suất mang
thuốc đạt 77,3 % [43].
12
Đến năm 2016, hướng nghiên cứu được tiếp tục mở rộng với sự thay đổi
màng bao PLGA/PEG hóa thay cho màng bao PLGA – chitosan do những ưu
điểm vượt trội của PLGA/PEG hóa như tăng độ ổn định, giảm tính kháng
nguyên và khả năng bị thực bào, cải thiện thời gian lưu thông trong máu [26]
và đơn giản hóa quá trình bào chế so với PLGA bao chitosan. Kết quả, nano
ART – PLGA/PEG hóa cho hiệu suất mang thuốc lên tới 92,48 %. Khi thử
giải phóng in vitro trong môi trường pH 7,4, nano cho thời gian giải phóng
kéo dài tới 48 giờ [11], [5].
Những kết quả tiềm năng nêu trên là nền tảng để chúng tôi tiếp tục tiến
hành nghiên cứu in vivo một số thông số dược động học của nano ART –
PLGA/PEG hóa.
13
2. CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Hóa chất, thiết bị và động vật thí nghiệm
2.1.1. Hóa chất
Chất chuẩn:
Bảng 2.1: Danh mục chất chuẩn
Tên chuẩn
Nguồn gốc
Lô SX
Hàm lƣợng
Artesunat
Viện kiểm
0209012
100,05 %
Artemisinin
nghiệm thuốc
0209012
99,08 %
DHA
trung ương
0309136.01
99,46 %
Dung môi:
Bảng 2.2: Danh mục dung môi
STT
Tên
Độ tinh khiết
Hãng sản xuất
1
Acetonitril
HPLC
Merck – Đức
2
Acid acetic băng
P.A.
Merck – Đức
3
Ethyl acetat
P.A.
Merck – Đức
4
Kali dicromat
P.A.
Chemapol – Nga
5
Methanol
HPLC
Merck – Đức
6
Natri Clorid
P.A.
Merck – Đức
2.1.2. Thiết bị
- Máy sắc ký lỏng khối phổ Agilent 1290/6460
- Bộ lọc dung môi (màng lọc 0,45 µm)
- Cân phân tích Mettler toledo XPE 105, Mettler AB 204
- Máy lắc xoáy votex Benchmixer BV 1010
- Máy lắc ngang GFL 3006
- Máy ly tâm Herme Z306
14
- Máy siêu âm Daihan WUC – A06H
- Máy cô nitơ Hanon HN200
- Tủ lạnh sâu -30°C Sanyon MDF U333
- Micropipet
+ 10 – 100 µl HTL LABMATEpro LMP
+ 100 – 1000 µl Nichipet EX 5000
+ 1000 – 5000 µl Nichipet EX 5000
- Tủ lạnh bảo quản chuẩn HAIER HYC - 940
- Tủ sấy Memmert ULM 500
Dụng cụ:
- Ống nghiệm có chứa sẵn chất chống đông heparin 5 ml.
- Bơm kim tiêm 5 ml.
- Đầu côn micropipet 0,1; 1; 5 ml.
- Ống ly tâm, vial thủy tinh.
- Bình định mức, pipet chính xác và các dụng cụ thủy tinh khác.
2.1.3. Động vật thí nghiệm
Thí nghiệm được tiến hành trên chó, giống đực, khỏe mạnh, cân nặng 10
± 1 kg. Cho chó nhịn đói ít nhất 10 giờ trước khi tiến hành thử thuốc. Trước
và trong quá trình thử nghiệm, chó không được uống bất kỳ loại thuốc nào.
2.2. Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là nano ART – PLGA/PEG hóa do Viện Công
nghệ Dược phẩm Quốc gia cung cấp với các đặc điểm:
- Thành phần: ART, PLGA, PLGA – mPEG.
- Phương pháp bào chế: ART, PLGA và PLGA – mPEG được hòa tan
trong dung môi diclomethan, sau đó hỗn hợp được nhỏ giọt vào dung
dịch Tween 80 kết hợp siêu âm và khuấy từ. Nhũ tương thu được tiếp tục
được khuấy từ trong vòng 4 giờ sau đó đem ly tâm. Phần cắn được rửa 3
15
lần và phân tán vào nước cất. Hỗn dịch nano ART sau đó được tinh chế
và tiến hành đông khô để thu được nano ART dưới dạng rắn [11], [5].
2.3. Nội dung nghiên cứu
Xác định nồng độ ART và DHA trong huyết tương chó ở các thời điểm
khác nhau sau khi cho sử dụng 1 liều đơn nano ART – PLGA/PEG hóa. Dựa
trên các kết quả thu được, tính toán 4 thông số dược động học: Cmax, Tmax,
AUC, T1/2 của artesunat và chất chuyển hóa có hoạt tính dihydroartemisinin từ
hệ tiểu phân nano.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Định lượng ART và DHA trong huyết tương
2.4.1.1. Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu
- Chế phẩm thử:
Chế phẩm thử là hỗn dịch tiểu phân nano ART phân tán trong nước có
nồng độ ART bằng 2,4 mg/ml.
- Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được tiến hành trên tổng cộng 12 con chó, mỗi đường đưa
thuốc thử với 6 con. Nhóm các chó uống hỗn dịch nano ART đánh số từ 1 đến
6. Nhóm các chó tiêm tĩnh mạch hỗn dịch nano ART đánh số từ 7 đến 12.
Thời điểm thử nghiệm của hai nhóm độc lập với nhau.
- Liều thử: 2,4 mg/kg cân nặng, cùng liều ở cả hai nhóm.
- Thời điểm lấy mẫu:
Mẫu phân tích được lấy tại 12 thời điểm: ngay trước khi uống/tiêm thuốc
(sử dụng làm mẫu chứng trắng), sau uống/tiêm thuốc 15, 30, 45, 60, 90, 120,
240, 360 phút, 9, 24, 30 giờ và được đánh số lần lượt là i.0 (mẫu chứng
trắng), i.1,…, i.11 trong đó i là số thứ tự của chó lấy máu.
16
- Vị trí lấy mẫu:
Mẫu máu được lấy tại tĩnh mạch khoeo chân hoặc tĩnh mạch cổ của chó
thí nghiệm.
- Quy trình lấy mẫu:
Cố định chó trên bàn thí nghiệm, dùng bơm tiêm 5 ml hút khoảng 3 – 4
ml máu tại tĩnh mạch khoeo chân hoặc tĩnh mạch cổ trước khi cho uống/tiêm
chế phẩm thử vào ống nghiệm đã có heparin để chống đông (mẫu chứng
trắng). Sau đó, tiến hành cho chó uống hoặc tiêm thuốc qua đường tĩnh mạch
trong tình trạng không gây mê. Các mẫu máu sau khi đưa thuốc được lấy
tương tự mẫu chứng trắng.
Kết thúc quá trình lấy máu (30,5 giờ sau khi cho chó uống/tiêm tĩnh
mạch nano ART), tiến hành lấy tối đa lượng máu có thể để thu được huyết
tương trắng phục vụ bước xây dựng đường chuẩn.
Ngay sau khi lấy, các mẫu máu được tiến hành ly tâm 5000 vòng trong 7
phút để tách riêng huyết tương:
+ Với mẫu ký hiệu i.0, i.1,…, i.11: huyết tương được hút chuyển vào ống
nghiệm có sẵn dung dịch (trong nước) K2Cr2O7 0,4M với thể tích bằng
10 % thể tích huyết tương đã lấy.
+ Với mẫu trắng: huyết tương sẽ được hút chuyển sang ống nghiệm sạch
và đậy kín.
Trong quá trình thí nghiệm, để đảm bảo sức khỏe, chó được bổ sung
nước muối sinh lý và dung dịch glucose 5 % tại thời điểm 1 giờ, 4 giờ kể từ
khi uống/tiêm chế phẩm thử. Kết thúc điểm lấy mẫu cuối của ngày 1, chó
được cho ăn bình thường.
-
Bảo quản: Tất cả các mẫu huyết tương được bọc kín bằng parafin, sau
đó bảo quản trong tủ lạnh sâu - 30°C và tiến hành phân tích trong vòng 30
ngày kể từ ngày lấy mẫu.
17