Nghiên cứu nuôi cấy tế bào rìa giác mạc và ứng dụng trong điều trị một số tổn thương giác mạc

4



B Y T
TRNG I HC Y H NI

o0o






BO CO KT QU NGHIấN CU TI CP B




nghiên cứu nuôi cấy tế bào rìa giác mạc và ứng
dụng trong điều trị một số tổn thơng giác mạc





Ch nhim ti: PGS.TS. Nguyn Th Bỡnh

C quan ch trỡ ti: Trng i hc Y H ni

8020


H Ni - 2009

5



B Y T
TRNG I HC Y H NI
o0o





BO CO KT QU NGHIấN CU TI CP B




nghiên cứu nuôi cấy tế bào rìa giác mạc và ứng
dụng trong điều trị một số tổn thơng giác mạc

Ch nhim ti: PGS. TS. Nguyn Th Bỡnh
Th ký ti : TS. Nguyn Khang Sn
C quan ch trỡ ti:Trng i hc Y H ni
Cp qun lý: B Y t
Thi gian thc hin: t thỏng 8 nm 2006 n thỏng 8 nm 2009
Tng kinh phớ thc hin ti: 380 triu ng
Trong ú: kinh phớ SNKH 380 triu ng
Ngun khỏc: 0 triu ng





H Ni - 2009


1


BẢN TỰ ĐÁNH GIÁ VỀ TÌNH HÌNH THỰC HIỆN VÀ NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI
CỦA ĐỀ TÀI KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CẤP BỘ

1. Tên đề tài: “Nghiên cứu nuôi cấy tế bào rìa giác mạc và ứng dụng trong điều trị
một số tổn thương giác mạc”.
2. Chủ nhiệm đề tài : PGS. TS Nguyễn Thị Bình
3. Cơ quan chủ trì đề tài : Trường Đại học Y Hà nội

4. Thời gian thực hiện : 8/2006- 8/2009
5. Tổng kinh phí thực hiện đề tài: 380 triệu đồng, trong đó kinh phí từ ngân sách là
380 triệu đồng.
6. Tình hình thực hiện
đề tài so với đề cương:
6.1.Về mức độ hoàn thành khối lượng công việc: Đề tài đã hoàn thành đầy đủ
khối lượng các công việc đã đề ra trong đề cương : Gồm:
- Tấm màng ối người đã xử lý: 240 tấm
- Tấm biểu mô giác mạc thỏ nuôi cấy : 120 tấm
- Tấm biểu mô giác mạc người nuôi cấy:20 tấm
- Gây bỏng giác mạc cho thỏ
: 32 thỏ
- Ghép tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy cho thỏ: 20 mắt
- Ghép tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy cho bệnh nhân tình nguyện: 6 mắt
- Đã đăng 3 bài báo có nội dung liên quan đến đề tài ở Tạp chí Nghiên cứu Y học:
1. “Đánh giá phương pháp xử lý mẫu mô vùng rìa giác mạc thỏ trong nuôi
cấy tạo tấm biểu mô giác mạc”; Tạp chí Nghiên cứu Y học, Supplement, Volume 62,
N
0
3- May , 2009.
2. “Nghiên cứu quy trình tạo tấm màng ối làm nền nuôi cấy tế bào gốc vùng rìa
giác mạc”; Tạp chí Nghiên cứu Y học, Volume 63,N
0
4- June, 2009.
3. “Nghiên cứu định danh tế bào tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy”; Tạp chí
Nghiên cứu Y học, Volume 64, N
0
5- October, 2009.
- Đào tạo :
+ 1 cao học chuyên ngành Mô –Phôi (BS. Phạm Thị Nhung): Tên đề tài:

“Đánh giá hiệu quả xử lý mẫu mô vùng rìa sinh thiết trong tạo tấm biểu mô giác
mạc thỏ nuôi cấy”.
+ 1 NCS chuyên ngành Nhãn khoa (ThS. Vũ Thị Tuệ Khanh): Tên đề tài:
“Nghiên cứu phương pháp ghép tấm biểu mô giác mạc vùng rìa nuôi cấy điều trị
hội chứng suy giảm tế bào nguồn sau bỏng mắt do kiềm”.

2


6.2. Về các yêu cầu khoa học và chỉ tiêu cơ bản của các sản phẩm
KHCN: Đối chiếu với yêu cầu khoa học và chỉ tiêu cơ bản của các sản phẩm
đặt ra trong đề cương, đề tài đã đạt đầy đủ:
- Tấm màng ối người đã xử lý: có kích thức 3x3 cm, vô khuẩn, dai và
đàn hồi tốt, làm nền nuôi cấy mảnh mô vùng rìa tạo tấm biểu mô thành công,
không bị phân hủy khi ghép tấm biể
u mô nuôi cấy cho thỏ và bệnh nhân
- Tấm biểu mô giác mạc thỏ và người nuôi cấy: có đầy đủ đặc điểm về
cấu trúc hình thái và hóa học của biểu mô giác mạc: rộng 4cm
2
, là biểu mô
lát tầng không sừng hóa gồm 4-5 hàng tế bào , các tế bào liên kết chặt chẽ
với nhau bằng các mộng bào tương và thể liên kết, không có tế bào tiết nhày,
bào tương chứa K3 và K12, sống và áp sát vào nhu mô của giác mạc khi
ghép cho thỏ và cho người (thỏ: 3 tháng, người: 9 tháng)
- Gây bỏng giác mạc cho thỏ: Xây dựng thành công mô hình gây bỏng
giác mạc thực nghiệm cho thỏ: phá hủy toàn bộ biểu mô giác mạc và vùng
rìa giác mạc, tạo thành sẹo giác mạc.
- Ghép thành công tấm biểu mô giác mạc nuôi c
ấy cho 20 mắt thỏ :
tấm biểu mô dán sát vào nhu mô giác mạc, các tế bào biểu mô có bào tương

và nhân bình thường.
- Ghép thành công tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy cho 6 mắt bệnh nhân: tấm biểu
mô áp tốt, biểu mô bề mặt nhãn cầu nhẵn bóng, nhuộm biểu mô bề mặt nhãn cầu bằng
fluorescein không thấy tổn thương, màng xơ mạch không phát triển, hiện tượng viêm trên
bề mặt nhãn cầu đã được giải quyết, các triệu chứng chủ quan của người bệnh được cải
thiện đáng kể, thị lực sau ph
ẫu thuật tăng từ 1 đến 3 dòng so với trước phẫu thuật.
- Đội ngũ các nhà khoa học, các bác sĩ, y tá, kỹ thuật viên có kiến thức và tay nghề
vững vàng trong nuôi cấy tấm biểu mô giác mạc và phẫu thuật ghép tấm biểu mô nuôi cấy
.
6.3. Về tiến độ thực hiện: Đề tài đã thực hiện đúng tiến độ đã đề ra (Mặc dù đề tài
được phê duyệt từ ngày 16/8/2006; tuy nhiên ngày 11/10/2006, đề
tài mới được phân bổ
kinh phí)
7. Về những đóng góp mới của đề tài:

3


Trên cơ sở so sánh với những thông tin đã được công bố trên các ấn
phẩm trong và ngoài nước đến thời điểm kết thúc đề tài, đề tài có những
điểm mới sau đây:
7.1. Về giải pháp khoa học - công nghệ: Đề tài đã xây dựng mô hình nghiên cứu
toàn diện và công phu. Trước tiên, các nghiên cứu được tiến hành trên thực nghiệm.
Những kết quả thu được trên thực nghiệm sẽ là định hướng cho nghiên cứu trên bệnh
nhân. Thông qua nghiên cứu thực nghiệm, các bác sĩ, y tá kỹ thuật viên rút ra được nhiều
kinh nghiệm cũng như rèn luyện được tay nghề trước khi tiến hành thử nghiệm tên bệnh
nhân.
7.2. Về
phương pháp nghiên cứu: Kết hợp các kỹ thuật thông thường như: nhuộm

giemsa, nhuộm H.E với các kỹ thuật hiện đại như: hiển vi điện tử xuyên và quét, nhuộm
hóa mô miễn dịch, nhuộm huỳnh quang.
7.3. Những đóng góp mới khác: đây là công trình đầu tiên ở Việt nam đã nuôi cấy
và ghép thành công tấm biểu giác mạc nuôi cấy , mở ra một phương pháp hiện đại điều trị
cho các b
ệnh nhân bị hội chứng suy giảm tế bào nguồn giác mạc.
8. Tình hình sử dụng kinh phí: Giải ngân đầy đủ, đúng tiến độ và đúng các quy định về
tài chính hiện hành, có bản xác nhận chi tiêu kèm theo.

Hà nội, ngày 15 tháng10 năm 2009
CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI


PGS.TS. Nguyễn Thị Bình


6



MỤC LỤC


ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3
1.1. Cấu trúc của bề mặt nhãn cầu [2] 3
1.1.1. Giác mạc 3
1.1.3. Kết mạc nhãn cầu 4
1.1.3. Vùng rìa giác mạc và tế bào gốc vùng rìa giác mạc. 5
1.1.4. Các yếu tố liên quan đảm bảo sự toàn vẹn của BMNC [36] 8

1.2. Màng ối và các phương pháp xử lý màng ối làm nền nuôi cấy 10
1.2.1. Màng ối 10
1.2.2. Chuẩn bị màng ối làm nền nuôi cấy. 12
1.3. Nuôi tạo tấm biểu mô giác mạc từ tế
bào gốc vùng rìa giác mạc 14
1.3.1. Chuẩn bị mẫu mô vùng rìa để nuôi cấy. 14
1.3.2. Môi trường nuôi cấy 15
1.3.3. Nuôi tạo tấm biểu mô giác mạc từ tế bào gốc VRGM 16
1.3.4. Định danh tế bào của tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy 17
1.4. Điều trị tổn thương bề mặt nhãn cầu bằng phương pháp ghép tấm biểu mô giác mạc
nuôi cấy 17
1.4.1. Hội chứng suy giảm tế bào gốc VRGM [24, 42, 46, 48] 17
1.4.2. Biểu hiệ
n lâm sàng của hội chứng suy giảm tế bào gốc VRGM 18
1.4.3. Chẩn đoán xác định hội chứng suy giảm tế bào gốc VRGM 19
1.4.4. Phân loại mức độ tổn thương của hội chứng suy giảm tế bào gốc VRGM [17]
19
1.4.5. Phương pháp điều trị hội chứng suy giảm tế bào gốc VRGM bằng ghép tấm
biểu mô giác mạc nuôi cấy 20
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23
2.1. Đố
i tượng nghiên cứu 23
2.2 Mô hình nghiên cứu 23
2.3. Phương pháp nghiên cứu 24
2.3.1. Xây dựng qui trình thu nhận, xử lý và bảo quản màng ối người làm nền nuôi
cấy. 24
2.3.2.Xây dựng qui trình trích thủ và xử lý mẫu vùng rìa giác mạc. 25
2.3.3. Lựa chọn môi trường nuôi cấy: 27

7

2.3.4. Ghép thực nghiệm trên thỏ 27
2.3.5. Ghép trên bệnh nhân tình nguyện 30
2.4. Kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu 33
2.5. Địa điểm nghiên cứu 34
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35
3.1.Xây dựng qui trình thu nhận, xử lý và bảo quản màng ối người làm nền nuôi cấy. 35
3.1.1. Lựa chọn màng ối 35
3.1.2. Lựa chọn phương pháp xử lý màng ối: 37
3.2. Lựa chọn phương pháp xử lý mảnh vùng rìa để nuôi cấy 39
3.2.1. M
ẫu mô vùng rìa giác mạc thỏ được chuẩn bị cho nuôi cấy 39
3.2.2. Diện tích phát triển của tấm BMVRGM nuôi cấy trên nền màng ối 40
3.2.4. Hình thái của tấm BMGM sau nuôi cấy 42
3.3. Lựa chọn môi trường nuôi cấy: 44
3.4. Lựa chọn phương pháp nuôi cấy 45
3.4.1. Tỷ lệ nuôi tạo thành công tấm biểu mô giác mạc (Bảng 3.3) 45
3.4.2. Chất lượng của tấm biểu mô 45
3.5. Xây dựng qui trình định danh, xác định điều kiện nuôi cấy tế
bào gốc BMVR và
tạo tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy. Đánh giá chất lượng tế bào của tấm BMVR nuôi
cấy 47
3.5.1. Cấu trúc vi thể của tấm biểu mô nuôi cấy 48
3.5.2. Cấu trúc siêu vi của tấm biểu mô nuôi cấy 49
3.5.3. Cấu trúc hoá học của tấm biểu mô nuôi cấy 51
3.6. Mô hình gây bỏng cho thỏ. 52
3.7. Ghép tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy cho thỏ 53
3.8. Nuôi và ghép tấm biểu mô nuôi cấy cho bệnh nhân tình nguyện 56
3.8.1. Đặc đ

iểm tình hình bệnh nhân (Bảng 3.4) 56
3.8.2. Đặc điểm tổn thương mắt trước phẫu thuật ghép tấm biểu mô (Bảng 3.5) 56
3.8.3. Thời gian nuôi cấy tấm biểu mô (Bảng 3.6) 57
3.8.4. Kết quả phẫu thuật tại các thời điểm theo dõi (Bảng 3.7) 57
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 61
KẾT LUẬN 69
KIẾN NGHỊ VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP 70
TÀI LIỆU THAM KHẢO 71


8


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.3. Cấu tạo màng rau thai người 10
Hình 2.1: Mô hình nghiên cứu 23
Hình 2.2: Bánh rau và màng rau 24
Hình 2.3: Mô hình nghiên cứu thực nghiệm 28
Hình 2.4: Phân nhóm thực nghiệm 29
Hình 3.1. Màng ối trên bề mặt bánh rau (H.E x 250) 35
Hình 3.2: Bề mặt màng ối người (giemsa, x 1000): 36
Hình 3.3: Màng ối cắt đứng dọc (HE x 800): 36
Hình 3.4. Màng ối không nạo biểu mô(H.E x 250) 37
Hình 3.5. Màng ối nạo biểu mô bằng cơ học(H.E x 250) 37
Hình 3.7. Tấm biểu mô nuôi trên màng ối còn biểu mô 38
Hình 3.8. Tấm biểu mô nuôi trên màng ối nạo biểu mô bằng cơ học 38
Hình 3.9. Tấm biểu mô nuôi trên màng ối n
ạo biểu mô bằng Ammonium 38
Hình 3.10: Mẫu mô vùng rìa không xử lý enzym (HE x250): 39

Hình 3.11: Mẫu mô vùng rìa được xử lí bằng dispase (HEx 250): 39
Hình 3.12:Biểu mô vùng rìa tái tạo sau 7 ngày trích thủ (HE x 250) 40
Hình 3.13: Sự phát triển và lan rộng của tấm BMGM nuôi cấy 41
Hình 3.14: Tấm biểu mô nuôi cấy ngày thứ 4. (KHV soi nổi x 25): 42
Hình 3.15: Bề mặt tấm biểu mô nuôi cấy 10 ngày (Giemsa x 200) 43
Hình 3.16: Tấm biểu mô nuôi cấy 10 ngày 43
Hình 3.17. Tấm biểu mô nuôi cấy 12 ngày, vùng đặt mảnh VRGM(H.E x 250) 43
Hình 3.18: Bề mặt tấm biểu mô nuôi cấy 16 ngày (Giemsa x 200) 44
Hình 3.19: Tấm biểu mô nuôi cấy 14 ngày (Nhuộm huỳ
nh quang x 250) 44
Hình 3.20. Nuôi cấy bằng dịch treo 4 ngày( Giemsa x 400) 46
Hình 3.22: Tấm biểu mô nuôi cấy ngày thứ 3 46
Hình 3.21. Tấm biểu mô nuôi cấy bằng dịch treo 18 ngày (H.E x500) 47
Hình 3.23. Tấm biểu mô nuôi cấy bằng mảnh mô vùng rìa 16 ngày (H.E x500) 47
Hình 3.24 : Bề mặt tấm biểu mô nuôi cấy 18 ngày (giemsa x250) 48
Hình 3.25 : Tấm biểu mô nuôi cấy 18 ngày (H.E x500) 49
Hình 3.26. Bề mặt tấm biểu mô nuôi cấy14 ngày (x5000) 49
Hình 3.27. Mặt dưới màng ối (x 10.000) 50
Hình 3.28: Tấm biểu mô nuôi cấy 18 ngày (x4000). 50
Hình 3.29: Tấm biểu mô nuôi cấy 18 ngày (x10.000). 50
Hình 3.30. Tấm biểu mô nuôi cấy 14 ngày (P.A.S x 1000) 51
Hình 3.31: Tấm biểu mô nuôi c
ấy 18 ngày (K3x500). 51
Hình 3.32: Tấm biểu mô nuôi cấy 18 ngày (K12x500). 51
Hình 3.33: Mắt thỏ trước bỏng 52
Hình 3.34: Mắt thỏ ngay sau khi gây bỏng 52
Hình 3.35: Mắt thỏ sau bỏng 1 tháng 52
Hình 3.36: Sau bỏng 7 ngày (H.E x 100) 53
Hình 3.37: Sau bỏng 15 ngày (H.E x100) 53
Hình 3.38: Sau bỏng 45 ngày (H.E x 100) 53

Hình 3.39: Mắt thỏ ngay sau ghép 53
Hình 3.40. Mắt thỏ sau ghép 7 ngày 54
Hình 3.41. Giác mạc thỏ sau ghép 7 ngày 54
Hình 3.42: Mắt thỏ sau ghép 15 ngày 54
Hình 3.43: Giác mạc thỏ sau ghép 15ngày 54

9


Hình 3.44. Mắt thỏ sau ghép 1 tháng 55
Hình 3.45: Giác mạc thỏ sau ghép 1 tháng 55
Hình 3.46: Mắt thỏ sau ghép 3 tháng 55
Hình 3.47: Giác mạc thỏ sau ghép 3 tháng 55
Hình 3.48: Mắt của bệnh nhân số 1 sau bỏng 3, 5 tháng 58
Hình 3.49: Mắt của bệnh nhân số 1 sau ghép tấm biểu mô nuôi cấy 1 tuần, 2 tháng 59
Hình 3.50: Mắt của bệnh nhân số 1 sau ghép tấm biểu mô nuôi cấy 6 tháng 59
Hình 3.51: Mắt của bệnh nhân số 1 sau ghép tấm biểu mô nuôi cấy 8 tháng 60





DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1. Diện tích của tấm BMVRGM nuôi cấy theo thời gian 41
Bảng 3.2 : Lựa chọn môi trường nuôi cấy 44
Bảng 3.3: Tỉ lệ nuôi cấy thành công tấm biểu mô giác mạc 45
Bảng 3.4: Đặc điểm tình hình bệnh nhân trước phẫu thuật 56
Bảng 3.5: Đặc điểm tổn thương mắt trước phẫu thuật ghép tấm biểu mô 56
Bảng 3.6: Thời gian nuôi cấy tấm biểu mô 57

Bảng 3.7: Kết quả phẫ
u thuật tại các thời điểm theo dõi 57

1


ĐẶT VẤN ĐỀ

Tổn thương giác mạc là một bệnh lý thường gặp trong nhãn khoa.
Nguyên nhân gây tổn thương giác mạc rất khác nhau nhưng đều làm mất độ
trong của giác mạc và gây giảm thị lực ở nhiều mức độ khác nhau. Trong
một số trường hợp, vùng rìa giác mạc - nơi cư trú của tế bào gốc biểu mô
giác mạc cũng bị tổn thương, di chứng để lại cho bệnh nhân là hộ
i chứng suy
giảm tế bào gốc của biểu mô giác mạc. Hậu quả của hội chứng này làm mất
độ trong của giác mạc do màng xơ mạch từ phía kết mạc xâm lấn qua vùng
rìa lên bề mặt của giác mạc, loét biểu mô giác mạc khó hàn gắn, tróc biểu mô
giác mạc tái phát [12, 15, 34, 41, 46]. Để điều trị hội chứng suy giảm tế bào
gốc của biểu mô giác mạc, các nhà nhãn khoa đã sử dụng các phương pháp
khác nhau: Ghép kế
t mạc rìa tự thân, ghép giác - củng mạc rìa từ giác mạc
tử thi, ghép màng ối. Kết quả điều trị khá tốt, đặc biệt với những trường hợp
tổn thương một mắt. Tuy nhiên với các kỹ thuật này, mảnh mô dùng để ghép
lấy từ bên mắt lành hoặc từ mắt tử thi cần có một diện tích khá lớn hoặc cần
toàn bộ giác mạc.
Trong vài năm gần đây, y – sinh họ
c hiện đại đã đạt được những thành
tựu lớn trong việc đổi mới mô bằng ghép tế bào gốc. Trong nhãn khoa, công
nghệ tạo tấm biểu mô giác mạc từ việc nuôi cấy tế bào gốc vùng rìa giác mạc
trên thực nghiệm và trên người đã có những thành công nhất định. Ghép tấm

biểu mô giác mạc nuôi cấy mang lại hiệu quả tốt cho việc phục hồi cấu trúc
và chức năng của giác mạ
c.
Xuất phát từ nhu cầu thực tế trong nước, nhiều bệnh nhân bị hội chứng
suy giảm tế bào gốc vùng rìa cần được điều trị và với mong muốn đưa ra
được một phương pháp hiện đại điều trị hội chứng này, chúng tôi đã tiến
hành đề tài “Nghiên cứu nuôi cấy tế bào rìa giác mạc và ứng dụng trong điều
trị một số tổn thương giác m
ạc”.


2


Mục tiêu của đề tài là:
1. Xây dựng qui trình nuôi cấy, nhận dạng tế bào gốc biểu mô vùng rìa
giác mạc thỏ trên nền màng ối người, tạo tấm biểu mô giác mạc nuôi
cấy. Ghép thành công tấm biểu mô nuôi cấy trên mắt thỏ.
2. Tạo tấm biểu mô giác mạc người nuôi cấy, phục vụ ghép tự thân cho
một số bệnh nhân tổn thương giác mạc.
Mục tiêu cụ thể:
1. Xây d
ựng qui trình thu nhận, xử lý và bảo quản màng ối người làm giá
đỡ cho tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy từ tế bào gốc biểu mô vùng rìa.
2. Xây dựng qui trình định danh, xác định điều kiện nuôi cấy tế bào gốc
BMVR và tạo tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy. Đánh giá chất lượng tế
bào của tấm BMVR nuôi cấy.
3. Tạo mô hình thực nghiệm gây tổn thương khu trú giác mạc thỏ. Ghép
tấm biểu mô giác m
ạc nuôi cấy. Xây dụng các tiêu chuẩn đánh giá về

hiệu quả ghép trên mắt thỏ.
4. Bước đầu tạo tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy, ghép tự thân cho một số
bệnh nhân tổn thương giác mạc.




3


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Cấu trúc của bề mặt nhãn cầu [2].
Bề mặt nhãn cầu (BMNC) là vùng được giới hạn bởi hai đường xám
của mi trên và mi dưới. BMNC gồm biểu mô giác mạc, biểu mô kết mạc và
được ngăn bởi biểu mô vùng rìa giác mạc (VRGM).
1.1.1. Giác mạc
Giác mạc chiếm 1/6 vỏ ngoài của nhãn cầu, hình hơi bầu dục, dày 0,8
– 0,9 mm ở vùng trung tâm và 11,7 mm ở chu biên. Giác mạc là cấu trúc vô
mạch, gồm 5 lớp: Biểu mô giác mạc, màng Bowman, chân bì giác mạc,
màng Descemet và nội mô giác mạc (Hình 1.1)

Hình 1.1. Ảnh vi thể giác mạc bình thường ( H.E x 250)
1. Biểu mô trước giác mạc 2. Nhu mô
3. Màng Desmert 4. Nội mô giác mạc

• Biểu mô giác mạc: là biểu mô lát tầng không sừng hoá, gồm 4-6
hàng tế bào, chiếm khoảng 10% bề dày của giác mạc. Biểu mô
được chia thành 3 lớp: lớp đáy, lớp tế bào hình cánh, lớp bề mặt.
Các tế bào lớp đáy hình trụ có khả năng phân chia, các tế bào liên

kết với nhau bằng thể liên kết và liên kết với màng đáy bằng thể
bán liên kết, các tế bào được sinh ra sẽ phát triển lên phía trên. Các

4


tế bào lớp giữa (tế bào hình cánh) có nhân tròn hoặc dài, các tế bào
liên kết với nhau bằng thể liên kết và các mộng liên kết. Các tế bào
bề mặt có hình đa diện dẹt, liên kết với nhau bằng vòng dính, dải
bịt và thể liên kết, bề mặt tế bào có những vi nhung mao ngắn và
được phủ bởi một lớp glycocalyx. Lớp glycocalyx này liên kết với
mucin của phim nước mắt giúp dàn đều làm phim nước mắt bền
vững để
bảo vệ sự toàn vẹn của BMNC. Trong bào tương của các
tế bào biểu mô giác mạc có nhiều loại keratin khác nhau, tuy nhiên
K3 và K12 được coi là những dấu ấn của những tế bào biểu mô
giác mạc đã biệt hóa. Đặc biệt K12 là dấu ấn tốt nhất và chỉ có ở
những lớp trên đáy của biểu mô giác mạc.
• Màng Bowman: Gồm màng đáy của biểu mô và màng Bowman
chính thức. Màng Bowman là lớp ngoài của chân bì giác mạc (nhu
mô giác m
ạc), gồm các sợi collagen xếp theo các hướng khác nhau.
Màng Bowman rất dai và là lớp bảo vệ quan trọng của nhãn cầu.
• Chân bì giác mạc: Chiếm 90% bề dày giác mạc, gồm các sợi
collagen chủ yếu là type I, III, ít collagen type IV và V. Xen giữa
các sợi và lá collagen là những tế bào sợi dẹt gọi là giác mạc bào
(keratocyte) khoảng gian sợi và gian bào chứa chất căn bản giàu
glycosaminoglycan.
• Màng Descemet: Dày 5-10µm, là lá đáy được tạo ra từ chất tiết của
nội mô giác mạc.

•
Nội mô giác mạc: Là biểu mô lát đơn gồm 1 hàng tế bào đa diện
dẹt xếp đều đặn phủ mặt sau giác mạc. Các tế bào nội mô giác mạc
không có khả năng phân chia.
1.1.3. Kết mạc nhãn cầu.
Kết mạc trải từ vùng rìa củng mạc đến đường xám của bờ mi, được
chia thành 3 phần: kết mạc mi, kết mạc cùng đồ và kết mạc nhãn cầu.

5


Biểu mô kết mạc nhãn cầu là biểu mô trụ tầng. Các tế bào liên kết với nhau
lỏng lẻo, khoảng gian bào rộng. Trong biểu mô có khoảng 5-10% tế bào hình
đài tiết nhày. Lớp đệm của kết mạc là mô liên kết thưa, chứa mạch máu,
mạch bạch huyết và các loại tế bào: lympho, dưỡng bào, tương bào và bạch
cầu đa nhân.
1.1.3. Vùng rìa giác mạc và tế bào gốc vùng rìa giác mạc
.
* Vùng rìa giác mạc:
Vùng rìa giác mạc là chỗ nối tiếp giữa giác mạc trong suốt ở phía
trước và củng mạc trắng đục ở phía sau. Biểu mô vùng rìa (BMVR) là vùng
tế bào biểu mô chuyển đổi về mặt hình thái cũng như chức năng từ biểu mô
lát tầng không sừng hoá của biểu mô giác mạc sang biểu mô có các tế bào
hình trụ, tế bào hình đài tiết nhày của biểu mô kết mạc. Biểu mô vùng rìa
gồm 7-10 hàng tế bào. Lớp t
ế bào đáy của biểu mô hình trụ và có khả năng
phân chia. Những tế bào này được gọi là tế bào gốc của biểu mô giác mạc,
đóng vai trò quan trọng trong việc đổi mới và tái tạo biểu mô giác mạc. Khi
soi vùng rìa bằng kính hiển vi thấy các khía dọc xếp theo hình nan hoa, đục
hơn tổ chức bao quanh. Hình ảnh này được gọi là hàng rào Vogt. Hàng rào

Vogt là nơi tập trung nhiều sắc tố của vùng rìa và được coi là biểu hiện lâm
sàng của sự toàn vẹ
n các tế bào gốc của biểu mô giác mạc. Sự tồn tại và phát
triển của các tế bào gốc còn phụ thuộc vào nhu mô vùng rìa. Nhu mô vùng
rìa được coi như môi trường có thể ức chế hoặc kích thích sự tăng trưởng của
các tế bào gốc biểu mô.
* Tế bào gốc vùng rìa giác mạc:
Trong cơ thể người, biểu mô giác mạc luôn được đổi mới. Các tế bào
gốc vùng rìa phân chia và biệt hóa tế bào để bù lại về mặ
t số lượng và chất
lượng các tế bào đã mất đi. Tế bào gốc biểu mô giác mạc là các tế bào hình
trụ, nằm ngay trên màng đáy của lớp biểu mô vùng rìa, có khả năng phân
chia mạnh. Từ cuối thập kỷ 80, sự tồn tại của tế bào gốc của biểu mô giác
mạc tại vùng rìa củng giác mạc đã được nhiều nhà nhãn khoa trên thế giới

6


nêu ra và nghiên cứu chứng minh sự tồn tại đó bằng các phương pháp khác
nhau. Davanger và Evansen (1971) là những người đầu tiên mô tả đặc điểm
của các tế bào biểu mô thuộc vùng rìa giác mạc [9]. Sau đó, nhiều công trình
nghiên cứu khoa học cơ bản đã được tiến hành chứng minh sự tồn tại của tế
bào gốc giác mạc [11, [41], [42].
Với phương pháp đánh dấu tế bào bằng đồng vị phóng xạ, nhiều tác
giả đã chứng minh hoạt động gián phân và biệt hoá tế bào xảy ra tại vùng rìa.
Mặt khác, tế bào biểu mô giác mạc chứa các lọai keratin khác nhau tuỳ theo
mức độ biệt hoá của tế bào. Sự có mặt của keratin K3 và keratin K12 chứng
tỏ mức độ biệt hoá cao của tế bào biểu mô giác mạc. Các loại kêratin này
không bao giờ thấy ở tế bào đáy thuộc vùng rìa. Tính chất này phù hợp với
tính chất của tế bào gốc. Sự

biểu mô hoá bắt đầu từ phía chu vi giác mạc, có
xu hướng về phía trung tâm giác mạc. Bình thường, kiểu hình biểu mô giác
mạc được duy trì nhờ sự cân bằng của những tế bào biểu mô bị bong ra trên
bề mặt và sự thay thế do gián phân của tế bào lớp đáy biểu mô và sự di cư về
phía trung tâm giác mạc của những tế bào đáy được sinh ra từ những tế bào
gốc trong vùng rìa giác mạc.
Thoft và cộng sự đã có nh
ững công trình nghiên cứu chứng minh sự
tồn tại cùng các hoạt động phân chia của tế bào gốc BMGM bằng những
phương pháp nhuộm, đánh dấu phóng xạ, quan sát quá trình biểu mô hoá.
Quá trình đổi mới của biểu mô bề mặt giác mạc tuân theo phương trình X +
Y = Z (Hình 1.2). Trong đó:X là sự tăng sinh tế bào từ dưới lên. Y là sự di
chuyển tế bào từ chu biên vào. Z là sự mất tế bào ở lớp nông [42], [43]

Hình 1.2. Sơ đồ quá trình đổi mới tế bào bề mặt giác mạc.

7


Tseng S. C. G và cộng sự đã ghép màng ối chia 2 nhóm: Một nhóm
chỉ ghép màng ối đơn thuần, một nhóm kết hợp ghép vùng rìa dị thân trên 31
mắt, kết quả nghiên cứu cho thấy các trường hợp có ghép vùng rìa thì thị lực
tăng và biểu mô hoá bề mặt nhãn cầu tốt hơn [48]. Thành công của phẫu
thuật ghép vùng rìa trên những bệnh nhân tổn thương bề mặt nhãn cầu nặng
một lần nữa là bằng chứng cho sự tồn tạ
i của tế bào gốc và vai trò quan trọng
trong sự hàn gắn biểu mô bề mặt nhãn cầu.
Hơn nữa, các mạch máu dưới kết mạc kết thúc và đổ vào đám rối mạch
vùng rìa, đám rối mạch này có vai trò quan trọng cung cấp các chất dinh
dưỡng và oxy cho quá trình gián phân của các tế bào gốc. Những nghiên cứu

quan sát trước kia cho thấy sự biểu mô hóa luôn xuất phát từ phía chu vi giác
mạc và hướng về trung tâm. Trong nghiên cứu thực nghiệm trên động vậ
t
không thể tạo tổn thương biểu mô vĩnh viễn nếu không phá hủy vùng rìa.
Hiện nay, việc phân biệt được tế bào gốc ở biểu mô vùng rìa vẫn là vấn đề
khó khăn. Nhưng sự tồn tại các tế bào có khả năng gián phân tại vùng rìa và
sự phân lập các loại Keratin từ các tế bào đó đã là một bằng chứng xác đáng.
Hơn thế, sự thành công của các phẫu thuật ghép biểu mô vùng rìa củ
ng giác
mạc và các phẫu thuật ghép tổ chức có nuôi cấy tế bào lấy từ vùng rìa đã
chứng minh sự tồn tại của tế bào gốc biểu mô giác mạc người.
Tế bào gốc giác mạc cùng lúc có thể biệt hóa theo hai con đường. Con
đường thứ nhất để bù lại về mặt số lượng tế bào biểu mô giác mạc, quá trình
này bắt đầu bằng việc di chuyển hướng tâm và theo chiều ngang của các tế
bào gố
c. Các tế bào này nhanh chóng tăng sinh và biệt hóa thành các tế bào
sau gián phân và di chuyển dần lên phía trên, cuối cùng biệt hóa thành tế bào
trưởng thành và tróc ra ở bề mặt biểu mô giác mạc. Liên tiếp nhiều quá trình
gián phân, biệt hóa và tăng sinh của tế bào gốc sẽ làm đổi mới liên tục các
lớp tế bào biểu mô giác mạc. Con đường biệt hóa tế bào thứ hai của tế bào
gốc đó là biệt hóa và tăng sinh tế bào theo chiều đứng ngay tại biểu mô vùng

8


rìa. Các nhà nghiên cứu cho rằng con đường này đóng một vai trò quan trọng
như một rào chắn để tách biệt biểu mô kết mạc và biểu mô giác mạc.
Chức năng của các tế bào gốc ở vùng rìa đã được nhiều nhà nhãn khoa
nghiên cứu và kết luận có 3 chức năng cơ bản: (1) Bù đắp về mặt số lượng tế
bào biểu mô giác mạc; (2) Biệt hóa thành tế bào biểu mô giác mạc với chức

năng và cấ
u trúc của tế bào biểu mô trưởng thành; (3) Ngăn chặn không cho
biểu mô kết mạc xâm lấn lên bề mặt giác mạc.
Tóm lại BMVR có chứa tế bào gốc của biểu mô giác mạc đã được
nhiều công trình khoa học chứng minh. Những tế bào đó đóng vai trò rất
quan trọng trong quá trình tái tạo sinh lý và trong quá trình tái tạo hồi phục
sau tổn thương biểu mô giác mạc.
1.1.4. Các yếu tố liên quan đảm bảo sự toàn vẹn của BMNC [36]
1.1.4.1. Mi m
ắt
Mi mắt có tác dụng bảo vệ BMNC khỏi các sang chấn về mặt cơ học
từ môi trường bên ngoài. Quan trọng hơn nữa cấu trúc mềm mại của bờ tự do
mi mắt giúp cho sự dàn trải của phim nước mắt trên BMNC giúp cho BMNC
luôn nhẵn bóng và đủ độ ẩm cần thiết. Bệnh nhân bỏng mắt, bờ tự do của mi
hay bị tổn thương ở nhiều mức độ
khác nhau. Nhẹ nhất có thể mất sự mềm
mại của bờ tự do, nặng hơn có thể có biến dạng toàn bộ bờ mi gây nên hở mi,
trễ mi. Do đó, ảnh hưởng đến sự bền vững của phim nước mắt và gây ảnh
hưởng đến sự toàn vẹn của BMNC.
1.1.4.2. Màng phim nước mắt.
Sự toàn vẹn của bề mặt nhãn cầu cũng được đảm bảo b
ởi mối quan hệ
mật thiết giữa biểu mô bề mặt nhãn cầu và màng phim nước mắt. Các rối
loạn bề mặt nhãn cầu làm màng phim nước mắt kém bền vững và ngược lại,
màng phim nước mắt kém bền vững sẽ góp phần làm các rối loạn bề mặt
nhãn cầu nặng hơn. Những tế bào hình đài thuộc bề mặt nhãn cầu tiết ra
mucin, là thành phần quan trọng của màng phim nước m
ắt. Hai đặc tính cơ

9

bản của biểu mô bề mặt nhãn cầu là biểu mô không sừng hoá và tiết mucin,
đóng vai trò quan trọng để đảm bảo sự bền vững của màng phim nước mắt.
Mặt khác, bề mặt nhãn cầu được hỗ trợ bởi các thành phần có trong nước
mắt như vitamin A, yếu tố phát triển biểu bì (Epidermal Growth Factor-
EGF), các yếu tố phát triển chuyển dạng ß1, ß2 (Transforming Growth
Factor-TGF- ß1, ß2), yếu tố phát triển nguyên bào sợi (basic Fibroblast
Growth Factor-FGFb).
1.1.4.3. Các tuyến lệ
Thành ph
ần không kém quan trọng của màng phim nước mắt là nước
mắt cùng các chất điện phân và các loại protein do tuyến lệ chính và tuyến lệ
phụ tiết ra. Nước mắt không những quan trọng về mặt chất lượng mà còn
quan trọng cả về số lượng. Trong các trường hợp bỏng mắt toàn bộ hệ thống
tuyến lệ phụ đều bị tổn hại cùng với biểu mô bề mặt nhãn cầ
u, do đó màng
phim nước mắt bị phá huỷ hoàn toàn, gây tình trạng khô mắt nặng nề.
1.1.4.4. Sự toàn vẹn của hai cung phản xạ điều tiết nước mắt
Sự khởi phát hai cung phản xạ điều tiết nước mắt đều bắt nguồn từ
những cảm giác của bề mặt nhãn cầu, gây ảnh hưởng tới quá trình điều tiết
nước mắt và chớp mi mắ
t. Trên những mắt bị bỏng, toàn bộ bề mặt nhãn cầu
bị tổn thương kèm theo các nhánh thần kinh cảm giác cho bề mặt nhãn cầu
cũng bị tổn thương. Do vậy, tình trạng khô mắt ngày càng nặng nề hơn do
giảm sút trầm trọng về số lượng cũng như chất lượng nước mắt và tần số
chớp mắt.
1.1.4.5. Chức năng của tế bào biểu mô BMNC đượ
c hỗ trợ bởi nguyên
bào sợi nhu mô và chất cơ bản.

Sự trong suốt của giác mạc phụ thuộc vào sự sắp xếp của các sợi
collagen và sự đồng nhất về kích thước sợi cũng như khoảng cách giữa các
sợi. Trong quá trình hàn gắn biểu mô giác mạc, chất căn bản ngoại bào có
chứa các thành phần như Fibronectin, enzym protease, các yếu tố phát triển

10


có vai trò quyết định trong sự kết dính và di chuyển trên bề mặt chân bì giác
mạc của các tế bào biểu mô.
1.2. Màng ối và các phương pháp xử lý màng ối làm nền nuôi cấy
1.2.1. Màng ối
Màng bọc thai gồm 3 màng liên kết với nhau: màng ối, màng đệm,
màng rụng. Màng ối là lớp trong cùng tiếp giáp với buồng ối và có độ dày
khác nhau tuỳ theo vị trí.
Màng ối gồm: Biểu mô, màng đáy và tiếp đến là tổ chức liên kết
mỏng, không có mạch máu (Hình 1.3) [19].


Hình 1.3. Cấu tạo màng rau thai người.
1. Biểu mô; 2. Màng đáy; 3. Lớp đặc;
4. Màng đệm nhẵn; 5. Màng rụng tử cung

Màng ối có nhiều đặc điểm vượt trội hơn so với các màng sinh học
khác là: tính chun giãn, tính trong suốt, mềm mại, nhẵn bóng, mỏng, khó
rách.
Theo nghiên cứu của tác giả Fukuda K. và cộng sự (1999), màng đáy
của màng ối hoàn toàn giống với màng đáy của kết mạc vì có chứa collagen
typ IV, V, fibronectin, laminin-1, laminin-5, vì thế màng ối được sử dụng để
thay thế kết mạc [12]. Các thành phần này đóng vai trò quan trọng trong sự

biệt hoá và sự tăng sinh c
ủa các tế bào biểu mô.
1
2
3
4
5
}Màng ối

11


Mặt khác, hiệu quả chống viêm và bảo vệ bề mặt nhãn cầu của màng
ối được giải thích qua sự có mặt nhiều loại cytokin chống viêm như
interleukin-1α interleukin-1β.
Màng ối có chức năng của một biểu mô phủ, là biểu mô chế tiết và có
khả năng trao đổi chất qua đường tế bào và gian tế bào.
Tế bào biểu mô màng ối có một số tính chất quan trọng là: Không biểu
lộ kháng nguyên HLA-A, B hoặ
c DR của β2 microglobulin trên bề mặt. Vì
vậy sau khi ghép vào cơ thể, hiện tượng thải loại miễn dịch không xảy ra.
Qua nhiều nghiên cứu lâm sàng cho thấy màng ối có 2 tác dụng khi
cấy ghép trên kết mạc, đó là tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình biểu mô
hoá và ngăn chặn quá trình viêm, tăng sinh xơ trên bề mặt nhãn cầu. Bên
cạnh đó, màng ối cung cấp màng cơ bản hỗ trợ sự di cư, kế
t dính của tế bào
biểu mô, thúc đẩy sự biệt hoá tế bào, có khả năng thay thế màng cơ bản của
kết mạc [20], [30], [33].
Màng ối còn có khả năng kháng khuẩn nên nguy cơ nhiễm trùng hậu
phẫu ít hơn so với ghép các màng sinh học khác như niêm mạc má, niêm

mạc miệng. Việc bóc tách màng ối ra khỏi màng đệm rất dễ dàng, cùng với
tính chun giãn tốt của màng ối tạo điều kiện cho các thao tác dàn trải trong
quá trình phẫu thuậ
t được dễ dàng.
Màng ối là một nguyên liệu sẵn có, dễ lấy, dễ xử lý. Màng ối được bảo
quản ở nhiệt độ - 80
O
C có thể để được nhiều tháng [11], [26], [32].
Như vậy, màng ối là một màng sinh học có nhiều ưu điểm vượt trội,
được sử dụng để che phủ trên bề mặt nhãn cầu đạt hiệu quả cao. Màng ối là
một chất nền lí tưởng để nuôi cấy tế bào gốc biểu mô giác mạc trên thực
nghiệm [30].

12


1.2.2. Chuẩn bị màng ối làm nền nuôi cấy.
Màng ối được sử dụng làm nền sinh học (giá đỡ sinh học) trong nuôi
cấy tế bào BMVR. Do tính chất của màng ối gần giống màng đáy của biểu
mô giác mạc nên tế bào biểu mô giác mạc có khả năng bám dính, phát triển,
tăng sinh và di cư trên nền màng ối. Mặt khác, khi tấm biểu mô đã phát triển
trên màng ối thì dễ dàng được thu hoạch để cấy ghép.
Chuẩn bị màng
ối cho nuôi cấy là một bước quan trọng, hầu hết các
tác giả đều chuẩn bị và bảo quản màng ối người theo phương pháp mà Lee S.
H., Tseng S. C. G., Prabhasawat P. và cộng sự mô tả:
- Màng rau được thu nhận có chọn lọc từ những ca mổ lấy thai có
kiểm soát, không mắc HIV, viêm gan và giang mai.
- Làm sạch máu và rửa bằng PBS (Phosphate-Buffered Salin) có pha
kháng sinh, kháng nấm .

- Tách màng ối ra khỏi màng đệm và trải tấm nitrocellulose có kích
thước 4 x 4 cm lên mặt tổ chức đệm của màng ối, lúc này màng ối dính ch
ặt
vào mảnh giấy với mặt biểu mô quay lên trên.
- Mảnh giấy mang mảnh màng ối được cuộn cho mặt biểu mô quay ra
ngoài và được bảo quản bằng hỗn hợp glycerol và môi trường DMEM với tỉ
lệ 1:1 ở - 80
o
C có thể sử dụng trong một năm.
- Ngay trước khi sử dụng, màng ối được làm tan băng (rã đông), rửa 3
lần với PBS vô trùng [15], [26], [44].
Có 2 cách xử lý màng ối hiện đang được các tác giả áp dụng là để
nguyên biểu mô màng ối và loại bỏ biểu mô. Để loại bỏ biểu mô các tác giả
sử dụng enzym nhưng có sự khác nhau giữa các tác giả về nồng độ enzym và
thời gian ủ:
Theo Koizumi N. và cộng sự, loạ
i bỏ tế bào biểu mô bằng cách ủ với
EDTA 0,02% thời gian là 2h trong tủ ấm 37
0
C sau đó dùng nạo biểu mô nạo
nhẹ nhàng, cuối cùng mảnh màng ối được làm sạch 2 lần nữa với PBS vô
trùng [23]. Nhưng Sun C. C thì ủ với EDTA 0,1% trong 30 phút [40].

13


Theo Song E. và cộng sự thì loại bỏ tế bào biểu mô màng ối bằng cách
ủ với 0,25% trypsin- 0,02% EDTA ở 37
o
C trong 2h để làm mất sự kết dính

của tế bào; sau đó dùng nạo biểu mô nạo nhẹ nhàng rồi rửa sạch bằng PBS
vô trùng [39]. Cũng với nồng độ men này nhưng theo Yiqui Du, Jing Chen
thì chỉ ủ trong 30 phút
. Jun Shimazaki và cộng sự (2002) lại loại bỏ biểu mô
của màng ối bằng cách ngâm tấm màng ối vào ammonium 10%, và nạo bỏ
biểu mô một cách nhẹ nhàng [18]
Koizumi N. và cộng sự (2000) đã nghiên cứu so sánh sự phát triển của
tế bào biểu mô VRGM nuôi cấy trên màng ối để nguyên và loại bỏ biểu mô,
tác giả thấy tế bào biểu mô phát triển trên màng ối đã loại bỏ biểu mô nhanh
hơn, tế bào tầng hoá tốt hơn so với màng
ối còn biểu mô, khoảng gian bào
giữa các tế bào hẹp hơn, giữa các tế bào có nhiều thể liên kết hơn. Sự khác
biệt này có ý nghĩa thống kê với p < 0,001) [23]. Nhưng Fukuda K. (1999)
thì cho rằng biểu mô màng ối có chứa những yếu tố tăng trưởng, yếu tố phát
triển biểu bì EGF, yếu tố phát triển giác mạc bào KGF, yếu tố phát triển thần
kinh NGF. Chính những yếu tố này sẽ giúp TBBM phát triển và phân chia
[13].
Về vấn
đề rã đông màng ối sau bảo quản lạnh hiện cũng có sự khác
nhau giữa các tác giả: Theo Lee S. H. và Tseng S. C. G. thì màng ối sau bảo
quản lạnh sẽ được để trong tủ nuôi cấy 37
o
C, 5% CO
2
qua đêm trước khi sử
dụng [26], [43], [47]. Đa số các tác giả khác chỉ để ở nhiệt độ phòng trước
khi sử dụng từ 15- 30 phút [15], [21], [44].
Nhiều tác giả đã nghiên cứu xem có sự khác nhau giữa việc sử dụng
màng ối tươi và sử dụng màng ối bảo quản? Theo Sato H. và cộng sự (1998)
thì các yếu tố tăng trưởng tồn tại trên màng ối bảo quản giảm 50% so với

màng ối tươi. Tác gi
ả cho rằng sử dụng màng ối tươi tốt hơn sử dụng màng
ối bảo quản vì các yếu tố sinh học sẽ phát huy tác dụng trong quá trình hàn
gắn biểu mô bề mặt nhãn cầu. Mặc dù vậy nhưng màng ối bảo quản hiện nay

14


c s dng ph bin vỡ tớnh tin li, trc khi nuụi cy hay phu thut
khụng mt nhiu thi gian chun b [35].
Nh vy, vn cha cú s
thng nht gia cỏc tỏc gi v vn chun
b mng i phc v nuụi cy : nguyờn hay loi b biu mụ
1.3. Nuụi to tm biu mụ giỏc mc t t bo gc vựng rỡa giỏc mc.
Trong nhng nm gn õy, cụng ngh nuụi cy t bo gc iu tr
cỏc bnh nan y ang rt phỏt trin. Nuụi cy t bo gc VRGM to thnh
tm bi
u mụ giỏc mc ri ghộp iu tr cỏc tn thng BMNC cng ó c
nhiu tỏc gi tin hnh thnh cụng trờn thc nghim v trờn ngi.(5,12,19)
1.3.1. Chun b mu mụ vựng rỡa nuụi cy.
Mu mụ vựng rỡa c ly trờn mt lnh, vựng rỡa cũn lnh trờn mt
tn thng hoc vựng rỡa t ngi hin giỏc mc. Kớch thc ca mnh biu
mụ vựng rỡa khỏc nhau dao ng t 1 mm n 6 mm, chiu rng ca mu
mụ vựng rỡa khong 1 2 mm v phớa kt m
c v khong 1 mm v phớa giỏc
mc. V trớ ly mu mụ vựng rỡa thng vựng rỡa phớa trờn, ni hng ro
Vogt c nhỡn thy. Mảnh mô vùng rìa sau khi đợc lấy khỏi mắt sẽ đợc
làm sạch 2 lần với PBS có chứa kháng sinh, kháng nấm (dung dịch để rửa
màng ối) v c loại bỏ củng mạc, mống mắt, nội mô giác mạc, màng tiếp
hợp và bao tenon. Phần mô còn lại đợc x lý nuụi cy.Vic x lý mnh

vựng rỡa nuụi cy khỏc nhau trong nghiờn cu ca cỏc tỏc gi. Liu S. và
cộng sự (2006) đã xử lý mảnh bằng dispase II (1,2 UI/ml trong dung dịch
muối đẳng trơng của Hank không có Mg
2+
và Ca
2+
) ở 37
o
, 5% CO
2

trong 10 phút [28]. Nakamura.T và cộng sự (2004) lại xử lý mảnh mô vựng
rỡa bằng 0,25% trypsin và 0,02% EDTA trong 5 phút [ 32]. Nng ca
dispase hoc trypsin cú th khỏc nhau trong cỏc nghiờn cu. Mt s tỏc gi
ỏp dng nuụi cy bng dch treo TBBMVR: Cỏc t bo biu mụ vựng rỡa
c tỏch riờng r thnh dng dch treo; sau ú c nuụi cy trờn nn mng
i [21], [28] .

15


1.3.2. Môi trường nuôi cấy
Môi trường thông dụng nhất sử dụng cho nuôi cấy tế bào gốc là môi
trường Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) có nồng độ glucose
cao. DMEM là môi trường nuôi cấy đệm bicarbonate được thiết kế để duy trì
pH từ 7,2 đến 7,4 với nồng độ CO
2
là 5% và 95% không khí. Do vậy, điều
khiển nồng độ CO
2

trong tủ ấm để đảm bảo nồng độ CO
2
bình thường xung
quanh tế bào và độ pH chính xác cho tế bào là một điều rất quan trọng. Môi
trường nuôi cấy cũng có thời hạn sử dụng nhất định, đặc biệt khi chúng đã
được bổ sung thêm huyết thanh hoặc L- glutamin. Điều kiện bảo quản môi
trường thích hợp nhất là trong tối ở 4
o
C. Huyết thanh bổ sung vào môi
trường nuôi cấy thường được dùng là huyết thanh bào thai bê (Fetal Bovine
Serum- FBS) hoặc huyết thanh bò (Bovine Serum - BS). [7].
FBS được nhiều tác giả sử dụng để bổ sung vào môi trường nuôi cấy
tế bào gốc. FBS đóng vai trò cung cấp năng lượng cho tế bào nuôi cấy và
cung cấp các yếu tố kích thích tăng sinh như yêú tố kích thích sinh trưởng
tiểu cầu (PDGF), yếu tố tế bào gốc (stem cell factor). Bên cạnh đó FBS còn
làm tăng độ nhớt trong môi trường và duy trì một áp suấ
t thẩm thấu thích
hợp cho các tế bào được nuôi cấy . Tuy nhiên giá thành của FBS rất cao.
BS là loại huyết thanh cũng thường được dùng để bổ sung vào môi
trường nuôi cấy. Vai trò của BS cũng tương tự như FBS. Một số tác giả cho
rằng hiệu quả nuôi cấy tế bào trong môi trường DMEM có bổ sung BS tương
tự như trong môi trường DMEM có bổ sung FBS.
Ngoài FBS và BS, để nuôi cấy tế bào vùng rìa giác mạc, các tác giả
còn bổ xung thêm một số thành phần: dimethyl sulfoxide, y
ếu tố tăng trưởng
biểu mô (Epithelial Growth Factor - EGF), insulin, hydrocortison,
choleratoxin, tranferrin, kháng sinh, kháng nấm. Nồng độ của các yếu tố bổ
xung khác nhau tuỳ từng tác giả.

16

1.3.3. Nuôi tạo tấm biểu mô giác mạc từ tế bào gốc VRGM
Có hai phương pháp đang được sử dụng để nuôi cấy tế bào gốc vùng
rìa giác mạc: Tạo tấm tế bào biểu mô giác mạc từ mảnh vùng rìa và tạo tấm
biểu mô giác mạc từ dịch treo các tế bào biểu mô vùng rìa. Năm 2007, Alex
J. và cộng sự đã tổng kết 17 báo cáo nuôi và ghép vùng rìa cho bệnh nhân,
thấy có tới 11 báo cáo đã dùng phương pháp thứ nhất [6] . Mảnh tổ ch
ức lấy
từ vùng rìa đặt lên trên mặt màng đáy của màng ối, và được ngâm trong dung
dịch nuôi cấy. Dung dịch bao gồm chất dinh dưỡng và các chất kích thích
tăng sinh và di chuyển của tế bào biểu mô vùng rìa trên bề mặt của màng ối,
quá trình này diễn ra trong khoảng từ 14 đến 28 ngày. Kỹ thuật “air lifting”
được một số tác giả sử dụng nhằm tạo điều kiện cho cho lớp tế bào nuôi cấy
tiếp xúc với không khí và kích thích sự t
ăng sinh và biệt hóa tế bào biểu mô
thành nhiều lớp. Một số tác giả khác cũng sử dụng thêm một lớp ở dưới đáy
của hệ thông nuôi cấy trên, lớp này có 3T3 fibroblasts. 3T3 fibroblasts là các
tế bào được tách ra từ bào thai của chuột, chúng có khả năng tăng sinh mạnh,
có vai trò thúc đẩy sự phát triển và di cư tế bào biểu mô nuôi cấy, đặc biệt
cho tổ chức da và giác mạc. Phương pháp tạo tấm biểu mô giác mạc từ
dịch
treo các tế bào biểu mô vùng rìa được sử dụng trong 6 nghiên cứu. Từ mảnh
mô vùng rìa giác mạc , dùng enzym tách lấy các tế bào biểu mô, dịch treo
gồm các tế bào biểu mô vùng rìa riêng lẻ hoặc thành từng đám tế bào và
nuôi cấy trên các chất liệu khác nhau như kính tiếp xúc, mảnh collagen hay
paraffin, hoặc tấm fibrin hoặc màng ối. Quá trình nuôi cấy cũng mất khoảng
từ 14 đến 21 ngày. Năm 2000, Koizumi N. và cộng sự đã công bố kết quả
nghiên cứu nuôi cấ
y tế bào biểu mô VRGM trên màng ối để nguyên biểu mô

và màng ối loại bỏ biểu mô. Kết quả sau 14 ngày nuôi cấy cho thấy các tế
bào biểu mô phân chia, phát triển và tăng nhanh về số lượng. Các tế bào
BMGM phát triển lên bề mặt biểu mô của màng ối. Sau 28 ngày nuôi cấy thì
các tế bào biểu mô đã phát triển tầng hoá [23].