Xây dựng phương pháp xác định các thuốc nhóm sulfonylurea trộn lẫn trong các chế phẩm đông dược bằng sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.99 MB, 76 trang )
BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ HÀ OANH
Mã sinh viên : 1201450
XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
CÁC THUỐC NHÓM SULFONYLUREA
TRỘN LẪN TRONG CÁC CHẾ PHẨM
ĐÔNG DƢỢC BẰNG SẮC KÝ LỚP
MỎNG HIỆU NĂNG CAO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
HÀ NỘI - 2017
BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ HÀ OANH
Mã sinh viên : 1201450
XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
CÁC THUỐC NHÓM SULFONYLUREA
TRỘN LẪN TRONG CÁC CHẾ PHẨM
ĐÔNG DƢỢC BẰNG SẮC KÝ LỚP
MỎNG HIỆU NĂNG CAO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Ngƣời hƣớng dẫn :
1. PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh
2.Ths.NCS Đào Thị Cẩm Minh
HÀ NỘI 2017
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh,
người thầy đã hướng dẫn và chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và
hoàn thành khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn NCS.Ths. Đào Thị Cẩm Minh – giảng viên khoa Dược
trường Đại học Y-Dược Huế, nghiên cứu sinh, người đã động viên, giúp đỡ tôi rất nhiều
trong quá trình thực hiện khóa luận.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới dược sĩ Phạm Thị Tâm – giảng viên khoa Dược trường
Đại học Y- Dược Thái Bình.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, các Thầy Cô giáo, các Kỹ thuật viên bộ
môn Hoá Phân Tích - Độc Chất - Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi
cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng tôi muốn gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnh ủng hộ,
khích lệ tạo động lực cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Hà Nội, ngày 18 tháng 5 năm 2017
Sinh viên
Nguyễn Thị Hà Oanh
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ____________________________________________________________ 1
Chƣơng 1 : TỔNG QUAN ___________________________________________________ 3
Tổng quan về đối tƣợng nghiên cứu ______________________________ 3
Các thực phẩm bảo vệ sức khoẻ và thuốc thảo dƣợc hỗ trợ điều trị và điều
trị tiểu đƣờng ________________________________________________ 3
Tổng quan về nhóm sulfonylurea ________________________________ 6
1.1.2.1 Glipizid ____________________________________________________________________ 6
1.1.2.2
Glimepirid _______________________________________________________________ 7
1.1.2.3
Gibenclamid _____________________________________________________________ 8
1.1.2.4
Gliclazid ________________________________________________________________ 9
Tổng quan về phƣơng pháp nghiên cứu ___________________________ 9
1.2.1 Sắc ký lớp mỏng _________________________________________ 9
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ___________________ 15
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị và đối tƣợng nghiên cứu ______________ 15
2.1.1 Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu ______________________________________________ 15
2.1.2 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu _____________________________________________________ 15
2.1.3 Đối tượng nghiên cứu ___________________________________________________________ 16
2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu ___________________________________ 17
2.2.1 Xây dựng quy trình định tính, định lượng glipizid, glimepirid, glibenclamid và gliclazid trộn lẫn trong
chế phẩm đông dược bằng HPTLC______________________________________________________ 17
2.2.1.1 Xây dựng quy trình xử lý mẫu _________________________________________________ 17
2.2.1.2 Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký ___________________________________________ 17
2.2.2 Thẩm định phương pháp _________________________________________________________ 18
2.2.3 Ứng dụng phương pháp HPTLC để phân tích mẫu thực _________________________________ 20
2.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu __________________________________ 20
Chƣơng 3 : THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ___________________________________ 21
3.1 Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp HPTLC _________________ 21
3.1.1 Khảo sát và lựa chọn điều kiện HPTLC _____________________________________________ 21
3.1.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu _____________________________________________________ 24
3.1.3
Thẩm định phương pháp _______________________________________________________ 28
3.1.3.1 Tính chọn lọc ______________________________________________________________ 28
3.1.3.2
Tính thích hợp hệ thống ___________________________________________________ 29
3.1.2.3
Khoảng tuyến tính ________________________________________________________ 30
3.1.2.4
Độ đúng, độ chính xác của phương pháp ______________________________________ 31
3.1.2.5
Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng _______________________________________ 34
3.1.4 Ứng dụng phương pháp HPTLC để phân tích mẫu thực_________________________________ 36
CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN __________________________________________________ 42
4.1 Lựa chọn phƣơng pháp phân tích ____________________________ 42
4.2 Xây dựng phƣơng pháp ____________________________________ 43
4.2.1 Điều kiện xử lý mẫu_____________________________________________________________ 43
4.3 Thẩm định phƣơng pháp ___________________________________ 44
4.4 Về kết quả nghiên cứ trên mẫu thực__________________________ 45
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ _______________________________________________ 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
1. Phụ lục 1
2. Phụ lục 2
1.1.
Sắc kí đồ analog đường tuyến tính Glipizid
1.2.
Sắc kí đồ analog đường tuyến tính glimepirid
1.3.
Sắc kí đồ analog đường tuyến tính glibenclamid
1.4.
Sắc kí đồ analog đường tuyến tính gliclazid
3. Phụ lục 3
Định lượng mẫu thực
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
AOAC
Hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thức (Association of
Official Analytical Chemists)
Glib
Glibenclamid
Glic
Gliclazid
Glim
Glimepirid
Glip
Glipizid
LOQ
Giới hạn định lượng (Limit of quantitation)
RSD
Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)
TLC
Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)
TEM
Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron
Microscopy)
TPBVSK
Thực phẩm bảo vệ sức khoẻ
WHO
Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization)
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Thành phần nền mẫu dược liệu tự tạo ................................................................ 16
Bảng 3.2 Kết quả khảo sát dung môi chiết của 4 chất phân tích ........................................ 25
Bảng 3.3 Kết quả đánh giá độ thích hợp hệ thống của phương pháp HPTLC ................... 30
Bảng 3.4 Kết quả đánh giá khoảng tuyến tính của 4 chất phân tích .................................. 31
Bảng 3.5 Đánh giá kết quả độ lặp lại và độ đúng của 4 chất phân tích.............................. 32
Bảng 3.6 . Kết quả xác định LOD, LOQ của 4 chất phân tích ........................................... 36
Bảng 3.7. Kết quả định lượng 4 chất trên mẫu thực ........................................................... 39
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1 Công thức cấu tạo của Glipizid ............................................................................. 6
Hình 1.2 Công thức cấu tạo của Glimepirid ......................................................................... 7
Hình 1.3 Công thức cấu tạo của Glibenclamid..................................................................... 8
Hình 1.4 Công thức cấu tạo của Gliclazid ............................................................................ 9
Hình 3.1. Kết quả khảo sát hệ dung môi pha động, trong đó 1- Gliclazid; 2-Glibenclamid;
3-Glipid; 4-Glimepirid; 5- hỗn hợp 4 chất chuẩn ............................................................... 21
Hình 3.2. Kết quả khảo sát hệ n- butylacetat chứa acid formic các tỷ lệ ........................... 22
Hình 3.3. Sắc kí đồ hệ n-butylacetat chứa 0,5% acid formic, sắc kí nhắc lại .................... 24
Hình 3.4 Kết quả phổ UV của các chất phân tích: a- Glip; b- Glim; c- Glib; d- Glic........ 24
Hình 3.5 Kết quả khảo sát dung môi chiết ......................................................................... 26
Hình 3.6 Sơ đồ xử lý mẫu phân tích ................................................................................... 27
Hình 3.7 Sắc ký đồ đánh giá độ chọn lọc HPTLC :1- trắng ; 2- chuẩn ; ........................... 28
3- trắng thêm chuẩn ............................................................................................................ 28
Hình 3.8 Sắc ký đồ analog của hỗn hợp hoạt chất xác định tính chọn lọc của phương pháp
(a)-chất chuẩn; (b)-mẫu placebo tự tạo; (c)- hỗn hợp chuẩn trên nền mẫu placebo. ......... 29
Hình 3.9 Sắc ký đồ analog xác định LOD của: a- Glip (96 ng/ vết);b- Glim (192 ng/ vết);
c-Glib (192 ng/vết); d- Glic(480 ng/ vết). .......................................................................... 35
Hình 3.10 Sắc kí đồ phân tích các mẫu chế phẩm đông dược trên thị trường ................... 37
Hình 3.11 Kết quả chồng phổ mẫu âm tính ........................................................................ 38
Hình 3.12 Kết quả chồng phổ UV các mẫu dương tính với Glibenclamid ........................ 38
ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, con người có xu hướng phòng bệnh, cải thiện sức khỏe và điều trị những
bệnh mãn tính bằng những sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên. Các thuốc đông dược,
thực phẩm bảo vệ sức khoẻ (TPBVSK) có nguồn gốc tự nhiên đang là mục tiêu mà các
nhà sản xuất và người tiêu dùng trong nước cũng như trên thế giới hướng tới. Tuy
nhiên, tình trạng tân dược được trộn trái phép trong đông dược, TPBVSK từ dược liệu
đang diễn ra (thành phần có hoạt chất tân dược nhưng không công bố trên nhãn) .
Đái tháo đường là một bệnh mạn tính và có thể gây tổn hại nghiêm trọng cho
nhiều hệ thống cơ thể trong một thời gian dài. Theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế
giới (WHO), có khoảng 422 triệu bệnh nhân đái tháo đường trên toàn thế giới và
khoảng 90% trong số đó là đái tháo đường typ II (không phụ thuộc insulin) [19].
Trên thị trường dược phẩm, bốn nhóm thuốc tổng hợp chính bao gồm: sulfonylure,
biguanid, thiazolidin và các thuốc khác không phải sulfonylure, được sử dụng phổ
biến để điều trị tiểu đường typ II. Đã có những nghiên cứu công bố thuốc giảm
glucose máu thường bị phát hiện trộn lẫn trái phép trong các chế phẩm đông dược
như metformin, glibenclamid, gliclazid [15], [17]; ... Nếu sử dụng các chế phẩm
này trong một thời gian dài mà không biết rõ thành phần, liều lượng người sử
dụng có thể xuất hiện biểu hiện của tác dụng không mong muốn như nhiễm toan
lactic, tổn thương gan thận, rối loạn tiêu hóa…[20], [21]. Do đó, một nhu cầu cấp
thiết nhằm phát triển một phương pháp nhanh chóng để sàng lọc các chế phẩm
đông dược bị trộn lẫn các thuốc tân dược này.
Để góp phần vào công tác kiểm tra phát hiện các chất cấm trộn lẫn trong các
chế phẩm đông dược, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng phƣơng pháp xác
định một số thuốc nhóm sulfonylurea trộn lẫn trong các chế phẩm đông dƣợc
bằng sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao”.
1
Với mục tiêu:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định tính, bước đầu định lượng các
thuốc nhóm sulfonylurea trộn lẫn trong các chế phẩm đông dược bằng sắc
ký lớp mỏng hiệu năng cao.
2. Ứng dụng phương pháp này để phân tích một số mẫu chế phẩm đông dược lưu
hành trên thị trường.
2
Chƣơng 1 : TỔNG QUAN
Tổng quan về đối tƣợng nghiên cứu
Các thực phẩm bảo vệ sức khoẻ và thuốc thảo dƣợc hỗ trợ điều trị và điều trị
tiểu đƣờng
Thực phẩm bảo vệ sức khỏe là sản phẩm được chế biến dưới dạng viên nang, viên
hoàn, viên nén, cao, cốm, bột, lỏng và các dạng chế biến khác có chứa một hoặc hỗn
hợp của các chất sau đây: a) Vitamin, khoáng chất, acid amin, acid béo, enzym,
probiotic và chất có hoạt tính sinh học khác; b) Hoạt chất sinh học có nguồn gốc tự
nhiên từ động vật, chất khoáng và nguồn gốc thực vật ở các dạng như chiết xuất, phân
lập, cô đặc và chuyển hóa [3].
Thuốc y học cổ truyền (bao gồm cả vị thuốc y học cổ truyền và thuốc thang) là
thuốc có thành phần là dược liệu được chế biến, bào chế hoặc phối ngũ theo lý luận và
phương pháp của y học cổ truyền hoặc theo kinh nghiệm dân gian thành chế phẩm có
dạng bào chế truyền thống hoặc hiện đại [2].
Thuốc thành phẩm y học cổ truyền (thuốc đông y, thuốc từ dược liệu) là dạng
thuốc y học cổ truyền đã qua tất cả các giai đoạn sản xuất, kể cả đóng gói và dán nhãn,
bao gồm: Thuốc dạng viên, thuốc dạng nước, thuốc dạng chè, thuốc dạng bột, thuốc
dạng cao và các dạng thuốc khác [2].
Mặc dù trong những năm gần đây đã có sự cải tiến của các loại thuốc chống đái
tháo đường tổng hợp, điều trị bệnh tiểu đường vẫn không đạt được thành công rõ rệt.
Điều trị bệnh tiểu đường rất phức tạp do đây là bệnh mãn tính, người bệnh phải dùng
thuốc cả cuộc đời, trong khi đó lại thiếu thuốc an toàn và hiệu quả, không bền vững về
lâm sàng…Ngược lại, các loại thuốc thảo dược đã đạt được những thành công trong
điều trị, hỗ trợ điều trị tiểu đường, đặc biệt là tính an toàn cao hơn, ít tác dụng bất lợi
hơn và khả năng hạ thấp lượng đường trong máu ổn định. Ở các nước phát triển, việc
3
sử dụng thuốc thảo dược cho người mắc bệnh tiểu đường được khuyến khích bởi
những lo ngại về tác dụng phụ và chi phí liên quan tới việc sử dụng lâu dài các thuốc
tân dược. Ở Việt Nam, các thuốc đông dược và TPBVSK sử dụng hỗ trợ điều trị tiểu
đường rất đa dạng. Người bệnh có thể đến các nhà thuốc để mua các TPBVSK có số
đăng ký, được bào chế thành dạng viên nén, viên nang hoặc trà túi lọc thuận tiện cho
việc sử dụng. Trong khi đó, các chế phẩm thuốc đông dược của các lương y, lương
dược (không có số đăng ký) được bào chế dưới dạng viên hoàn hay thuốc bột ngoài
được bán tại cơ sở chế biến còn được bán trên các trang mạng xã hội, người bệnh
không cần đến tận nơi cũng có thể có được sản phẩm thuốc để sử dụng. Điều này vừa
có lợi vừa bất lợi cho người bệnh, khi những chế phẩm này chưa được kiểm soát chặt
chẽ có thể có những chế phẩm bị trộn lẫn tân dược mà người sử dụng không được biết.
Về thành phần của các thuốc đông dược và TPBVSK hỗ trợ điều trị tiểu đường
cũng rất đa dạng. Các chế phẩm có thể chỉ có 1 hoặc nhiều thành phần là dược liệu.
Các dược liệu phổ biến nhất được sử dụng trong các chế phẩm này là dây thìa canh,
khổ qua, nhàu, giảo cổ lam, sinh địa, hoài sơn…
Tuy thuốc từ thảo dược đã sử dụng lâu đời, nhưng người sử dụng có rất ít kiến
thức về tính an toàn của nó. Thuốc đông dược được tự do bán trong cửa hàng thực
phẩm sức khỏe, trong siêu thị và được tiếp thị tràn lan trên các trang mạng. Do
quy định thiếu chặt chẽ, có nhiều thuốc thảo dược kém chất lượng và có tình trạng
trộn với thuốc tổng hợp không khai báo. Đây cũng là vấn đề mà các cơ quan chức
năng của nước ta cũng rất quan tâm. Trong những năm gần đây, cùng với sự phối hợp
của các cơ quan công an, thanh tra dược, hệ thống kiểm nghiệm từ Trung ương đến địa
phương đã phát hiện nhiều loại thuốc và chế phẩm đông dược có trộn lẫn tân dược.
Trong đó bao gồm cả chế phẩm có và không có nguồn gốc, được sản xuất trong nước
hay nhập từ nước ngoài nhưng nhiều nhất là các chế phẩm không có số đăng ký. Các
4
chế phẩm này ngày càng được làm giả một cách khéo léo và tinh vi : ví dụ trộn tân
dược vào vỏ nang, lượng trộn được tính theo liều dùng của thuốc…
Nhằm đảm bảo chất lượng dược liệu, thuốc y học cổ truyền, thuốc từ dược liệu
sử dụng trong phòng và điều trị bệnh, Bộ Y tế đã ban hành nhiều văn bản chỉ đạo
tăng cường công tác quản lý chất lượng dược liệu, thuốc y học cổ truyền, thuốc từ
dược liệu, đặc biệt là Chỉ thị số 03/CT-BYT ngày 24/02/2012 về việc tăng cường
quản lý cung ứng, sử dụng dược liệu, thuốc Y học cổ truyền, thuốc từ dược liệu
trong các cơ sở khám chữa bệnh bằng y học cổ truyền với nhiều giải pháp đồng
bộ. Kết quả kiểm tra đánh giá chất lượng thuốc năm 2013, toàn quốc có 56.179
mẫu thuốc đã được kiểm tra đánh giá chất lượng (cả thuốc tân dược và đông
dược), trong đó phát hiện 1004 mẫu thuốc (1,79 %) không đạt chỉ tiêu chất lượng
và 08 (0,014%) mẫu thuốc giả; tỷ lệ thuốc giả và thuốc kém chất lượng là (1,8%).
Tỷ lệ thuốc giả và thuốc kém chất lượng năm 2013 (1,8%) giảm so với năm 2012
(3,09%) [7].
Đã có nhiều nghiên cứu đã chỉ ra tình trạng trộn lẫn tân dược trong các chế phẩm
đông dược hỗ trợ điều trị tiểu đường tại các nước [10], [15]... Tại Trung Quốc năm
2010, khi kiểm tra 30 mẫu thuốc cổ truyền và thực phẩm chức năng trên thị trường đã
phát hiện trong 14 mẫu có chứa các thuốc chống đái tháo đường tổng hợp (gồm có:
glibenclamid, metformin, rosiglitazon, glimepirid, phenformin…) [15]. Trong một
nghiên cứu khác tiến hành năm 2009 cũng tại nước này, trong số 20 mẫu thuốc thảo
dược được kiểm tra, 5 thuốc được phát hiện có chứa glibenclamid, 3 thuốc chứa
gliclazid, 3 thuốc chứa phenformin, hai thuốc khác chứa glimepirid và metformin [17].
Tại Ả Rập Saudi, trong nghiên cứu công bố năm 2006, khi tiến hành kiểm tra các mẫu
chế phẩm nguồn gốc dược liệu cũng đã phát hiện một số mẫu dương tính với
glibenclamid [11].
5
Từ các nghiên cứu ở các nước trên thế giới, nhận thấy các thuốc nhóm
sulfonylurea như glibenclamid, gliclazid, glimepirid có thể được trộn vào các chế phẩm
đông dược hỗ trợ điều trị tiểu đường, để góp phần nghiên cứu đồng thời 4 hoạt chất
chống đái tháo đường nhóm sulfonyurea là glipizid, glimepirid, glibenclamid và
gliclazid, đề tài này đã được tiến hành.
Tổng quan về nhóm sulfonylurea
1.1.2.1 Glipizid
- Công thức cấu tạo: C21H27N5O4S
Hình 1.1 Công thức cấu tạo của Glipizid
Pyrazinecarboxamid,
N-[2-[4-[[[(cyclohexylamino)carbonyl]amino]sulfonyl]
phenyl]ethyl]-5-methy-1-cyclohexyl-3-[[p-[2(5-methylpyrazinecarboxamido)
ethyl]phenyl]sulfonyl]urea
-
Tính chất: Bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng, gần như không tan trong
nước, ít tan trong ethanol. Tan ít trong methylclorid, aceton, methanol ..., hòa
tan tốt trong dung dịch kiềm và dimethylformanid.[2]
-
Liều dùng: Khởi đầu người lớn 5mg /ngày; người già hay người bệnh gan là 2,5
mg/ngày. Duy trì thường từ 15mg/ ngày, chia làm nhiều lần [5].
-
Tác dụng và cơ chế: có tác dụng là giảm nồng độ glucose trong máu tới mức
bình thường ở người đái tháo đường không phụ thuộc insulin. Cơ chế: kích thích
6
tiết insulin từ tế bào beta tuyến tụy, làm giảm lưu lượng glucose từ gan ra huyết
thanh, làm tăng tác dụng của insulin ở tế bào đích ngoại biên [5].
-
Tác dụng không mong muốn: đau đầu, chán ăn, buồn nôn, nôn, ỉa chảy, cảm
giác đầy bụng, táo bón, nóng rát ngực. Trên nội tiết, gây hạ glucose huyết, hạ
natri huyết [5].
1.1.2.2 Glimepirid
Công thức cấu tạo: C24H34N4O5S
Hình 1.2 Công thức cấu tạo của Glimepirid
Tên
khoa
học:
1-((4-(2-(3-Ethyl-4-methyl-2-oxo-3-pyrroline-1-carboxamido)-
ethyl)phenyl)sulphonyl)-3-trans-(4-methylcyclohexyl)urea
-
Tính chất: Bột trắng hoặc gần như trắng, không tan trong nước, tan trong
dimethylformamid, ít tan trong dicloromethan, rất ít tan trong methanol [2].
-
Liều dùng: Khởi đầu 1-2mg /ngày. Duy trì 1-4mg/ ngày. Tối đa 8mg/ngày.
Tác dụng và cơ chế tác dụng: có tác dụng hạ glucose huyết, kích thích giải phóng
insulin từ tế bào beta tuyến tụy. Cơ chế: liên kết với thụ thể ở màng tế bào beta, làm
đóng các kênh Kali phụ thuộc lại, gây khử cực màng, làm kích thích mở kênh Calci.
Từ đó làm tăng nồng độ Calci trong tế bào, kích thích giải phóng insulin khỏi tế bào. Ở
ngoài tụy, glimepirid giúp cải thiện sự nhạy cảm của các mô ngoại vi với insulin và
làm giảm thu nạp insulin tại gan [5].
7
-
Tác dụng không mong muốn: tác dụng không mong muốn quan trọng nhất là tụt
glucose huyết, ngoài ra gây cảm giác chóng mặt, nhức đầu, buồn nôn, nôn, tiêu
chảy, đau bụng [5].
1.1.2.3 Gibenclamid
Công thức hoá học: C23H28ClN3O5S
Hình 1.3 Công thức cấu tạo của Glibenclamid
Tên khoa học:
1 – (4 – (2 – (5 – cloro – 2 – methoxybenzamido) ethyl)
benzensulfonyl) – 3 – cyclohexylure [6].
-
Tính chất: Bột kết tinh trắng, không tan trong nước và ether, hơi tan trong
dicloromethan, khó tan trong methanol và ethanol 96%, tan trong các dung dịch
kiềm loãng. Nóng chảy ở 1690C đến 1740C [6], [4].
-
Liều dùng: Liều ban đầu từ 2,5 - 5 mg mỗi ngày. Liều duy trì từ 1,25 - 10
mg/ngày. Liều tối đa là 15 mg/ngày [5].
-
Tác dụng và cơ chế tác dụng: là giảm glucose huyết, do làm tăng tính nhạy cảm
của tế bào beta tuyến tụy với insulin nên làm tăng giải phóng insulin; làm tăng
mức insulin do làm giảm độ thanh thải của insulin tại gan [5].
-
Tác dụng không mong muốn: hạ glucose huyết, buồn nôn, nôn [5].
8
1.1.2.4 Gliclazid
Công thức cấu tạo:
Hình 1.4 Công thức cấu tạo của Gliclazid
Tên khoa học: 1– (azabicyclo (3,3,0) oct–3–yl)– 3-p-tolylsulfonylure [6]
-
Tính chất: Bột kết tinh trắng, không tan trong nước, dễ tan trong dicloromethan,
hơi tan trong aceton, khó tan trong ethanol 96% [4], [6].
-
Liều dùng: Có thể bắt đầu dùng với liều: 40 - 80 mg, thường dùng 80 mg/ngày
và tối đa là 320 mg/ngày [6].
-
Tác dụng và cơ chế tác dụng: kích thích tế bào beta tuyến tụy giải phóng insulin,
do vậy thuốc chỉ có tác dụng trên người bệnh còn có khả năng sản xuất insulin.
-
Tác dụng không mong muốn: rối loạn tiêu hóa, buồn nôn, nôn đau đầu, phát
ban. [5]
Tổng quan về phƣơng pháp nghiên cứu
1.2.1 Sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng (TLC) trong kiểm nghiệm dược phẩm đã được phát triển từ lâu. Lớp
mỏng kết dính là pha tĩnh. Pha tĩnh của TLC là các hạt có kích thước 10-30 µm được
rải đều và kết dính thành lớp mỏng đồng nhất dày khoảng 250 µm trên giá đỡ làm bằng
thuỷ tinh, nhôm hoặc chất dẻo. Một số chất thường dùng làm pha tĩnh là silica, dẫn
chất siloxan, cellulose, nhôm oxyd, gel sephadex…trong đó được dùng phổ biến nhất
9
là silica (SiO2) và nhôm oxyd. Các hạt trong pha tĩnh làm nhiệm vụ tách có thể theo cơ
chế: phân bố, hấp phụ, trao đổi ion...[1], [4].
Pha động thay đổi tuỳ thuộc vào cơ chế sắc ký. Để tăng cường sức rửa giải, thường kết
hợp 2-3 dung môi. Nguyên lý chia tách dựa vào hệ số phân bố giữa hai pha. Pha động
di chuyển qua pha tĩnh nhờ lực mao dẫn. Các chất phân tích sẽ di chuyển với tốc độ
khác nhau tùy thuộc vào bản chất của chúng, kết quả là chúng được tách riêng có vị trí
khác nhau trên bản mỏng [1].
Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số lưu giữ Rf .
Trị số này được tính bằng tỷ lệ giữa quãng đường di chuyển của chất phân tích và
quãng đường dịch chuyển của pha động [1], [4].
Rf = dR /dM
dR: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích.
dM: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động (đo trên cùng đường
đi của vết).
Rf : có giá trị dao động giữa 0 và 1.
TLC được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực do có nhiều ưu điểm như: thiết bị
đơn giản, chi phí thấp, thực hiện nhanh; phát hiện được tất cả các chất kể cả các chất
không di chuyển theo pha động (nằm ở điểm xuất phát); thực hiện tách dễ dàng các
mẫu có nhiều thành phần – có thể thực hiện sắc ký đồng thời 10-20 mẫu hoặc hơn, so
sánh trực tiếp mẫu thử với mẫu chuẩn; phương pháp này cho phép bán định lượng
nhanh thành phần trong thuốc nên thường dùng để đánh giá nhanh chất lượng của
thuốc; ngoài ra phương pháp cho phép cung cấp hình ảnh sắc ký đồ làm dấu vân tay
cho mỗi thuốc, do đó thích hợp cho việc kiểm tra độ tinh khiết của thuốc và phát hiện
thuốc giả [1].
10
Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao
Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là một hình thức tiên tiến của TLC. HPTLC
được điều khiển bởi phần mềm thích hợp đảm bảo tính ứng dụng và độ tin cậy, độ lặp
lại cao nhất các số liệu đưa ra. Trong đó, các thông số của quá trình phân tích được ghi
lại và kiểm soát chặt chẽ, do đó có độ lặp lại cao. Các bước của quá trình phun mẫu,
khai triển mẫu, nhận diện vết được tiến hành bằng thiết bị tự động hoặc bán tự động,
giảm thiểu tối đa sai số có thể gặp trong quá trình phân tích. Quá trình phun mẫu được
tiến hành tự động hoặc bán tự động, đảm bảo chính xác thể tích mẫu phun, đồng thời
có sấy bằng khí nitơ do đó giảm sự oxy hóa đối với chất phân tích dễ bị oxy hóa. Trong
quá trình khai triển, điều kiện về nhiệt độ, độ ẩm được kiểm soát chặt chẽ, đảm bảo độ
lặp lại của kết quả khi tiến hành giữa các lần phân tích khác nhau và tại các phòng thí
nghiệm khác nhau. Hệ thống đèn UV tích hợp máy ảnh và hệ thống phần mềm giúp
phân tích số liệu ứng dụng trong định tính và định lượng [9].
Hiện nay để tăng cường độ tin cậy của kết quả phân tích, người ta sử dụng bản mỏng
hiệu năng cao (high performance plates). Bản này được tráng lớp pha tĩnh mỏng hơn
TLC (dày khoảng 100µm) với bột mịn có kích thước hạt 5µm độ đồng đều cao hơn.
Khi dùng bản mỏng này, hiệu quả cao hơn do kích thước hạt mịn hơn, độ nhạy và độ
phân giải được tăng cường vì vết sắc ký nhỏ, thời gian sắc ký ngắn hơn và lượng dung
môi ít hơn so với TLC [9].
Ƣu điểm của HPTLC:
- Phù hợp với cả phân tích định tính và định lượng.
- Trong một lần khai triển sắc ký có thể phân tích đồng thời nhiều mẫu cùng lúc, tiết
kiệm thời gian và chi phí cho hóa chất, vật tư tiêu hao.
11
- Các mẫu phân tích và các mẫu chuẩn được chấm trên cùng một bản mỏng sắc ký,
khai triển cùng lúc trong cùng điều kiện dung môi, nhiệt độ, độ ẩm nên cho độ lặp lại
cao, hạn chế sự tác động của môi trường giữa các lần phân tích.
- Chuẩn bị mẫu đơn giản, ít gặp vấn đề nền mẫu.
- Tài liệu hóa dễ dàng, kết quả có độ tin cậy cao.
Do những ưu điểm trên nên chúng tôi lựa chọn kỹ thuật HPTLC cho nghiên cứu này.
Một số nghiên cứu định tính, định lượng nhóm thuốc giảm glucose máu trộn trong các
chế phẩm từ dược liệu
Kenichi Kumasaka [14] đã sàng lọc và định lượng cho 6 sulfonylure chữa tiểu
đường: tolbutamid, acetohexamid, chlorpropamid, gliclazid, glibenclamid, và
glimepirid trộn trái phép trong thực phẩm chức năng. Các sulfonylure được chiết với
aceton, sau đó dịch chiết đem tiến hành TLC và HPLC. Trong phân tích TLC, các chất
tách tốt với pha động gồm n-butyl acetat có chứa 0,4 % acid formic. Quan sát vết ở UV
254 nm. Thuốc thử phát hiện : Dragendoff, acid phosphomolybdic 10% methanol, acid
sulfuric 30% methanol. Giá trị Rf tương ứng của tolbutamid, acetohexamid,
chlorpropamid, gliclazid, glibenclamid và glimepirid trong các mẫu là 0,78; 0,58; 0,69;
0,48; 0,40 và 0,35. Với phương pháp HPLC sử dụng cột Cadenza CD-C18, pha động:
acetonitril-đệm amoni acetat theo gradient, tốc độ dòng 1,0 ml/phút, thể tích tiêm 10
µl, bước sóng phát hiện: 230 nm, 247 nm. LOD của gliclazid, glibenclamid và
glimepirid lần lượt là 100, 50, 20 ng/vết.
Ning Li [15] sử dụng phương pháp UPLC-MS/MS để phát hiện và định lượng 14 loại
thuốc chống đái tháo đường tổng hợp bổ sung bất hợp pháp trong thuốc cổ truyền và
thực phẩm chức năng của Trung Quốc. Các mẫu ở các dạng: viên nén, viên nang, thuốc
viên, thuốc hạt được chuyển về dạng bột đồng nhất. Cân chính xác lượng bột mẫu
12
tương đương với một đơn vị liều và chuyển vào một bình nón 100 ml, thêm 40 ml
methanol, siêu âm trong 20 phút, lọc qua giấy lọc. Mẫu được tách trên cột C18 với pha
động gồm acetonitril và nước (cả hai có chứa 0,1% acid formic) rửa giải theo gradient,
tốc độ dòng 0,20 ml/phút, thể tích tiêm 10 µl, chế độ phát hiện MRM, các LOD dao
động 0,03-5,45 ng/mL. Kết quả có 9 loại thuốc chống đái tháo đường tổng hợp
(glibenclamid-phổ biến nhất, metformin, rosiglitazon, glimepirid, phenformin,
gliclazid, chlorpropamid, nateglinid và mitiglinid) được tìm thấy từ 14 mẫu trong số 30
mẫu thu thập từ thị trường. Lượng glibenclamid được trộn lẫn thay đổi từ 0,88 mg/viên
đến 6,78 mg/viên.
Wensheng Pang [17] đã tiến hành phát hiện và xác định cấu trúc của các thuốc hạ
đường huyết tổng hợp thêm trái phép vào các sản phẩm thuốc từ thảo dược để chống
bệnh tiểu đường bằng phương pháp LC-MS-MS, phân tích theo chế độ MRM. Các
mẫu dạng viên nén hoặc nang được nghiền thành bột, sau đó chiết siêu âm với
methanol (2 lần x 100 ml; 20 phút mỗi lần); gộp dịch chiết và ly tâm 10 phút, gạn dịch
và chuyển sang bình định mức 250 ml và pha loãng đến vạch bằng methanol; 1ml dung
dịch này được chuyển sang bình định mức 10ml và pha loãng đến vạch bằng methanol.
Sử dụng cột C18 (2,1mm x 150mm, 5µm); pha động là hỗn hợp của acetonitril và dung
dịch acid formic 0,05% trong nước tỷ lệ 60:40; tốc độ dòng 0,2 ml/phút tại 40,7 bar;
thể tích tiêm 10 µl. Trong số 20 mẫu thuốc thảo dược được kiểm tra, 5 thuốc phát hiện
thấy có chứa glibenclamid, 3 thuốc chứa gliclazid, và 3 thuốc chứa phenformin, hai
thuốc khác chứa glimepirid và metformin. Hàm lượng glibenclamid được trộn lẫn thay
đổi từ 0,28 mg/viên đến 4,9 mg/viên, tính theo liều dùng tối đa hàng ngày là 1,56 mg
đến 29,4 mg.
Mei Cui [11] sử dụng sắc ký lỏng cặp ion pha đảo (RP-IPC) kết hợp với DAD để
xác định đồng thời 14 loại thuốc chống đái tháo đường tổng hợp trong các thuốc cổ
truyền của Trung Quốc. Các mẫu ở các dạng: viên nén, viên nang, thuốc viên và thuốc
13
hạt được nghiền thành bột đồng nhất. Lượng bột tương đương 1 liều dùng được cho
vào bình định mức 50 ml, thêm 40 ml methanol, chiết siêu âm trong 20 phút, pha loãng
đến vạch bằng methanol. Việc tách được thực hiện trên cột C18 với pha động gồm
acetonitril và dung dịch chứa 1,0 mmol natri dodecyl sulfat và triethylamin 0,1% (sử
dụng acid phosphoric điều chỉnh tới pH 3,75), tốc độ dòng 0,8 ml/phút rửa giải theo
gradient, thể tích tiêm 20 µl, phát hiện ở UV 220 nm. Kết quả, có 7 loại thuốc chống
đái tháo đường tổng hợp (glibenclamid-phổ biến nhất, metformin, phenformin,
rosiglitazon, gliclazid, glimepirid và mitiglinid) được tìm thấy từ 9 trong số 26 mẫu
thuốc cổ truyền thu thập được. Hàm lượng glibenclamid được trộn lẫn thay đổi từ 0,58
mg/viên đến 3,25 mg/viên, tính theo liều dùng là 3,34 mg/ngày đến 13,8 mg/ngày.
Hiện nay, các nghiên cứu đồng thời với nhóm thuốc này được trộn lẫn trong các
chế phẩm đông dược và TPBVSK tại Việt Nam là rất ít hoặc chưa được công bố. Từ
những tham khảo trên, đề tài tiến hành xây dựng các phương pháp HPTLC để phát hiện
và bước đầu định lượng 4 chất chống đái tháo đường nhóm sulfonylurea (glipizid,
glimepirid, glibenclamid, gliclazid) được trộn trái phép trong các chế phẩm đông dược
và TPBVSK được thu thập tại thị trường Việt Nam.
14
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị và đối tƣợng nghiên cứu
2.1.1 Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu
a. Chất chuẩn:
- Glipizid 99,17%. SKS: 0107207 (Viện kiểm nghiệm thuốc TW).
- Glibenclamid 100,10%. SKS: 0103129 (Viện kiểm nghiệm thuốc TW).
- Glimepirid 99,49%. SKS: 0115320.01 (Viện kiểm nghiệm thuốc TW).
- Gliclazid 99,53%. SKS: WS. 021518701 (Viện kiểm nghiệm thuốc TW).
b. Hoá chất : Methanol, n-butyl acetat, acid formic, acid acetic băng, ethanol,
dicloromethan, cloroform, n-hexan, benzen… đạt độ tinh khiết thuốc thử phân tích
(AR).
2.1.2 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu
- Hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPTLC CAMAG, CAT No 027.6200 (Thuỵ
Sỹ) : bộ phận chấm bán tự động, bộ phận khai triển tự động, máy chụp ảnh. Phần mềm
điều khiển winCAT và phần mềm video Scan của Camag: quét bản mỏng, thu nhận
hình ảnh vết sắc ký, xử lý dữ liệu hình ảnh trên máy tính.
- Bản mỏng TLC Silica gel 60 F254 của Merck (Đức).
- Cân phân tích Sartorius TE 214S (d=0,1 mg) (Đức).
- Máy lắc xoáy Labinco BV L46..
- Máy siêu âm D-78224 Singen/Htw (Đức).
- Máy ly tâm Kubota 6500 (Nhật Bản).
15
- Tủ sấy WiseVen WOF-105 (Hàn Quốc).
- Các dụng cụ thủy tinh: bình định mức, bình chiết, pipet ...
2.1.3 Đối tƣợng nghiên cứu
- Mẫu thử: 40 chế phẩm đông dược và TPBVSK dạng bào chế viên nén, viên nang
cứng và viên hoàn có chỉ định điều trị hoặc hỗ trợ điều trị tiểu đường đang lưu hành
trên thị trường, được mua tại các nhà thuốc, mua qua các trang mạng internet, của các
lương y hoặc do người dùng nghi ngờ yêu cầu kiểm tra.
- Nền mẫu tự tạo: mẫu bột mịn tự tạo từ 18 vị dược liệu đại diện cho các vị dược liệu
có trong 40 mẫu chế phẩm đông dược, TPBVSK có mặt trên thị trường.
Bảng 3.1. Thành phần nền mẫu dược liệu tự tạo
Dây thìa canh
6g
Mướp đắng
6g
Giảo cổ lam
3g
Câu kỳ tử
4g
Mạch môn
2g
Nhàu
3g
Diệp hạ châu
2g
Bạch linh
2g
Mẫu đơn
2g
Ngũ vị tử
1g
Trạch tả
2g
Quế chi
2g
Sơn thù
2g
Hoài sơn
1g
Sinh địa
5g
Phụ tử
2g
Tan diệp
2g
Ngưu tất
2g
- Mẫu chuẩn tự tạo: chất chuẩn trộn cùng nền mẫu tự tạo với tỉ lệ nhất định.
16
2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1 Xây dựng quy trình định tính, định lƣợng glipizid, glimepirid, glibenclamid và
gliclazid trộn lẫn trong chế phẩm đông dƣợc bằng HPTLC
2.2.1.1 Xây dựng quy trình xử lý mẫu
Dựa vào khả năng hòa tan của các chất nghiên cứu trong dung môi [4], [8] và
căn cứ vào kết quả của các nghiên cứu đã công bố [12], [16], tiến hành khảo sát khả
năng chiết các thuốc tân dược từ nền mẫu bằng các dung môi với nhiều tỉ lệ khác nhau
và lựa chọn dung môi chiết hiệu suất cao, cho vết gọn, sắc nét. Các dung môi khảo sát
bao gồm:
- Methanol
- Methanol : Nước
- Ethanol
Dựa theo các tài liệu [14], [16], quy trình xử lí mẫu cho đối tượng phân tích là
chế phẩm đông dược, TPBVSK nghiên cứu dự kiến:
Xác định khối lượng trung bình đơn vị mẫu, làm đồng nhất mẫu. Cân chính xác
một lượng mẫu tương ứng với ½ liều vào ống falcon, thêm chính xác 25,0 ml dung môi
chiết, lắc xoáy. Siêu âm 15-30 phút ở nhiệt độ phòng, ly tâm 6000 vòng/phút trong 20
phút. Gạn dịch chiết và hút chính xác 20,0 ml dịch chiết, cô đến cắn rồi hòa tan cắn
trong chính xác 1,0 ml dung môi.
2.2.1.2 Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký
- Pha tĩnh : Sử dụng bản mỏng silica gel 60 F254 với kích thước khác nhau.
17
