Nghiên cứu nuôi cấy sinh khối rễ tơ sâm dây (Codonopsis sp.) trong hệ thống Bioreactor (LV thạc sĩ)

BỘ GIÁO DỤC

VIỆN HÀN LÂM

VÀ ĐÀO TẠO

KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
----------------------

NGUYỄN ĐÌNH TRỌNG

NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY SINH KHỐI RỄ TƠ SÂM DÂY
(Codonopsis sp.) TRONG HỆ THÔNG BIOREACTOR

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội, 2015
1


BỘ GIÁO DỤC

VIỆN HÀN LÂM

VÀ ĐÀO TẠO

KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

----------------------

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY SINH KHỐI RỄ TƠ SÂM DÂY
(Codonopsis sp.) TRONG HỆ THÔNG BIOREACTOR

Chuyên ngành:

Sinh học thực nghiệm

Mã số:

60 42 01 14

Học viên:

Nguyễn Đình Trọng

Hướng dẫn khoa học:

PGS. TS. Chu Hoàng Hà

Hà Nội, 2015

2


Luận văn Thạc sĩ

Nguyễn Đình Trọng

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan Luận văn này hoàn toàn được hoàn thiện bằng quá trın
̀ h
nghiên cứu khoa học của bản thân dưới sự hướng dẫn trực tiếp của PGS. TS.
Chu Hoàng Hà cùng với cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công
nghệ sinh học. Các số liệu hình ảnh, kết quả được trình bày trong luận văn này
là trung thực, không sao chép bất cứ tài liệu, công trình nghiên cứu của người
khác mà không chỉ rõ nguồn tham khảo. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam
đoan của mình trước hội đồng khoa ho ̣c.

Hà Nội, tháng 12 năm 2015
Học viên

Nguyễn Đình Trọng

3


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lỏng biết ơn chân thành đến những người đã hướng dẫn, giúp
đỡ tận tịnh tôi hoàn thành luận văn này:
PGS. TS. Chu Hoàng Hà, Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học, Trưởng phòng
Công nghệ Tế bào Thực vật – Viện Công nghệ sinh học, đã hướng dẫn và hỗ trợ tận
tình, truyền đạt kiến thức, những kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình thực hiện
đề tài.
TS. Phạm Bích Ngọc, Phó trưởng phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện
Công nghệ sinh học, người cô, người chị đã trực tiếp hướng dẫn, luôn theo sát thí

nghiệm của tôi để đưa ra những lời khuyên bổ ích và kịp thời cho tôi ngay từ những
ngày đầu tiên tôi bước vào phòng thí nghiệm.
GS. TS. Lê Trần Bình, PGS. TS. Lê Văn Sơn, TS. Chu Nhật Huy, KS. Nguyễn
Khắc Hưng, CN. Nguyễn Phú Tâm và các cán bộ phòng Công nghệ tế bào thực vật
đã giúp đỡ, chỉ bảo tận tình về chuyên môn.
Trong những năm học tập và nghiên cứu tại phòng Công nghệ tế bào thực vật,
tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ, động viên chân thành của tập thể
cán bộ phòng. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô giáo tại cơ sở Viện Sinh thái
và Tài nguyên Sinh vật đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong thời gian
học tập vừa qua.
Bằng tình cảm chân thành, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn
ở bên, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn này.
Hà Nội, tháng 12 năm 2015
Học viên

Nguyễn Đình Trọng

4


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ------------------------------------------------------------------------------------------------------ LỜI CẢM ƠN ------------------------------------------------------------------------------------------ MỤC LỤC ------------------------------------------------------------------------------------------------i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT -------------------------------------------------------------------- iii
DANH MỤC BẢNG---------------------------------------------------------------------------------- iv
DANH MỤC HÌNH ----------------------------------------------------------------------------------- v
MỞ ĐẦU ------------------------------------------------------------------------------------------------ 1
1.1.Đặt vấn đề -----------------------------------------------------------------------------------------------------------1
1.2.Mục đích nghiên cứu--------------------------------------------------------------------------------------------2
1.2.1. Mục tiêu tổng quát ------------------------------------------------------------------------------- 2

1.2.2. Mục tiêu cụ thể ----------------------------------------------------------------------------------- 2
1.3.Nội dung nghiên cứu --------------------------------------------------------------------------------------------3
1.4.Ý nghĩa khoa học -------------------------------------------------------------------------------------------------3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ---------------------------------------------------------- 4
1.1.Tổng quan về cây Sâm dây -----------------------------------------------------------------------------------4
1.1.1. Giới thiệu về phân bố địa lý -------------------------------------------------------------------- 4
1.1.2. Phân loại------------------------------------------------------------------------------------------- 4
1.1.3. Hình thái------------------------------------------------------------------------------------------- 4
1.1.4. Tác dụng dược lý của cây Sâm dây ----------------------------------------------------------- 5
1.1.5. Tính cấp thiết của việc nghiên cứu, bảo tồn và sản xuất bền vững cây Sâm dây ------11
1.2.Nuôi cấy sinh khối rễ tơ – giải pháp tạo nguồn dược phẩm sạch phục vụ sức khoẻ
cộng đồng ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 12
1.2.1. Giới thiệu về nuôi cấy nuôi cấy sinh khối tế bào -------------------------------------------12
1.2.2. Giới thiệu về Agrobacterium rhizogenes – phương pháp tạo rễ tơ ở tế bào thực vật--------------------------------------------------------------------------------------------------------------13
1.2.3. Cơ chế chuyển các gen vùng T-DNA vào tế bào thực vật --------------------------------14
1.2.4. Nuôi cấy sinh khối rễ tơ------------------------------------------------------------------------17
1.2.5. Ứng dụng hệ thống bioreactor trong nuôi cấy sinh khối rễ tơ ----------------------------22
1.2.6. Ảnh hưởng của elicitor đến khả năng tích luỹ các chất thứ cấp --------------------------24
1.3.Một số phương pháp tách chiết, phương pháp định tính và định lượng saponin --26
1.3.1. Phương pháp tách chiết ------------------------------------------------------------------------26
1.3.2. Một số phương pháp định tính saponin ------------------------------------------------------27
1.3.3. Ứng dụng phương pháp quang phổ trong định lượng saponin tổng số------------------28
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU -------------------------- 29
2.1.Vật liệu nghiên cứu -------------------------------------------------------------------------------------------- 29
i


Luận văn Thạc sĩ

Nguyễn Đình Trọng

2.2.Thiết bị và hoá chất nghiên cứu-------------------------------------------------------------------------- 29
2.3.Phương pháp nghiên cứu ----------------------------------------------------------------------------------- 29
2.3.1. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật --------------------------------------------------29
2.3.2. Đánh giá các dòng chuyển gen bằng phương pháp PCR ----------------------------------30
2.3.3. Đánh giá khả năng tăng sinh của các dòng rễ tơ Sâm dây --------------------------------31
2.3.4. Xác định kích thước mẫu cấy phù hợp cho nuôi cấy --------------------------------------32
2.3.5. Xác định loại môi trường thích hợp cho nuôi cấy rễ tơ trên môi trường thạch.--------32
2.3.6. Xác định loài môi trường lỏng thích hợp cho nuôi cấy rễ tơ -----------------------------33
2.3.7. Ảnh hưởng của salicylic acid (SA) lên sinh trưởng và tích luỹ chất khô trong rễ tơ
Sâm dây--------------------------------------------------------------------------------------------------33
2.3.8. Lựa chọn mô hình nuôi cấy bioreactor phù hợp --------------------------------------------34
2.3.9. Phương pháp nuôi cấy sinh khối rễ tơ trong hệ thống bioreactor ------------------------34
2.3.10.Phương pháp tách chiết saponin từ sinh khối rễ tơ ---------------------------------------35
2.3.11.Phương pháp bán định lượng hàm lượng saponin trong sinh khối rễ tơ ---------------35
2.3.12.Phương pháp tính toán ------------------------------------------------------------------------36
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN --------------------------------------------------- 37
3.1. Kiểm tra đánh giá các dòng rễ tơ chuyển gen bằng phương pháp PCR--------------- 37
3.2. Đánh giá tốc độ sinh trưởng của các dòng rễ tơ Sâm dây ----------------------------------- 39
3.3. Xác định kích thước mẫu phù hợp cho nuôi cấy ------------------------------------------------- 41
3.4.Xác định loại môi trường thích hợp cho nuôi cấy rễ tơ trên môi trường đặc -------- 42
3.5.Kết quả nuôi cấy rễ tơ trên các môi trường lỏng khác nhau -------------------------------- 43
3.6.Ảnh hưởng của salicylic acid (SA) lên sinh trưởng và tích luỹ hợp chất thứ cấp
trong rễ tơ Sâm dây ------------------------------------------------------------------------------------------------- 45
3.7.Lựa chọn mô hình nuôi cấy bioreactor phù hợp với điều kiện cơ sở vật chất tại
Viện Công nghệ sinh học ----------------------------------------------------------------------------------------- 47
3.8.Kết quả nuôi cấy rễ tơ sâm dây trên các mô hình bioreactor ------------------------------- 49
3.9.Kết quả bán định lượng hàm lượng saponin tổng số trong sinh khối rễ tơ, so sánh
với sâm tự nhiên ------------------------------------------------------------------------------------------------------ 52
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ --------------------------------------------------- 55

1.1.Kết luận------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 55
1.2.Kiến nghị ----------------------------------------------------------------------------------------------------------- 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO ------------------------------------------------------------------------- 56

ii


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
A. rhizogenes :

Agobacterium rhizogenes

A. tumefaciens :

Agrobacterium tumefaciens

Aux

:

Auxin

B5

:

Gamborg B5, 1968

bp

:

Base pair

DNA

:

Desoxyribonucleic acid

GusA

:

β-glucuronidase

kp

:

Kilobase pair

LB

:

Left border

MS

:

Murashige and Skoog, 1962

MeOH

:

Methanol

RB

:

Right border

Ri-plasmid

:

Root induction plasmid

Rol

:

Root locus

SA

:

Salicylic acid

SH

:

Schenk và Hildebrandt, 1972

sp

:

Species

ss T-DNA

:

Single strain T-DNA

vir

:

Virulence genes

JA

:

Jasmonic acid

WPM

:

McCown’s Woody Plant, 1981

iii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Cấ u trúc hóa ho ̣c 7 saponin trong Codonopsis lanceolata ------------------- 6
Bảng 1.2. Khả năng ức chế khối u ở chuột của CPPW1 và CPPW1B ------------------ 8
Bảng 1.3. Một số loài thực vật được nuôi cấy rễ tơ để thu hoạt chất sinh học ------ 20
Bảng 2.1. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu --------------------------------------- 30
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR nhân gen rolA, rolB, rolC--------------------- 31
Bảng 3.1. Sự phát triển của các đoạn rễ tơ sâm dây có kích thước khác nhau ------ 41
Bảng 3.2. Sự phát triển của rễ tơ sâm dây trên các loại môi trường khác nhau ----- 42
Bảng 3.3. So sánh thành phần của các môi trường cơ bản MS, B5, WPM, SH ----- 43
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của SA đến sự sinh trưởng của rễ tơ Sâm dây ----------------- 45
Bảng 3.5. Kết quả nuôi cấy rễ tơ sâm dây trên các hệ thống bioreactor khác nhau sau
4 tuần nuôi cấy ------------------------------------------------------------------------------- 51
Bảng 3.6. Kích thước củ Sâm dây 1 -3 tuổi thu thập ở Kon Tum --------------------- 52
Bảng 3.7. Kết quả xác định hàm lượng saponin tổng số ------------------------------- 53

iv

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cây Sâm dây ------------------------------------------------------------------------ 4
Hın
̀ h 1.2. Cấ u trúc hóa ho ̣c saponin trong sâm dây (Ichikawa et al., 2009) ----------- 6
Hình 1.3. Cơ chế chuyển gen chung của Agrobacterium ------------------------------- 15
Hình 1.4. Các hệ thống rễ tơ Sâm dây được nuôi cấy tại Viện Công nghệ sinh học 19
Hình 1.5. Hệ thống bioreactor sủi bọt dạng cầu ----------------------------------------- 24
Hình 3.1. Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen rolA, rolB, rolC bằng kỹ thuật PCR
-------------------------------------------------------------------------------------------------- 38
Hình 3.2. Kết quả khảo sát tốc độ sinh trưởng của các dòng rễ tơ Sâm dây --------- 40
Hình 3.3. Sự phân nhánh và kéo dài của các mẫu rễ tơ sau 2 tuần nuôi cấy trên các
môi trường khác nhau.----------------------------------------------------------------------- 42
Hình 3.4. Đường cong sinh trưởng của rễ tơ sâm dây trên các môi trường khác nhau
-------------------------------------------------------------------------------------------------- 44
Hình 3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của SA đến sinh trưởng rễ tơ Sâm dây ----- 46
Hình 3.6. Hệ thống bioreactor mà TS. Nguyển Hữu Hổ sử dụng tại Viện Sinh học
nhiệt đới --------------------------------------------------------------------------------------- 48
Hình 3.7. Hệ thống bioreactor PGS. TS. Dương Tấn Nhựt sử dụng tại Viện Sinh học
Tây Nguyên ----------------------------------------------------------------------------------- 48
Hình 3.8. Hệ thống bioreactor trong ngành công nghiệp dược phẩm ở Hàn Quốc - 48
Hình 3.9. Hệ thống bioreactor đang được sử dụng tại Viện Công nghệ sinh học --- 49
Hình 3.10. Rễ tơ thu được sau 4 tuần nuôi cấy trên hệ thống bioreactor 5 lít ------- 50
Hình 3.11. Các mẫu củ Sâm dây thu thập tại Kon Tum -------------------------------- 52

v


Luận văn Thạc sĩ

Nguyễn Đình Trọng

MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Sâm dây hay Đẳng sâm có danh pháp khoa học là Codonopsis sp., một loài
thực vật lâu năm thuộc họ Hoa chuông (Campanulaceae). Chúng có nguồn gốc
từ khu vực Đông Bắc châu Á và bán đảo Triều Tiên. Rễ của đẳng sâm được sử
dụng trong y học cổ truyền từ xa xưa với tác dụng bổ ngũ tạng, tăng sức dẻo dai,
tăng cường khả năng miễn dịch cho cơ thể, có tác dụng bổ huyết, chống mệt mỏi,
giảm stress. Trong sâm dây chứa các hoạt chất chủ yếu như saponin,
polysaccharide, triterpen, steroid… Do có nhiều công dụng trong y dược nên sâm
dây có nguy cơ bị khai thác quá mức làm giảm khả năng tái sinh và phát triển.
Cây Sâm dây đã được đưa vào chương trình bảo tồn các loài cây quí hiếm và
được đưa vào sách đỏ vào năm 1996 ( theo Sách đỏ Việt Nam – phần Thực vật,
NXB KHTNCN, 2007).
Những giá trị y dược quý của cây Sâm dây hiện nay đã được trong và ngoài
nước công nhận, do đó việc khai thác, sử dụng và quản lý bền vững nguồn tài
nguyên này cần được quan tâm triệt để. Những năm gần đây, cùng với xu hướng
chung trên thế giới, ở nước ta hướng nghiên cứu công nghệ sinh khối tế bào thực
vật để sản xuất các sản phẩm thứ cấp đã bắt đầu được quan tâm đầu tư phát triển.
Tuy nhiên trong quá trình nuôi cấy tạo sinh khối tế bào thực vật để làm giảm hoặc
mất tính biệt hoá ở các mô tế bào nuôi cấy cần bổ sung các chất điều hoà sinh
trưởng vào trong môi trường nuôi cấy. Vấn đề này là một trong những trở ngại
lớn nhất do tồn dư của các chất điều hoà sinh trưởng trong sinh khối tế bào nuôi
cấy. Điều này đã ảnh hướng trực tiếp đến sản phẩm cũng như sức khoẻ người tiêu
dùng. Việc này hoàn toàn có thể khắc phục trong nuôi cấy sinh khối từ rễ tơ.
Rễ tơ là một loại bệnh xuất hiện ở thực vật bậc cao do sự xâm nhiễm của vi
khuẩn Agrobacterium rhizogenes gây ra. Đặc biệt, rễ tơ có thể sinh trưởng và phát
triển tốt trên môi trường không có chứa chất điều hòa sinh trưởng. Do khả năng
sinh trưởng nhanh, kỹ thuật nuôi cấy đơn giản kết hợp hệ thống bioreactor, rễ tơ

1


Luận văn Thạc sĩ

Nguyễn Đình Trọng

đã và đang được ứng dụng nhằm thu nhận các hợp chất thứ cấp từ các loài thực
vật có giá trị dược liệu cao. Các dược chất của sâm dây chủ yếu được tích lũy ở
rễ nên rất thích hợp cho việc ứng dụng công nghệ nuôi cấy sinh khối rễ tơ. Hướng
nghiên cứu này cho khả năng thu nhận lượng lớn sinh khối rễ sâm dây tạo nguồn
nguyên liệu ốn định đáp ứng nhu cầu làm thuốc hay thực phẩm chức năng. Bên
cạnh đó còn góp phần bảo tồn đa dạng sinh học của loài Sâm dây ngoài tự nhiên.
Nuôi cấy rễ tơ trong hệ thống bioreactor gặp một số vấn đề đó là hình thái
rễ tơ của các loài thực vật khác nhau là hoàn toàn khác nhau, đặc điểm như độ
dày, độ dài, độ phân nhánh của rễ bị ảnh hưởng bởi các loài thực vật và các chủng
A. rhizogenes sử dụng cho cảm ứng tạo rễ tơ. Ngoài ra, sự tăng trưởng tế bào và
sản xuất chất chuyển hóa là không đồng nhất trong rễ tơ đã làm khó khăn trong
việc tối ưu hóa hệ thống bioreactor.
Xuất phát từ các ưu điểm trên của hệ thống nuôi cấy rễ tơ và những tác dụng
dược lý quý của cây Sâm dây, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu nuôi
cấy sinh khối rễ tơ Sâm dây (Codonopsis sp.) trong hệ thống bioreactor”.
Công trình này được thực hiện tại phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công
nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
1.2. Mục đích nghiên cứu
1.2.1. Mục tiêu tổng quát: Nghiên cứu cơ sở khoa học và thực nghiệm của việc
tạo sinh khối cây Sâm dây làm nguyên liệu sản xuất dược phẩm và thực phẩm
chức năng bằng công nghệ nuôi cấy rễ tơ.
1.2.2. Mục tiêu cụ thể:
-

Lựa chọn dòng rễ tơ sâm dây sinh trưởng và phát triển ổn định.

-

Tối ưu môi trường nuôi cấy rễ tơ sâm dây.

-

Nuôi cấy nhân sinh khỗi rễ tơ trên các hệ thống bioreactor.

-

Bước đầu định lượng hàm lượng saponin trong sinh khối rễ tơ so với dược

liệu tự nhiên.

2


Luận văn Thạc sĩ

Nguyễn Đình Trọng

1.3. Nội dung nghiên cứu
- Phân tích các dòng rễ tơ bằng phương pháp PCR
- Đánh giá sinh trưởng của các dòng rễ tơ
- Tối ưu môi trường nuôi cấy rễ tơ sâm dây trên môi trường đặc
- Tối ưu môi trường nuôi cấy rễ tơ sâm dây trên môi trường lỏng
- Nuôi cấy sinh khối rễ tơ trong hệ thống bioreactor

- Tách chiết hoạt chất
- Bước đầu định lượng saponin tổng số.
1.4. Ý nghĩa khoa học
Làm cơ sở cho việc sản xuất quy mô công nghiệp sinh khối rễ tơ cây Sâm
dây cho mục đích làm nguyên liệu dược phẩm và thực phẩm chức năng.

3


Luận văn Thạc sĩ

Nguyễn Đình Trọng

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Tổng quan về cây Sâm dây

1.1.1. Giới thiệu về phân bố địa lý
Cây Sâm dây hay Đảng sâm có tên khoa học là Codonopsis sp. là loài cây
dược liệu sử dụng củ. Cây thân leo, sống lâu năm, thường phân bố tại các vùng
núi cao có khí hậu mát mẻ quanh năm. Cây sâm dây thuộc họ Hoa chuông
(Campanulaceae).
Đảng sâm phân bố nhiều ở vùng Đông Bắc Á. Ở Việt Nam, trong thời gian
1961-1985 viện Dược liệu đã phát hiện Đảng sâm ở 14 tỉnh vùng núi phía Bắc;
còn ở phía Nam chỉ thấy xuất hiện ở vùng Tây Nguyên. Vùng phân bố tập trung
nhất ở các tỉnh Lai Châu, Sơn La, Lào Cai, Hà Giang, Cao Bằng, Lạng Sơn, Gia
Lai, Kon Tum, Quảng Nam, Đà Nẵng, Lâm Đồng.
1.1.2. Phân loại
Giới

: Plantae

Phân giới

: Tracheobionta

Nhóm lớn

: Spermatophyta

Nhóm

: Magnoliopsida

Bộ

: Campanulales

Họ

: Campanulaceae

Loài

: Codonopsis sp.

Hình 1.1. Cây Sâm dây
(Nguồn: )

1.1.3. Hình thái
Sâm dây là cây thảo sống lâu năm, có xu hướng leo bằng thân quấn, phân
nhánh nhiều, phía dưới hơi có lông, phía ngọn nhẵn (Hình 1.1). Toàn thân có mủ
trắng. Lá mọc đối, ít khi mọc so le; gốc lá hình tim; đầu lá nhọn, phiến lá mỏng
hình trứng rộng, dài 3 - 8 cm, rộng 2 – 4 cm; mép nguyên lượn sóng hoặc hơi
4


Luận văn Thạc sĩ

Nguyễn Đình Trọng

khía răng cưa; mặt trên màu lục nhạt; mặt dưới màu trắng xám, nhẵn hoặc có lông
rải rác. Hoa mọc riêng ở kẽ lá. Có cuống dài 2 – 6 cm. Đài có 5 phiến hẹp; tràng
hình chuông, màu trắng hoặc hơi vàng, có vân tím ở họng; chia 5 thuỳ, nhị 5, chỉ
nhị hơi dẹt; bao phấn dính gốc; bầu hình cầu có 5 ô. Quả nang hình cầu, có 5 cạnh
mờ, đầu bẹt, phía trên có một núm nhỏ hình nón, đường kính 1 – 2 cm, có đài tồn
tại; khi chín màu tím hoặc đỏ; hạt nhiều, màu vàng nhạt, bóng. Rễ hình trụ dài,
đường kính có thể đạt 1 – 1,7 cm. Đầu rễ phình to, trên có nhiều vết sẹo lồi của
thân cũ, phía dưới thường phân nhánh; mặt ngoài màu vàng nhạt, khi khô màu
vàng xám (Đỗ Tất Lợi, 2005).
1.1.4. Tác dụng dược lý của cây Sâm dây
Tác dụng dược lý của cây Sâm dây đã được công bố rộng rãi trên thế giới
thông qua nhiều đề tài nghiên cứu khoa học về điều trị bệnh tiểu đường, khả năng
tăng cường sức khoẻ, tác dụng với hệ tiêu hoá, tác dụng với hệ tim mạch, tác dụng
đối với máu và hệ thống tạo máu, đối với điều hoà huyết áp, chống mệt mỏi,
chống oxy hoá, kháng ung thư, kháng khuẩn và tăng cường hệ thống miễn dịch
(Ueda et al., 2002; Li et al., 2004; Chan et al., 2009; Wang et al., 1996; Luo et
al., 2007; Liu et al., 1988; Yongxu et al., 2008; He et al., 2015; He et al., 2014).
Các dược tính của Codonopsis sp. có thể là do các thành phần hợp chất có trong

cây có khả năng cải thiện sức khoẻ con người, bao gồm: cacbohydrates,
glycosides, steroids, alkaloids, terpenes… Theo C. G. Fu và cs (2007) ở loài
Codonopsis lanceolata có 6 flavonoids, 4 alkaloids, 12 triterpenes và sterol, 10
loại hợp chất dễ bay hơi, 12 nguyên tố vi lượng và 17 acid amin (Fu et al., 2007).
Dịch chiết Codonopsis sp. có thể ngăn ngừa và bảo vệ tế bào gan chống lại tổn
thương do rượu (Bai et al., 2008; Zhang et al., 2007), và có tác dụng chống đột
biến, chống oxy hoá, chống lão hoá, cải thiện khả năng miễn dịch, chống mệt
mỏi, buồn ngủ, giảm đau , hạ huyết áp… (Peng et al., 2009).

5


Luận văn Thạc sĩ

Nguyễn Đình Trọng

Thành phầ n saponin đã làm nên công du ̣ng chın
́ h của Đảng sâm cũng như
các vi ̣thuố c sâm khác. Theo Ichikawa và cs (2009) khi phân tı́ch HPLC pha đảo
kế t hơ ̣p đầ u dò khố i phổ ion hóa tia điê ̣n phát hiê ̣n trong rễ Codonopsis lanceolata
chứa 7 saponin gồ m: lancemaside A, lancemaside B, lancemaside C, lancemaside
E, lancemaside G, Foetidissimoside A và aster saponin Hb. Hàm lươ ̣ng
lancemaside A thay đổ i từ 2,65 đế n 3,64 mg/g rễ khô đố i với mẫu Codonopsis
Hàn Quố c, nhưng chı̉ đa ̣t 0,101 mg/g đố i với mẫu có nguồ n gố c từ Nhâ ̣t Bản
(Ichikawa et al., 2009)

Hın
̀ h 1.2. Cấ u trúc hóa học saponin trong sâm dây (Ichikawa et al., 2009)
Bảng 1.1. Cấ u trúc hóa học 7 saponin trong Codonopsis lanceolata
(Ichikawa et al., 2009)

Hơ ̣p chất

Aglycone

R1

R2

Lancemaside A

I

β-GlcA

β–Xyl-(13)-β–Xyl-(14)-αRha-(12)-α-Ara

Lancemaside B

I

β-GlcA

β-Xyl-(13)-β–Xyl-(14)-αRha-(12)-α-Ara-(13)-Glc-β

Lancemaside C

I

β-GlcA

β-Xyl-(14)-α-Rha-(12)-αAra-(13)-Glc-β

Lancemaside E

I

βGlc(13)β-GlcA

β-Xyl-(13)-β-Xyl-(14)-αRha-(12)-α-Ara-(13)

Lancemaside G

II

β-GlcA

β-Xyl-(13)-β-Xyl-(14)-αRha-(12)-α-Ara-(13)

Foetidissimoside A

I

β-GlcA

β-Xyl-(14)-α-Rha-(12)-α-Ara

aster saponin Hb

I

β-GlcA

α-Rha-(12)-α-Ara
6


Luận văn Thạc sĩ

Nguyễn Đình Trọng

Joh và cs (2010) cho thấy Lancemaside A có khả năng tăng tính kháng viêm
gây ra bởi các lipopolysaccharide ở trên chuột thử nghiệm. Lancemaside A làm
giảm sự hoạt động của các tác nhân gây viêm, bên cạnh đó, nhóm tác giả cho thấy
hoạt chất này có khả năng kháng viêm dựa trên cơ chế kết hợp với tác nhân gây
viêm là lipopoly saccharide và TLR4 (một protein tham gia vào quá trình phát
hiện tác nhân gây bệnh ở người và động vật) (Joh et al., 2010). Kim và cs (2014)
cho thấy Lancemaside A tách chiết từ rễ cây Codocopsis lanceolata có khả năng
điều khiển cơ chế đáp ứng viêm gián tiếp qua bạch cầu và đại thực bào (Kim et
al., 2014). Ngoài khả năng, tăng khả năng kháng viêm ở động vật thử nghiệm,
năm 2013 Hyam và cs cho thấy Lancemaside A có khả năng gây ức chế đối với
TNBS- một tác nhân gây viêm ruột kết ở chuột thí nghiệm (Hyam et al., 2013).
Bên cạnh các saponin, rễ Codonopsis sp. còn chứa các polysaccharide có
dược tính quý trong điều trị một số bệnh ở người, tính gây độc đối với các khối
u, tăng cường khả năng miễn dịch ở người.
Hoạt động chống khối u: Polysaccharide từ C. pilosula có thể ức chế sự hoạt
động của các tế bào ung thư dạ dày người và các tế bào ung thư gan (Yang et al.,
2011). Một pectic polysaccharide ở rễ Codonopsis sp. có khả năng gây độc với tế
bào ung thư phổi người (Yang et al., 2013). Một nghiên cứu in vitro sử dụng tế
bào HO- 8910 (ung thư buồng trứng) cho thấy một polysaccharide có tính axit có

nguồn gốc từ rễ C. pilosula có thể làm giảm sự xâm nhập và di căn của các tế bào
khối u thông qua việc giảm biểu hiện CD44 (Xin et al., 2012). Khả năng gây ức
chế sự phát triển khối u đã được ghi nhận ở những con chuột được tiêm tế bào
khối u và uống 50 hoặc 100mg/kg một trong hai polysaccharides của C. pilosula
sẽ làm ức chế khoảng 22,86 - 56,73 % sự phát triển của khối u (Xu et al., 2012).

7


Luận văn Thạc sĩ

Nguyễn Đình Trọng

Bảng 1.2. Khả năng ức chế khối u ở chuột của CPPW1 và CPPW1B
(Xu et al., 2012)

Tỷ lệ ức chế
(%)

Trọng lượng
lá lách tương
đối (mg/g)

Trọng lượng
tuyến ức
tương đối
(mg/g)

6,01

2,16

TT

Trọng lượng
khối u (g)

NC

2,45 ± 0,24

PC

0,89b

63,67

5,12

1,90

CL

1,64b

33,06

7,34b

2,45a

CH

1,06b

56,73

8,46b

2,61b

CBL

1,89a

22,86

6,14

2,24

CBH

1,56b

36,33

6,35

2,31

NC: Đối chứng âm; PC: đối chứng dương; CL: CPPW1 (50 mg/kg); CH: CPPW1 (100
mg/kg); CBL: CPPW1B (50 mg/kg); CBH: CPPW1B (100 mg/kg); aP<0,05 và bP<0,01.

Tác dụng trên hệ miễn dịch, chống viêm: Zhang và Wang thấy rằng 6 ngày
uống polysaccharide (800 mg/kg/ngày) từ C. pilosula có tác dụng trên chuột suy
giảm miễn dịch gây ra bởi cyclophosphamide, bao gồm tăng cường hoạt động các
tuyến ức, lách và các hoạt động thực bào của các đại thực bào phúc mạc và phục
hồi hoạt động của α - naphthyl - acetate esterase trong tế bào lympho ngoại vi.
Trong một nghiên cứu miễn dịch in vitro, một polysaccharide tan trong nước ở
liều 50, 100 và 200 mg/mL có thể tăng sinh tế bào lympho kích thích bởi
concanavalin A- hoặc lipopolysaccharide (LPS) (Sun, 2009). Ngoài ra, chiết xuất
methanol của C. pilosula gây ức chế cảm ứng nitric oxide synthase và oxy hóa
protein trong quá trình kích thích LPS ở dòng tế bào đại thực bào chuột RAW
264.7 (Yoo et al., 2013). Một nghiên cứu in vitro khác cho thấy, một
polysaccharide từ C. pilosula có thể kích thích sự biệt hóa của tế bào lách trong
chống viêm kích thích bởi LPS (Yongxu et al., 2008). Vai trò chống viêm còn
được chứng minh khi một polysaccharide từ C. pilosula biểu hiện tăng sản xuất
kháng nguyên khi dùng chung với một loại vắc-xin, cho thấy polysaccharide này
có thể được sử dụng như một chất bổ trợ (Sun, 2009). Một nghiên cứu đánh giá
8


Luận văn Thạc sĩ

Nguyễn Đình Trọng

hoạt động của các đại thực bào thực bào cho thấy một polysaccharide có khả năng
tăng hoạt động thực bào, sau khi uống 50 hoặc 100mg/kg dịch chiết C. pilosula
mỗi ngày, có thể làm tăng khả năng thực bào tương ứng là 15,6% và 28,7% (Xu

et al., 2012).
Trong kết quả nghiên cứu về hiệu quả tác dụng chống oxi hóa của dịch chiết
các cây Panax quinquefolium, Panax notoginseng, Codonopsis pilosula,
Pseudostellaria heterophylla và Glehnia littoralis của nhóm tác giả T.B. Ng và
cs (2004) cho thấy dịch chiết từ cây Codonopsis pilosula và Glehnia littoralis có
tác dụng cao nhất trong việc ức chế hiện tượng huyết tán. Các kết quả cũng cho
thấy nếu chỉ quan tâm đến hoạt động chống oxi hóa thì các cây Panax
notoginseng, Codonopsis pilosula, Pseudostellaria heterophylla và Glehnia
littoralis là các đối tượng thay thế rẻ hơn cây nhân sâm.
Nghiên cứu của Chen và cs (2013) cho thấy dịch chiết từ cây Codonopsis
javanica có khả năng làm giảm dần hiện tượng insulin cao và quá trình peroxide
hóa ở những con chuột kháng insulin được nuôi bằng fructose. Yang và cs (2013),
đã tách chiết và xác định được cấu trúc một pectic polysaccharide (CPP1b) từ cây
Codonopsis pinocuda. Theo nghiên cứu này, CPP1b được tách chiết bằng phương
pháp sắc kí cột cellulose DEAE, phân tử này có khối lượng khoảng 1,45x 105 Da.
Pectic CPP1b có khả năng kháng khối u do pectic này thể hiện tính gây độc với
các tế bào ung thư phổi A549 (Yang et al., 2013).
Khi thử nghiệm đánh giá hiệu quả chống lại bệnh béo phì của cây
Codonopsis lanceolata ở những con chuột bị béo phì. Các kết quả nghiên cứu gợi
ý rằng cây Codonopsis lanceolata có một tiềm năng lớn để ứng dụng trong việc
chống lại bệnh béo phì vì nó giảm sự hình thành và tích lũy quá mức các chất
béo. Cây Codonopsis lanceolata có tiềm năng là thực phẩm chức năng có thể sử
dụng trong kiểm soát và điều trị bệnh béo phì (Choi et al., 2013)
Các nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như dược tính của các loài
Codonopsis được thực hiện chủ yếu trên đối tượng rễ củ tự nhiên. Hiện chỉ có
9


Luận văn Thạc sĩ

Nguyễn Đình Trọng

một số ít nghiên cứu thành phần hoạt chất trên đối tượng là sinh khối tế bào
Codonopsis sp.
Trong nghiên cứu sự cảm ứng tạo rễ bất định và tách chiết chất Codonopside
từ Codonopsis lanceolata của Krishna và cs (2007). Theo nhóm tác giả này việc
tạo rễ trực tiếp từ mẫu lá của cây Codonopsis lanceolata trên môi trường MS với
30 g/L sucrose và các nồng độ khác nhau của các chất điều hòa sinh trưởng IAA,
IBA thì môi trường cơ bản với 3 mg/L IBA đạt được kết quả mọc rễ tối đa là
100%. Các rễ này tiếp tục được nuôi trên các môi trường lỏng B5, SH, MS để
thiết lập môi trường nuôi cấy rễ tối ưu. Kết quả là môi trường B5 với nồng độ
IBA 0,5 mg/L có hiệu quả lớn nhất đối với sự sinh trưởng của rễ bất định trong
bình nuôi cấy 250 ml cũng như nuôi cấy bioreactor. Trọng lượng rễ tươi là 6,19
gam tương đương với 0,81 gam trọng lượng khô ở bình nuôi cấy thể tích 250 ml,
ở bình nuôi cấy bioreactor thể tích 2 lít là 48,56 gam trọng lượng tươi và 8,26
trọng lượng khô, sau thời gian nuôi cấy một tháng. Các rễ thu được trong điều
kiên nuôi cấy này cũng dày hơn, cứng cáp hơn rễ tơ và phát triển được trong môi
trường có sục khí mạnh. Thành phần saponin ở các rễ nuôi cấy này được tách
chiết và phân tích bằng dự liệu phổ, dữ liệu này khớp với các dữ liệu đã được
công bố trước đó. Nhóm tác giả cũng đã phát triển được một phương pháp đơn
giản và hiệu quả để sản xuất được các Codonopside từ rễ bất định của Codonopsis
lanceolata (Krishna et al., 2007). Codonopside có tác dụng cảm ứng chết theo
chương trình của các tế bào bạch cầu hạt non trong điều trị bệnh ung thư máu ở
người (Lee et al., 2005). Do đó, việc nuôi cấy rễ tơ cây Codonopsis lanceolata
trong bioreactor có thể coi là nguồn nguyên liệu thay thế cho việc tách chiết hoạt
chất sinh học có giá trị cao.
Theo các nghiên cứu khoa học ở Việt Nam, sâm dây có tác dụng tăng cường
sức khoẻ, chống mệt mỏi và tăng sự thích nghi của động vật thử nghiệm trong
môi trường nhiệt độ cao. Đối với hệ tiêu hóa, sâm dây có tác dụng tăng cường
trương lực của hồi tràng và cường độ co bóp càng tăng nếu tăng nồng độ thuốc.

10


Luận văn Thạc sĩ

Nguyễn Đình Trọng

Đối với hệ tim mạch, sâm dây làm tăng cường độ co bóp của tim, tăng lượng máu
cho não, chân và nội tạng, còn đối với máu và hệ thống máu: sâm dây có tác dụng
làm tăng số lượng hồng cầu, huyết sắc tố, làm giảm số lượng bạch cầu. Ngoài ra,
sâm dây còn có tác dụng hạ huyết áp, tăng cường miễn dịch của cơ thể, có tác
dụng kháng viêm, hóa đàm, giảm ho, kháng khuẩn...
Công trình “Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học của vị thuốc Đảng
sâm Việt Nam” của Hoàng Minh Chung và cs (2002) là nghiên cứu lần đầu tiên
công bố các thành phần hóa học của cây Đảng sâm Việt Nam. Bằng một số
phương pháp định tính và định lượng trên các mẫu củ sâm tươi và cao sâm, nhóm
tác giả này đã đưa ra một số kết luận về đặc điểm thực vật của cây sâm dây mọc
ở Sapa; các thành phần có trong rễ sâm dây khô và tươi: đường khử, acid amin,
chất béo và saponin; thành phần và hàm lượng của các loại acid amin có trong rễ
sâm dây. Nhóm tác giả này cũng đã công bố kết quả những nghiên cứu về hợp
chất saponin có trong sâm dây. Loại saponin chủ yếu là saponin triterpenoid, hàm
lượng saponin vào khoảng 3,12 ± 0,08 %.
Các nghiên cứu trong nước trên cây Sâm dây còn rất hạn chế, mới chỉ dừng
lại ở phân tích thành phần hóa học, các tác dụng dược lý và nhân nhanh giống cây
sâm dây bằng phương pháp nuôi cấy mô.
1.1.5. Tính cấp thiết của việc nghiên cứu, bảo tồn và sản xuất bền vững cây
Sâm dây
Do giá trị y dược quý của cây Sâm dây hiện nay đã được nhiều người biết
đến và giá trị kinh tế cao nên sâm dây bị khai thác quá mức làm giảm khả năng
tái sinh và phát triển của cây, dẫn đến cạn kiệt và có nguy cơ tuyệt chủng. Cây

sâm dây đã được đưa vào chương trình bảo tồn các loài cây quý hiếm ở Việt Nam.
Trước tình hình trên, bên cạnh việc nghiên cứu giá trị của cây Sâm dây ở
Việt Nam, phân tích dược tính để đưa ra những hướng dẫn chiết xuất, sử dụng tốt
nhất phục vụ sức khoẻ cộng đồng, cần sớm nghiên cứu áp dụng nuôi cấy sinh

11


Luận văn Thạc sĩ

Nguyễn Đình Trọng

khối tế bào thực vật tạo nguồn nguyên liệu ổn định, đáp ứng nhu cầu cấp thiết của
ngành công nghiệp dược phẩm và thực phẩm chức năng.
1.2.

Nuôi cấy sinh khối rễ tơ – giải pháp tạo nguồn dược phẩm sạch phục

vụ sức khoẻ cộng đồng
1.2.1. Giới thiệu về nuôi cấy nuôi cấy sinh khối tế bào
Trên thế giới công nghệ sinh khối tế bào thực vật dựa trên cơ sở tính toàn
năng và tính biệt hóa của tế bào thực vật đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều
lĩnh vực: dược phẩm, thực phẩm chức năng, chất phụ gia thực phẩm, nông nghiệp,
lâm nghiệp,… vừa tạo ra nguyên liệu, vừa giúp bảo tồn nguồn gen quý hiếm.
Cho đến nay, rất nhiều hoạt chất có nguồn gốc thực vật mang giá trị kinh tế
cao là sản phẩm của sinh khối tế bào thực vật:
i) Các hoạt chất dùng trong dược phẩm như caffein thu được từ nuôi cấy tế
bào (Coffea arabica), betalain từ mô sẹo củ cải đường, berberin từ cây (Coptis
japonica) (loài cây này phải trồng từ 4-6 năm mới thu được hàm lượng Berberin
đáng kể trong rễ, trong khi hàm lượng này có thể thu được sau 4 tuần nuôi cấy.

ii) Các chất khác như chất dùng trong thực phẩm bao gồm các chất tạo màu
(Anthocyanin, crocin), các chất tạo mùi (vani, mùi hành và mùi tỏi)
iii) Các chất khác như shikonin – chất có khả năng diệt khuẩn và Paclitaxel.
Một ví dụ điển hình về ứng dụng hệ thống bioreactor 10.000 lít trong sản xuất
reserpine (alkaloid chiết xuất từ cây Ba gác có tác dụng chữa bệnh cao huyết áp
và các bệnh rối loạn tuần hoàn máu) có thể sản xuất được 3500 kg resperin trong
thời gian 30 ngày, tương đương với lượng hàng năm cả thế thu được từ cây rễ đó.
Với sâm đã có rất nhiều các nghiên cứu về tạo sinh khối sâm từ tế bào
huyền phù, mô sẹo, từ nuôi cấy rễ bất định hay rễ tơ để thu hoạch các hoạt chất
quý (Kawaguchi et al., 1990; Asada et al., 1993; Zhao et al., 2001; Jeong et al.,
2002; Palazon et al., 2003; Woo et al., 2004). Hiện nay, một số nước tiêu thụ và
xuất khẩu sâm lớn như Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc đã ứng dụng nuôi cấy
12


Luận văn Thạc sĩ

Nguyễn Đình Trọng

sinh khối tế bào từ nhân sâm trong sản xuất các sản phẩm chức năng hay làm
thuốc bổ, thuốc phòng chống bệnh tim mạch, chống gốc tự do, tăng cường chức
năng hệ thần kinh trung ương, các loại mỹ phẩm (Jeong et al., 2002; Nguyen et
al., 1993). Trong khi đó, có rất ít nghiên cứu về nuôi cấy sinh khối tế bào cây bá
bệnh. Gần đây, nhóm nghiên cứu của Maziah và cs (2009) đã thành công trong
nuôi cấy cảm ứng tạo hoạt chất chống ung thư 9-methoxycanthin-6-one từ mô
sẹo (Maziah et al., 2009).
Trong quá trình nuôi cấy tạo sinh khối tế bào thực vật nhằm giảm hoặc mất
tính biệt hóa ở các mô tế bào nuôi cấy cần thiết bổ sung các chất điều tiết sinh
trưởng vào trong môi trường nuôi cấy. Vấn đề này là một trong những trở ngại
lớn làm nản lòng các nhà nghiên cứu do tồn dư của các chất điều tiết sinh trưởng

trong sinh khối tế bào nuôi cấy ảnh hưởng trực tiếp đến sản phẩm và sức khỏe
người sử dụng. Tuy nhiên việc này này hoàn toàn có thể khắc phục trong nuôi
cấy sinh khối từ rễ tơ sẽ được đề cập ở mục sau.
1.2.2. Giới thiệu về Agrobacterium rhizogenes – phương pháp tạo rễ tơ ở tế
bào thực vật
Agrobacterium rhizogenes, tên khoa học khác là Rhizobium rhizogenes, là
một loài vi khuẩn đất Gram âm, thuộc họ Rhizobiaceae nằm trong bộ Rhizobiales
cố định đạm. Chúng có khả năng nhận biết được các phân tử tín hiệu từ các tế
bào thực vật bị tổn thương và tấn công vào vị trí đó. Mô tế bào thực vật bị nhiễm
bởi vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes cảm ứng và phát triển mạnh mẽ các rễ.
Do đó Agrobacterium rhizogenes là một yếu tố cần được quan tâm đến trong việc
cảm ứng tạo rễ bất định từ tế bào thực vật in vitro (Britton et al., 2008).
Agrobacterium được biết đến từ rất lâu trong nông nghiệp với vai trò là các
vi khuẩn cố định đạm, cung cấp nguồn nitơ cho cây trồng. Trong những thập kỉ
gần đây thì các nhà khoa học đã chú ý đến vai trò của hai loài vi khuẩn
Agrobacterium rhizogenes và Agrobacterium tumefaciens

trong mục đích

chuyển gen vào thực vật. Chúng được xem như là các “kĩ sư trao đổi chất”, được
13


Luận văn Thạc sĩ

Nguyễn Đình Trọng

sử dụng để chuyển gene vào tế bào thực vật nhằm mục đích đẩy mạnh quá trình
sinh tổng hợp ra các hợp chất thứ cấp cần thiết. Trong đó, Agrobacterium
tumefaciens được biết đến với vai trò cảm ứng tạo ra các khối u (mô sẹo) và

Agrobacterium rhizogenes thì được biết đến với vai trò cảm ứng tạo ra các rễ bất
định ở thực vật hai lá mầm (Britton et al., 2008; Sevon et al., 2002).
1.2.3. Cơ chế chuyển các gen vùng T-DNA vào tế bào thực vật
Khi tế bào thực vật bị thương tiết ra các polyphenol hấp dẫn các vi khuẩn,
và thực hiện chuyển đoạn T-DNA (transfer DNA) từ Ri-plasmid vào hệ gen của
tế bào vật chủ. Tuy nhiên, ngày nay người ta nhận ra rằng các vi khuẩn này đáp
ứng với các hợp chất phenol nhất định của thực vật như acetosyringone và
hydrocy acetosyringone (Bernard et al., 2010). Nhìn chung cơ chế quá trình xâm
nhiễm và cơ chế phân tử của quá trình vận chuyển T-DNA vào tế bào vật chủ của
vi khuẩn A. tumefaciens và A. rhizogenes được chứng minh là tương tự nhau
(Hình 1.3).

14


Luận văn Thạc sĩ

Nguyễn Đình Trọng

Hình 1.3. Cơ chế chuyển gen chung của Agrobacterium
(Hà Thị Mỹ Ngân, 2013)

Ban đầu Agrobacterium sẽ phải tiếp xúc với tế bào thực vật. Quá trình này
được thực hiện nhờ các gen chvA và chvB. Hai gen này đảm nhiệm việc mã hóa
và vận chuyển β-1,2-glucans vào không gian giữa thành tế bào và màng sinh chất.
Polysacharid này giữ vai trò quan trọng trong việc giữ vi khuẩn Agrobacterium
tiếp xúc với tế bào thực vật. Nếu không có sự tiếp xúc này sẽ không có sự truyền
T-DNA. T-DNA được truyền sang tế bào thực vật nhờ vào hệ thống gen vir.
Quá trình chuyển gen hoạt động dựa vào hệ thống protein virA/virG. Sau
khi tiếp xúc, protein virA có chức năng như một sensor sẽ nhận biết các phân tử

tín hiệu từ tế bào thực vật. Các tín hiệu này chính là các hợp chất do tế bào thực
vật bị tổn thương tiết ra. Protein virA tự phosphoryl hóa rồi sau đó phosphoryl
hóa protein virG. Các tín hiệu hóa học này sẽ được dẫn truyền từ protein virA
sang protein virG (Schmulling et al., 1988). Sản phẩm của protein virG tiếp tục
làm hoạt hóa toàn bộ các gen vir còn lại mà hai gen được hoạt hóa cuối cùng là
15


Luận văn Thạc sĩ

Nguyễn Đình Trọng

virB và virE. Trước đó, khi virD được hoạt hóa, sản phẩm của gen này sẽ thực
hiện quá trình tạo sợi đơn T-DNA chiều 3’ đến 5’ ss T-DNA từ sợi kép ban đầu.
Hai protein virD1 và virD2 nhận biết hai trình tự 25 kb đặc hiệu tại biên trái (LB)
và biên phải (RB), sau đó đoạn T-DNA đơn được cắt ra khỏi sợi kép, virD2 liên
kết chặt chẽ với đầu 5’. Đoạn ss T-DNA sẽ được bảo vệ, bao bọc chặt chẽ bởi
protein virE khỏi sự phân giải bởi các nuclease nội bào. Tiếp đến phức hợp ss TDNA sẽ được đưa sang tế bào thực vật thông qua kênh vận chuyển được tạo bởi
các protein virB, có khoảng 11 loại protein được mã hóa bởi gen virB.
Khi vào đến nhân tế bào thực vật, bước cuối cùng và cũng là quan trọng nhất
là gắn kết sợi đơn T-DNA vào genome tế bào thực vật. Hai protein có chức năng
quan trọng trong quá trình này là protein virE2 và virD2. Protein virE2 là một
loại protein bám sợi đơn có chức năng bao bọc bảo vệ đoạn T-DNA khỏi bị các
endonuclease phân hủy. Trong khi đó, protein virD2 có chức năng tối quan trọng
đó là gắn kết T-DNA vào hệ genome. Protein virD2 không chỉ phân cắt tạo sợi
đơn mà còn có khả năng gắn kết đầu 5’ của T-DNA vào đầu kết thúc 3’ của
genome tế bào chủ. Quá trình gắn kết diễn ra tại vị trí ngẫu nhiên. Trong quá trình
chèn, một số đoạn DNA ngắn của tế bào thực vật bị mất đi, bên cạnh đó, các biên
của T-DNA xuất hiện sự tương đồng với DNA thực vật tại vị trí chèn (Bernard et
al., 2010). Để thực hiện chức năng gắn kết này, protein virD2 có chức năng như

một ligase (Schmulling et al., 1988). Giai đoạn gắn kết là giai đoạn cuối cùng của
quá trình biến nạp và thực sự cần các protein của tế bào chủ tham gia vào chu
trình. Chức năng của các protein này là chuyển đoạn T-DNA từ dạng sợi đơn trở
về dạng sợi kép và tồn tại lâu dài trong genome thực vật.
T-DNA ở Ri-plasmid bao gồm 2 vùng chính là vùng biên trái (LB) và vùng
biên phải (RB). Hai vùng này có kích thước khoảng 15-20 kb và được xen kẽ bởi
một đoạn DNA, đoạn DNA này sẽ không được chuyển vào hệ gen của tế bào vật
chủ. Vùng biên phải mang các gen mã hóa sinh tổng hợp auxin (tms1 và tms2),
vùng biên trái bao gồm 18 khung đọc (ORFs), trong đó có 4 locus 10, 11, 12 và
16