Xây dựng phương pháp phân tích một số kháng sinh nhóm cephalosporin bằng điện di mao quản

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ HUỆ
Mã sinh viên: 1201245

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN
TÍCH MỘT SỐ KHÁNG SINH
NHÓM CEPHALOSPORIN BẰNG
ĐIỆN DI MAO QUẢN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2017


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ HUỆ
Mã sinh viên: 1201245

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN
TÍCH MỘT SỐ KHÁNG SINH
NHÓM CEPHALOSPORIN BẰNG
ĐIỆN DI MAO QUẢN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Người hướngdẫn:
ThS. Nguyễn Thị Thùy Linh
Nơi thực hiện:
Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất

HÀ NỘI - 2017


LỜI CẢM ƠN
Khóa luận này được hoàn thành tại bộ môn hóa phân tích, trường Đại học
Dược Hà Nội với sự chỉ bảo tận tình của ThS.Nguyễn Thị Thùy Linh cùng các thầy
cô trong bộ môn Hóa phân tích Trường Đại học Dược Hà Nội.
Tôi xin phép bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới người cô, người đã tận tình
hướng dẫn tôi, đã dành nhiều thời gian và công sức giúp đỡ tôi trong quá trình
nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và toàn thể cán bộ nhân viên Trường
Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi tận tình trong quá trình thực hiện
khóa luận.
Cuối cùng tôi vô cùng cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân đã động viên
và hết lòng giúp đỡ để tôi hoàn thành khóa luận này.
Hà Nội, tháng 5 năm 2017
Sinh viên
Lê Thị Huệ


MỤC LỤC
Trang
ĐẶT VẤN ĐỀ........................................................................................................1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN.................................................................................2
1.1 .Tổng quan về nhóm kháng sinh cephalosporin............................................2
1.1.1. Công thức cấu tạo, phân loại, phổ tác dụng ...........................................2
1.1.2.Công thức, tính chất của các cephalosporin và amoxicillin.....................5
1.1.3. Các phương pháp phân tích định lượng cephalosporin............................7
1.2. Tổng quan về điện di mao quản....................................................................11
1.2.1. Khái niệm ...............................................................................................11

1.2.2 . Nguyên lý của quá trình điện di mao quản............................................12
1.2.3. Kỹ thuật đưa mẫu và tiêm mẫu...............................................................13
1.2.4. Phân loại.................................................................................................14
1.3. Tổng quan về phƣơng pháp chuẩn nội........................................................16
1.3.1. Khái niệm...............................................................................................16
1.3.2. Yêu cầu đặt ra với chất chuẩn nội...........................................................16
1.3.3. Phương pháp chuẩn hóa nhiều điểm ......................................................17
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................18
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị................................................................................18
2.1.1. Nguyên vật liệu .....................................................................................18


2.1.2. Hóa chất, trang thiết bị...........................................................................19
2.2. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................19
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu..............................................................................20
2.3.1. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn, dung dịch thử và các dung dịch làm việc.20
2.3.2. Khảo sát và lựa chọn điều kiện điện di....................................................21
2.3.3. Thẩm định phương pháp phân tích...........................................................21
2.3.4. Ứng dụng .................................................................................................23
2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu .......................................................................23
CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN...........................25
3.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện điện di........................................................25
3.1.1. Khảo sát dung dịch điện ly nền.................................................................25
3.1.2. Khảo sát bước sóng phát hiện ..................................................................25
3.1.3. Mao quản và xử lý mao quản....................................................................26
3.1.4. Khảo sát pH dung dung dịch điện ly nền..................................................27
3.1.5 Khảo sát nồng độ dung dịch điện ly nền...................................................29
3.1.6. Khảo sát điện thế đặt vào hai đầu mao quản............................................30
3.1.7. Khảo sát thời gian bơm mẫu....................................................................31
3.1.8. Tổng kết điều kiện tối ưu.........................................................................33

3.1.9. Định tính các kháng sinh trên điện di đồ.................................................33
3.2. Thẩm định phƣơng pháp phân tích.............................................................35


3.2.1. Độ phù hợp hệ thống...............................................................................35
3.2.2. Độ đặc hiệu.............................................................................................37
3.2.3. Khoảng nồng độ tuyến tính.....................................................................39
3.2.4. Độ lặp lại ...............................................................................................42
3.2.5. Độ đúng...................................................................................................44
3.3. Ứng dụng định lƣợng trong chế phẩm.........................................................46
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................50
TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................................52


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid

Chromatography)
HPLC-RP

Sắc ký pha đảo
(Reversed-phase high-performance liquid chromatographic)

CE

Điện di mao quản (Capillary electrophoresis)

CZE

Điện di mao quản vùng (capillary zone electrophoresis)

EOF

Dòng điện thẩm (electroosmotic flow)

UV-VIS

Bước sóng tử ngoại –khả kiến

AMOX

Amoxillin

CPN

Cephalexin

CFR

Cefdinir

CFM

Cefixim

C

Nồng độ

tM

Thời gian di chuyển

S

Diện tích

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối


DANH MỤC CÁC BẢNG
STT Tên

Nội dung

Trang

bảng
1

1.1

Công thức, tính chất, chỉ định của CPN, CFR, CFM, AMOX

5

2

1.2

Một số nghiên cứu định lượng cephalosporin bằng HPLC

7

3

2.1

Thông tin và đặc điểm từng loại chế phẩm phân tích

18

4

3.1

Tổng kết các điều kiện tối ưu

33

5

3.2

Độ phù hợp hệ thống của cephalexin

35

6

3.3

Độ phù hợp hệ thống của cefdinir

36

7

3.4

Độ phù hợp hệ thống của cefixim

36

8

3.5

Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích của kháng sinh

39

cephalexin
9

3.6

Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích của kháng sinh

40

cefdinir
10

3.7

Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích của kháng sinh

41

cefixim
11

3.8

Kết quả đánh giá độ lặp lại trên mẫu kháng sinh cephalexin

43

500mg
12

3.9

Kết quả đánh giá độ lặp lại trên mẫu kháng sinh cefdinir

43

300mg
13

3.10

Kết quả đánh giá độ lặp lại trên mẫu kháng sinh cefixim

44

200mg
14

3.11

Kết quả đánh giá độ đúng của cephalexin

45

15

3.12

Kết quả đánh giá độ đúng của cefdinir

45

16

3.13

Kết quả đánh giá độ đúng của cefixim

46

17

3.14

Kết quả định lượng chế phẩm cefalexin

47

18

3.15

Kết quả định lượng chế phẩm cefnivid

48

19

3.16

Kết quả định lượng chế phẩm lecefti

49

DANH MỤC CÁC HÌNH
STT Tên

Nội dung

Trang

hình
1

1.1

Công thức chung của các kháng sinh cephalosporin

2

2

1.2

Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo của hệ điện di mao quản

11

3

3.1

Điện di đồ khi sử dụng dung dịch đệm photphat hoặc borat

25

4

3.2

Phổ hấp thụ của các kháng sinh

26

5

3.3

Điện di đồ của các kháng sinh ở pH khác nhau

28

6

3.4

Điện di đồ tại nồng độ borat 10mM, 20mM, 30mM, 40mM

30

7

3.5

Điện di đồ ở điện thế 10kV, 15kV, 20kV, 25kV

31

8

3.6

Điện di đồ khi bơm mẫu 6s, 8s, 10s, 12s

32

9

3.7

Điện di đồ của các kháng sinh cephalosporin ở điều kiện tối 33
ưu

10

3.8

Điện di đồ của các kháng sinh AMOX, AMOX+CPN, 34
AMOX+CFR, AMOX+CFM

11

3.9

Điện di đồ định tính các kháng sinh

35

12

3.10

Điện di đồ các kháng sinh chứng minh độ đặc hiệu

38

13

3.11

Đường chuẩn của kháng sinh cephalexin

40

14

3.12

Đường chuẩn của kháng sinh cefdinir

41

15

3.13

Đường chuẩn của kháng sinh cefixim

42

16

3.14

Điện di đồ định lượng viên cefalexin

48

17

3.15

Điện di đồ định lượng viên cefnirvid

48

18

3.16

Điện di đồ định lượng viên lecefti

49

ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, khi xã hội ngày càng phát triển thì vấn đề sức khỏe của con người
ngày càng được chú trọng đặc biệt là các sản phẩm liên quan trực tiếp đến sức khỏe.
Kháng sinh là nhóm thuốc rất quan trọng trong công tác phòng, chữa bệnh.
Các kháng sinh được phân thành nhiều nhóm khác nhau dựa vào cấu tạo hóa học
(kháng sinh nhóm β-lactam, aminoglycosid, tetracyclin, quinolon, macrolid...);
trong đó các kháng sinh nhóm β-lactam được sử dụng rộng rãi. Trong nhóm βlactam các kháng sinh nhóm cephalosporin được sử dụng ngày càng nhiều.
Cephalosporin là nhóm kháng sinh bán tổng hợp quan trọng chữa bệnh cho con
người, thú y, phổ kháng khuẩn rộng tác dụng trên cả vi khuẩn Gr(+) và Gr(-), đang
được chỉ định rộng rãi trong việc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn tại nước ta. Nhóm
này đứng thứ 7 trong số 10 loại thuốc dùng nhiều nhất để điều trị các bệnh nhiễm
khuẩn với doanh số 7,2 tỷ đô la năm 1999, sau đó là các penicillin và các nhóm
kháng sinh khác[2]. Hàm lượng kháng sinh trong chế phẩm không đúng với hàm
lượng ghi trên nhãn sẽ không đạt hiệu quả điều trị, vi khuẩn dễ nhờn thuốc, kháng
thuốc, từ đó việc chữa trị bệnh càng khó khăn. Vì vậy kiểm soát chất lượng các
kháng sinh là quan trọng và cần thiết, trong đó có việc xác định hàm lượng kháng
sinh trong chế phẩm.
Ở Việt Nam đã có rất nhiều công trình nghiên cứu tách và định lượng đồng
thời các kháng sinh cephalosporin trong các mẫu dược phẩm, sinh học, thực phẩm
và môi trường, phần lớn làm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). HPLC là kỹ
thuật tách chọn lọc, độ lặp lại tốt. Tuy nhiên kỹ thuật phải sử dụng một lượng lớn
dung môi hữu cơ, giá thành phân tích cao. Hiện nay, điện di mao quản là một kỹ
thuật đang được phát triển với một số ưu điểm như: hiệu lực tách tốt, dung môi, hóa
chất ít, an toàn, tiết kiệm chi phí.
Kỹ thuật điện di mao quản (CE) đã được đưa vào phương pháp chung của
DĐVN IV[3], nhưng các chuyên luận sử dụng CE chưa có nhiều. Tách và xác định
đồng thời kháng sinh cephalosporin bằng phương pháp điện di mao quản trong mẫu
dược phẩm là một hướng nghiên cứu mới. Vì vậy chúng tôi quyết định chọn đề tài

1


là “ Xây dựng phương pháp phân tích một số kháng sinh nhóm cephalosporin bằng
điện di mao quản”. Với hai mục tiêu:
1. Xây dựng được phương pháp định lượng một số kháng sinh nhóm

cephalosporin bằng điện di mao quản.
2. Ứng dụng phương pháp này để định lượng một số kháng sinh nhóm

cephalosporin trong chế phẩm đang lưu hành trên thị trường.

2


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về nhóm kháng sinh cephalosporin
1.1.1. Công thức cấu tạo, phân loại, phổ tác dụng
a) Công thức chung của cephalosporin
Các cephalosporin cấu trúc chung gồm 2 vòng: vòng β-Lactam 4 cạnh gắn
với 1 dị vòng 6 cạnh, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R. Khác nhau bởi các
gốc R[1].

Hình 1.1. Công thức chung của các kháng sinh cephalosporin
Tên gọi chung của các cephalosporin khi chưa có gốc R là: (6R,7R) 8-oxo-5-thia-1azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid
Khi thay đổi các gốc R, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R được các
cephalosporin có độ bền, tính kháng khuẩn và dược động học khác nhau.
b) Phân loại và phổ tác dụng
Dựa vào khổ kháng khuẩn, chia các cephalosporin thành 4 thế hệ[5]. Các
cephalosporin thế hệ trước tác dụng trên vi khuẩn gram dương mạnh hơn, nhưng

trên gram âm yếu hơn thế hệ sau và ngược lại .
- Cephalosporin thế hệ 1 (cephalexin, cefadroxil, cefazolin...): Có hoạt tính mạnh
trên các chủng vi khuẩn Gram-dương nhưng hoạt tính tương đối yếu trên các chủng

3


vi khuẩn Gram-âm. Phần lớn cầu khuẩn Gram-dương nhạy cảm với cephalosporin
thế hệ 1 (trừ enterococci, S. epidermidis và S. aureus kháng methicilin). Hầu hết
các vi khuẩn kỵ khí trong khoang miệng nhạy cảm, nhưng với B fragilis thuốc
không có hiệu quả. Hoạt tính tốt trên các chủng Moraxella catarrhalis, E.coli, K.
pneumoniae, và P. mirabilis.
- Cephalosporin thế hệ 2 (cefaclor, cefuroxim...): Các cephalosporin thế hệ 2 có
hoạt tính mạnh hơn trên vi khuẩn Gram-âm so với thế hệ 1 (nhưng yếu hơn nhiều so
với thế hệ 3). Một số thuốc như cefoxitin, cefotetan cũng có hoạt tính trên B.
Fragilis.
- Cephalosporin thế hệ 3 (cefotaxim, cefdinir, cefixim...): Cephalosporin thế hê ̣ 3
nói chung có hoạt tính chố ng cầ u khuẩ n Gram dương y ếu hơn thế hê ̣ 1, nhưng có
tác dụng tố t hơn nhiề u đ ối với họ Enterobacteriaceae kể cả các chủng tiế t beta lactamase. Mô ̣t s ố các thuốc như ceftazidim, cefoperazon cũng có tác dụng chố ng
Pseudomonas aeruginosa, nhưng ít có tác dụng chố ng cầ u khuẩ n Gram dương hơn
các thuố c thế hê ̣ 3 khác.
- Cephalosporin thế hệ 4 (Cefepim, cefpirom): Cephalosporin thế hê ̣ 4, có phổ
kháng khuẩ n rô ̣ng so với thuố c thế hê ̣ 3 và có đô ̣ bề n vững cao đối với sự thủy phân
bởi các beta - lactamase qua trung gian thể nhiễm sắc và plasmid. Kháng sinh thế hê ̣
4 được dùng để điều trị đặc hiệu nhiễm trực khuẩn Gram âm ưa khí đã kháng với
cephalosporin thế hệ 3.
Đối tượng mà đề tài nghiên cứu là các cephalosporin sau: cephalexin,
cefdinir, cefixim. Các cephalosporin này hiện đang được sử dụng nhiều trong điều
trị và các công ty dược trong nước sản xuất rất nhiều. Để tăng độ lặp lại của phương
pháp điện di chúng tôi lựa chọn phương pháp chuẩn nội. Vì vậy cần lựa chọn chất

chuẩn nội cho phù hợp.

4


1.1.2. Công thức, tính chất của các cephalosporin và amoxicillin
Bảng 1.1. Công thức, tính chất, chỉ định của CPN, CFR, CFM, AMOX
Công thức cấu tạo

Tính chất

Chỉ định

-Bột kết tinh
trắng hay gần
như trắng.

AMOX

-Khó tan trong
.3H2O
C16H19N3O5S. 3H2O

nước và trong
ethanol 96%
-Tan trong các

acid (6R)- 6- (a- D- 4 Hydroxyphenylglycylamino) penicilanic
trihydrat

dung dịch acid
loãng và dung
dịch hydroxyd
kiềm loãng.
-Bột kết tinh màu Cefalexin được

C16H17N3O4S.H2O

CPN

acid (6R,7R)-7-[[(2R)-2-amino-2phenylacetyl]amino]-3-methyl-8-oxo-5thia-1-azabicyclo

[4.2.0]oct-2-en-2-

carboxylic monohydra

trắng, mùi lưu

chỉ định để điều

huỳnh

trị các bệnh

-Ít tan trong

nhiễm trùng

nước

đường hô hấp,

-Tan trong dung

nhiễm trùng

dịch kiềm loãng.

đường tiết niệu,

Thực tế không

nhiễm trùng da và

tan trong ethanol

mô mềm, viêm tai

96%,ether

giữa và nhiễm
trùng khác

5


-Bột kết tinh màu Điều trị nhiễm
trắng đến hơi

khuẩn mức độ

vàng nâu

nhẹ đến vừa do

CFR

-Ít tan trong nước các chủng vi

C14H13N5O5S2
acid 8-[2-(2-amino-1,3-thiazol-4-yl)-1hydroxy-2-nitroso-ethenyl]amino-4ethenyl-7-oxo-2-thia-6azabicyclo[4.2.0]oct-4-ene-5carboxylic

- Nó ít hòa tan

khuẩn nhạy cảm

trong axit

trong các trường

clohydric loãng

hợp :Viêm phổi

và ít hòa tan

mắc tại cộng

trong đệm

đồng, đợt cấp của

phosphate 0,1M

viêm phế quản

pH 7,0.

mãn, nhiễm
khuẩn da không
biến chứng...

-Bột trắng hoặc

Điều trị các bệnh

gần như trắng,

nhiễm trùng cấp

hơi hút ẩm.

tính sau khi gây

-Ít tan trong

ra bởi vi sinh vật:

nước, tan trong

-Nhiễm trùng

CFM

methanol, hơi tan đường hô hấp
trong ethanol,

C16H15N5O7S2.3H2O

-Nhiễm trùng

thực tế không tan đường tiết niệu

acid(6R,7R)-7-[[(Z)-2(2aminothiazol-4-yl)-2-

trong ethyl

: ví dụ như viêm

[(carboxymethoxy)imino]acetyl]

acetat.

bàng quang

amino]-3-ethenyl-8-oxo-5-thia-1
azabicyclo[4.2.0]oct-2-en-2-carboxylic
trihydrat

Nhận thấy amoxicillin có cấu trúc hóa học tương tự các chất nghiên cứu nên

lựa chọn amoxicillin làm chất chuẩn nội.
6


1.1.3. Các phương pháp phân tích định lượng cephalosporin
Các nghiên cứu trên thế giới
a) Định lượng cephalosporin bằng phương pháp HPLC
Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng một vai trò vô cùng
quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau, nhất
là trong việc tách và phân tích lượng vết các chất. Phương pháp HPLC với cột tách
pha đảo được sử dụng rất rộng rãi để xác định các kháng sinh cephalosporin trong
các loại mẫu khác nhau do có nhiều ưu thế so với các phương pháp khác vì có độ
chính xác, độ nhạy, độ lặp lại cao, khoảng tuyến tính rộng…
Bảng 1.2. Một số nghiên cứu định lượng cephalosporin bằng HPLC
Chất phân

Chương trình sắc ký (cột-pha động-tốc Thời gian

tích

độ dòng-bước sóng phát hiện)

lưu

Srinivasa Rao

Cefditoren

Cột C18 (250 x 4,6 mm, 5μm)-methanol

2,75 phút

Narala và

Pivoxil trong

: đệm kali dihydrogen photphat (75:25

K.Saraswa[21]

chế phẩm

v/v)-1ml/phút-231nm

Cefdinir

Cột C18 (250 x 4,6 mm, 5μm)-acetonitril 2,97 phút

trong chế

: đệm kali dihydrogen photphat (70:30

phẩm

v/v) - 1ml/phút - 285nm

Hassan Y.

Ceftriaxone,

Cột C18 (150 mm × 4,6 mm, 5μm)-đệm

Tách

Aboul-Enein

cefixim,

photphat 50mM (pH=5) : methanol

trong

và các cộng

cefdinir trong (80:20 v/v)-1ml/phút-230nm

vòng 7

sự[18]

huyết tương

phút

Tên tác giả

người

7

b) Phương pháp quang học
Rageh A.H và cộng sự đã đề xuất phương pháp quang phổ để xác định
cefaclor monohydrat, cefadroxil monohydrat, cephalexin khan, cefradin khan,
cefotaxime sodium, cefoperazone sodium, ceftriaxone sodium, ceftazidime
penthydrate, natri cefazolin, cefixime và cefpodoximeproxetil trong công thức
dược phẩm. Phương pháp này dựa trên sự thủy phân của các loại thuốc được
nghiên cứu trong NaOH 0,5M ở 100oC để tạo ra các ion sulfid và phản ứng tiếp
theo của các ion sulfide hình thành với NBD-Cl (4-chloro-7-nitrobenzo-2-OXA-1,
3-diazole) để tạo thành sản phẩm màu vàng đo ở 390 nm [20].
Chavala A.K và cộng sự mô tả một phương pháp để xác định ceftazidim
và cefepim dựa trên phản ứng ngưng tụ của chúng với 1-naphthoquinolone-4sulphonate (NQS) trong môi trường có tính kiềm để tạo thành sản phẩm có màu
cam. Kết quả cho thấy Ceftazidim và cefepim có độ hấp thụ tối đa ở 495 nm và
475 nm và tuyến tính trong khoảng nồng độ tương ứng là 20-80 và 20-140
µg/mL. Phương pháp đề xuất được áp dụng cho việc định lượng ceftazidim và
cefepim trong các chế phẩm tiêm thương mại [14].
Elbashir và cộng sự đề xuất phương pháp quang phổ huỳnh quang cho việc
phân tích cephalosporin trong công thức dược phẩm. Phương pháp được dựa trên
một phản ứng giữa các cephalosporin với 1-naphthoquinolone-4-sulphonate
(NQS) trong môi trường kiềm, để tạo ra các dẫn chất có phát huỳnh quang chiết
với chloroform và sau đó đo bằng máy quang phổ huỳnh quang. Định luật Beer
đúng trong khoảng nồng độ 10-60; 5-35 và 10-60 ng/mL tương ứng cho cefixim,
cephalexin, và natri cefotaxim [15, 16, 17].

8


c) Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE)
Gần đây, phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt về hiệu
quả tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít. Phương pháp đã được ứng

dụng để tách và xác định các kháng sinh cephalosporin trong nhiều đối tượng mẫu
khác nhau.
Attila Gaspar và cộng sự đã tách và xác định thành công 14 kháng sinh họ
cephalosporin bằng phương pháp điện di mao quản vùng (capillary zone
electrophoresis – CZE). Quá trình tách dùng đệm photphat 25 mM có pH= 6,8.
Phương pháp này tách được 14 kháng sinh trong vòng 20 phút, giới hạn phát hiện
14 kháng sinh cefalosporin C, cefoxitin, cefazolin, cefadroxil, cefoperazon,
cefamandol, cefaclor, CEP, CEF, ceftibuten, cefuroxim, ceftazidim, cefotaxim,
ceftriaxon với giới hạn phát hiện 0,42 – 1,62 µg/l. Mục đích của phương pháp được
ứng dụng để nghiên cứu độ bền của kháng sinh họ cephalosporins trong nước tại
nhiệt độ khác nhau (+25, +4 và -180C). Kết quả cho thấy các kháng sinh giảm nồng
độ không lớn hơn 20% tại nhiệt độ phòng sau khi pha loãng [11].
A. R. Solangi, S. Q. Memon, M. Y. Khuhawar, and M. I. Bhanger đã xây
dựng phương pháp để tách và định lượng hỗn hợp tám kháng sinh nhóm
cephalosporins gồm: cefadroxil (CFL), cefixim (CIX), cefuroxim natri (CFR),
ceftriaxon sodium (CTR), ceftizoxim (CFT), cefaclor (CFC), cefradin (CFD), và
cefotoxim (CTA). Phương pháp này tách được các chất trong vòng chưa đầy 11
phút. Quá trình tách dùng đệm natri tetraborat 50mM, pH=9, điện thế là 30 kV. Giới
hạn phát hiện nằm trong phạm vi 0,5-5 µg/mL. Phát hiện là do hấp thụ UV 214 nm.
Phương pháp này được áp dụng để phân tích các cephalosporin trong dược phẩm
và trong nước tiểu, độ lệch chuẩn tương đối ( n = 4) là RSD trong khoảng 0,31,9%[12].
Mrestani Y, Neubert R, Hartl A, Wohlrab J đã xác định các kháng sinh
cephalosporin (cephalexin, cefadroxil, cefaclor, Ceftazidim, cefsulodin, Cefotaxim,

9


cefamandol, Cefuroxim, cefodizim) trong nước tiểu và trong mật. Việc xác định các
cephalosporin đã được thực hiện như là một phương pháp trực tiếp. Các mẫu chỉ
được pha loãng trong đệm và được tiêm vào thiết bị mà không cần bất kỳ sự chuẩn

bị mẫu nào khác. Việc xác định và tách các cephalosporin trong cả hai môi trường
dùng đệm citrat 50mM, pH=6, điện thế 30kV. Khoảng nồng độ tuyến tính nằm
trong khoảng từ 10-500 µg / ml [19].
Yong–MinLi và cộng sự đã tiến hành phân tích kháng sinh cephalexin bằng
phương pháp sắc ký điện động mixen (MEKC). Phương pháp đã tách biệt hoàn toàn
cefadroxil từ mười chất có liên quan được biết trong vòng 15 phút (bao gồm cả
quá trình rửa). Việc tách được thực hiện trong hệ đệm acetate (50 mM; pH 5,25) có
chứa sodium dodecyl sulfate (SDS 110 mM). Mao quản silica dài 44 cm (chiều dài
hiệu dụng 36 cm), điện áp 18 kV; nhiệt độ 15oC; và bước sóng phát hiện là 254 nm
[22].
Nghiên cứu tại Việt Nam
Ở Việt Nam cũng có nhiều nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật điện di mao quản
trong phân tích các kháng sinh nhóm cephalosporin. Nguyễn Văn Yên và Nguyễn
Thị Thanh Phương đã tách và xác định thành công hỗn hợp 5 kháng sinh thuộc
nhóm cephalosporin sử dụng nhiều ở Việt Nam: cephalexin, cephadroxil, cefixim,
cefaclor, cefotaxim. Qúa trình tách sử dụng đệm Na2HPO4 10mM:MeOH (8:2), điện
thế 25 kV và bước sóng phát hiện là 283 nm[10].
Nhìn chung phương pháp quang học là đơn giản, dễ tiến hành nhưng thường
phải tạo phản ứng để tạo thành sản phẩm có màu. Với phương pháp HPLC kết quả
tách tốt, độ chính xác, độ nhạy cao nhưng giá thành chi phí phân tích một mẫu lớn,
tốn dung môi. Khả năng phân giải của CE giúp cho việc tách các cephalosporin
tương đối nhanh và đơn giản. Phương pháp điện di mao quản (CE) ngày càng được
sử dụng nhiều do đặc điểm thuận lợi của nó (hiệu quả tách cao, tính linh hoạt lớn,
phương pháp phát triển nhanh chóng và sử dụng ít mẫu và thuốc thử). Trong khóa

10


luận này chúng tôi tiến hành nghiên cứu phương pháp để định lượng đồng thời
cephalexin, cefixim, cefdinir bằng phương pháp điện di mao quản.

1.2. Tổng quan về điện di mao quản
1.2.1. Khái niệm
Điện di là hiện tượng di chuyển của tiểu phân tích điện hòa tan hay phân tán
trong chất điện giải khi có dòng điện đi qua. Cation di chuyển về phía cực âm
(cathod), anion di chuyển về phía cực dương (anod). Các phần tử không tích điện
không bị hút về phía hai điện cực.
Điện di mao quản (CE – capillary electrophoresis) là một kỹ thuật tách các
chất trong dung dịch lỏng dựa trên sự di chuyển khác nhau của các phân tử chất
(mang điện tích) trong cột mao quản dưới ảnh hưởng của điện trường tạo bởi điện
áp cao thế (10 – 30 kV) đặt vào hai đầu mao quản.

Hình 1.2. Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo của hệ điện di mao quản
Một hệ thiết bị CE cơ bản bao gồm các bộ phận sau:


Mao quản tách: thường làm bằng vật liệu silic (gọi là mao quản silica, là loại mao
quản phổ biến nhất), teflon, PEEK, với đường kính ngoài (OD) 365 μm, đường
kính trong (ID) từ 10 đến 150 μm (phổ biến nhất là 50 μm). Tổng chiều dài mao
quản có thể từ 10 đến 100 cm (thường là 60 cm). Chiều dài hiệu dụng (là chiều dài
11


tính từ đầu bơm mẫu của mao quản đến vị trí đặt detector) thường dao động từ 25 –
50 cm đối với mao quản dài 60 cm. Trong quá trình điện di, mao quản được nạp
đầy dung dịch đệm điện di.


Dung dịch đệm điện di: dùng để tạo môi trường cho quá trình điện di xảy ra khi áp
thế cao vào hai đầu mao quản. Trong quá trình điện di, hai đầu mao quản được được
đặt trong hai bình chứa dung dịch đệm điện di. Lưu ý: Hai lọ đựng dung dịch đệm

tại hai đầu mao quản phải ở độ cao ngang bằng nhau.



Nguồn điện thế cao: thường dao động từ 10 đến 30 kV, dùng để áp vào hai đầu mao
quản nhằm sinh ra điện trường lớn cho quá trình điện di xảy ra.



Detector (cảm biến): bộ phận phát hiện và ghi nhận tín hiệu của chất phân tích sau
quá trình phân tách điện di mao quản, do đó thường được đặt ở phần cuối (gần cuối
hoặc cuối) của mao quản tuỳ theo loại cảm biến. Các loại cảm biến thông dụng
trong phương pháp CE bao gồm: hấp thụ phân tử (UV-Vis), huỳnh quang phân tử,
phát xạ hoặc hấp thụ nguyên tử, khối phổ, đo dòng, đo thế và đo độ dẫn.



Bộ phận tiêm mẫu tự động.



Bộ phận điều khiển: thường là máy tính sử dụng phần mềm chuyên dụng phù hợp,
để ghi nhận, hiển thị và xử lý kết quả phân tích. Hiện nay, bộ phận này còn có thể
thực hiện chức năng điều khiển tự động hoá quá trình phân tích từ khâu bơm mẫu
đến khâu cho ra kết quả cuối cùng của quá trình phân tích điện di mao quản.



Bộ phận điều nhiệt cho mao quản

1.2.2. Nguyên lý của quá trình điện di mao quản
Quá trình vận hành của CE điển hình với mao quản mà mặt trong thành mao
quản không có lớp bao và mao quản chứa dung dịch đệm làm việc, thì nhóm
silanol hiện diện trên thành phía trong của mao quản thủy tinh sẽ giải phóng ion
hydrogen vào dung dịch đệm và bề mặt thành mao quản sẽ tích điện âm ngay cả ở
pH rất thấp. Cation hay các chất hòa tan tích điện dương một phần trong môi
trường bị hút tĩnh điện vào thành mao quản tích điện âm tạo nên một lớp điện
tích kép.

12


Quá trình điện di bắt đầu bằng cách đặt thế trên chiều dài cột mao quản làm
cho phần dung dịch của lớp điện tích kép di chuyển về phía đầu cathod của mao
quản kéo theo khối dung dịch. Sự chuyển động của khối dung dịch dưới tác dụng
của lực điện trường được gọi là dòng điện thẩm (electroosmotic flow - EOF). Mức
độ ion hóa của nhóm silanol trên thành mao quản phụ thuộc chủ yếu vào pH của
dung dịch đệm làm việc và các chất điều chỉnh được thêm vào chất điện giải. Ở pH
thấp, nhóm silanol nói chung có độ ion hóa thấp và dòng EOF nhỏ. Ở pH cao hơn,
nhóm silanol bị ion hóa nhiều hơn và dòng EOF tăng.
Ngoài pH của dung dịch đệm dòng EOF sẽ thay đổi khi :
 Lực ion của dung dịch tăng lên, làm giảm thế zeta nên dòng EOF giảm
 Trong một số trường hợp, các dung môi hữu cơ như methanol hay acetonitril
được cho thêm vào dung dịch đệm để làm tăng độ tan của các chất hòa tan và
các chất phụ gia hay để ảnh hưởng đến mức độ ion hóa của mẫu. Nói chung,
việc thêm các chất điều chỉnh hữu cơ sẽ làm giảm dòng EOF.
Detector được đặt về phía đầu cathod của mao quản. Dòng EOF thường lớn
hơn linh độ điện di. Do vậy, ngay cả anion cũng bị đẩy về phía cathod và
detector. Khi sử dụng đệm phosphat pH 7,0 ở mao quản không có lớp bao, thông
thường trình tự xuất hiện các chất tan trong điện di đồ là các cation, các

chất trung tính và các anion.
1.2.3. Kỹ thuật đưa mẫu và tiêm mẫu
Cách đưa mẫu vào trong mao quản bao gồm tiêm kiểu di chuyển điện (kiểu
điện động), và tiêm áp suất âm và tiêm áp suất dương (kiểu thủy tĩnh).
Để tiêm kiểu di chuyển điện, dung dịch mẫu được đưa vào mao quản bằng
cách nhúng mao quản và điện cực vào trong lọ mẫu và đặt lên đó một điện thế
cao trong thời gian ngắn. Mẫu đi vào mao quản bằng sự phối hợp của điện di và
dòng EOF. Bởi vậy, các chất phân tích có linh độ khác nhau đi vào trong mao quản

13


ở mức độ khác nhau. Độ dẫn của mẫu thử và chất chuẩn cũng ảnh hưởng đến dòng
EOF và thể tích tiêm.
Tiêm áp suất âm là đặt áp suất âm ở đầu mao quản có detector và hút dung
dịch mẫu vào đầu tiêm của mao quản. Tiêm áp suất dương là tạo áp suất lên lọ
chứa mẫu, đẩy mẫu vào trong mao quản. Tiêm áp suất có thể đưa tất cả các thành
phần của mẫu vào trong mao quản ở cùng một mức độ, nói chung là cho độ tái lặp
tốt nhất và là cách tiêm thường được áp dụng nhất. Thể tích mẫu phụ thuộc vào
chiều dài và đường kính trong của mao quản và điện thế hay áp suất áp đặt. Thể tích
mẫu đặc trưng được tiêm vào trong mao quản khoảng từ 1 -20 nL.
Mỗi một phương pháp tiêm mẫu có những ưu và nhược điểm riêng, tùy
thuộc vào thành phần của mẫu, kiểu tách và áp dụng phương pháp. Không có kiểu
tiêm mẫu nào nói trên có độ tái lặp như bộ tiêm mẫu của máy sắc ký lỏng hiệu
năng cao hiện đang có mặt trên thị trường. Tùy theo hoàn cảnh cụ thể, cần thiết
phải sử dụng chất chuẩn nội cho các phương pháp cụ thể khi cần sự tiêm mẫu chính
xác.
1.2.4 Phân loại
Hiện nay, có 5 loại chủ yếu của điện di mao quản:
 Điện di mao quản vùng (capillary zone electrophoresis - CZE) còn gọi là

điện di dung dịch tự do hay điện di mao quản dòng tự do.
 Sắc ký mixen điện động, còn gọi là sắc ký điện động mixen (micellar
electrokinetic chromatography - MEKC).
 Điện di mao quản gel (capillary gel electrophoresis - CGE).
 Điện di mao quản hội tụ đẳng điện (capillary isoelectric focusing - CIEF)
 Điện di mao quản đẳng tốc (capillary isotachophoresis - CITP).

14


Nguyên lý của điện di mao quản vùng
Trong điện di mao quản vùng, quá trình tách được kiểm soát bằng sự khác
nhau về linh độ tương đối của từng thành phần trong mẫu thử hoặc dung dịch
thử. Linh độ là hàm số của điện tích chất phân tích và kích thước trong điều kiện
nhất định của phương pháp. Chúng được tối ưu hóa bằng cách kiểm soát các thành
phần của đệm, pH và lực ion.
Điện di mao quản vùng sử dụng nguyên lý của điện di và điện thẩm để tách
các tiểu phân tích điện. Linh độ điện di của ion (uEP), được biễu diễn bằng phương
trình:
uEP=q/(6𝝅ηr)
Trong đó q là điện tích của ion, η là độ nhớt dung dịch và r là bán kính của ion
hydrat hóa. Từ mối liên hệ này suy ra, chất phân tích kích thước nhỏ, điện tích lớn
có linh độ lớn. Chất phân tích kích thước lớn, điện tích nhỏ có linh độ thấp.
Tốc độ di chuyển (vEP), tính bằng cm/s, được biểu thị bằng phương trình:
VEP=uEP(V/L)
Trong đó uEP là linh độ điện di, V là điện thế đặt và L là chiều dài (cm) tổng cộng
của mao quản.
Tốc độ của EOF (vEO), tính bằng cm/s, được biễu diễn bằng phươ ng trình:
VEO=uEO(V/L)
Thời gian (t), tính bằng giây, cần thiết cho chất tan di chuyển trên toàn bộ chiều

dài hiệu dụng (l) của mao quản (từ đầu vào đến detector), t được biểu thị bằng hệ
thức sau:
t = l / E( uEP + uEO ) = lL /V( uEP +uEO )

15


Trong đó E là cường độ điện trường và các ký hiệu khác được định nghĩa như ở
trên.
Hiệu lực của hệ thống điện di có thể liên quan đến linh độ, dòng EOF và được biểu
thị bằng số đĩa lý thuyết (N), được tính bằng phương trình:
N = ( uEP + uEO ) V/ 2D
Trong đó D là hệ số khuếch tán của chất hòa tan và các ký hiệu khác được định
nghĩa như trên.
Độ phân giải (R) của hai chất hòa tan được rửa giải kế tiếp nhau, có thể
xác định bằng phương trình:
R=0,18 ( uEP1- uEP2 )[V/D( ūEP + uEO )]1/2
Trong đó uEP1 và uEP2 độ của hai chất hòa tan, ūEP là linh độ trung bình của hai chất
tan và các ký hiệu khác được định nghĩa như trên.
1.3 .Tổng quan về phƣơng pháp chuẩn nội
1.3.1. Khái niệm
Kỹ thuật chuẩn nội có thể được tóm tắt như sau: Người ta thêm vào cả mẫu
chuẩn lẫn mẫu thử những lượng bằng nhau của một chất tinh khiết, rồi tiến hành
chạy trong cùng điều kiện. Chất được thêm này được gọi là chất chuẩn nội.
Từ những dữ kiện về: diện tích (hoặc chiều cao) pic và lượng (hoặc nồng độ)
của chuẩn, chuẩn nội, mẫu thử, có thể xác định được hàm lượng của thành phần cần
định lượng trong mẫu thử một cách chính xác.
1.3.2. Yêu cầu đặt ra với chất chuẩn nội
- Trong cùng điều kiện, chất chuẩn nội phải tách được hoàn toàn và có thời gian lưu
gần với thời gian lưu của chất phân tích trong mẫu thử.

- Có cấu trúc hóa học tương tự như chất thử.
16