Nghiên cứu tách chiết Thrombin từ phổi bò ứng dụng làm nguyên liệu tạo băng gạc cầm máu hanh vết thương (LV thạc sĩ)

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

LÊ THỊ VUI

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT THROMBIN TỪ PHỔI BÕ ỨNG
DỤNG LÀM NGUYÊN LIỆU TẠO BĂNG GẠC CẦM MÁU
NHANH VẾT THƢƠNG
(Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2015
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
1

Chuyên ngành Sinh học thực
nghiệm

Lê Thị Vui


VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

LÊ THỊ VUI

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT THROMBIN TỪ PHỔI BÕ ỨNG DỤNG
LÀM NGUYÊN LIỆU TẠO BĂNG GẠC CẦM MÁU NHANH VẾT
THƢƠNG
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 01 14
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

HƢỚNG DẪN KHOA HỌC : TS. LÊ MINH TRÍ
VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ QUÂN SỰ VIỆT NAM

e
Hà Nội - 2015


MỤC LỤC
MỤC LỤC..................................................................................................................3
LỜI CAM ĐOAN...................................................................................................... 6
LỜI CẢM ƠN............................................................................................................ 7
DANH MỤC CÁC BẢNG.........................................................................................8
DANH MỤC CÁC HÌNH..........................................................................................9
MỞ ĐẦU..................................................................................................................11
1..........................................................................................Lý do chọn đề tài
11
2.....................................................................................Mục tiêu nghiên cứu
12
3.....................................................................................Nội dung nghiên cứu
12
4.

Những điểm mới của đề tài............................ Error! Bookmark not

defined. 4.1. Trên thế giới ...................................................... Error! Bookmark
not

defined.

4.2.

Trong

nước

........................................................

Error!

Bookmark not defined.
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU..................................................................13
1.1CƠ CHẾ CẦM MÁU VÀ CÁC PHƢƠNG PHÁP CẦM MÁU....................13
1.1.1. Cơ chế cầm máu.............................................................................................13
1.1.2. Các yếu tố đông máu......................................................................................13
1.1.3. Các giai đoạn của cầm máu............................................................................14
1.1.3.1. Co mạch tại chỗ................................................................................14
1.1.3.2. Tạo nút tiểu cầu................................................................................14
1.1.3.3. Tạo cục máu đông............................................................................ 15
1.1.3.4. Co cục máu đông và tan cục máu đông............................................18
1.1.4. Các phƣơng pháp cầm máu........................................................................... 19
1.1.4.1. Cầm máu bằng lá và thảo dược........................................................ 19
1.1.4.2. Cầm máu bằng phương pháp vật lý..................................................19


1.1.4.3. Cầm máu bằng một số chất hóa học................................................ 20
1.2. THROMBIN.................................................................................................. 20
1.2.1. Khái quát chung về thrombin.........................................................................20

1.2.1.1. Cấu chúc và chức năng.................................................................... 20
1.2.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của thrombin.........................22
1.2.1.4. Ứng dụng của thrombin....................................................................23
1.2.2. Prothrombin....................................................................................................24
1.2.2.1. Thành phần của prothrombin............................................................24
1.2.2.2. Thời gian prothrombin......................................................................25
1.2.2.3. Kích hoạt prothrombin......................................................................25
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU.........................................................................27
CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................... 30
2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị.......................................................................... 30
2.1.1. Vật liệu...........................................................................................................30
2.1.2. Hóa chất......................................................................................................... 31
2.1.3. Dung dịch và đệm.......................................................................................... 31
2.1.4. Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm...........................................................................32
2.1.4.1. Dụng cụ.............................................................................................32
2.1.4.2. Thiết bị..............................................................................................32
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu...............................................................................33
2.2.1................................................................................................................Kh
ảo sát hàm lƣợng thrombin trong phổi bò..................................................... 33
2.2.1.1. Tách chiết thrombin từ mẫu phổi bò.................................................33
2.2.1.3. Khảo sát thrombin trong mẫu phổi...................................................33
2.2.1.4. Khảo sát hoạt tính thrombin............................................................. 33
2.2.2................................................................................................................Tối
ƣu hóa quy trình tách chiết thrombin từ phổi bò........................................... 33
2.2.2.1.
Tách thrombin ở nồng độ ethanol khác nhau...................................33
2.2.2.2. Tách thrombin ở nồng độ aceton khác nhau.....................................35
2.2.2.3. Tách chiết thrombin ở các ngưỡng nhiệt độ khác nhau....................36
2.2.2.4. Tách chiết thrombin ở độ pH khác nhau...........................................38
2.2.2.5..........................................................................................................T

ách chiết thrombin với các ngưỡng thời gian ngâm tách mẫu khác


nhau
40
2.2.2.6. Tối ưu hóa quy trình tách chiết thrombin từ phổi bò........................43
2.2.3. Nghiên cứu bổ sung các chất an định (bền) cấu trúc của thrombin và tannic
acid ở điều kiện môi trƣờng thƣờng....................................................................43
2.2.9.1. Đá nh giá khả năng chuyên̉ hóa fibrinogen của thrombin...............43
2.2.9.2. Ảnh hưởng của các chất an định...................................................... 43
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................... 44
3.1 Khảo sát hoạt tính của thrombin ở một số mẫu phổi bò đƣợc thu thập ở
các vùng khác nhau.............................................................................................44
3.2. Tối ƣu hóa quy trình tách chiết thrombin từ phổi bò..............................46
3.2.1. Tách thrombin ở nồng độ ethanol khác nhau.................................................46
3.2.2.Tách prothrombin ở nồng độ acetone khác nhau............................................49
3.2.3. Tách thrombin ở điều kiện nhiệt độ khác nhau..............................................49
3.2.4. Tách thrombin ở cách ngƣỡng pH khác nhau................................................53
3.2.5. Tách thrombin với các ngƣỡng thời gian ngâm tách mẫu khác nhau............54
3.3. Tối ƣu hóa quy trình tách chiết thrombin từ phổi bò.............................56
3.4. Kết quả nghiên cứu bổ sung các chất an định (bền) cấu trúc của thrombin và
tannic acid ở điều kiện môi trƣờng thƣờng.....................................................59
3.4.1. Đánh giá ảnh hƣởng của các chất an định đối với acid tannic và thrombin .. 59
3.4.2. Ảnh hƣởng của các chất an định đối với thrombin........................................59
3.4.3. Ảnh hƣởng của các chất an định đối với thrombin bổ sung 0,05% tannic acid
.................................................................................................................................. 62
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................... 66
1.

Kết luận..........................................................................................................66

2.

Kiến nghị........................................................................................................66

TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................... 67
I.

Tài liệu Tiếng Việt......................................................................................... 67

II. Tài liệu Tiếng Anh.........................................................................................68


PHỤ LỤC................................................................................................................73
PHỤ LỤC 1: Quy trình công nghệ gắn thrombin lên băng gạc bằng các phƣơng
pháp khác nhau (phun, tẩm)..................................................................................73
PHỤ LỤC 2: Một số hình ảnh thử nghiệm cầm máu trên thỏ bằng băng gạc tẩm
thrombin................................................................................................................75


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và đƣợc sự hƣớng dẫn
khoa học của Ts. Lê Minh Trí. Các nội dung nghiên cứu, kết quả, số liệu công bố
trong đề tài này là trung thực và đảm bảo độ tin cậy. Những số liệu trong các bảng
biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá đƣợc chính tác giả thu thập từ
các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo.
Ngoài ra, trong luận văn còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng nhƣ số liệu
của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc.

Hà Nội, ngày

tháng

Tác giả

Lê Thị Vui

năm 2015


LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Lê Minh Trí – Phòng
Hóa sinh - Viên Hoá hoc - Vâ liê , Viện KH & CN Quân sự Việt Nam - người đã
t u
trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện nghiên cứu của mình, đem lại cho tôi những kiến
thức bổ trợ, vô cùng có ích trong thời gian thực hiện nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của toàn thể cán bộ - nhân viên Phòng
Công nghệ Enzyme – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm khoa học và công
nghệ Việt nam đã nhiệt tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để tôi
thực hiện nghiên cứu này.
Cũng xin gửi lời cám ơn chân thành tới Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo sau đại
học, Đại học Thái Nguyên, Ban Chủ nhiệm Viện Hoá học – Vật liệu, Viện KH & CN
Quân sự Việt Nam đã tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Công trình được hỗ trợ từ nhiệm vụ cấp Bộ Quốc phòng « Nghiên cứu chế tạo
băng gạc cầm máu nhanh vết thương từ thrombin và tannic acid ».
Cuối cùng tôi xin gửi lời cám ơn đến gia đình, bạn bè, những người đã luôn
bên tôi, động viên và khuyến khích tôi trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu
của mình.
Hà Nội, ngày 18 tháng 11 năm 2015.

Lê Thị Vui


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng

Tên bảng

1.1

Các yếu tố đông máu

2.1

Hóa chất sử dụng

2.2

Các dung dịch và đệm

2.3

Các thiết bị đƣợc sử dụng

3.1

Ảnh hƣởng của nồng độ ethanol trong quá trình tách tới hoạt
tính thrombin

3.2

Ảnh hƣởng của nồng độ acetone trong quá trình tách tới hoạt
tính thrombin

3.3

Ảnh hƣởng của nhiệt độ trong quá trình tách tới hoạt tính
thrombin

3.4

Ảnh hƣởng của pH trong quá trình tách tới hoạt tính thrombin

3.5

Ảnh hƣởng của thời gian ngâm tách mẫu trong quá trình tách tới
hoạt tính thrombin

3.6

Ảnh hƣởng của một số yếu tố tới hoạ t tí nh của thrombin

3.7

Đánh giá các chất an định đến đối với thrombin

3.8

Đánh giá các chất an định đến đối với thrombin bổ sung 0,05%
tannic acid

Trang


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình

Tên hình

Trang

1.1

Minh hoạ đông máu nội sinh và ngoại sinh

1.2

Cấu trúc thrombin ở ngƣời

1.3

Cấu trúc không gian của prothrombin

1.4

Cơ chế hoaṭ đôṇ g của thrombin

1.5

Thành phần prothrombin

1.6

Sơ đồ về sƣƣ̣ hoaṭ đôṇ g cuả prothrombin

2.1

Các mẫu phổi thu thập

3.1

Điện di đồ SDS-PAGE

3.2

Khảo sát hoạt tính của thrombin của các mẫu phổi bò khác
nhau

3.3

SDS-PAGE protein tách từ mẫu phổi bò sử dụng ethanol

3.4

SDS-PAGE protein tá ch tƣ̀ mâũ

phổ i bò sƣ̉ dunƣ̣ g acetone

3.5

SDS-PAGE protein tá ch tƣ̀ mâũ
độ khác nhau

phổ i bò ở các nhiệt

3.6

SDS-PAGE protein tá ch tƣ̀ mâũ

phổ i bò ở pH khá c nhau

3.7

SDS-PAGE protein tá ch tƣ̀ mâũ

phổ i bò khi ngâm mâũ

3.8

Khảo sát khả năng chuyển hóa fibrionogen của thrombin và
acid tannic

3.9

Ảnh hƣởng của Tween 20 đối với thrombin ở thời điểm ban
đầu

3.10

Ảnh hƣởng của tween 80 đối với thrombin ở thời điểm ban đầu

3.11

Ảnh hƣởng của triton x100 đối với thrombin ở thời điểm ban
đầu

3.12

Ảnh hƣởng của SDS đối với thrombin ở thời điểm ban đầu

3.13

. Ảnh hƣởng của PEG 4000 đối với thrombin


3.14

Ảnh hƣởng của tween 20 đối với thrombin bổ sung 0,05% acid
tannic ở thời điểm ban đầu

3.15

Ảnh hƣởng của tween 80 đối với thrombin bổ sung 0,05% acid
tannic ở thời điểm ban đầu

3.16

Ảnh hƣởng của triton x100 đối với thrombin bổ sung 0,05%
acid tannic ở thời điểm ban đầu

3.17

Ảnh hƣởng của PEG 4000 đối với thrombin bổ sung 0,05%
acid tannic ở thời điểm ban đầu

3.18

Ảnh hƣởng của SDS đối với thrombin bổ sung 0,05% acid
tannic ở thời điểm ban đầu


MỞ ĐẦU
1.

Lý do chọn đề tài

Mỗi năm, trên thế giới, số ngƣời tử vong vì không đƣợc cầm máu kịp thời
do tổn thƣơng mạch máu ngày càng gia tăng và không có dấu hiệu thuyên giảm.
Các tác nhân dẫn đến sự tổn thƣơng của mạch máu chủ yếu do tác động bên
ngoài nhƣ xung đột, các hoạt động sinh hoạt bình thƣờng của con ngƣời nhƣ
tham gia giao thông, sử dụng vật sắc nhọn, vết thƣơng do côn trùng, động vật
hút máu … gây nên. Ngoài ra, còn do bên trong cơ thể có nhiều mô chết hoặc
tổn thƣơng khiến các yếu tố đông máu đã bị sử dụng trong quá trình đông máu
không tập trung, không còn đủ để duy trì cầm máu khi mạch máu bị tổn thƣơng.
Khi gặp những trƣờng hợp nhƣ vậy, cần có các phƣơng pháp cầm máu nhanh,
đơn giản, hiệu quả nhất. Tuy nhiên, vì không có kỹ năng vận dụng sơ cứu cùng
tâm lý bất ổn định khiến việc sơ cứu trở nên khó khăn dẫn đến những trƣờng
hợp đáng tiếc.
Ở Việt Nam, theo một nghiên cứu khảo sát ở Bệnh viện Việt Đức Hà Nội,
khi phân tích hơn 324.000 bệnh án của bệnh nhân nhập viện từ năm 1990 đến

2002, các nghiên cứu viên nhận ra rằng bệnh nhân đƣợc sơ cấp cứu rất thấp
(khoảng 5 - 10%), trong đó chỉ khoảng 50% số trƣờng hợp sơ cứu thành công.
Hiện nay, các phƣơng pháp cầm máu tại chỗ thƣờng là các phƣơng pháp
vật lý nhƣ băng chèn, băng ép, đặt garo - đòi hỏi phải có dụng cụ phù hợp và
ngƣời sơ cứu phải có kĩ năng chuẩn, thao tác nhanh, chính xác. Tuy nhiên, đa số
ngƣời dân đều chƣa đƣợc trang bị những kĩ năng trên, hoặc chƣa có ý thức tự
tìm hiểu nên hiệu quả của những phƣơng pháp trên đôi khi không cao, dẫn đến
rất nhiều trƣờng hợp đáng tiếc đã xảy ra. Vì vậy, có một phƣơng pháp sơ cứu
cầm máu đơn giản, hiệu quả nhanh là một nhu cầu cấp thiết.
Thrombin là yếu tố có vai trò rất quan trọng trong sinh lý đông máu cũng
nhƣ các tình trạng bệnh lý. Thrombin sau khi đƣợc hình thành đã chuyển
fibrinogen thành fibrin đơn phân. Các fibrin đơn phân tự trùng hợp thành fibrin
ở dạng sợi, một mạng lƣới fibrin đƣợc hình thành. Giai đoạn này cũng có sự
tham gia của ion Ca2+ các tế bào máu đƣợc giữ lại trên lƣới fibrin và tạo nên cục
máu đông. Chính mạng lƣới này dính vào vị trí tổn thƣơng của thành mạch để
ngăn cản sự chảy máu. Bản chất của máu đông là hình thành lƣới fibrin từ
fibrinogen nhờ thrombin. Chính vì những ứng dụng tiềm năng lớn của thrombin,
do vậy chúng tôi tiến hành đề tài : “Nghiên cứu tách chiết thrombin từ phổi
bò ứng dụng làm nguyên liệu tạo băng gạc cầm máu nhanh vết thƣơng”.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


Luận văn Tốt nghiệp khóa K17 –
2015

2.

Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật

Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu quy trình tách chiết thrombin từ phổi bò, các điều kiện tinh
sạch thrombin , đánh giá ảnh hƣởng của một số chất an định lên hoạt tính của
thrombin đƣợc tách chiết.
3.
-

Nội dung nghiên cứu

Thu thập, đánh giá, xây dựng nguồn nguyên liệu: Khảo sát hoạt tính của thrombin
ở một số mẫu phổi bò đƣợc thu thập ở các vùng khác nhau.
Tách chiết, tinh sạch thrombin từ phổi bò: Đánh giá ảnh hƣởng của một số chất
đến quá trình tách chiết thrombin từ phổi bò; Nghiên cứu các điều kiện tách
chiết, tinh sạch thrombin từ phổi bò.
Đánh giá ảnh hƣởng của một số chất an định lên hoạt tính của thrombin.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
13

Chuyên ngành Sinh học thực
nghiệm

Lê Thị Vui


CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 CƠ CHẾ CẦM MÁU VÀ CÁC PHƢƠNG PHÁP CẦM MÁU
1.1.1. Cơ chế cầm máu
Oxy và chất dinh dƣỡng đƣợc phân phối khắp cơ thể thông qua hệ tuần
hoàn máu điều này dẫn đến hai thách thức lớn. Đầu tiên, nếu cơ thể bị tổn

thƣơng dẫn đến nhiễm trùng, vi khuẩn và virus sẽ di chuyển một cách nhanh
chóng tới khắp mọi nơi mà máu đi. Hệ thống miễn dịch, kháng thể của cơ thể sẽ
đối phó với vấn đề này. Thứ hai, máu đƣợc bơm khắp cơ thể dƣới áp lực, bất kỳ
rò rỉ nhỏ nào ở hệ tuần hoàn máu đều có thể dẫn đến sự thất thoát lớn lƣợng
máu của cơ thể. Tuy nhiên, máu mang một hệ thống sửa chữa khẩn cấp: hệ
thống đông máu. Khi chúng ta bị cắt hoặc bị thƣơng, máu của chúng ta xây
dựng một hệ thống tạm thời để ngăn chặn những thiệt hại, tạo thời gian cho các
mô xung quanh xây dựng một hệ thống sửa chữa lâu dài hơn.
Sự đông máu là một quá trình phức tạp qua đó tạo ra các cục máu đông.
Đông máu là một cơ chế quan trọng trong quá trình cầm máu. Khi thành mạch
máu bị tổn thƣơng, máu đƣợc cầm nhờ chỗ tổn thƣơng đƣợc che phủ bởi cục
máu đông chứa tiểu cầu và sợi huyết. Rối loạn đông máu có thể làm tăng nguy
cơ chảy máu hoặc tạo cục máu đông và huyết tắc.
Đông máu là một quá trình máu chuyển từ thể lỏng thành thể đặc do
chuyển fibrinogen thành fibrin không hòa tan và các sợi fibrin này bị trùng hợp
tạo thành mạng lƣới giam giữ các thành phần của máu làm máu đông lại. Bình
thƣờng, trong máu và trong các mô có các chất gây đông và chất chống đông,
nhƣng các chất gây đông ở dạng tiền chất, không có hoạt tính. Khi mạch máu bị
tổn thƣơng sẽ hoạt hóa các yếu tố đông máu theo kiểu dây truyền làm cho máu
đông lại.
1.1.2. Các yếu tố đông máu
Bảng 1.1. Các yếu tố đông máu:
Ký
hiệu

Tên thƣờng dùng

Phụ thuộc
vitamin K

Nơi cƣ trú

I

Fibrinogen

Trong huyết tƣơng

Không

II

Prothrombin

Trong huyết tƣơng

Có

III

Yếu
tố
tổ
thromboplastin

chức, Trong tổ chức (thành
mạch)


IV

Ion Canxi

Trong huyết tƣơng

V

Proaccelerin,
Plasma
accelerator globulin
Trong huyết tƣơng

Không

VII

Proconvertin

Có

VIII

Yếu tố chống Hemophilie
A
Trong huyết tƣơng

Không

IX

Yếu tố chống Hemophilie
B, yếu tố Chrismas
Trong huyết tƣơng

Có

X

Yếu tố Stuart

Có

XI

Yếu tố chống Hemophilie
C, plasma thromboplastin
antecedent
Trong huyết tƣơng

Không

XII

Yếu tố Hageman, yếu tố
tiếp xúc

Trong huyết tƣơng

Không

XIII

Yếu tố ổn định sợi huyết

Trong tiểu cầu

Không

Trong huyết tƣơng

Trong huyết tƣơng

1.1.3. Các giai đoạn của cầm máu
Cầm máu có tính chất sinh mạng, nếu quá trình cầm máu có rối loạn (tăng
đông hoặc giảm đông) và mất kiểm soát thì đều có nguy cơ cao gây tử vong.
Quá trình cầm máu gồm 4 giai đoạn:
1.1.3.1. Co mạch tại chỗ
Khi thành mạch bị tổn thƣơng, mạch máu lập tức co lại để làm giảm lƣu
lƣợng máu và hạn chế sự mất máu. Co mạch là do sự co thắt của cơ trơn trong
thành mạch tại chỗ và do các phản xạ giao cảm. Trong các mạch máu nhỏ, co
mạch đƣợc duy trì nhờ sự giải phóng các chất gây co mạch do các tiểu cầu bắt
đầu kết tụ lại ở vị trí tổn thƣơng và giải phóng ra. Một trong những chất đó là
serotonin. Co mạch tại chỗ làm hạn chế lƣợng máu chảy và tạo điều kiện hình
thành nút tiểu cầu.
1.1.3.2. Tạo nút tiểu cầu
Các tế bào tổn thƣơng của thành mạch giải phóng ra ADP. ADP hấp dẫn
tiểu cầu đến tiếp xúc với các sợi collagen đƣợc bộc lộ ở thành mạch. Các tiểu
cầu trở nên hoạt hoá và khử hạt, giải phóng ADP, serotonin và những yếu tố tiểu

cầu cần cho sự đông máu. Sự giải phóng ADP của tiểu cầu hấp dẫn thêm các tiểu
cầu khác, làm chúng phồng lên và trở nên kết dính (tiểu cầu hoạt hoá). Một số
lớn tiểu cầu kết tụ ở chỗ tổn thƣơng tạo thành nút tiểu cầu để bịt miệng vết
thƣơng và tạo ra một bộ khung cho cục máu đông hình thành. Các tiểu cầu hoạt
hoá cũng giải phóng ra thromboxan A2, một chất gây co mạch rất mạnh và
prostaglandin H2, một chất kết tụ tiểu cầu. Khi nút tiểu cầu đƣợc tạo ra máu sẽ
ngừng chảy đối với những tổn thƣơng nhỏ và tạo điều kiện để hình thành cục
máu đông.
1.1.3.3. Tạo cục máu đông
Đông máu phát triển trong vòng 15 đến 20 giây nếu là tổn thƣơng nặng và
trong 1 đến 2 phút nếu là tổn thƣơng nhẹ. Đây là là một chuỗi các phản ứng hoá
học của các yếu tố đông máu có trong huyết tƣơng, có trong mô tổn thƣơng và
đặc biệt quan trọng là tiểu cầu. Những chất hoá học do thành mạch bị tổn
thƣơng và do tiểu cầu giải phóng ra sẽ cùng với các yếu tố đông máu trong
huyết tƣơng khởi động quá trình đông máu. Nếu vết thƣơng không quá rộng,
trong vòng 3 đến 6 phút, cục máu đông sẽ bịt kín chỗ tổn thƣơng một cách vững
chắc.
Tạo cục máu đông là một chuỗi các phản ứng phức tạp, gồm nhiều giai
đoạn, về cơ bản có thể chia làm 3 giai đoạn chính:
(1)

Tạo prothombinase

Giai đoạn này bắt đầu khi máu tiếp xúc với mô tổn thƣơng (đông máu
ngoại sinh) hoặc đƣợc khởi động khi không có tổn thƣơng mô (đông máu nội
sinh).
- Đông máu ngoại sinh (extrinsic pathway): Khi máu tiếp xúc với mô tổn thƣơng,
yếu tố III của mô đƣợc giải phóng ra sẽ tƣơng tác với yếu tố VII có trong huyết
tƣơng và ion calci tạo thành một tác nhân hoạt hoá yếu tố X. Yếu tố X hoạt hoá
(Xh) với sự có mặt của ion calci, tƣơng tác với yếu tố V trên các hạt mixen

phospholipid của mô tạo ra phức hợp protrombinase.
- Đông máu nội sinh (intrinsic pathway): Có thể xảy ra bên trong hoặc bên ngoài
cơ thể với bƣớc đầu tiên là sự hoạt hoá của yếu tố XII. Trong cơ thể, sự hoạt hoá
của yếu tố XII xảy ra khi tiếp xúc với collagen, fibrin, màng tiểu cầu trong quá
trình kết tụ tiểu cầu. Yếu tố XII cũng có thể đƣợc hoạt hoá trong một số trạng
thái nhƣ stress, lo lắng, sợ hãi…Ở bên ngoài cơ thể (trong ống nghiệm) yếu tố
XII đƣợc hoạt hoá khi máu tiếp xúc với bề mặt lạ. Yếu tố XIIh xúc tác cho sự


hoạt hoá của yếu tố XI. Với sự có mặt của ion calci, yếu tố XIh sẽ hoạt hoá yếu
tố IX. Yếu tố IXh tƣơng tác với yếu tố VIIIh trên bề mặt các hạt mixen


phospholipid của tiểu cầu, với sự có mặt của ion calci tạo ra một phức hợp
enzym để hoạt hoá yếu tố X. Yếu tố Xh, với sự có mặt của ion calci, tƣơng tác
với yếu tố V trên bề mặt các hạt mixen phospholipid tiểu cầu tạo ra phức hợp
protrombinase nhƣ con đƣờng ngoại sinh.
Khi mạch máu bị tổn thƣơng, đông máu đƣợc khởi động đồng thời bởi cả
hai con đƣờng: Tromboplastin của mô khởi động con đƣờng ngoại sinh trong
khi sự tiếp xúc của yếu tố XII và tiểu cầu với các sợi collagen của thành mạch
khởi động con đƣờng nội sinh. Mối liên quan giữa hai con đƣờng thể hiện ở tác
dụng của trombin làm hoạt hoá các yếu tố trong cơ chế nội sinh. Khi trombin
hoạt hoá yếu tố VIII nó cũng tác dụng trực tiếp trên tiểu cầu làm cho tiểu cầu kết
tụ với nhau và giải phóng ra các hạt chứa những yếu tố gây đông ở dạng chƣa
hoạt động. Nhƣ vậy sự khởi động của con đƣờng đông máu ngoại sinh cũng gây
hoạt hoá con đƣờng nội sinh.
Sự khác nhau quan trọng giữa con đƣờng nội sinh và ngoại sinh là ở chỗ
con đƣờng ngoại sinh một khi đƣợc phát động có bản chất bùng nổ, tốc độ của
phản ứng đông máu chỉ bị giới hạn bởi lƣợng tromboplastin của mô do các mô
tổn thƣơng giải phóng và bởi số lƣợng của các yếu tố XII, VII, V trong máu.

Với những chấn thƣơng nặng của các mô, đông máu xảy ra chỉ trong vòng 15
giây trong khi con đƣờng nội sinh diễn ra với tốc độ chậm hơn rất nhiều,
thƣờng là cần thời gian từ 1 đến 6 phút mới gây ra đông máu.
(2) Tạo thrombin
Protrombin là một globulin có trong huyết tƣơng và do gan sản xuất. Nó là
tiền chất không hoạt động của một enzym tiêu protein rất mạnh là trombin. Với
sự có mặt của ion calci, protrombinase sẽ chuyển protrombin thành trombin.
Trong phức hợp prothrombinase, yếu tố Xa là một enzyme phân giải
protein thực sự, nó chuyển prothrombin thành thrombin. Khi thrombin đƣợc
hình thành, nó sẽ hoạt hoá yếu tố V và yếu tố VIII. Hai yếu tố này càng thúc đẩy
tác dụng của yếu tố Xa tạo nên sự điều hoà ngƣợc dƣơng tính.
Thrombin cũng là một enzyme phân giải protein, nó cũng có thể tác động
lên chính prothrombin để tăng tạo thrombin. Ngoài ra, nó còn thúc đẩy quá trình
hoạt hoá các yếu tố IX, X, XI, XII và sự kết tụ tiểu cầu. Nhƣ vậy, khi thrombin
đã hình thành, nó sẽ khởi phát quá trình điều hoà ngƣợc dƣơng tính làm
thrombin đƣợc tạo ra nhiều hơn và quá trình đông máu tiếp tục phát triển rất
mạnh cho đến khi có một cơ chế ngăn chặn lại.


Hình 1.1 Minh hoạ đông máu nội sinh và ngoại sinh
(3) Tạo fibrin và cục máu đông
Fibrinogen là một protein hoà tan trong huyết tƣơng, do gan sản xuất.
Thrombin vừa hình thành sẽ cùng Ca 2+ nhanh chóng chuyển fibrinogen phân tử
thành fibrin đơn phân. Các fibrin đơn phân này nối lại với nhau tạo thành các sợi
fibrin để từ đó hình thành mạng lƣới của cục máu đông. Lúc đầu cầu nối giữa
các fibrin là cầu nối hydro lỏng lẻo nên cục máu đông yếu, dễ tan rã. Sau vài
phút, nhờ sự có mặt của yếu tố ổn định fibrin (yếu tố XIII, đƣợc hoạt hóa bởi
thrombin) các cầu nối đồng hóa trị thay thế cầu nối hydro, đồng thời có thêm các
dây nối chéo giữa các sợi fibrin kế cận tạo nên mạng lƣới fibrin bền vững.
Mạng lƣới này giam giữ các tế bào máu, tiểu cầu, huyết tƣơng tạo nên cục máu

đông. Cục máu đông bít thành mạch bị tổn thƣơng, ngăn cản sự mất máu


1.1.3.4. Co cục máu đông và tan cục máu đông
Co cục máu đông: Ít phút sau khi cục đông đƣợc hình thành, nó bắt đầu
co lại và giải phóng hầu hết các dịch trong cục đông trong vòng 20 đến 60 phút.
Dịch đó gọi là huyết thanh. Huyết thanh chính là huyết tƣơng đã bị lấy đi
fibrinogen và hầu hết các yếu tố đông máu khác, do đó huyết thanh không đông
đƣợc.
Trong giai đoạn này, tiểu cầu vẫn đóng vai trò rất quan trọng. Nếu cục
đông không co lại đƣợc chứng tỏ số lƣợng tiểu cầu trong máu ngoại vi giảm.
Vai trò của tiểu cầu nhƣ sau: Tiểu cầu làm cho các sợi fibrin gắn chặt vào nhau.
Ngoài ra tiểu cầu bị giam trong mạng lƣới fibrin tiếp tục giải phóng ra yếu tố ổn
định fibrin. Yếu tố này tạo ra nhiều dây nối bắt chéo giữa các sợi fibrin ở cạnh
nhau. Bản thân tiểu cầu tham gia trực tiếp vào sự co cục máu bằng cách hoạt hoá
trombosthenin. Các protein co này làm co các gai tiểu cầu đang gắn vào fibrin.
Tất cả các hiện tƣợng trên có tác dụng ép mạng lƣới fibrin lại làm cho nó nhỏ
hơn và huyết thanh bị tiết ra ngoài. Sự co cục máu đông đƣợc hoạt hoá bởi
trombin và các ion calci. Ion calci do tiểu cầu giải phóng.
Sự co cục máu đông kéo các bề mặt vết thƣơng lại làm lòng mạch máu
đƣợc mở ra nếu trƣớc đó nó bị tắc nghẽn bởi cục đông làm cho sự lƣu thông
của máu trở lại bình thƣờng, kích thích sự sửa chữa các mô tổn thƣơng và làm
tan cục máu đông.
Tan cục máu đông: Trong huyết tƣơng có một euglobulin gọi là
plasminogen. Khi đƣợc hoạt hoá nó sẽ trở thành plasmin. Plasmin là enzym tiêu
protein giống nhƣ trypsin có tác dụng tiêu hoá các sợi fibrin và tiêu hoá cả các
chất khác ở chung quanh nhƣ fibrinogen, yếu tố V, yếu tố VIII, yếu tố II và yếu
tố XII. Khi plasmin đƣợc hình thành bên trong cục máu đông nó có thể làm tan
cục đông và cũng phá huỷ nhiều yếu tố đông máu có thể gây chảy máu.
Khi cục đông đƣợc hình thành, một lƣợng lớn plasminogen bị giam giữ

trong cục đông cùng với những protein khác của huyết tƣơng. Các mô tổn
thƣơng và nội mô mạch máu giải phóng ra một chất hoạt hoá rất mạnh gọi là
chất hoạt hoá plasminogen của mô. Khoảng một ngày sau khi máu đông, chất
hoạt hoá này có tác dụng chuyển plasminogen thành plasmin và làm tan cục
đông. Nhiều mạch máu nhỏ bị tắc nghẽn do các cục đông có thể đƣợc khai
thông trở lại nhờ cơ chế này. Ngày nay các chất hoạt hoá plasminogen đã đƣợc
tổng hợp bằng kỹ thuật tái tổ hợp gen và đƣợc dùng để điều trị huyết khối trong
động mạch, ví dụ nhƣ chế phẩm Alteplase (rTPA)


Plasmin không chỉ tiêu hoá fibrin mà còn tiêu hoá fibrinogen và một số
yếu tố đông máu khác. Tuy nhiên, máu cũng chứa một yếu tố khác gọi là a2antiplasmin, yếu tố này gắn với plasmin và ức chế tác dụng của plasmin. Sự tan
cục máu đông cho phép làm sạch những cục máu đông hình thành ở các mô
trong một số ngày. Tuy nhiên, đôi khi nó cũng làm cho vết thƣơng của mạch
máu đã đƣợc bịt bằng cục đông mở miệng trở lại. Một chức năng đặc biệt quan
trọng của hệ thống plasmin là lấy đi những cục đông rất nhỏ từ hàng ngàn mao
mạch ngoại vi có thể gây tắc mạch nếu nhƣ không có cơ chế dọn sạch các cục
máu đông này.
1.1.4. Các phƣơng pháp cầm máu
1.1.4.1. Cầm máu bằng lá và thảo dược
Một số loại lá cây có tác dụng cầm máu vết thƣơng tại chỗ rất dễ kiếm
xung quanh nhƣ cây bỏng, cỏ mực, lá trầu không, rau ngổ, húng láng, cải củ,
xƣơng xông, huyết dụ, tam thất, nhọ nồi, móng rồng, lá tía tô, nõn chuối, lá dâu
non… Đây là những bài thuốc dân gian quen thuộc, đã đƣợc sử dụng rộng rãi
đối với các vết thƣơng bị tổn thƣơng nhẹ. Thƣờng thì các loại lá hay thảo dƣợc
sẽ đƣợc rửa sạch, giã nát và đắp lên vết thƣơng và băng ép lại. Tuy nhiên
phƣơng pháp này chỉ là biện pháp cầm máu tạm thời, có thể gây nhiễm trùng vết
thƣơng và tạo mô sẹo không có thẩm mỹ.
1.1.4.2. Cầm máu bằng phương pháp vật lý
- Gấp chi tối đa: là biện pháp cầm máu đơn giản và rất tốt mà ngƣời bị có thể tự

làm ngay sau khi bị thƣơng. Khi chi bị gấp mạnh, động mạch cũng bị gấp và de
ép bởi các khối cơ bao quanh làm cho máu ngừng chảy. Chỉ áp dụng ở những
vết thƣơng không có gãy xƣơng kèm theo.
- Ấn động mạch: dùng ngón tay, có thể bằng một ngón cái, 2 ngón cái, 4 ngón tay
khác hoặc cả nắm tay ấn vào động mạch trên đƣờng đi của nó từ tim đến vết
thƣơng. Động mạch bị ép chặt giữa ngón tay và nền xƣơng làm cho máu ngừng
chảy ngay tức khắc.
- Băng ép: băng các vòng băng xiết tƣơng đối chặt, đè ép mạch vào các bộ phận
bị tổn thƣơng, tạo điều điện thuận lợi cho việc hình thành các cục để cầm máu.
Thích hợp với các vết thƣơng không có thƣơng tổn mạch máu lớn.
- Băng chèn: là băng ép có vật chèn lên các vị trí ấn động mạch. Con chèn đƣợc
đặt trên đƣờng đi của động mạch, giữa vết thƣơng và tim, càng sát vết thƣơng
càng tốt, sau đó băng cố định con chèn bằng nhiều vòng xiết tƣơng đối chặt theo
kiểu vòng tròn hoặc số 8.


- Băng đút nút: là cách băng có dùng thêm bấc gạc để nút vào vết thƣơng, thích
hợp với các vết thƣơng động mạch ở sâu, giữa các kẽ xƣơng, vùng cổ, chậu.
- Băng kẹp để tại chỗ: dùng kẹp cầm máu kẹp cả cụm các mạch máu và tổ chức
xung quanh để kẹp tại chỗ, băng vết thƣơng lại rồi chuyển thƣơng binh về tuyến
sau.
- Thắt mạch máu: sau khi đã kẹp cả cụm, có thể khâu buộc chỉ cả cụm rồi tháo có
thể mở rộng vết thƣơng, tìm mạch máu và thắt tại chỗ.
- Khâu da mép vết thƣơng: dùng khi chảy máu ồ ạt, vết thƣơng gọn sạch...
Mà các phƣơng pháp trên không làm đƣợc.
- Ga rô: ga rô là biện pháp cầm máu tạm thời bằng dây cao su hoặc dây vải xoắn
chặt vào đoạn chi để làm ngừng sự lƣu thông máu từ phía trên xuống phía dƣới
của chi.
1.1.4.3. Cầm máu bằng một số chất hóa học
-

Gel chiết xuất từ thực vật (Veti-gel), dung dịch cầm máu liquid bandage là hai
chất mô phỏng lớp da của ngƣời bởi một màng phủ giúp cầm máu và thúc đẩy
quá trình hồi phục vết thƣơng.

-

Bọt cầm máu (Bọt polyurethane polymer): loại bọt này có thể tiêm vào những vết
nội thƣơng để ngăn chặn máu chảy bên trong. Bọt cầm máu đƣợc tiêm vào vết
thƣơng dƣới dạng hai chất lỏng, sau khi đƣợc tiêm vào vết thƣơng, bọt sẽ bung
ra và cứng lại ngăn máu chảy.

-

Quikclot: Quikclot đƣợc sử dụng trong các trƣờng hợp bị tổn thƣơng đến động
mạch. Thuốc đƣợc sản xuất dƣới dạng bột xốp, màu khoáng chất, có chứa các
ion bạc.
1.2. THROMBIN
1.2.1. Khái quát chung về thrombin
1.2.1.1. Cấu chúc và chức năng
Thrombin là môt

serine pr oteinase,
đƣơc
ngƣời và đóng vai trò quan tron g trong các
hiên
máu, chƣ́ ng nghen macƣ̣ h và viêm.

mã hoá bơỉ gene F 2 trong cơ thể
tƣơ g sinh

n hoc

nhƣ sƣƣ̣ cầm


Hình 1.2 Cấu trúc thrombin ở người.
Thrombin là một enzyme thủy phân có khả năng cắt mối liên kết (CO~NH-) trong các phân tử polypeptide, protein và một số cơ chất tƣơng tự
thành các amino acid tự do hoặc các peptide phân tử thấp hơn. Thrombin tồn tại
ở 3 dạng α- thrombin, β-thrombin và γ-thrombin, trong đó α-thrombin đƣợc
hình thành đầu tiên và có khả năng hoạt động mạnh nhất. Ban đầu, thrombin tồn
tại ở dạng bất hoạt đƣợc gọi là prothrombin và chỉ đƣợc hoạt hóa khi có tổ chức
bị tổn thƣơng.
Thrombin đóng vai trò quan trọng trong quá trình đông máu bằng cách thúc
đẩy kết tập tiểu cầu và bằng cách chuyển fibrinogen thành các cục máu đông
fibrin trong bƣớc cuối cùng của dòng thác đông máu . Ngoài ra , thrombin ảnh
hƣởng đến các hiêu ƣ́ ng của các tế bào khác . Bên cạnh việc thúc đẩy kết tập tiểu
cầu, thrombin cũng kích thíc h tiểu cầu để giải phóng các chất trung gian bao
gồm thromboxane A2, yếu tố tiểu cầu 4, PDGF (platelet-derived growth factor)
và TGF - β (transforming growth factor -β). Thrombin cũng đóng vai trò chính
trong việc tìm các tế bào viêm vào trong các vi ƣ̣ trí chấn thƣơng và tính theo hóa
chất cho một số loại tế bào khác nhau bao gồm bạch cầu đơn nhân , đại thực bào
và bạch cầu trung tính . Nó cũng ảnh hƣởng đến một số quá trình trọng điểm cuả
sƣƣ̣ hồi phuc mô.


Thrombin có chức năng chuyển hóa fibrinogen thành fibrin; hoạt hóa các
yếu tố đông máu.
1.2.1.2. Cơ chê
hoat

đô g của thrombin
n

Trong quá trình đông má u , Sƣƣ̣ hoatƣ̣ đông củ a thrombin giú p chuyên̉
hó a
yếu tối XI thành XIa , VIII thành VIIIa , V thành Va , fibrinogne thành fibrin va
XIII thaǹ h XIIIa.
Yếu tố XIIIa là môt transglutaminase , xúc tác quá trình tạo thành các liên
kết đồng hoá tri ƣ̣giƣã lysine và glutamine trong fibrin . Các liên kết đồng hoá tri
làm tăng sự ổn định của fibrin.

Hình 1.4 Cơ chê
hoat

đô g của thrombin
n

1.2.1.3. Các yêu tố ảnh hưởng đên hoạt động của thrombin
* Yếu tố kích thích
Dạng tiền hoạt động của thrombin là prothrombin. Để kích thích
prothrombin phân giải thành thrombin cần có những yếu tố sau:


+ Ion Ca2+: Ca2+ kết hợp với phức hợp prothrombinase chuyển
prothrombin thành thrombin;
+ Tiểu cầu: Là kho dự trữ Ca2+ xúc tác vào quá trình chuyển
prothrombin thành thrombin;