NGHIÊN CỨU THU NHẬN NACETYLDGLUCOSAMINE TỪ DỊCH THỦY PHÂN CHITIN BẰNG CHITINASE

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------

HOÀNG NỮ LỆ QUYÊN

NGHIÊN CỨU THU NHẬN N-ACETYL-D-GLUCOSAMINE TỪ DỊCH
THỦY PHÂN CHITIN BẰNG CHITINASE

Chuyên ngành :

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS.TS LÊ THANH HÀ

Hà Nội – Năm 2015

i


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ......................................................... V
DANH MỤC BẢNG ..................................................................................................... VI
DANH MỤC HÌNH .....................................................................................................VII
MỞ ĐẦU ...........................................................................................................................1
PHẦN I: TỔNG QUAN...................................................................................................3
1.1. Chitin – nguyên liệu sản xuất GlcNAc ...........................................................3

1.1.1. Tổng quan về chitin ..................................................................................3
1.1.2. Tính chất của chitin ..................................................................................4
1.1.3. Ứng dụng của chitin .................................................................................5
1.2. Chitinase và cơ chế xúc tác thủy phân chitin ................................................6
1.2.1. Giới thiệu về enzyme chitinase ................................................................ 6
1.2.2. Phân loại enzyme chitinase ......................................................................6
1.2.3. Cơ chế thủy phân chitin của chitinase ......................................................7
1.3. Penicillium oxalicum ........................................................................................8
1.3.1. Phân loại ...................................................................................................8
1.3.2. Đặc điểm hình thái và sinh lý ...................................................................9
1.3.3. Hệ enzyme chitinase do Penicillium oxalicum tổng hợp .......................10
1.4. Tổng quan về N-acetyl-D-glucosamine ........................................................10
1.4.1. Cấu tạocủa GlcNAc ................................................................................11
1.4.2. Tính chấtcủa GlcNAc .............................................................................11
1.4.3. Ứng dụng của N-Acetyl-D-Glucosamine ...............................................12
1.5. Tình hình nghiên cứu về sản xuất GlcNAc bằng chitinase ........................13
1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới .........................................................13
1.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ...........................................................14
1.6. Cơ sở khoa học củaphương pháp tinh sạch GlcNAc ..................................15

ii


PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................................................... 16
2.1. Nguyên liệu ....................................................................................................16
2.2. Môi trường ......................................................................................................16
2.3. Hóa chất và thiết bị ........................................................................................17
2.4. Phương pháp nghiên cứu ..............................................................................18
2.4.1. Phương pháp chuẩn bị chitin huyền phù ................................................18
2.4.2. Phương pháp lên men chìm ....................................................................18

2.4.3. Phương pháp siêu lọc .............................................................................19
2.4.4. Phương pháp thủy phân chitin bằng chế phẩm chitinase .......................20
2.4.5. Quy trình tinh sạch GlcNAc ...................................................................20
2.4.6. Các phương pháp phân tích ....................................................................22
2.4.6.1. Xác định hoạt độ chitinase .............................................................. 22
2.4.6.2. Xác định hoạt độ N-β-acetylhexosaminidase .................................22
2.4.6.3. Xác định hoạt độ endochitinase ......................................................23
2.4.6.4. Phương pháp kết tủa bằng dung môi ethanol ..................................23
2.4.6.5. Phương pháp kết tinh GlcNAc ........................................................24
2.4.6.6.Phương pháp TLC xác định phổ sản phẩm của quá trình thủy phân
......................................................................................................................24
2.4.6.7. Định lượng N-Acetylglucosamine bằng phương pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao (HPLC)..................................................................................25
2.4.6.8. Xác định độ ẩm của sản phẩm GlcNAc ..........................................25
2.4.6.9. Phương pháp xác định độ tinh sạch của GlcNAc ...........................25
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................................26
3.1. Khảo sát thu nhận chế phẩm chitinase cô đặc từ chitinase thô của
Penicillium oxalicum 20B bằng phương pháp siêu lọc. .....................................26
3.1.1. Hoạt độ, hiệu suất thu hồi của chế phẩm enzymechitinase cô đặc ........26
3.1.2. Ảnh hưởng của hoạttính endochitinase và N-β-acetylhexosaminidase
đến khả năng thủy phân của các chế phẩm chitinase cô đặc ............................ 27
iii


3.1.2. Xác định sản phẩm thủy phân của chế phẩm chitinase cô đặc 4 lần ......29
3.2. Thu nhận và tinh sạch GlcNAc .....................................................................32
3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ Ethanol đến khả năng kết tủa tạp chất ............32
3.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ Ethanol đến khả năng kết tinh ........................34
3.2.3. Nghiên cứu khả năng loại muối bằng cô đặc dịch thủy phân ................36
3.2.4. Ảnh hưởng của mức độ cô đặc đến quá trình tinh sạch GlcNAc ...........39

3.2.5. Ảnh hưởng của thời gian kết tủa cồn đến quá trình tinh sạch GlcNAc .40
3.2.6. Quy trình thu hồi và tinh sạch GlcNAc ở qui mô phòng thí nghiệm .....41
PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................46
4.1. Kết luận ...........................................................................................................46
4.2. Kiến nghị .........................................................................................................46
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 47
PHỤ LỤC .......................................................................................................................53

iv


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

KÝ HIỆU

TÊN ĐẦY ĐỦ

GlcNAc, NAG

N-acetyl-D-glucosamin

(GlcNAc)2

Diacetyl chitobiose

(GlcNAc)3

Chitooligomer

EtOH

Ethanol

LD50

Lethal Dose

TP

Thủy phân

DNS

3,5-dinitrosalicylic axit

OD

Mật độ quang

Et

Enzyme thô

E2

Enzyme cô đặc 2 lần

E3

Enzyme cô đặc 3 lần

E4

Enzyme cô đặc 4 lần

Eqm

Enzyme qua màng

NAHase

β-N-axetylhexosanminidase

v


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Sản lượng, giá trị thương mại và lượng tiêu thụ của các sản phẩm từ chitin ...5
Bảng 2.1. Thành phần dinh dưỡng các môi trường sử dụng ...........................................16
Bảng 2.2. Hóa chất sử dụng ............................................................................................. 17
Bảng 2.3. Thiết bị sử dụng............................................................................................... 17
Bảng 3.1. Hoạt độ chế phẩm enzyme chitinase ............................................................... 26
Bảng 3.2. Hoạt độ endochitinase và NAHase các mẫu chế phẩm chitinase ...................28
Bảng 3.3. Kết quả tinh sạch sử dụng cồn kết tủa............................................................. 35
Bảng 3.4. Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch sau loại muối ..............................................37
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của mức độ cô đặc ........................................................................40
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của thời gian kết tủa cồn .............................................................. 41
Bảng 3.7. Hiệu suất thu hồi sau lọc dòng ngang ............................................................. 41
Bảng 3.8. Kết quả tinh sạch sản phẩm .............................................................................42

vi


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc chitin .................................................................................................................................3
Hình 1.2. Ba dạng cấu trúc chitin ................................................................................................................4
Hình 1.3. Cơ chế phân cắt chitin .................................................................................................................8
Hình 1.4. Chi Penicillium các thành phần của chổi (bộ máy mang bào tử trần) ....................9
Hình 1.5. Công thức cấu tạo của GlcNAc .............................................................................................11
Hình 2.1.Sơ đồ quy trình tạo chế phẩm chitinase cô đặc ................................................................19
Hình 2.2.Sơ đồ quy trình tinh sạch GlcNAc ........................................................................................21
Hình 3.1. Khả năng thủy phân của chế phẩm chitinase...................................................................27
Hình 3.2. Sắc ký bản mỏng sản phẩm thủy phân chitin bằng chế phẩm chitinase ..............30
Hình 3.3. Kết quả HPLC mẫu sản phẩm thủy phân ..........................................................................31
Hình 3.4. Lượng kết tủa trên 5ml dịch cô đặc ở các nồng độ cồn ..............................................32
Hình 3.5. Kết quả sắc ký mẫu kết tủa cồn .............................................................................................33
Hình 3.6. Lượng đường khử thất thoát vào kết tủa ...........................................................................34
Hình 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ cồn đến lượng GlcNAc kết tinh thu được ......................34
Hình 3.8. Kết quả săc ký TLC mẫu kết tinh .........................................................................................36
Hình 3.9. Kết quả sắc ký mẫu sau kết tinh ............................................................................................38
Hình 3.10. Kết quả sắc ký HPLC sản phẩm tinh sạch .....................................................................39
Hình 3.11. Kết quả phân tích HPLC mẫu sản phẩm tinh sạch .....................................................43
Hình 3.12. Phân tích HPLC với mẫu GlcNAc nội chuẩn ...............................................................44
Hình 3.13. Kết quả TLC sản phẩm GlcNAc sau tinh sạch ............................................................44

vii


LỜI CAM ĐOAN
Tôi là Hoàng Nữ Lệ Quyên xin cam đoan nội dung trong luận văn này với đề

tài: “Nghiên cứu thu nhận N-acetyl-D-glucosamin từ dịch thủy phân chitin
bằng chitinase” là công trình nghiên cứu và sáng tạo do chính tôi thực hiện dưới sự
hướng dẫn của PGS.TS. Lê Thanh Hà. Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn
là hoàn toàn trung thực và chưa công bố trong bất cứ công trình khoa học nào khác.

viii


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành được luận văn này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi
đã nhận được sự ủng hộ, giúp đỡ tận tình của thầy cô giáo, gia đình và bạn bè.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Lê Thanh Hà - Viện Công
nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã tận
tình chỉ bảo tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp này.
Tôi xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo thuộc Viện Công nghệ sinh
học & Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã giảng dạy và
giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Học viên

Hoàng Nữ Lệ Quyên

ix


Luận văn Thạc sĩ khoa học

Hoàng Nữ Lệ Quyên

MỞ ĐẦU

Việt Nam với điều kiện thuận lợi về địa lý cho việc phát triển ngành nuôi
trồng thủy hải sản, nên trong những năm gần đây ngành thủy hải sản của nước ta
đang phát triển mạnh mẽ và không ngừng xuất khẩu ra nhiều nước trên thế giới.
Trong đó thì sản phẩm tôm đông lạnh chiếm tỷ lệ rất lớn. Sản phẩm xuất khẩu của
tôm chủ yếu là thân thịt tôm đã bỏ vỏ,đầu, vì vậy khi sản lượng tiêu thụ tôm ngày
càng tăng thì đồng nghĩa với việc các phụ phẩm kèm theo đó là vỏ, đầu tôm,…
(chính là nguồn nguyên liệu chitin dồi dào) cũng ngày càng tăng. Hàng năm ở Việt
Nam, tôm đông lạnh xuất khẩu khoảng 58.000 tấn và lượng phế thải cũng khoảng
33.000 tấn (chiếm khoảng 40% nguyên liệu) [1]. Từ trước đến nay một phần nhỏ

nguồn phế liệu này chủ yếu được dùng làm thức ăn gia súc, phân bón, hoặc bỏ
đi mà chưa tận dụng để sản xuất các sản phẩm có giá trị cao.
Chitin là một poly-beta-1,4-N-Acetylglucosamine, một trong những polymer
sinh học phổ biến quan trọng trong tự nhiên [45]. Nó chỉ đứng thứ hai sau cellulose
về mặt số lượng.Người ta ước tính rằng tỉ lệ hình thành chitin hàng năm và số lượng
ổn định của chitin là vào khoảng 1010 đến 1011 tấn [47].Chitin được tìm thấy chủ
yếu trong vỏ của động vật giáp xác như cua và tôm, các lớp biểu bì côn trùng và
thành tế bào nấm.Chitin chiếm 20-58% trọng lượng khô của động vật biển, trong đó
bao gồm tôm, cua, mực và sò.
Những năm gần đây các nhà khoa học nhận ra rằng, nếu chỉ sử dụng lượng
chitin này làm thức ăn gia súc thì hàng năm chúng ta đã bỏ đi một khối lượng lớn
nguồn nguyên liệu có giá trị kinh tế cao. Để tận dụng nguồn phế liệu đócác nghiên
cứu theo hướng tạo ra các dẫn xuất từ chitin đang rất được quan tâm. N-Acetyl-Dglucosamine (GlcNAc)là đơn phân cấu tạo nên chitin - hay còn gọi là 2-acetamino2-deoxy-β-D-glucose tham gia trong thành phần cấu tạo nên glycoprotein,
proteoglycan và glycosaminoglycan – những hợp chất có vai trò tái tạo mô liên kết
và ngăn chặn các phản ứng viêm trong cơ thể [53]. GlcNAc có vị ngọt, được áp

Công Nghệ Sinh Học

12013 - 2015

Luận văn Thạc sĩ

Hoàng Nữ Lệ Quyên

dụng bổ sung vào đường uống, tạo điều kiện cho việc sử dụng nó trong tiêu thụ
hàng ngày và ưu điểm lớn nhất của GlcNAc là không có bất kỳ tác dụng phụ
nào[48].Vì những tác dụng như thế nên N-acetyl-D-glucosamine được ứng dụng
trong nhiều lĩnh vực như: mỹ phẩm, y học, thực phẩm, nông nghiệp,…GlcNAc có
thể được sản xuất theo con đường thủy phân chitin bằng phương pháp hóa học hay
sinh học. Phương pháp hóa học được thực hiện thủy phân bằng axit Clohydric
(HCl) nồng độ 15-36%, chi phí sản xuất cao,năng suất thấp (< 65%), đặc biệt chất
thải có tính axit và không thân thiện với môi trường [10]. So với phương pháp hóa
học, phương pháp sinh học với việc sử dụng hệ enzyme chitinase - từ nguồn vi sinh
vật – có nhiều ưu điểm như điều kiện phản ứng êm dịu, cho hiệu suất thủy phân cao
[28] và sản phẩm thường chỉ chứa GlcNAc dễ dàng cho quá trình tinh sạch và đặc
biệt không gây ô nhiễm môi trường [11].
Từ nhu cầu thực tiễn, nhằm hoàn thiên qui trình sản xuất GlcNAc từ chitin
bằng phương pháp sinh học chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu thu
nhận N-Acetyl- D-glucosamine từ dịch thủy phân chitin bởi chitinase”.
Nội dung của đề tài:
- Khảo sát thu nhận chế phẩm chitinase cô đặc từ chitinase thô của
Penicillium oxalicum 20B bằng phương pháp siêu lọc.
- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Ethanol đến hiệu suất thu hồi và mức độ
tinh sạch của sản phẩm GlcNAc.
- Khảo sát ảnh hưởng của mức độ cô đặc dịch thủy phân đến hiệu suất thu
hồi và mức độ tinh sạch của sản phẩm GlcNAc.

Công nghệ Sinh học

2

2013 – 2015


Luận văn Thạc sĩ

Hoàng Nữ Lệ Quyên

PHẦN I: TỔNG QUAN
1.1. Chitin – nguyên liệu sản xuất GlcNAc
1.1.1. Tổng quan về chitin
Chitin là polyme tự nhiên phổ biến thứ hai sau cellulose. Chitin là
polysaccarit được tìm thấy nhiều nhất ở côn trùng và các loài giáp xác. Thông
thường vỏ tôm cua được chứa từ 30-40% protein, 30-50% canxi cacbonat và canxi
photphat và 20-30% chitin. Ngoài ra, chitin có thể thu được từ tảo biển, động vật,
thực vật bậc thấp trên cạn với lượng nhỏ[12]. Chitin được cấu tạo bởi các đơn vị Naxetyl-β-D-glucosamin nối với nhau bởi các cầu nối β-1,4 glucoside.
Công thức phân tử chitin (C8H13O5)n, Mchitin = (203,09)n.
Trọng lượng phân tử trung bình khoảng từ 1,03x106– 2,5x106 Dalton [13].

Hình 1.1. Cấu trúc chitin
Chitin có chứa 6-7% nitơ và dẫn xuất deaxetyl của nó, chitosan có chứa 79,5% nitơ. Có 3 dạng của chitin: α, β và γ chitin. Dạng α -chitin (vỏ tôm, cua) được
phân bố rộng rãi nhất, cả α – chitinvà β - chitin ( mực) đều được thương mại hóa
[14], [15].
Các chuỗi α-chitin được sắp xếp song song ngược chiều nhau đều đặn, cách
sắp xếp này giúp hình thành thêm các liên kết hydro giữa các chuỗi dẫn đến dạng

Công nghệ Sinh học

3

2013 – 2015


Luận văn Thạc sĩ

Hoàng Nữ Lệ Quyên

này ổn định và bền nhất. Dạng β-chitin các chuỗi được bố trí song song cùng chiều
ít ổn định hơn. Trong khi đó, dạng γ-chitin bao gồm hai chuỗi song song cùng chiều
với chuỗi thứ ba định hướng theo hướng ngược lại[16], [13].

Hình 1.2. Ba dạng cấu trúc chitin
Dạng β có thể chuyển đổi sang dạng α bằng xử lý với kiềm (KOH) nhưng
không thể chuyển ngược lại và dạng γ-chitin có thể chuyển đổi sang α-chitin bằng
cách xử lý với lithium thiocyanate [17], [47].
Dạng γ-chitin thu được chủ yếu từ nấm và nấm men rất ít nghiên cứu được
thực hiện vì nó được cho là cấu trúc lỗi của một trong hai dạng α hoặc β – chitin
chứ không phải là một dạng cấu trúc thứ ba của chitin hoặc có thể coi nó là biến thể
của α-chitin [18], [19].
1.1.2. Tính chất của chitin
Chitin có màu trắng hoặc trắng ngà, vô định hình. Chitin ở thể rắn, xốp nhẹ,
không màu, không mùi, không vị.
Chitin không tan trong nước (pH=7) và các dung môi hữu cơ thông thường
nhưng có thể được hòa tan trong các dung môi như hexafluoro-2-propanol, N,Ndimethylacetamid hoặc hexafluroacetone. Chitin khá ổn định trong dung dịch kiềm
đậm đặc, ngay cả ở nhiệt độ cao.Khi mức độ N-acetyl hóa ít hơn 50%, chitin trở nên
hòa tan trong dung dịch acid hữu cơ yếu (pH < 6,0) như acid acetic loãng (0,1M) và
khi hòa tan được gọi là chitosan. Chitosan hòa tan được do có nhiều nhóm amin tự

Công nghệ Sinh học

4

2013 – 2015


Luận văn Thạc sĩ

Hoàng Nữ Lệ Quyên

do có thể tương tác với nhiều chất hóa học [20], [47]. Khi chitin trong điều kiện
axit HCl đậm đặc, nhiệt độ cao sẽ bị phân cắt thành các đơn phân glucosamine.
Chitin không độc với người và động vật. Arai K. và cộng sự đã xác định
được chỉ số LD50 =16 g/kg thể trọng (LD50 “ Lethal Dose”: Liều gây chết 50% số
động vật thử nghiệm).
1.1.3. Ứng dụng của chitin
Chitin được ứng dụng chủ yếu để sản xuất các sản phẩm chitosan, dẫn xuất
chitin, chitosan, chitooligosaccharide (COS), glucosamin. Ngày càng tăng các sản
phẩm hữu ích từ chitin có giá trị thương mại cao. Khoảng 65% chitin được dùng để
sản xuất glucosamin, 25% sản xuất chitosan, 9% sản suất COS và 1% cho sản xuất
N-acetylglucosamine.

Bảng 1.1. Sản lượng, giá trị thương mại và lượng tiêu thụ
của các sản phẩm từ chitin
Sản phẩm
Glucosamin

Sản lượng
hàng năm (tấn)
4500

Lượng chitin
tiêu thụ (tấn)
9000

Giá trị thương
mại (USD/kg)
7-35

Chitosan

3000

4000

10-100

Oligosaccharide

500

1000

50-100

N-acetylglucosamin

100

200

20-140

Giá trị kinh tế của N-acetylglucosamine cao và được ứng dụng rộng rãi trong
nhiều ngành nghề như: y dược, nông nghiệp, mỹ phẩm… nhưng sản lượng sản xuất
hàng năm vẫn còn hạn chế so với các sản phẩm khác từ chitin. Việc sản xuất Nacetylglucosamine bằng phương pháp hóa học cho hiệu suất không cao, chi phí sản
xuất cao và các phế liệu gây tổn hại đến môi trường. Hiện nay, các nhà khoa học đã
và đang nghiên cứu ứng dụng phương pháp sinh học vào sản xuất N-

Công nghệ Sinh học

5

2013 – 2015


Luận văn Thạc sĩ

Hoàng Nữ Lệ Quyên

acetylglucosamine nhằm tạo năng suất, chất lượng cao đồng thời không gây ô
nhiễm môi trường.
1.2. Chitinase và cơ chế xúc tác thủy phân chitin
1.2.1. Giới thiệu về enzyme chitinase
Chitinase (EC 3.2.2.14) hay còn gọi là poly β-1,4-(2-acetamido-2-deoxy)-Dglucosid glucanohydrolase là enzyme thủy phân xúc tác cho sự phân hủy chitin
thành các đơn phân N-acetylglucosamine, chitobiose hoặc chitotriose qua việc phân
giải liên kết β-1,4-glycoside giữa C1 và C4 của hai phân tử N-acetylglucosamine liên
tiếp nhau trong chitin [21], [22]. Chúng có mặt trong hầu hết các loài sinh vật như
vi khuẩn, nấm, nấm men, thực khuẩn, xạ khuẩn, động vật chân đốt và con người,
đóng vai trò sinh lý và sinh thái quan trọng [23], [24]. Sự hiện diện của chitinase

được mô tả đầu tiên vào năm 1911 bởi Bernard Karrer khi ông đã tìm thấy một yếu
tố kháng nấm nhạy cảm với nhiệt. Sau đó vào năm 1929 Hofman đã phát hiện ra
chitinase trong ốc sên. Chitinase có các kích thước phân tử khác nhau, từ 20kDa đến
90kDa [25]. Chúng có khả năng thủy phân chitin trực tiếp đến chitooligomers trọng
lượng phân tử thấp, đóng vai trò quan trọng trong nông nghiệp và y tế như hoạt chất
bảo vệ thực vật và chống ung thư [25]. Hiện nay, chitinase đang ngày càng được
nghiên cứu rộng rãi bởi các ứng dụng mà chúng mang lại.
Chitinase thu được từ Serratia sp, Bacillus sp, Aeromonas sp, Clostridium
sp, Trichoderma sp và Aspergillus sp đã được chứng minh có thể thủy phân chitin
thành GlcNAc [26].
1.2.2. Phân loại enzyme chitinase
Chitinase chia ra endochitinase, chitin 1-4-β-chitobiosidase và β-N-acetyl
hexosaminidase.

Công nghệ Sinh học

6

2013 – 2015


Luận văn Thạc sĩ



Hoàng Nữ Lệ Quyên

Endochitinase (EC 3.2.1.1.4) là enzyme phân cắt nội mạch chitin một

cách ngẫu nhiên tạo các đoạn oligosaccharide, đã được nghiên cứu từ dịch chiết môi

trường nuôi cấy nấm mốc Trichoderma harzianum (2 loại endochitinase:
M1=36kDa, pI1=5,3±0,2 và M2=40kDa, pI2=3,9), Glicocladium virens (M=41kDa,
pI=7,8).


Chitin 1-4-β-chitobiosidase (EC 3.2.1.1.29) là loại exochitinase phân

cắt chitin và chitioligomer với mức trùng hợp lớn hơn hay bằng 3 [(GlcNAC)n với
n 3] từ đầu không khử và chỉ giải phóng diaxetylchitobiose (GlcNAc) 2. Cụ thể
enzyme này thu được từ Trichoderma harzianum (M=36kDa, pI=4,4±0,2).


β-N-axetylhexosaminidaseNAHase (EC 3.2.1.52) là enzyme phân cắt

chitin oligomer từ đầu không khử cho sản phẩm chính là các monomer N-axetyl-Dglucosamin (GlcNAc). Enzyme này ngoài phản ứng thủy phân chitin oligomer, thì
nó còn phản ứng với cơ chất khác như oligo N-axetylgalactosamines. Hiện nay theo
cách phân loại mớiβ-N-axetylhexosaminidase bao gồm cả N-axetyl-β-Dglucosaminidase (NAGs) và chitobiase.
1.2.3. Cơ chế thủy phân chitin của chitinase
Enzyme phân giải chitin bao gồm: endochitinase, chitin 1-4-β-chitobiosidase
và N-acetyl-β-D-hexosaminidase (NAHase) đều đã được tìm thấy trong dịch tự
phân của Penicillium oxalicum 20B. Hoạt tính endochitinase và NAHase của chủng
Penicillium oxalicum 20B đã được chứng minh [6] và khả năng thủy phân chitin
thành GlcNAc bởi dịch lên men chủng Penicillium oxalicum 20B cũng đã được
công bố [3].
Endochitinase, chitobiosidase và β-N-axetylhexosanminidase có thể hoạt
động trên cơ chất là dịch huyền phù chitin, vách tế bào nấm, chitooligomer và hoạt
động kém hơn trên chitin thô thu từ vỏ tôm. Chitin và vách tế bào nấm chứa chitin
là những cơ chất thích hợp cho endochitinase hơn là chitobiosidase và β-Naxetylhexosanminidase. Chitooligomer (GlcNAc)3 và cao hơn nữa là sợi chitin đều

Công nghệ Sinh học

7

2013 – 2015


Luận văn Thạc sĩ

Hoàng Nữ Lệ Quyên

có thể là cơ chất của 3 loại enzyme trên nhưng β-N-axetylhexosanminidase thì hoạt
động chậm hơn trong việc làm giảm độ đục của chitin huyền phù[5]. (GlcNAc)2 là
cơ chất tốt nhất của β-N-axetylhexosanminidase nhưng không là cơ chất của
endochitinase hay chitobiosidase. Chính vì thế có thể sử dụng để phân biệt hoạt tính
giữa endochitinase, chitobiosidase và β-N-axetylhexosanminidase. Sản phẩm sau
cùng của sự phân cắt là đơn phân N-axetyl glucosamine (GlcNAc).

Hình 1.3. Cơ chế phân cắt chitin
1.3. Penicillium oxalicum
1.3.1. Phân loại
Giới:

Fungi

Ngành phụ:

Ascomycotina

Lớp:

Plectomyceste

Bộ:

Eurotiales

Công nghệ Sinh học

8

2013 – 2015


Luận văn Thạc sĩ

Hoàng Nữ Lệ Quyên

Họ:

Eurotiaceae

Chi:

Penicillium

1.3.2. Đặc điểm hình thái và sinh lý
Penicilliumlà một chi lớn với ít nhất 150 loài, nhiều loài có hình dáng tương
tự nhau. Chi Penicilliumđặc trưng bởi các đặc điểm:

Hình 1.4. Chi Penicillium các thành phần của chổi (bộ máy mang bào tử trần)

Sợi nấm ngăn vách, phân nhánh, không màu hoặc màu nhạt, đôi khi màu sẫm.
Khuẩn lạc màu lục, vàng lục, xanh lục, lục xám, xám, đôi khi có màu vàng, đỏ, tím
hoặc trắng. Mặt trái khuẩn lạc không màu hoặc có màu sắc khác nhau, môi trường
thạch nuôi cấy không màu hoặc có màu sắc do có mặt các sắc tố hòa tan tương ứng.
Bộ máy mang bào tử trần (còn gọi là "chổi", penicillius) hoặc chỉ gồm giá bào tử
trần với một vòng thể bình ở đỉnh giá, hoặc gồm giá bào tử trần với hai đến nhiều
cuống thể bình (metulae) ở phần ngọn giá, trên đỉnh của mỗi cuống thể bình đó có
các thể bình (cấu tạo hai vòng, biverticillate). Giá bào tử trần có thể phát triển từ các
sợi nấm nằm sát cơ chất, sát mặt môi trường thạch nuôi cấy (các sợi nền), khi đó
thường có chiều dài đều nhau và khuẩn lạc có dạng mặt nhung (velutinate). Bào tử

Công nghệ Sinh học

9

2013 – 2015


Luận văn Thạc sĩ

Hoàng Nữ Lệ Quyên

trần cũng như giá bào tử trần, các nhánh, các cuống thể bình, các thể bình tùy từng
loại có mặt ngoài nhẵn, ráp, có gai hoặc sần sùi, gồ ghề.
Penicilliumđược biết đến cho việc sản xuất hàng loạt các enzyme ngoại bào
cho ngành công nghiệp thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Hiện nay, Penicillium
được quan tâm vì có nhiều ứng dụng trong enzyme thủy phân chitin [46].
1.3.3. Hệ enzyme chitinase do Penicillium oxalicum tổng hợp
Hệ chitinase bao gồm:
Endochitinase (EC 3.2.1.14) là nhóm enzyme phân cắt ngẫu nhiên nội mạch

chitin và các chitooligomer, tạo ra hỗn hợp gồm nhiều loại sản phẩm với độ dài và
trọng lượng phân tử khác nhau: chitotetraose, chitotriose, chitobiose, nhưng chiếm
đa số là các chitobiose (GlcNAc)2 do hoạt tính của endochitinase không thể phân cắt
thêm. Enzyme nhóm này có trọng lượng phân tử nhỏ, cỡ 75 kDa [29].
N-acetyl hexosaminidase (EC 3.2.1.52) (chitobiase, EC 3.2.1.29 và Nacetyl-glucosaminase (NAGase, EC 3.2.1.30): khác với chitobiosidase, phân cắt
mạch chitin hay chitooligomer từ đầu không khử tạo thành sản phẩm duy nhất là
monomer (GlcNAc). Trọng lượng phân tử của nhóm enzyme này cỡ 140 kDa [28],
[54].
1.4. Tổng quan về N-acetyl-D-glucosamine
N-axetyl-D-glucosamin (GlcNAc) là một hoạt chất sinh học có thể được tạo
ra từ quá trình thủy phân chitin bằng acid hoặc hệ enzyme chitinase. Nấm mốc là
đối tượng tiềm năng cho sinh tổng hợp chitinase ngoại bào cho mục đích thủy phân
chitin thu GlcNAc.
N-axetyl-D-glucosamin (GlcNAc) hay còn gọi là 2-acetamino-2-deoxy-β-Dglucose tham gia trong thành phần cấu tạo nên glucoprotein, proteoglycan và
glycosaminoglycan. Đây là những hợp chất có vai trò tái tạo mô liên kết và ngăn

Công nghệ Sinh học

10

2013 – 2015


Luận văn Thạc sĩ

Hoàng Nữ Lệ Quyên

chặn các phản ứng viêm trong cơ thể [30]. Vì vậy đã có nhiều nghiên cứu thành
công trong ứng dụng GlcNAc để điều trị các bệnh về viêm khớp và viêm ruột mãn
tính cũng như sử dụng trong thực phẩm chức năng và mỹ phẩm.

1.4.1. Cấu tạocủa GlcNAc
GlcNAc có công thức chung là Cm(H2O)n
GlcNAc có công thức tổng quát là: C8H15NO6
GlcNAc là một dẫn xuất monosaccharide, là những hợp chất hữu cơ có nhiều
nhất trong các sinh vật sống, đóng vai trò là nguồn năng lượng dự trữ chính cho các
quá trình trao đổi chất và sinh tổng hợp như đường, carbonhydrate,
monosacharide,...

Hình 1.5. Công thức cấu tạo của GlcNAc
1.4.2. Tính chấtcủa GlcNAc
Trọng lượng phân tử: 221,21 g/mol; Nhiệt độ nóng chảy: 2210C.
GlcNAc là một dạng bột màu trắng, có vị ngọt nhẹ, khả năng hoàn tan của
GlcNAc là 25% trong nước và 1% trong các dung môi không màu. GlcNAc hiếm
khi tồn tại ở dạng tự do, ngoại trừ trong sữa người (khoảng 600-1500 mg/ml).

Công nghệ Sinh học

11

2013 – 2015


Luận văn Thạc sĩ

Hoàng Nữ Lệ Quyên

GlcNAc không chỉ đóng một vai trò trong cơ quan thực vật và phôi động vật không
xương sống [53].
GlcNAc là một thành phần của polysaccharide không đồng nhất như murein
(là một polysaccharide thành phần cơ bản của tế bào vi khuẩn) và acid hyaluronic

(là yếu tố chính ảnh hưởng tới sự hình thành mạch, sự vận động của sụn, khớp, độ
bám dính và chữa lành vết thương)[31].
Ở người, GlcNAc thường thấy trong các glycoprotein như mô
plasminogen[32], tuyến giáp kích thích hocrmone (TSH), gonadotropin màng đệm ở
người (hCG) giúp cho khớp vận động dễ dàng hơn. Ở động vật, GlcNAc cũng thấy
trong các loài động vật có vú. Trong thực vật, GlcNAc đã thấy trong Bromelin,
Ricin agglutinin và Abrus agglutinin [33].
1.4.3. Ứng dụng của N-Acetyl-D-Glucosamine
Nhiều nghiên cứu về GlcNAc được thực hiện trên động vật như kiểm tra
Ames, thử nghiệm độc tính, cấp tính trên các tế bào tủy xương, nhiễm sắc thể tinh
hoàn chuột…[34] cho thấy GlcNAc là một hợp chất có giá trị với độ an toàn cao,
được sử dụng để bổ sung dinh dưỡng và ứng dụng trong điều trị.
- GlcNAc được sử dụng trong điều trị tổn thương khớp: GlcNAc có ưu
điểm là tính ổn định và chắc chắn sau khi tiêm chống lại bệnh thoái hóa khớp một
cách hiệu quả. N-acetyl-D-glucosamine được dung nạp tốt và sự phân hủy của
GlcNAc trong sự trao đổi chấtở bệnh nhân cao tuổi vẫn xảy ra tốt [53].
- GlcNAc với tiềm năng trong điều trị viêm ruột (IBD): Bệnh viêm ruột
(IBD) là bệnh mãn tính gây viêm ở một số phần của ruột. GlcNAc có khả năng tăng
cường việc giải phóng mucopolysaccharides acid nguyên bào sợi và khôi phục lại
sự hình thành của cấu trúc bảo vệ đường tiêu hóa. GlcNAc hoạt động như một tác
nhân bảo vệ cho việc khôi phục sự toàn vẹn và chức năng bình thường của niêm
mạc ở người [34].

Công nghệ Sinh học

12

2013 – 2015

Luận văn Thạc sĩ

Hoàng Nữ Lệ Quyên

- Ứng dụng của GlcNAc trong sản xuất siacilic acid: N-Acetylneuraminic
acid (Neu5Ac) là sialic acid, các loại dược phẩm được tổng hợp hóa học từ Neu5Ac
để sản xuất các chất ức chế neuraminidase để sử dụng để điều trị nhiễm cúm. Có thể
sản xuất Neu5Ac GlcNAc [35].
- Ứng dụng của GlcNAc trong mỹ phẩm:Sử dụng GlcNAc để cải thiện chất
lượng làn da, GlcNAc đã được chứng minh là một chất thẩm thấu da tốt dựa trên
thử nghiệm in vitro trên tế bào của Franz. Ngoài tác dụng giữ ẩm, GlcNAc còn có
tác dụng giảm sự xuất hiện của sự tăng sắc tố trên khuôn mặt [36]. GlcNAc có khả
năng kích thích hoạt động của enzyme synthetase hyaluronate trong các màng tế
bào nguyên sợi của da người, do đó hỗ trợ việc sản sinh hyaluronic acid HA, chống
lại các tác nhân bên ngoài và quá trình lão hóa tự nhiên, giảm sự xuất hiện của nếp
nhăn [53].
1.5. Tình hình nghiên cứu về sản xuất GlcNAc bằng chitinase
1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Theo Sashiwa và cộng sự (2002) nghiên cứu sản xuất GlcNAc từ α-chitin bởi
các enzyme thô có nguồn gốc từ Aeromonas hydrophila H2230 [48]. Ở trong
nghiên cứu này, sản xuất GlcNAc từ α-chitin đạt hiệu suất 77% trong thời gian 10
ngày.
Theo nghiên cứu của Kuk và cộng sự (2005), chủng vi khuẩn Aeromonas sp.
GJ-18 được phân lập từ đất có khả năng thủy phân chitin tạo sản phẩm GlcNAc.
Bằng phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC) và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao (HPLC) đã chứng minh được tại 450C, pH tối ưu 5.0 thủy phân trong thời gian
9 ngày thu được hiệu suất phản ứng tạo GlcNAc là 94.9% [38].
Theo nghiên cứu của Binod và cộng sự (2007), sử dụng enzyme
endochitinase và chitobiose từ nấm để sản xuất GlcNAc. Trong 15 chủng nấm được
lựa chọn, chủng Penicillium aceleatum NRRL2129 có hoạt độ enzyme

Công nghệ Sinh học

13

2013 – 2015


Luận văn Thạc sĩ

Hoàng Nữ Lệ Quyên

endochitinase cáo nhất; chủng Trichoderma harzianum TUBF 927 cho hoạt độ
enzyme chitobiose cao nhât. Kết hợp hợp hai chủng với nhau sẽ tạo ra lượng lớn
GlcNAc [39].
Theo nghiên cứu của Kumar và cộng sự (2011), tỉ lệ giữa endochitinase và
NAHase đóng vai trò quan trọng trong thủy phân chitin thành GlcNAc [40].
Enzyme endochitinase và NAHase đều tìm thấy trong dịch lên men của Penicillium
oxalicum 20B[6],[3], [4]. Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào sử dụng enzyme thô từ
Penicillium oxalicum 20B thủy phân chitin thu GlcNAc.
1.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Các nghiên cứu ở Việt nam hiện nay chủ yếu tập trung vào chitinase.
Đặng Trung Thành (2008) nghiên cứu thu nhận nguồn chitinase từ Khoai
lang (Imomoea batatas) ở Khánh Hòa đã thu được những kết quả khả quan khi tận
dụng nguồn phế phẩm từ lá khoai lang để sản xuất nguồn enzyme có giá trị[7].
Nghiên cứu của Nguyễn Quang Nhân (2009) nghiên cứu thu nhận, tinh sạch
và xác định tính chất của chitinase từ mủ cây cao su Hevea brasiliensis, đề ra quy
trình thu nhận chitinase từ mủ cây cao su cũng như những đặc tính hóa lý của
enzyme [2].
Năm 2003, các tác giảĐinh Minh Hiệp, Nguyễn Thị Hồng Thương, Đồng

Thị Thanh Thu có công trình nghiên cứu khảo sát một số các yếu tố tác động lên
quy trình sinh tổng hợp hệ enzyme chitinase của các chủng nấm mốc Trichoderma
sp.
Năm 2004, tác giả Tô Duy Khương thực hiện đề tài khảo sát sự sinh tổng
hợp chitnase ở Trichoderma sp và khả năng đối kháng với một số nấm gây bệnh
[8].Nghiên cứu của Đinh Minh Hiệp (2010), nghiên cứu chitinase và khả năng đối
kháng với một số nấm gây bệnh ở thực vật [9].

Công nghệ Sinh học

14

2013 – 2015


Luận văn Thạc sĩ

Hoàng Nữ Lệ Quyên

Hiện nay các nghiên cứu về thu nhận và tinh sạch N-Acetyl-D-glucosamine
chưa thấy công bố ở Việt Nam.
1.6. Cơ sở khoa học củaphương pháp tinh sạch GlcNAc
Nghiên cứu của Grandison, A.S và cộng sự (2003) sử dụng phương pháp lọc
thông thường và lọc nano để tinh sạch probiotic oligosaccharide từ hỗn hợp phản
ứng [42]. Việc sử dụng các loại màng lọc nano có thể phân tách được đến 80%
monosaccharide ra khỏi disaccharide và oligosaccharide.
Để tinh sạch 1-Deoxynojirimycin (DNJ) từ dịch lên men có chứa protein và
polysaccharide, Zhu đã dùng ethanol nồng độ 80% [51].
Trong nghiên cứu của mình, Cabrera đã chỉ ra rằng nồng độ cồn càng cao
càng kết tủa được oligosaccharide có phân tử lượng thấp, cụ thể chitosanoligomer

với mức độ trùng hóa 11 có thể kết tủa trong methanol 90% nhưng lại tan trong
methanol 70% [42].
Các nghiên cứu về tinh sạch GlcNAc còn rất ít ngoại trừ nghiên cứu của
Aiba [41]. Aiba sử dụng enzyme thô từ Trichoderma viride thủy phân β-chitin trong
10 ngày, sau khi ly tâm loại bỏ cơ chất dư, lọc màng loại bỏ enzyme dư và cô đặc
chân không khoảng 15 lần, sử dụng ethanol với tỉ lệ dịch cô đặc : ethanol = 1: 10 để
kết tủa tạp chất. Kết quả thu được GlcNAc với hiệu suất 47% và độ tinh sạch đạt
95%.

Công nghệ Sinh học

15

2013 – 2015


Luận văn Thạc sĩ

Hoàng Nữ Lệ Quyên

PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Nguyên liệu
Chitin mũ ni được mua từ công ty MTV Chitosan Việt nam (Kiên
Giang)
Chủng Penicillium oxalicum 20B, có trong bộ sưu tập giống phòng thí
nghiệm bộ môn Công nghệ Sinh học - Trường đại học Bách khoa Hà Nội.
2.2. Môi trường
Sử dụng môi trường PDA trong nhân giống và giữ giống, môi trường Czapek
để hoạt hóa giống, môi trường MS-chitin cơ bản để lên men với thành phần dinh
dưỡng cụ thể như bảng sau:

Bảng 2.1. Thành phần dinh dưỡng các môi trường sử dụng
Môi trường

PDA

Czapek

MS – chitin
cơ bản

Công nghệ Sinh học

Thành phần

Hàm lượng (%)

Potato extra
Saccarose
Aga
pH
NaNO3
K2HPO4
KCl
MgSO4.7H2O
Saccarose
FeSO4
pH
Chitin
Cao nấm men
KH2PO4

K2HPO4
MgSO4.7H2O
NaCl
KCl
CaCl2
pH

0,5
3
1,6-2
7
0,3
0,1
0,03
0,05
3
0,001
7
0,4
1
0,4
0,2
0,14
0,1
0,1
0,01
5

16

2013 – 2015