Ứng dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao trong phân tích định tính bài thuốc tiền liệt thanh giải

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌCDƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ NGỌC VUI

ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG
CAO TRONG PHÂN TÍCH
ĐỊNH TÍNH BÀI THUỐC
“TIỀN LIỆT THANH GIẢI”
KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI – 2014


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ NGỌC VUI

ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG
CAO TRONG PHÂN TÍCH
ĐỊNH TÍNH BÀI THUỐC
“TIỀN LIỆT THANH GIẢI”
KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Ngƣời hƣớng dẫn: 1. ThS. Cao Ngọc Anh
2. TS. Nguyễn Quỳnh Chi
Nơi thực hiện :

Bộ môn Dược liệu

HÀ NỘI – 2014


LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành khóa luận này, trước hết tơi xin bày tỏ sự kính trọng và lịng
biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Quỳnh Chi và ThS. Cao Ngọc Anh, người cơ,
người thầy đã tận tình hướng dẫn cho tôi những kiến thức cũng như những kinh
nghiệm nghiên cứu khoa học quý báu.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới ThS. Lê Thanh Bình đã giúp đỡ tơi trong q
trình hồn thành khóa luận tại bộ mơn.
Tơi cũng xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới các thầy cô và các anh chị kỹ thuật
viên đang công tác tại bộ môn Dược Liệu-Trường Đại học Dược Hà Nội tạo
điều kiện để tơi hồn thành khóa luận. Cuối cùng tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới
gia đình, bạn bè – những người đã luôn tin tưởng, cổ vũ, động viên tôi trong học tập
và trong cuộc sống.
Hà Nội, tháng 5 năm 2014

Sinh viên

Nguyễn Thị Ngọc Vui


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................ 2
1.1. Tổng quan về bài thuốc TLTG.................................................................2
1.1.1. Xuất xứ của bài thuốc ..............................................................................2
1.1.2. Tổng quan về các vị thuốc trong bài TLTG .............................................2

1.1.3. Tác dụng của bài thuốc “Tiền liệt thanh giải” ..........................................7
1.1.4. Phân tích bài thuốc ...................................................................................7
1.2. Tổng quan về phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) .........................7
1.2.1. Nguyên tắc phương pháp sắc ký lớp mỏng. .............................................7
1.2.2 Ưu, nhược điểm của phương pháp sắc ký lớp mỏng. ................................9
1.2.3. Ứng dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng và sắc ký lớp mỏng hiệu năng
cao trong kiểm nghiệm dược liệu. .............................................................................10
CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, NỘI DUNG
VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................... 12
2.1. Nguyên liệu ...............................................................................................12
2.2. Phƣơng tiện nghiên cứu ..........................................................................12
2.2.1 Thuốc thử, chất đối chiếu ........................................................................12
2.2.2 Dung mơi, hóa chất: ................................................................................13
2.2.3. Máy móc, dụng cụ, thiết bị: ....................................................................13
2.3. Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu ..................................................14
2.3.1. Khảo sát các điều kiện khai triển sắc ký lớp mỏng để phân tích định tính
cao bài thuốc “Tiền liệt thanh giải”. .........................................................................14
2.3.2. Áp dụng các điều kiện đã được khảo sát để phân tích định tính mẫu cao
và cốm bài thuốc trong q trình sản xuất thử nghiệm. ............................................16
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................... 17
3.1. Khảo sát các điều kiện khai triển SKLM để phân tích định tính cao
bài thuốc “Tiền liệt thanh giải”. ............................................................................17
3.1.1. Phân tích định tính dịch chiết toàn phần. ...............................................17


3.1.2 Phân tích định tính phân đoạn n-hexan: ..................................................17
3.1.3 Phân tích định tính phân đoạn ethylacetat:.............................................20
3.1.4 Phân tích định tính phân đoạn n-butanol .................................................27
3.1.5 Nhận biết sự có mặt của acid oleanolic trong bài thuốc..........................32
3.2. Áp dụng các điều kiện đã đƣợc khảo sát để phân tích định tính mẫu

cao và cốm bài thuốc bằng HPTLC. ......................................................................34
3.3 BÀN LUẬN ...............................................................................................43
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT............................................................................ 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CLR

Cỏ lưỡi rắn

DĐTQ

Dược điển Trung Quốc

DĐVN IV

Dược điển Việt Nam IV

ĐS

Đan sâm

HB

Hoàng bá.

HH

Hồng hoa.

NT

Ngưu tất.

SKĐ

Sắc ký đồ

TC

Trâu cổ.

TLTG

Tiền liệt thanh giải

TT

Thương truật

YD

Ý dĩ


DANH MỤC CÁC BẢNG
Tên bảng
Bảng 1.1: Thành phần bài thuốc “ Tiền liệt thanh giải ”.

Trang
2

Bảng 1.2: Tóm tắt tiêu chuẩn sắc ký lớp mỏng của các dược liệu 6
thành phần.
Bảng 1.3: Một số chất thường dùng làm pha tĩnh cho SKLM.

8

Bảng 2.1: Bộ phận dùng của các dược liệu.

12


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Tên hình

Trang

Hình 2.2 : Sơ đồ chiết phân đoạn bài thuốc.

15

Hình 3.1 Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng dịch chiết phân đoạn n-hexan bài

19

thuốc so sánh với dịch chiết các dược liệu thành phần khi quan sát dưới
ánh sáng thường (A), ánh sáng tử ngoại có bước sóng 254 nm (B), 366

nm (C), sau khi phun thuốc thử anisaldehyd-acid sulfuric dưới ánh sáng
thường (D) và dưới ánh sáng tử ngoại có bước sóng 366 nm (E).
Hình 3.2. Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng dịch chiết phân đoạn ethylacetat

22

bài thuốc so sánh với dịch chiết các dược liệu thành phần khi quan sát
dưới ánh sáng thường (A), ánh sáng tử ngoại có bước sóng 254 nm (B),
366 nm (C), sau khi phun thuốc thử NP/PEG dưới ánh sáng thường (D)
và dưới UV 366 nm (E).
Hình 3.3. Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng dịch chiết phân đoạn ethylacetat

24

bài thuốc so sánh với các dược liệu thành phần khi quan sát dưới ánh
sáng thường (A), ánh sáng tử ngoại có bước sóng 254 nm (B) và 366 nm
(C), sau khi phun thuốc thử anisaldehyd-acid sulfuric dưới ánh sáng
thường (D), dưới UV 366 nm (E).
Hình 3.4. Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng dịch chiết phân đoạn ethylacetat,

26

Tanshinon IIA, đan sâm khi quan sát lần lượt dưới ánh sáng thường (A),
ánh sáng tử ngoại có bước sóng 254 nm (B), 366 nm (C), sau khi phun
thuốc thử anisaldehyd-acid sulfuric dưới sáng thường (D) và dưới UV
366 nm (E).
Hình 3.5: Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng dịch chiết phân đoạn n-butanol và

28

ethylacetat so sánh với các dược liệu thành phần khi quan sát dưới ánh
sáng thường (A),ánh sáng tử ngoại có bước sóng 254 nm (B), 366
nm(C) và sau khi phun thuốc thử anisaldehyd-acid sulfuric dưới ánh
sáng thường (D) và UV 366 nm(E).
Hình 3.6: Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng so sánh dịch chiết cồn 70% của

30


hoàng bá và dịch chiết phân đoạn ethylacetat bài thuốc khi quan sát
dưới ánh sáng thường (A), ánh sáng tử ngoại có bước sóng 254 nm (B),
366 nm(C), sau khi hiện màu bằng thuốc thử anisaldehyd–acid sulfuric
dưới ánh sáng thường (D), dưới UV 366 nm (E).
Hình 3.7. Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao của dịch chiết phân

31

đoạn n-butanol, ethylacetat so sánh với các dược liệu thành phần khi
quan sát dưới ánh sáng thường (A), dưới ánh sáng tử ngoại có bước
sóng 254 nm (B), 366 nm(C), sau khi phun thuốc thử anisaldehyd-acid
sulfuric dưới ánh sáng thường (D) và UV 366 nm (E).
Hình 3.8. Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng dịch thủy phân của ngưu tất, bài

33

thuốc so sánh với acid oleanolic sau khi hiện màu bằng thuốc thử
anisaldehyd-acid sulfuric và quan sát dưới ánh sáng thường (A), ánh
sáng tử ngoại có bước sóng 366 nm (B).
Hình 3.9. Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao dịch chiết phân

35

đoạn n-hexan của C1 và C2 so sánh với C0 và các dược liệu thành phần
khi quan sát dưới ánh sáng thường (A), dưới ánh sáng tử ngoại ở bước
sóng UV 254 nm (B) và UV 366 nm (C), sau khi hiện màu bằng thuốc
thử anisaldehyd-acid sulfuric quan sát dưới ánh sáng thường (D), dưới
UV 366 nm (E).
Hình 3.10. Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao dịch chiết phân

36

đoạn ethylacetat của C1 và C2 so sánh với C0 và các dược liệu thành
phần (hệ 2) khi quan sát dưới ánh sáng thường (A), dưới ánh sáng tử
ngoại ở bước sóng UV 254 nm (B) và UV 366 nm (C); sau khi hiện màu
bằng thuốc thử NP/PEG quan sát dưới ánh sáng thường (D), dưới UV
366 nm (E).
Hình 3.11.. Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao dịch chiết phân
đoạn ethylacetat của C1 và C2 so sánh với C0 và các dược liệu thành
phần (hệ 3) khi quan sát dưới ánh sáng thường (A), dưới ánh sáng tử
ngoại ở 2 bước sóng UV 254 nm (B) và UV 366nm (C); sau khi hiện

37


màu bằng thuốc thử anisaldehyd-acid sulfuric quan sát dưới ánh sáng
thường (D), dưới UV 366 nm (E).
Hình 3.12. Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao dịch chiết phân

39

đoạn n-butanol của C1 và C2 so sánh với C0 và các dược liệu thành phần
khi quan sát dưới ánh sáng thường (A), dưới ánh sáng tử ngoại có bước
sóng UV 254 nm (B) và UV 366 nm (C) và sau khi hiện màu bằng thuốc
thử anisaldehyd - acid sulfuric quan sát dưới ánh sáng thường (D), dưới
UV 366 nm (E).
Hình 3.13. Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao dịch chiết phân

41

đoạn ethylacetat của C1 và C2 so sánh với C0 và Tanshinon IIA, đan sâm
quan sát dưới ánh sáng thường (A), dưới ánh sáng tử ngoại ở 2 bước
sóng UV 254 nm (B) và UV 366 nm (C); sau khi hiện màu bằng thuốc
thử anisaldehyd-acid sulfuric quan sát dưới ánh sáng thường (D), dưới
UV 366 nm (E).
Hình 3.14. Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao dịch thủy phân của
C1 và C2 so sánh với Ngưu tất và acid oleanolic sau khi hiện màu bằng
thuốc thử anisaldehyd-acid sulfuric quan sát dưới ánh sáng thường (A),
dưới ánh sáng tử ngoại có bước sóng 366 nm (B).

42


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Phì đại lành tính tuyến tiền liệt (PĐLTTTL) là một bệnh gây ra nhiều lo lắng
cho nam giới ở tuổi trung niên và cao niên. Bệnh thường xuất hiện ở nam giới trên
40 tuổi. Tỷ lệ mắc bệnh và mức độ trầm trọng của bệnh thường gia tăng theo độ
tuổi.
Sử dụng các thuốc có nguồn gốc hóa dược trong điều trị PĐLTTTL thường

dẫn đến các tác dụng không mong muốn như chứng vú to ở nam giới, gây bất lực,
giảm ham muốn tình dục, hạ huyết áp thế đứng, chóng mặt, buồn ngủ. Do đó, hiện
nay phương pháp điều trị bằng y học cổ truyền đã và đang được sử dụng trong điều
trị PĐLTTTL nhằm hạn chế tác dụng không mong muốn và tai biến trên.
Bài thuốc TLTG đã được nghiên cứu trong điều trị PĐLTTTL dưới dạng cốm
tan từ dịch chiết nước toàn phần của các dược liệu cho các kết quả khả quan. Tuy
nhiên, liều thuốc dùng trong một ngày cịn khá lớn (60g/gói x 2 gói/ngày) và bệnh
nhân PĐLTTTL kèm theo đái tháo đường chiếm tỷ lệ khá cao không sử dụng được
do tá dược là glucose. Xuất phát từ thực tế đó, các nghiên cứu về bào chế, đánh giá
tác dụng của cao “Tiền liệt thanh giải” thu được từ dịch chiết cồn đã được triển
khai. Tuy nhiên để đảm bảo tính hiệu quả và an toàn của bài thuốc, dạng cao này
cần phải được chuẩn hóa. Để góp phần tiêu chuẩn hóa cao “ Tiền liệt thanh giải” đề
tài: Ứng dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao trong phân tích định
tính bài thuốc “Tiền liệt thanh giải” được thực hiện với 2 mục tiêu:
1. Lựa chọn điều kiện khai triển sắc ký lớp mỏng để phân tích định tính cao
“Tiền liệt thanh giải”.
2. Áp dụng điều kiện sắc ký lớp mỏng đã được xây dựng để phân tích một
mẫu cao và một mẫu cốm trong quá trình sản xuất thử nghiệm bài thuốc.


2

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về bài thuốc TLTG.
1.1.1. Xuất xứ của bài thuốc
“Tiền liệt thanh giải” (TLTG) là bài thuốc có nguồn gốc từ bài thuốc cổ
phương “Tứ diệu hoàn” của tác phẩm cổ “Thành phương tiện độc” được gia thêm 4
vị: Cỏ lưỡi rắn, Đan sâm, Hồng hoa, Trâu cổ. Bài thuốc TLTG có 8 vị và có khối
lượng cụ thể như sau:
Bảng 1.1: Thành phần bài thuốc “ Tiền liệt thanh giải ”

Tên vị thuốc

Ký

Tên khoa học

hiệu
Cỏ lưỡi rắn

CLR

Khối lượng trong bài
thuốc

Herba Hedyotis corymbosae

15g

Đan Sâm

ĐS

Radix Salvia miltiorrhiza

15g

Hoàng bá

HB

Cortex Phellodendron amurense

10g

Hồng hoa

HH

Flos Carthamus tinctorius

10g

Ngưu tất

NT

Radix Achyranthes bidentata

10g

Thương truật

TT

Rhizoma Atractylodes chinensis

15g

Trâu cổ

TC

Fructus Fici pumilae

20g

Ý dĩ

YD

Semen Coicis

20g

1.1.2. Tổng quan về các vị thuốc trong bài TLTG
1.1.2.1 Cỏ lưỡi rắn (tên khác: Tán phòng hoa nhĩ thảo, An điền lan, Vương
thái tơ, Xà thiệt thảo).
Vị thuốc là tồn cây rửa sạch, phơi khô của cây Cỏ lưỡi rắn – Oledenlandia
corymbosa (L.)Lamk hay Hedyotis corymbosa L. họ Cà phê (Rubiaceae).
- TPHH: Acid hữu cơ (acid asperulosidic, acid geniposidic), 0,12% alcaloid
biflorin và bifloron, β-sitosterol, và acid ursolic.
- Công dụng: Thanh nhiệt giải độc, chữa sốt, ho, chữa viêm da, viêm gan,
viêm họng, viêm đường tiết niệu, chữa sốt rét, chữa rắn cắn. Liều dùng: 6-12g.
[3],[6],[10],[12],[16].


3

1.1.2.2. Đan sâm ( tên khác: Đơn sâm, huyết sâm, xích sâm, huyết căn ).
Vị thuốc là rễ phơi hay sấy khô của cây Đan sâm - Salvia miltiorrhiza Bunge.

họ Bạc hà (Lamiaceae).
- Thành phần hóa học chính: Phenol và acid phenolic: danshensu, acid
salvianolic B…; các hợp chất diterpen: Tanshinon IIA [3],[6],[11],[15].
- Tính vị, quy kinh: Vị đắng, tính mát, quy vào 2 kinh tâm và can.
- Công năng, chủ trị: Hoạt huyết, trục huyết ứ dùng để trị hành kinh không
đều, đau bụng kinh, bế kinh, sau khi đẻ huyết ứ đọng gây đau bụng. Dưỡng tâm an
thần dùng trong các bệnh hồi hộp mất ngủ, suy nhược thần kinh. Bổ huyết dùng
trong trường hợp thiếu máu. Bổ can tỳ dùng trong trường hợp gan và lá lách bị sưng
to. Giải độc trong các trường hợp sang lở, mụn nhọt. Liều dùng: 8-12g [6],[7],[11].
1.1.2.3. Hoàng bá (tên khác: Hoàng nghiệt, Nguyên bá, Xuyên hoàng bá, Hoa
hoàng bá).
Dược liệu là vỏ thân, vỏ cành già đã cạo bỏ lớp bần, phơi khơ của cây Hồng
bá - Phellodendron amurense Rupr., họ Cam (Rutaceae).
- Thành phần hố học chính: Vỏ thân chứa 1,6% berberin; ngồi ra cịn có các
alcaloid khác là palmatin, magnoflorin, jatrorrhizin, phellodendrin, menispermin,
candicin; các chất đắng obakunon, obakulacton, và các chất khác: β-sitosterol và
campesterol.
- Tính vị, quy kinh: Vị đắng, tính hàn, quy vào kinh thận, bàng quang, tỳ.
- Công năng: Tư âm giáng hỏa, lợi thấp giải độc, thanh thấp nhiệt ở hạ tiêu, tả
tướng hỏa.
- Chủ trị: Chứng âm hư phát sốt, vàng da do thấp nhiệt, nhiệt tả lỵ ra máu, xích
bạch đới, bàng quang thấp nhiệt gây tiểu tiện ít, tiểu tiện khó, tiểu buốt dắt; ngứa lở
ngoài da, miệng lưỡi lở loét, đau mắt đỏ.
- Liều dùng: 5-10g/ ngày dạng thuốc sắc [3],[6],[7],[11].
1.1.2.4. Hồng hoa (tên khác: Hồng lam hoa, rum)
Vị thuốc là hoa phơi khô của cây Hồng hoa - Carthamus tinctorius L., họ Cúc
(Asteraceae).


4

- Thành phần hố học chính: Hoa hồng hoa chứa carthamin trong đó aglycon
gồm 2 đơn vị carthamindin và isocarthamidin. Ngồi ra cịn có một số sắc tố màu
vàng là saflor yellow A, saflor yellow B và saflomin A.
- Tính vị, quy kinh: Vị cay, tính ấm, quy vào 2 kinh tâm và can.
- Công năng, chủ trị: Hoạt huyết thông kinh, ứ huyết: dùng trong bệnh bế kinh,
kinh nguyệt khơng đều, có đau bụng kinh, huyết ứ thành hịn cục; còn dùng trong
trường hợp sau đẻ máu bị ứ đọng, bụng trướng đau. Giải độc: dùng trong trường
hợp sưng đau, thai chết lưu trong bụng. Nhuận tràng thông tiện.
- Liều dùng: 4-12g/ngày [3],[6],[7],[11].
1.1.2.5. Ngưu tất (tên khác: Hoài ngưu tất)
Vị thuốc là rễ phơi (hay sấy) khô của cây Ngưu tất - Achyranthes bidentata
Blume., họ Giền (Amaranthaceae).
- Thành phần hóa học chính: Rễ chứa acid oleanolic 0,096%, saponin tồn
phần 4,04% và các acid oleanolic α-L.rhamnopyranosyl-β-D-galactopyranosid. Rễ
còn chứa ecdysteron và inokosteron.
- Tính vị, quy kinh: Vị đắng, chua, tính bình, quy vào kinh can, thận.
- Công năng, chủ trị: Hoạt huyết thông kinh hoạt lạc: dùng trong trường hợp
kinh nguyệt bế, kinh nguyệt không đều. Thư cân, mạnh gân cốt: dùng cho các bệnh
đau khớp, đau xương sống. Chỉ huyết: dùng trong các trường hợp hỏa độc bốc lên
gây nôn ra máu chảy máu cam. Lợi niệu, trừ sỏi: dùng trong trường hợp tiểu tiện
đau buốt, tiểu tiện ra sỏi đục. Giáng áp dùng trong bệnh cao huyết áp, giải độc
chống viêm. Liều dùng: 8-12g/ngày [3],[6],[7],[12].
1.1.2.6. Trâu cổ (tên khác: Trâu cổ, vẩy ốc, bị lệ, cây xộp).
Vị thuốc là quả giả bổ dọc, phơi khô của cây Trâu cổ - Ficus pumila L., họ
Dâu tằm (Moraceae)
- Thành phần hóa học: Trong vỏ quả giả chứa 13%chất gôm khi thủy phân cho
glucose, fructose, arabinose.
- Tính vị, quy kinh: Quả trâu cổ có vị ngọt, hơi chát, tính bình.

5

- Công năng: Bổ thận, cố tinh, thông kinh, hành huyết, dễ đẻ, giảm đau,
lợi sữa.
- Chủ trị: Mụn nhọt, đinh độc sưng nhức, phụ nữ khó đẻ, kinh nguyệt khơng
đều, ít sữa; lỵ lâu ngày, thốt giang (lịi dom); còn là vị thuốc bổ, chữa đau lưng, di
tinh, liệt dương, thông đại tiểu tiện.
- Liều dùng: Ngày dùng 8-16g có thể đến 30g sắc uống hoặc nấu cao [3],[6].
1.1.2.7. Thương truật (tên khác: Sơn tinh, Mã kế, Mao truật, Tiên truật).
Vị thuốc là thân rễ phơi khô của cây Thương truật - Atractylodes chinensis
(DC.) Koidz. hoặc Atractylodes lancea (Thunb) DC., họ Cúc (Asteraceae).
- Thành phần hóa học chính: Tinh dầu, trong đó có atractylon, atractylen.
- Tính vị, quy kinh: Vị cay, đắng; tính ơn, quy vào kinh vị, tỳ.
- Cơng năng, chủ trị: Hóa thấp kiện tỳ: trị thấp khuẩn ở tỳ vị, bụng trướng đầy,
buồn nôn, ăn uống không tiêu. Trừ phong thấp: dùng trong trường hợp phong thấp,
tê dại xương cốt đau nhức, đau khớp. Thanh can sáng mắt: dùng trị bệnh mờ mắt.
Liều lượng: 4-12g/ngày [3],[6],[7].
1.1.2.8.Ý dĩ (tên khác: Dĩ mễ, Bo bo).
Dùng nhân đã loại vỏ phơi hay sấy khô của quả cây Ý dĩ - Coix lachryma-jobi
L. var. mayuen (Roman.) Stapt, họ Lúa (Poaeceae).
- Thành phần hóa học chính: Hạt chứa tinh bột 50-79%, protein 16-19%, dầu
béo 2-7%, thiamin, acid amin và adenosin.
- Tính vị, quy kinh: vị ngọt nhạt, tính hơi hàn; quy vào 5 kinh tỳ, vị, phế ,can,
đại tràng.
- Công năng, chủ trị: Lợi thủy: dùng để trị các bệnh phù thũng, tiểu tiện khó
khăn. Kiện tỳ hóa thấp: dùng để trị bệnh tỳ hư, tiêu hóa kém, tiết tả. Trừ phong
thấp, đau nhức. Thanh nhiệt độc, trừ mủ: dùng điều trị chứng phế hóa mủ. Thư cân
giải kinh: dùng khi chân tay bị co quắp. Giải độc tiêu viêm: dùng ý dĩ trong bệnh
viêm ruột thừa. Liều dùng: 20-50g/ngày [3],[6],[7].

6

 Trong số 8 dược liệu thành phần của bài thuốc thì có đến 6 dược liệu (trừ cỏ
lưỡi rắn và trâu cổ) có tiêu chuẩn về SKLM trong DĐVN IV và DĐTQ 2010. Dưới
đây là bảng tóm tắt tiêu chuẩn về SKLM của các dược liệu thành phần.
Bảng 1.2: Tóm tắt tiêu chuẩn sắc ký lớp mỏng của các dược liệu thành phần

Tiêu chuẩn về sắc ký

Tên

Dược điển VN IV [4]

dược

Dược điển trung quốc 2010 [13]

liệu

Hệ dung môi

Chất đối chiếu

Đan

Benzen-

Dược

sâm

ethylacetat

chuẩn

(19:1)

hoặc Tanshinon ethylacetat

Tanshinon

IIA

trong ethylacetat

Hệ dung môi

Chất đối chiếu

liệu Ether dầu hỏa Dược liệu chuẩn
(60-90)-

hoặc

trong (4:1)

IIA

ethylacetat
Hoàng

Cyclohexan-

Dung

dịch Ether dầu hỏa Dược liệu chuẩn

bá

ethylacetat-

berberin clorid (60-90)-

aceton (7:3:1,5) trong methanol

hoặc

Ethylacetat-acid Dược

hoa

formic-nước-

Obacunone

(1:1)
Hồng

ethylacetat

trong ethylacetat

liệu Ethylacetat-

Dược liệu chuẩn

chuẩn

acid

CRS

formic-

methanol

nước-methanol

(7:2:3:0,4)

(7:2:3:0,4)

Ngưu

Chloroform-

Dung dịch acid cloroform-

β–ecdysterone CRS

tất

methanol (40:1)

oleanolic 0,1% methanol-

và ginsenoside R0

trong ethanol

nước-acid

CRS/methanol

hoặc dược liệu formic
chuẩn.
Thương Ether dầu hỏa Dược

(7:3:0,5:0,05)
liệu Ether dầu hỏa Dược liệu chuẩn


7

truật

(60-900)-

chuẩn

hoặc

aceton(9:2)

ethylacetat

(60-90)-

Atractydin

CRS/methanol

(20:1)
Ý dĩ

Ether dầu hỏa Dược
(60-90)-

chuẩn

liệu Ether dầu hỏa Dược liệu chuẩn
(60-90)-

ethylacetat-acid

ethylacetat-acid

acetic

acetic

(10:3:0,1)

(10:3:0,1)

1.1.3. Tác dụng của bài thuốc “Tiền liệt thanh giải”
Hoạt huyết hóa ứ, thanh thấp nhiệt, thơng lợi bàng quang, bổ thận.
1.1.4. Phân tích bài thuốc
Trong bài, Hồng bá (khổ hàn) dùng để thanh nhiệt (do tính hàn) táo thấp (do
vị khổ) ở hạ tiêu, Thương truật khổ ôn để táo thấp. Hai vị hợp lại làm cho nhiệt
được tống ra ngoài, thấp được loại trừ. Ý dĩ nhân, Ngưu tất thanh lợi thấp nhiệt ở hạ
tiêu, tăng cường tác dụng lợi niệu, thông tiểu tiện; đồng thời gia thêm các vị Hồng
hoa, Đan sâm để hoạt huyết, giúp hóa ứ, tăng cường tác dụng thông lợi tiểu tiện. Cỏ
lưỡi rắn, Trâu cổ được phối hợp vào để tăng cường tác dụng hoạt huyết, hóa ứ, tiêu
khối u, giúp lợi tiểu tiện và bồi bổ chức năng thận.
1.2. Tổng quan về phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM)
1.2.1. Nguyên tắc phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng.
 Nguyên tắc phương pháp: Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất
được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các
chất cần tách. Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân
tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc
phiến kim loại. Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với
nhau theo tỷ lệ quy định trong từng chuyên luận. Trong quá trình di chuyển qua lớp
hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo


8

hướng pha động, với những tốc độ khác nhau. Kết quả, ta thu được một sắc ký đồ
trên lớp mỏng.
Cơ chế của sự chia tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng
lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của
chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động.
Ðại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di
chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng
dịch chuyển của dung môi:
trong đó: Rf = a/b.
a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử, tính bằng cm.
b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung mơi đo trên cùng đường đi
của vết, tính bằng cm.
Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến l [1].
 Pha tĩnh
Pha tĩnh là các hạt có kích thước 10-30μm được rải đều và kết dính thành
lớp mỏng đồng nhất dày khoảng 250 μm trên giá đỡ hình vng.Bản mỏng có sẵn
trên thị trường có kích thước khác nhau thường 5x20 cm hoặc 20x20cm, nhiều khi
có thêm các chất phát huỳnh quang không tan vào pha tĩnh để dễ phát hiện chất
phân tích.
Bảng 1.3: Một số chất thường dùng làm pha tĩnh cho SKLM [1]
STT
1

Pha tĩnh
Silica

Cơ chế sắc kí
Hấp phụ

Ứng dụng phân tích

Acid amin, hydrocarbon, alcaloid,
vitamin

2

Dẫn chất siloxan

Phân bố

Các chất ít phân cực

3

Cellulose

Phân bố

Acid amin, carbohydrat, nucleotid

4

Alumina

Hấp phụ

Hydrocarbon, alcaloid, chất màu thực
phẩm, lipid

5

Cát biển

Phân bố

Đường, acid béo

6

Cellulose trao đổi

Trao đổi ion

Acid nucleic, nucleotid, ion kim loại,


9

ion
7

Gel Sephadex

halogenid
Loại cỡ

Polymer, protein, phức kim loại

Trong đó silica gel thường dùng nhất theo cơ chế sắc kí hấp phụ. Các loại bản
mỏng silica gel: silica gel G (có trộn thạch cao 5%); silica gel H (không trộn thạch
cao); silica gel GF254: có trộn thạch cao và chất huỳnh quang (Fluorescent).

 Pha động [1.]
Để tăng cường rửa giải, thường kết hợp 2 hay nhiều dung môi.
Nguyên tắc lựa chọn: Tuỳ thuộc tính chất phân cực và ái lực với pha tĩnh, ta
chọn lựa dung môi sao cho phù hợp. Khảo sát lựa chọn theo nguyên tắc tam giác
Stahl, nghĩa là muốn tách những chất khơng hoặc ít phân cực, phải dùng chất hấp
phụ có hoạt năng cao và dung mơi khai triển yếu (ít phân cực) hoặc ngược lại.
 Phát hiện sắc kí đồ [1].
Phát hiện các vết tách dưới ánh sáng thường bằng mắt, quan sát được các vết
có màu. Ngồi ra, ta có thể sử dụng hệ thống đèn tử ngoại với 2 bước sóng thường
sử dụng là UV 254 nm và 366 nm. Cũng có thể quét bản mỏng qua bộ phận Scanner
Densitometer trong khoảng bước sóng 200-800 nm để lựa chọn bước sóng phát hiện
phù hợp. Trong một số trường hợp cần dùng thuốc thử để hiện vết trên sắc kí đồ, ta
dung bình phun thuốc thử.
1.2.2 Ƣu, nhƣợc điểm của phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng.
 Ưu điểm chung của phương pháp SKLM: [1]
- Đơn giản, dễ thực hiện.
- Chi phí khơng q cao.
- Dễ áp dụng tại các cơ sở.
- Lượng mẫu cần nhỏ, phân tích đồng thời được nhiều mẫu.
- Kết quả thu được dưới dạng hình ảnh.
 Nhược điểm chung của phương pháp SKLM: [1]
- Kết quả phụ thuộc vào nhiều yếu tố và độ lặp lại kém.
- Khả năng phân tách còn hạn chế.


10

- Khơng thể tự động hố hồn tồn.
 Hiện nay, bên cạnh loại bản mỏng thông thường TLC silica gel 60 F254 cịn
có loại bản mỏng hiệu năng cao HPTLC silica gel 60 F254. Loại bản mỏng này có

kích thước hạt hấp phụ nhỏ hơn (5-6µm so với 10-12µm/TLC); độ dày bản mỏng
nhỏ hơn (100µm so với 250 µm/TLC). Do đó bản mỏng hiệu năng cao có những ưu
điểm sau: khả năng phân tách tốt hơn, lượng chất đưa lên bản mỏng ít hơn, thời gian
khai triển ngắn hơn; sử dụng loại bản mỏng này thường gắn với hệ thống máy chấm
sắc ký tự động, buồng khai triển sắc ký, máy quét, chụp ảnh và phần mềm xử lý
hình ảnh, số liệu; do đó có độ lặp lại tốt hơn [19].
Hiện nay, khái niệm SKLM hiệu năng cao không chỉ được hiểu đơn thuần là
sắc ký lớp mỏng thông thường được thực hiện trên bản mỏng hiệu năng cao sử dụng
hệ thống trang thiết bị hiện đại mà còn được hiểu rộng hơn là sự kết hợp tối ưu của
trang thiết bị hiện đại (kỹ thuật), cơ sở lý thuyết (khoa học) và phương pháp đã
được chuẩn hóa. [19]
1.2.3. Ứng dụng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng và sắc ký lớp mỏng hiệu
năng cao trong kiểm nghiệm dƣợc liệu.
SKLM là một phương pháp được sử dụng phổ biến trong kiểm nghiệm dược
liệu. Đây là một trong các tiêu chuẩn định tính có mặt trong hầu hết các chun luận
dược liệu trong Dược điển các nước.
Ví dụ trong Dược điển thảo dược Hoa Kỳ (American Herbal Pharmacopoeia –
AHP), cả 31 chuyên luận dược liệu đều có tiêu chuẩn về SKLM có kèm theo hình
ảnh SKĐ, sử dụng sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) [23].
Hay trong Dược điển Châu Âu 8.0 (2014), tất cả các chuyên luận dược liệu
đều có tiêu chuẩn SKLM, một số chuyên luận đã thay SKLM thông thường sang
SKLM hiệu năng cao [22].
Trong Dược điển Trung Quốc (2010), số chuyên luận dược liệu và bài thuốc
có tiêu chuẩn SKLM là 873 chuyên luận (so với 347 chuyên luận /DĐTQ 2005).
Hầu hết các bài thuốc đều có tiêu chuẩn về SKLM [13].


11

Đối với DĐVN, nếu như trong DĐVN III có 71/270 chun luận có tiêu chuẩn

SKLM thì trong DĐVN IV (2010) [4] số chuyên luận dược liệu có tiêu chuẩn
SKLM đã lên đến 168 chuyên luận (trong tổng số 283 chuyên luận). Trong DĐVN
IV có 23 chuyên luận bài thuốc trong đó có 19 chun luận có tiêu chuẩn về SKLM.
Ngồi định tính, SKLM cịn được sử dụng để định lượng và bán định lượng;
kiểm tra nguồn nguyên liệu đầu vào; độ đồng đều giữa các lơ, mẻ trong q trình
sản xuất và độ ổn định của các dạng thuốc thành phẩm, bán thành phẩm. SKLM là
một trong các công cụ hữu hiệu để phát hiện nhầm lẫn, giả mạo dược liệu, dựa trên
hình ảnh “dấu vân tay sắc ký” của dược liệu [18],[20].


12

CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, NỘI DUNG
VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu
 Mẫu dược liệu được cung cấp bởi công ty cổ phần dược phẩm Khang Minh.
Bảng 2.1: Bộ phận dùng của các dược liệu.
Tên dược liệu
Tán phòng hoa nhĩ thảo

Bộ phận dùng
Phần trên mặt đất

Đan sâm

Rễ

Hoàng bá

Vỏ thân

Hồng hoa

Hoa

Ngưu tất

Rễ

Thương truật

Thân rễ

Trâu cổ

Quả

Ý dĩ

Hạt

 Bán thành phẩm bài thuốc thu được trong quá trình nghiên cứu sản xuất thử
nghiệm của công ty dược phẩm Khang Minh:
- Dạng cao: mẫu 7 thu được từ dịch chiết cồn 70% bài thuốc.
- Dạng cốm: mẫu 9 thu được từ cao dược liệu theo quy trình sau:
+ Cho tá dược vào máy trộn, cho máy hoạt động, cho từ từ cao dược liệu vào
tá dược, vừa cho vừa trộn đều.
+ Sau khi cho hết lượng cao của mẻ, lấy hỗn hợp ra khỏi máy, cho vào máy
đùn để tạo cốm.
+ Sấy cốm tạo thành ở nhiệt độ 60 – 70oC trong khoảng 3 giờ (đạt độ ẩm

không quá 5%).
+ Lấy cốm ra, để nguội rồi đóng túi .
2.2. Phƣơng tiện nghiên cứu
2.2.1 Thuốc thử, chất đối chiếu
 Thuốc thử được chuẩn bị theo tài liệu [21]


13

 Thuốc thử vanilin-acid sulfuric: trộn đều dung dịch vanilin 1% trong cồn
tuyệt đối với dung dịch acid sulfuric 10% trong cồn tuyệt đối theo tỷ lệ 1:1 về thể
tích, bản mỏng sau khi phun thuốc thử được sấy ở 1000C trong 5-10 phút, quan sát
dưới ánh sáng thường.
 Thuốc thử anisaldehyd –acid sulfuric: trộn đều 0,05 ml anisaldehyd với 1,0
ml acid acetic băng và 8,5ml methanol, 0,5ml acid sulfuric đậm đặc, bản mỏng sau
khi phun thuốc thử được sấy ở 1000C trong 5-10 phút, quan sát sắc ký đồ dưới ánh
sáng thường và ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 366 nm.
 Thuốc thử NP/PEG: Trộn đều dung dịch diphenyl boryloxyethylamin 1%
trong methanol với dung dịch PEG 4000 5% trong ethanol theo tỉ lệ 10:8, quan sát
sắc ký đồ dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 366 nm.
 Chất đối chiếu.
 Chất đối chiếu: dung dịch Tanshinon IIA 0,2mg/ml, acid ursolic 0,2mg/ml,
acid oleanolic 0,2mg/ml trong methanol được cung cấp bởi công ty cổ phần dược
phẩm Khang Minh.
 Chất đối chiếu: berberin hàm lượng 90,62% được cung cấp bởi Viện kiểm
nghiệm thành phố HCM, hòa tan trong methanol để được dung dịch có nồng độ
1mg/ml.
2.2.2 Dung mơi, hóa chất:
Nguồn cung cấp: cơng ty trách nhiệm hữu hạn Hóa Ứng Dụng- số 10- Lê
Thánh Tơng- Hồn Kiếm- Hà Nội, đạt tiêu chuẩn phân tích:

- n-hexan

- Acid acetic

- Ethanol tuyệt đối

- Ether dầu (60-90)

- Methanol

- Isopropanol

- Ethylacetat

- Chloroform

- Acid hydrochloric

- n-butanol

- Toluen

2.2.3. Máy móc, dụng cụ, thiết bị:
- Bản mỏng tráng sẵn TLC, HPTLC silica gel 60 F254 của hãng MERCK
(Đức).
- Cân kỹ thuật Precisa, cân phân tích.


14

- Tủ sấy SHELLAB (Đức).
- Máy cất chân không Bucher.
- Buồng chụp CAMAG REPROSTAR 3 và máy ảnh canon ISUS 115.
- Máy chấm sắc ký tự động Linomat V.
- Nồi đun cách thủy, bình chiết và bộ dụng cụ chiết hồi lưu.
- Bình định mức, pipet, ống đong và các dụng cụ phân tích cần thiết khác.
2.3. Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Khảo sát các điều kiện khai triển sắc ký lớp mỏng để phân tích định
tính cao bài thuốc “Tiền liệt thanh giải”.
2.3.1.1 Chuẩn bị dịch chấm sắc ký.
 Chuẩn bị dịch chiết cồn 70% của bài thuốc.
Cân các dược liệu theo tỷ lệ khối lượng từng dược liệu trong bài thuốc ( tổng
khối lượng là 115g), cắt nhỏ, trộn đều các dược liệu, thêm cồn 70% đến ngập dược
liệu, đun hồi lưu trong 1 giờ, lọc nóng qua bơng, thu lấy dịch chiết, thêm tiếp cồn
70% đến ngập dược liệu rồi chiết hồi lưu lần 2 và 3 trong 30 phút, lọc nóng qua
bơng, thu lấy dịch chiết. Gộp dịch chiết, lọc qua giấy lọc bằng phễu lọc hút chân
không Buchner. Cất thu hồi dung môi, cô cách thủy phần dịch chiết đậm đặc thu
được 31,32g cao đặc. Hòa tan cao trong cồn 70%, lọc qua giấy lọc thu được dịch
chấm sắc ký ( dịch chiết toàn phần: DCtp).
 Chuẩn bị dịch chiết phân đoạn bài thuốc từ cao toàn phần.
 Lấy 10g cao bài thuốc phân tán đều vào 80ml nước cất.
 Chiết phân đoạn 1: đem dịch trên chiết với 40ml n-hexan trong bình gạn, thu lấy
phần n-hexan, tiếp tục bổ sung thêm n-hexan chiết tiếp như trên đến khi phần nhexan khơng cịn màu, tập trung dịch n-hexan sau đó lọc qua natri sulfat khan,
giữ lại phần dịch chiết nước để chiết phân đoạn 2, cơ bớt dịch n-hexan đến thể
tích 15ml thu được dịch chấm sắc ký.
 Phần nước còn lại được tiếp tục chiết phân đoạn 2 và 3 lần lượt bằng dung môi
ethyl acetat và n-butanol tương tự như chiết phân đoạn 1 thu được dịch chấm sắc
ký.

15

10g cao
bài thuốc
Phân tán vào
80ml nước cất
Dịch chiết nước
Chiết với n-hexan

Dịch chiết nước
Dịch chiết n-hexan
Chiết với ethylacetat

Dịch chiết
ethylacetat

Dịch chiết nước
Chiết với n-butanol

Dịch chiết n-butanol

Dịch chiết nước

Bay hơi dung
môi

15ml dịch chiết nhexan (dịch chấm
sắc ký)

15 ml dịch chiết

ethylacetat (dịch
chấm sắc ký)

20ml dịch chiết nbutanol (dịch
chấm sắc ký)

Hình 2.2: Sơ đồ chiết phân đoạn bài thuốc.
 Chuẩn bị dịch chiết cồn 70% từng dược liệu.
Cân khoảng 15g dược liệu đã cắt nhỏ, thêm cồn 70% đến ngập dược liệu, chiết
hồi lưu trong 1 giờ, lọc qua giấy lọc, dịch lọc cô cách thủy đến cắn. Hòa tan cắn
dược liệu trong cồn 70% thành dung dịch có nồng độ khoảng 50 mg/ml, lọc dịch
trên qua giấy lọc thu được dịch chấm sắc ký.
2.3.1.2 Lựa chọn hệ dung môi khai triển và thuốc thử hiện màu.