Biểu hiện, tinh sạch, đánh giá hoạt tính sinh học của thrombin tái tổ hợp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VŨ THỊ HỒNG DUYÊN

BIỂU HIỆN, TINH SẠCH, ĐÁNH GIÁ
HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA
THROMBIN TÁI TỔ HỢP

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VŨ THỊ HỒNG DUYÊN

BIỂU HIỆN, TINH SẠCH, ĐÁNH GIÁ
HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA
THROMBIN TÁI TỔ HỢP
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH
MÃ SỐ: 60720408

Người hướng dẫn khoa học: TS. Đỗ Thị Tuyên
TS. Đào Thị Mai Anh

HÀ NỘI 2017


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Đỗ Thị Tuyên và TS. Đào
Thị Mai Anh những người thầy đã định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn,
sửa luận văn và tạo mọi điều kiện hóa chất, thiết bị cũng như kinh phí để thực
hiện đề tài này.
Tôi xin cảm ơn tập thể Phòng Công nghệ sinh học Enzym, Viện Công
nghệ sinh học đã chỉ bảo, giúp đỡ tận tình cho tôi trong quá trình thực nghiệm
cũng như chia sẻ những kinh nghiệm chuyên môn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo bộ môn Hóa sinh
cùng các thầy cô trong các bộ môn, phòng ban, thư viện trường Đại học Dược
Hà Nội đã luôn quan tâm, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá
trình học tập.
Đề tài này được thực hiện trong khuôn khổ của đề tài “Nghiên cứu điều
kiện biểu hiện và tinh sạch thrombin tái tổ hợp ứng dụng tạo băng gạc cầm
máu nhanh vết thương” do TS. Đỗ Thị Tuyên - Viện CNSH làm chủ nhiệm
đề tài.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn đồng nghiệp, bạn bè và người thân trong gia
đình đã giúp đỡ, tạo điều kiện, động viên tôi trong suốt thời gian học tập.
Hà Nội, ngày 31 tháng 3 năm 2017
Học viên

Vũ Thị Hồng Duyên

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................... 3
1.1. Sơ lược về quá trình đông máu ............................................................... 3
1.1.1. Các yếu tố đông máu........................................................................... 3
1.1.2. Cơ chế của quá trình đông máu .......................................................... 4
1.1.2.1. Giai đoạn thành lập phức hợp prothrombinase ............................ 4
1.1.2.2. Giai đoạn thành lập thrombin ...................................................... 5
1.1.2.3. Giai đoạn thành lập fibrin và cục máu đông ................................ 6
1.2. Thrombin, vai trò, nguồn gốc.................................................................. 6
1.2.1. Thrombin ............................................................................................. 6
1.2.2. Vai trò của thrombin trong quá trình cầm máu ................................... 8
1.2.3. Nguồn gốc của thrombin ................................................................... 11
1.2.3.1. Prothrombin ............................................................................... 11
1.2.3.2. Sự hình thành thrombin ............................................................ 13
1.2.4. Ứng dụng của thrombin .................................................................... 15
1.2.4.1. Công cụ nghiên cứu ................................................................... 15
1.2.4.2. Ứng dụng trong Y - Dược.......................................................... 15
1.2.4.3. Sản xuất thực phẩm.................................................................... 16
1.2.5. Tình hình nghiên cứu, sản xuất thrombin trong nước và quốc tế ..... 16


1.2.5.1. Trên thế giới............................................................................... 16
1.2.5.2. Tại Việt Nam ............................................................................. 17
1.3. Chủng vi khuẩn Escherichia coli .......................................................... 18
1.3.1. Các thông tin chung về chủng E.coli ................................................ 18
1.3.1.1. Hình thái học.............................................................................. 18

1.3.1.2. Môi trường nuôi cấy .................................................................. 18
1.3.2. E.coli được sử dụng như một hệ biểu hiện để sản xuất protein tái tổ
hợp ................................................................................................................... 18
1.3.3. Ưu điểm và hạn chế của hệ biểu hiện protein trên E.coli ................. 19
1.3.3.1. Ưu điểm ..................................................................................... 19
1.3.3.2. Hạn chế ...................................................................................... 20
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 22
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị ......................................................................... 22
2.1.1. Nguyên liệu ....................................................................................... 22
2.1.2. Hóa chất ............................................................................................ 22
2.1.3. Môi trường nuôi cấy ......................................................................... 24
2.1.4. Thiết bị thí nghiệm ............................................................................ 24
2.1.5. Dụng cụ ............................................................................................. 25
2.2. Nội dung nghiên cứu .............................................................................. 25
2.3. Phương pháp nghiên cứu....................................................................... 27
2.3.1. Phương pháp hoạt hóa chủng E.coli ................................................. 27
2.3.2. Phương pháp nuôi cấy, biểu hiện thrombin ở chủng E.coli.............. 27
2.3.3. Phân tích protein bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE ........................ 27


2.3.4. Phương pháp tinh sạch protein tái tổ hợp ......................................... 28
2.3.5. Phương pháp thẩm tách ..................................................................... 29
2.3.6. Xác định hàm lượng protein ............................................................. 29
2.3.7. Phương pháp thử hoạt tính ................................................................ 30
2.3.7.1. Đánh giá khả năng chuyển hóa fibrinogen của thrombin .......... 30
2.3.7.2. Đánh giá khả năng phản ứng với cơ chất đặc hiệu Tosyl- GlyPro-Arg-4-nitranilide acetate (Chromozym TH) ........................................ 32
2.3.7.3. Đánh giá trên động vật thực nghiệm.......................................... 32
2.3.8. Xử lý số liệu……………………………………………………… 32
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................... 33
3.1. Chọn lọc các chủng E.coli sinh tổng hợp thrombin ............................ 33

3.2. Lựa chọn điều kiện biểu hiện thrombin ở chủng E.coli BL21(DE3) . 38
3.2.1. Lựa chọn nhiệt độ biểu hiện thrombin .............................................. 38
3.2.2. Lựa chọn điều kiện pH môi trường biểu hiện thrombin ................... 39
3.2.3. Lựa chọn nồng độ pepton của môi trường LB biểu hiện thrombin .. 40
3.2.4. Lựa chọn nồng độ chất cảm ứng IPTG biểu hiện thrombin ............. 41
3.2.5. Lựa chọn thời điểm kết thúc biểu hiện thrombin .............................. 42
3.3. Kết quả tinh sạch thrombin và đánh giá độ tinh khiết ....................... 43
3.4. Đánh giá hoạt tính sinh học của thrombin tái tổ hợp ......................... 45
3.4.1. Khả năng chuyển hóa fibrinogen ...................................................... 45
3.4.2. Phản ứng với cơ chất đặc hiệu Tosyl- Gly-Pro-Arg-4-nitranilide
acetate (Chromozym TH).................................................................................45
3.4.3. Đánh giá hoạt tính của thrombin trên động vật thực nghiệm ........... 46


Chương 4. BÀN LUẬN ................................................................................. 47
4.1. Bàn luận về kết quả lựa chọn chủng E.coli có biểu hiện thrombin tốt
nhất ................................................................................................................. 47
4.2. Bàn luận về kết quả chọn các điều kiện biểu hiện thrombin ............. 48
4.2.1. Kết quả lựa chọn điều kiện nhiệt độ ................................................. 48
4.2.2. Kết quả lựa chọn điều kiện pH ......................................................... 48
4.2.3. Kết quả lựa chọn nồng độ pepton của môi trường LB ..................... 49
4.2.4. Kết quả lựa chọn nồng độ IPTG ....................................................... 49
4.2.5. Kết quả lựa chọn thời điểm thu mẫu ................................................. 50
4.3. Bàn luận về kết quả tinh sạch và hoạt tính của thrombin tái tổ hợp 50
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 52
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN

Deoxyribonucleic acid

ĐC

Đối chứng

IPTG

Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside

Kb

Kilobase

kDa

Kilo Dalton

M

Marker

OD

Optical density

SDS-PAGE

Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

TEMED

N,N,Nˊ, Nˊ-Tetramethylethylenediamine

TLTK

Tài liệu tham khảo

v/v

Volume/volume

w/v

Weight/volume


DANH MỤC CÁC BẢNG
STT

Tên bảng

Bảng 1.1

Các yếu tố liên quan đến đông máu

3

Bảng 1.2

Các công trình nghiên cứu biểu hiện thrombin

16

Bảng 1.3

Các hệ thống biểu hiện được sử dụng để sản xuất

19

Trang

protein tái tổ hợp
Bảng 1.4

Một số dược phẩm sinh học hiện có trên thị trường

19

Bảng 2.1

Thành phần các loại đệm và dung dịch

23

Bảng 2.2

Các thiết bị thí nghiệm

24

Bảng 2.3

Thành phần gel co và gel tách

28

Bảng 3.1

Khối lượng ướt tế bào của năm chủng E.coli

34

Bảng 3.2

So sánh mức độ biểu hiện protein thrombin của các

35

chủng
Bảng 3.3

Hàm lượng protein tinh sạch từ chủng E.coli BL21

36

(DE3) và E.coli (DE3)plys E
Bảng 3.4

Bảng 3.5

Thời gian chuyển fibrinogen thành fibrin của
thrombin ở phân đoạn E2 tinh sạch được tách ra từ
chủng E.coli BL2 1(DE3) và E.coli (DE3)plysE
Mức độ biểu hiện protein thrombin từ chủng E.coli

37

38

BL21 (DE3) tại các nhiệt độ khác nhau
Bảng 3.6

Biến đổi pH môi trường sau khi nuôi cấy

39

Bảng 3.7

Mức độ biểu hiện protein thrombin từ chủng E.coli

40

BL21 (DE3) tại pH môi trường khác nhau
Bảng 3.8

Mức độ biểu hiện thrombin từ chủng E.coli BL21

41

(DE3) tại nồng độ pepton môi trường khác nhau
Bảng 3.9

Mức độ biểu hiện protein thrombin từ chủng E.coli
BL21 (DE3) cảm ứng bởi nồng độ IPTG khác nhau

42


Bảng 3.10

Mức độ biểu hiện protein thrombin từ chủng E.coli

43

BL21 (DE3) với thời điểm kết thúc biểu hiện khác
nhau
Bảng 3.11

Bảng tóm tắt quá trình tinh sạch thrombin từ chủng

44

E.coli BL21 (DE3)
Bảng 3.12

Thời gian chuyển fibrinogen thành fibrin

45

Bảng 3.13

Đánh giá hoạt độ enzym của thrombin

46

Bảng 3.14

Thời gian cầm máu trên động mạch tai thỏ

46


DANH MỤC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ
Số STT

Tên hình

Hình 1.1

Các giai đoạn của quá trình đông máu

5

Hình 1.2

Cấu tạo của α-Thrombin

7

Hình 1.3

Cấu trúc không gian của α-thrombin

7

Hình 1.4

Sự tự phân giải của thrombin

8

Hình 1.5

Cấu trúc fibrinogen và các vị trí hoạt động

9

Hình 1.6

Quá trình chuyển từ fibrinogen thành mạng lưới fibrin

9

Hình 1.7

Vai trò trung tâm của thrombin

10

Hình 1.8

Cấu trúc tinh thể của prothrombin

12

Hình 1.9

Các vùng cấu trúc không gian của prepro-prothrombin

12

Trang

và các vị trí cắt
Hình 1.10

Quá trình tạo thành thrombin

13

Hình 1.11

Sơ đồ về sự hoạt động của prothrombin

14

Sơ đồ 2.1

Nội dung nghiên cứu

26

Hình 2.1

Công thức phân tử Coomassie Brilliant Blue G250

30

Hình 2.2

Đường chuẩn Bradford có sử dụng BSA làm chuẩn

30

Hình 3.1

Mật độ tế bào của các chủng E.coli mang plasmid

33

pET22b(+)
Hình 3.2

Điện di đồ kiểm tra biểu hiện thrombin của các chủng

34

Hình 3.3

Điện di đồ so sánh khả năng tinh sạch protein thrombin
của E.coli BL21 (DE3) và E.coli (DE3)plysE
Điện di đồ so sánh biểu hiện protein thrombin từ chủng
E.coli BL21 (DE3) ở nhiệt độ khác nhau
Điện di đồ so sánh biểu hiện protein thrombin từ chủng
E.coli BL21 (DE3) ở pH môi trường khác nhau
Điện di đồ so sánh biểu hiện thrombin từ chủng E.coli
BL21 (DE3) ở nồng độ pepton môi trường khác nhau

36

Hình 3.4
Hình 3.5
Hình 3.6

38
39
40


Hình 3.7

Hình 3.8

Hình 3.9

Điện di đồ so sánh biểu hiện protein thrombin từ chủng
E.coli BL21 (DE3) cảm ứng bởi nồng độ IPTG khác

nhau
Điện di đồ so sánh biểu hiện protien thrombin từ chủng
E.coli BL21 (DE3) với thời điểm kết thúc biểu hiện
khác nhau
Điện di đồ protein thrombin tinh sạch từ E.coli BL21
(DE3)

41

42

44


ĐẶT VẤN ĐỀ
Máu đóng vai trò quan trọng trong cơ thể sống, được lưu thông trong cơ thể
bởi hệ thống mạch máu. Khi mạch máu bị tổn thương, nếu vết thương nhỏ và ở vị
trí thuận lợi cho băng bó thì cơ chế cầm máu của cơ thể đáp ứng được yêu cầu, vết
thương được kiểm soát. Nhưng với những vết thương lớn, đặc biệt là các vết mổ,
chảy máu sau phẫu thuật là một biến chứng nguy hiểm thường gặp trong y khoa.
Nếu không được cấp cứu kịp thời bệnh nhân sẽ shock do giảm tưới máu ở phạm
vi tế bào và rối loạn chuyển hóa tế bào, ảnh hưởng tới tính mạng. Đông máu được
coi như giai đoạn chính quyết định đến thời gian của quá trình cầm máu. Trên thế
giới, các nhà khoa học đã nghiên cứu nhiều phương pháp cầm máu tức thời ứng
dụng vào y học để rút ngắn thời gian của quá trình đông máu. Thrombin là một
enzym phân giải protein, đóng vai trò như chìa khóa trong chuỗi phản ứng hình
thành cục máu đông. Quá trình chuyển máu từ dạng lỏng sang dạng gel ở nơi bị
tổn thương trung bình từ 6 - 10 phút, nhưng nếu có sẵn một lượng thrombin tại vị
trí tổn thương thì sẽ rút ngắn thời gian đông máu. Vì vậy, thrombin dùng tại chỗ
được sử dụng rộng rãi trong phẫu thuật trên thế giới [28]. Thrombin chủ yếu tách

chiết từ phổi và máu động vật, có nhiều hạn chế như: xuất hiện kháng thể kháng
protein động vật (gây huyết khối), kháng thể chống lại yếu tố V (gây chảy máu)
[46], phải sử dụng một lượng lớn động vật vấp phải sự phản đối của hiệp hội yêu
động vật…[45], thrombin được phân lập từ huyết tương người có thể hạn chế một
số vấn đề trên nhưng vẫn còn nguy cơ lây nhiễm virus [29]. Với sự phát triển của
công nghệ sinh học thrombin tái tổ hợp đã được nghiên cứu và đưa vào sử dụng,
khắc phục được những hạn chế của thrombin từ động vật, đặc biệt còn an toàn với
cả trẻ em [24]. Đối với phẫu thuật khi có chỉ định thrombin sẽ làm giảm đáng kể
nguy cơ chảy máu, bục vết khâu sau mổ; Đối với những vết thương xảy ra trong
sinh hoạt hàng ngày nếu có các chế phẩm thrombin dùng tại chỗ sẽ hạn chế đáng
kể nguy cơ mất máu và phải tới gặp bác sỹ để khâu vết thương (điều này rất có ý
nghĩa đối với trẻ nhỏ).
1


Hội nhập với xu hướng nghiên cứu của thế giới, đồng thời mong muốn tạo
ra sản phẩm có tính ứng dụng cao, luận văn: “Biểu hiện, tinh sạch, đánh giá hoạt
tính sinh học của thrombin tái tổ hợp” được tiến hành với hai mục tiêu:
1. Lựa chọn được điều kiện tối ưu biểu hiện thrombin tái tổ hợp.
2. Tinh sạch được thrombin tái tổ hợp, đánh giá hoạt tính sinh học của
thrombin.

2


Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Sơ lược về quá trình đông máu
Đông máu là giai đoạn trung tâm đóng vai trò quan trọng trong hệ thống
cầm máu của cơ thể, giúp hệ thống này hoàn thành nhiệm vụ làm cho máu ngừng
chảy ở vết thương.

Về phương diện hóa sinh, quá trình đông máu là một hệ thống gồm nhiều
phản ứng hóa học để biến fibrinogen (hòa tan trong huyết tương) thành fibrin (có
dạng sợi không hòa tan). Các fibrin liên kết thành lưới sợi huyết ôm lấy các huyết
cầu tạo thành cục máu đông, nút vào chỗ mạch bị tổn thương để cùng với yếu tố
co mạch, co sợi huyết chống lại sự chảy máu [27].
1.1.1. Các yếu tố đông máu
Quá trình đông máu được thực hiện nhờ có sự tham gia của các yếu tố đông
máu. Các yếu tố đông máu bao gồm các yếu tố của huyết tương, của tiểu cầu và
của tổ chức. Đến ngày nay, người ta đã phát hiện 15 yếu tố đông máu được ký
hiệu theo thứ tự bằng chữ số La Mã như trình bày trong bảng 1.1 [54].
Bảng 1.1. Các yếu tố liên quan đến đông máu
Ký hiệu

Tên yếu tố

Yếu tố I

Fibrinogen

Yếu tố II

Prothrombin

Yếu tố III

Thromboplastin tổ chức

Yếu tố IV

Ion Ca2+

Yếu tố V

Proaccelerin

Yếu tố VII

Proconvertin

Yếu tố VIII

Yếu tố chống chảy máu A (antihemophilic globin-AHG)

Yếu tố IX

Yếu tố chống chảy máu B (plasma thromboplastin
component-PTC)
3


Yếu tố X

Yếu tố Stuart

Yếu tố XI

Tiền thromboplastin huyết tương (yếu tố chống chảy máu
C)

Yếu tố XII

Yếu tố Hageman

Yếu tố XIII

Yếu tố ổn định fibrin

Yếu tố XIV

Yếu tố Fletcher

Yếu tố XV

Yếu tố Fitzeland (HMW kininogen)

Yếu tố XVI

Yếu tố Von Willebrand (vwf)

Các yếu tố đông máu được chia thành 3 nhóm [54]:
- Các yếu tố liên quan đến fibrinogen (Fibrinogen, V, VIII, XIII)
- Các yếu tố phụ thuộc Vitamin K (II, VII, IX, X)
- Các yếu tố tiếp xúc (XI, XII, HMWK, Fletcher)
Hầu hết các yếu tố đông máu có bản chất là protein (trừ yếu tố IV là Ca 2+)
có vai trò như những enzym. Bình thường các yếu tố đông máu này tồn tại ở dạng
không hoạt động, khi xuất hiện một yếu tố bất thường (chất ngoại lai, tổn thương
mạch...) chúng được hoạt hóa một cách trình tự theo kiểu bậc thang để cuối cùng
tạo thành cục máu đông.
1.1.2. Cơ chế của quá trình đông máu
Quá trình đông máu được chia thành 3 giai đoạn: giai đoạn thành lập phức

hợp prothrombinase; giai đoạn thành lập thrombin; giai đoạn thành lập fibrin và
cục máu đông:
1.1.2.1. Giai đoạn thành lập phức hợp prothrombinase
Đây là giai đoạn phức tạp và kéo dài nhất của quá trình đông máu. Phức
hợp prothrombinase gồm: Yếu tố Xa, yếu tố Va, ion Ca ++, phospholipid [44]. Sự
hình thành phức hợp prothrombinase theo hai con đường nội sinh và ngoại sinh,
4


cơ chế ngoại sinh xuất hiện nếu có chấn thương thành mạch hoặc các mô kế cận,
cơ chế nội sinh xuất hiện khi máu thoát ra ngoài cơ thể từ lòng mạch hoặc tiếp xúc
với lớp collagen. Cả hai con đường đều đi đến tạo phức hợp prothrombinase, tuy
nhiên con đường ngoại sinh mất nhiều thời gian hơn (hình 1.1) [26].

Yếu tố Xa
Thrombin
Yếu tố VIIa
Yếu tố IXa

Tổnthương
thươngmạch
mạch
Tổn

Thrombin

Yếu tố mô
Yếu tố VIIa
+
Yếu tố mô

Ca2+

Bề mặt

Yếu tố IXa

Yếu tố IX

Yếu tố VII
+
Yếu tố mô

Yếu tố IX

Yếu tố IXa

Yếu tố IX

Yếu tố VII

Yếu tố VIIa
Ca2+, PL

Ca2+, PL

Yếu tố X

Yếu tố VIII Yếu tố Xa

Yếu tố X

Phức hợp
Prothrombinase
(Xa, Va,
Ca2+, PL)
Prothrombin

Yếu tố V

Thrombin
Yếu tố XIII

Fibrinogen

Fibrin

Ca2+
Fibrin

Yếu tố XIIIa

Màng
lướiFibrin

Hình 1.1. Các giai đoạn của quá trình đông máu [13]
1.1.2.2. Giai đoạn thành lập thrombin
Phức hợp Prothrombinase lập tức chuyển prothrombin thành thrombin. Sự
hình thành thrombin diễn ra rất nhanh, được tính bằng vài giây. Tiểu cầu
cũng đóng vai trò quan trọng trong việc chuyển prothrombin thành thrombin.
Trong phức hợp prothrombinase, yếu tố Xa là một enzym phân giải protein

thực sự, nó chuyển prothrombin thành thrombin. Khi thrombin được hình thành,

5


nó sẽ hoạt hoá yếu tố V và yếu tố VIII. Hai yếu tố này càng thúc đẩy tác dụng của
yếu tố Xa tạo nên sự điều hoà ngược dương tính.
Thrombin cũng là một enzym phân giải protein, nó cũng có thể tác động lên
chính prothrombin để tăng tạo thrombin. Ngoài ra, nó còn thúc đẩy quá trình hoạt
hoá các yếu tố IX, X, XI, XII và sự kết tụ tiểu cầu.
Như vậy, khi thrombin đã hình thành, nó sẽ khởi phát quá trình điều hoà
ngược dương tính làm thrombin được tạo ra nhiều hơn và quá trình đông máu tiếp
tục phát triển rất mạnh cho đến khi có một cơ chế ngăn chặn lại [35].
1.1.2.3. Giai đoạn thành lập fibrin và cục máu đông
Thrombin vừa hình thành sẽ cùng Ca2+ nhanh chóng chuyển fibrinogen
phân tử thành fibrin đơn phân. Các fibrin đơn phân này nối lại với nhau tạo thành
các sợi fibrin. Dưới tác động của yếu tố ổn định fibrin, mạng lưới fibrin bền vững
được hình thành và giam giữ các thành phần của máu: hồng cầu, tiểu cầu, huyết
tương,… tạo nên cục máu đông.
Sau khi hình thành khoảng 20 - 60 phút, cục máu đông sẽ co lại và tiết ra 1
chất dịch gọi là huyết thanh. Tiểu cầu bị giam giữ trong cục máu đông đóng vai
trò quan trọng trong việc co cục máu nhờ vào các protein co rút. Các tiểu cầu còn
tiếp tục tiết ra yếu tố ổn định fibrin làm tăng cường các cầu nối giữa các sợi fibrin
kề cận. Ngoài ra, sự co cục máu cũng được thúc đẩy bởi thrombin và Ca 2+ được
tiết ra từ các kho dự trữ trong tiểu cầu. Cuối cùng, cục máu đông trở thành một
khối nhỏ và đặc hơn [14].
1.2. Thrombin, vai trò, nguồn gốc
1.2.1. Thrombin
Năm 1872 sau khi Alexander Schmidt (người Đức) chứng minh sự chuyển
đổi fibrinogen thành fibrin là kết quả hoạt động của một enzym và ông đặt tên cho

enzym đó là “thrombin” và tiền thân của nó là “prothrombin” [72]. Ngày nay
6


người ta biết đến thrombin như là một serin protease, thuộc nhóm các enzym thủy
phân có khả năng cắt mối liên kết (-CO~NH-) trong các phân tử polypeptid,
protein và một số cơ chất tương tự thành các acid amin tự do hoặc các peptid phân
tử thấp hơn. Serin protease sử dụng acid amin serin làm trung tâm hoạt động. Một
số ví dụ quen thuộc về serin protease có thể kể đến trypsin và chymotrypsin, các
enzym có trong hệ tiêu hóa ở người [69]. Tuy nhiên, thrombin có tính đặc hiệu
cao hơn so với các enzym tiêu hóa trên, nó chỉ cắt 4 cầu Arg-Gly của fibrinogen
trên chuỗi Aα và Bβ mà không phân giải tất cả các protein khác trong máu [67].
Thrombin tồn tại ở 3 dạng α-thrombin, β-thrombin và γ-thrombin, trong đó αthrombin được hình thành đầu tiên và có khả năng hoạt động mạnh nhất [59].
α-Thrombin có khối lượng nguyên tử khoảng 36.000 dalton bao gồm hai
chuỗi A và B được liên kết bởi cầu disulfua. Phân tử thrombin có cấu trúc bậc 3
với 4 cầu disulfua, sự gấp cuộn này một phần tạo nên tính chất enzym xúc tác cho
thrombin [51].

Hình 1.2. Cấu tạo của α-thrombin [59]

Hình 1.3. Cấu trúc không gian của
α-thrombin [61]

Thrombin là một protein khá đặc biệt chứa một lượng lớn các phân tử phân
cực và tích điện, phân bố không đồng đều trên chiều dài của nó. Hơn 70% số
amino acid trên bề mặt thrombin là ưa nước. 79 trong số 89 amino acid tích điện
được để lộ ra bề mặt của phân tử, trong khi 10 amino acid còn lại được dấu hoàn
toàn ở trong các nếp gấp của protein [51]. Hầu hết các amino acid tích điện này
được sắp xếp để tương tác với nhau. Những tương tác này có vai trò quan trọng
trong việc duy trì liên kết giữa chuỗi A và B cũng như cấu trúc của cả protein. Cấu

trúc cuối cùng này bao quanh trung tâm hoạt động của thrombin [36].
7


Sau khi thrombin được hoạt hóa, chúng sẽ tham gia vào phản ứng chuyển
hóa fibrinogen thành các phân tử fibrin đơn phân. Tuy nhiên, thrombin chỉ tồn tại
trong một thời gian ngắn bởi sự tự phân cắt ở vị trí Arg62-Ile và Arg73-Asn trên
chuỗi nặng để tạo thành β-thrombin, β-thrombin sau đó bị biến đổi thành γthrombin bởi sự phân giải ở Arg123-Glu và Lys154-Gly [6].

Hình 1.4. Sự tự phân giải của thrombin [12]

1.2.2. Vai trò của thrombin trong quá trình cầm máu
Trong cơ thể, quá trình đông máu được kiểm soát một cách cẩn thận để
tránh những hậu quả nghiêm trọng có thể gây nên bởi cục máu đông như: nhồi
máu cơ tim, tai biến mạch máu dẫn đến đột quỵ và tử vong. Vì vậy, thrombin ban
đầu tồn tại ở dạng bất hoạt được gọi là prothrombin và chỉ được hoạt hóa khi có
tổ chức bị tổn thương.
Thrombin hoạt động bằng nhiều con đường để thúc đẩy cầm máu, được biết
đến nhiều nhất trong số đó là chuyển hóa fibrinogen thành fibrin, fibrinogen
protein huyết tương cuối cùng tham gia vào quá trình đông máu. Fibrinogen bao
gồm hai cặp mỗi cặp gồm ba chuỗi polypeptide (α, β, và γ) tạo thành một chuỗi
xoắn ba kết hợp với hai miền nằm ngoài (D) và một miền trung tâm (E) theo vùng

8


cuộn (hình 1.5). Thrombin cắt fibrinogen ở 4 vị trí liên kết Arg-Gly, hai liên kết
của chuỗi Aα và hai ở chuỗi Bβ.

Hình 1.5. Cấu trúc fibrinogen và các vị trí hoạt động

Việc chuyển từ fibrinogen thành fibrin làm lộ các vị trí trùng hợp N-tận của
trung tâm E trong phân tử, cho phép liên kết giữa acid amin N-tận của phân tử
fibrin này với acid amin C-tận của phân tử fibrin khác để tạo thành polyme fibrin
(trùng hợp) [42].
Thrombin chuyển yếu tố XIII thành XIIIa (là 1 transglutaminase) làm cho
mạng lưới cấu trúc của fibrin toàn vẹn bằng cách liên kết chéo cộng hóa trị giữa
glutamin và lysin trên những phân tử fibrin liền kề (hình 1.6) [10].

Hình 1.6. Quá trình chuyển từ fibrinogen thành mạng lưới fibrin [42]
Ổn định cục máu đông được tăng cường một cách gián tiếp bởi thrombin
theo cơ chế hoạt hóa TAFI, một carboxypeptidase có tác dụng loại bỏ lysin ở đầu
C-tận của fibrin làm giảm hoạt hóa plasminogen thành plasmin [4]. Ngoài ra,
thrombin xúc tác chuyển đổi yếu tố XI thành XI hoạt hóa (XIa), cũng như xúc tác

9


yếu tố VIII và yếu tố V thành VIII hoạt hóa (VIIIa) và V hoạt hóa (VIIIa) của con
đường cầm máu nội sinh (Cơ chế điều hòa ngược dương tính) [12].
Ngoài vai trò trong việc tạo ra mạng lưới liên kết chéo của các sợi fibrin,
thrombin còn thúc đẩy kích hoạt tiểu cầu, dẫn đến kết tập tiểu cầu [15], quá trình
degranulation (một phần của của phản ứng dị ứng), và biểu hiện bề mặt của các
phospholipid thúc đẩy cầm máu như phosphatidylserin.

Hình 1.7. Vai trò trung tâm của thrombin [12]
Thrombin kích thích một loạt các phản ứng của tế bào nội mô, trong đó có
biểu hiện bề mặt tế bào và bài tiết phân tử kết dính tế bào, cũng như sản xuất các
yếu tố tăng trưởng và các cytokin. Thrombin cũng thúc đẩy giải phóng cytokin ở
các tế bào cơ trơn và kích thích sự gia tăng của cả tế bào cơ trơn và các nguyên
bào sợi. Mặc dù có rất nhiều chất kết dính được kích hoạt bởi thrombin nhưng

không phải tất cả tác dụng của thrombin đều làm tăng đông máu. Khi thrombin
tiếp xúc với thrombomodulin (TM) tạo phức hợp TM-thrombin sẽ hoạt hóa protein
C có tác dụng làm bất hoạt yếu tố Va và VIIIa, từ đó làm giảm chuyển prothrombin
thành thrombin [9].
10


Hoạt động của thrombin được kiểm soát chặt chẽ bởi các yếu tố kìm hãm
để ngăn chặn hình thành cục máu đông không đúng, trong số đó là họ chất ức chế
serin protease (serpin) và phản ứng ức chế sẽ gia tăng đáng kể nếu có sự hiện diện
của glycosaminoglycan như: Heparin, heparan sulfat, dermatan sulfate. Các serpin
quan trọng nhất chịu trách nhiệm về hoạt động của thrombin là antithrombin [52],
heparin cofactor II (HCII) [63] và protease nexin I (PNI) [5]. Antithrombin rất
phong phú trong huyết tương (nồng độ 2,3 µM) ức chế hàng loạt các protein serin
của quá trình đông máu và là chất chính hạn chế hình thành cục máu đông.
1.2.3. Nguồn gốc của thrombin
1.2.3.1. Prothrombin
Thrombin được bắt nguồn từ prothrombin. Prothrombin được hình thành từ
prepro-prothrombin - một sản phẩm được tổng hợp ở gan và bài tiết vào tuần hoàn,
Prothrombin là một glycoprotein với lượng polysaccharid chiếm khoảng 12%.
Trong máu người, nồng độ prothrombin đạt khoảng 50-100 mg/l. Trình tự amino
acid của prothrombin bò và người đã được xác định vào năm 1970 [37].
Prothrombin có khối lượng nguyên tử khoảng 72.000 dalton, gồm 4 miền: vòng
xoắn 1, vòng xoắn 2, chuỗi nhẹ và chuỗi nặng của -thrombin (Hình 1.8 và 1.9).
Chuỗi polypeptid của prothrombin gồm 622 amino acid [16] (chi tiết trình trự acid
amin xem phụ lục đính kèm). Trong đó:
Vị trí

Độ dài (acid amin)

Miêu tả

1 - 24

24

Peptid tín hiệu

25 - 43

19

Propeptid

44 - 622

579

Prothrombin

44 - 198

155

Vòng xoắn 1 (mảnh 1)

199 - 327

129

Vòng xoắn 2 (mảnh 2)

328 - 363

36

Chuỗi nhẹ của thrombin

364 - 622

259

Chuỗi nặng của thrombin
11


Hình 1.8. Cấu trúc tinh thể của prothrombin [49]

Hình 1.9. Các vùng cấu trúc không gian của prepro-prothrombin và các vị
trí cắt [12]
(Mũi tên màu xám: Vị trí cắt loại bỏ propeptide để tạo thành prothrombin
Biểu tượng ◊: Vị trí Asparagin liên kết carbohydrat
Biểu tượng γ: γ-carboxyglutamic acid (Gla)
Biểu tượng ○: Bộ ba xúc tác tạo thành chức năng trypsin-like
Mũi tên màu đen: Vị trí cắt để tạo thành thrombin
Mũi tên màu trắng: Vị trí cắt thứ 2 của chuỗi nhẹ thrombin tạo α-thrombin)

12

1.2.3.2. Sự hình thành thrombin
Prothrombin trải qua một loạt các biến đổi sau dịch mã để tạo thành
thrombin (Hình 1.10). Đoạn petide tín hiệu của prepro-prothrombin được cắt bởi
peptidase tín hiệu tạo thành pro-prothrombin, peptid mới tạo thành này đi vào lưới
nội chất và bị biến đổi bởi γ-glutamyl carboxylase, đây là một enzym có sẵn ở
lưới nội chất, nhận diện trình tự chuỗi propeptid và xúc tác dưới sự có mặt của
vitamin K chuyển 10 acid amin glutamat thành 10 γ-carboxyglutamat (gla) ở
miền Gla [60], [43]. Sự chuyển glutamat thành γ-carboxyglutamat làm cho miền
Gla có khả năng liên kết với ion Ca2+. Điện tích dương có trong ion Ca2+ sẽ cố
định prothrombin vào lớp màng phospholipid kép mang điện tích âm ở vị trí tổn
thương của mạch máu và hoạt hóa tiểu cầu [55], [39], [38]. γ-glutamyl
carboxylation sử dụng vitamin K như 1 cofactor để chuyển Glu thành gla và oxy
hóa vitamin K thành vitamin K 2,3 epoxid, sau đó các dạng epoxid này lại được
quay trở lại dạng hydroquinolon bởi 2 enzym là vitamin K epoxid reductase và
vitamin K reductase, cả 2 đều bị ức chế mạnh bởi Warfarin [53].

Hình 1.10. Quá trình tạo thành thrombin [12]
Sau khi được cố định tại lớp phospholipid kép, prothrombin sẽ được hoạt
hóa bởi phức hợp prothrombinase. Phức hợp prothombinase bao gồm yếu tố Xa và
13