PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG B2 – AGONIST (CLENBUTEROL VÀ SALBUTAMOL) TRONG THỊT HEO
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (490.79 KB, 24 trang )
Phân tích hàm lượng β – Agonist
(Clebuterol & salbutamol) trong thịt heo
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
*****
Tên đề tài:
PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG B2 – AGONIST
(CLENBUTEROL VÀ SALBUTAMOL) TRONG THỊT HEO
Nhóm thực hiện:
1.
2.
3.
4.
Chung Hữu Nghĩa
Đặng Kỳ Duyên
Phù Thùy Dương
Nguyễn Thị Mỹ Duyên
15139079
15139027
15139025
15139028
GVHD: Phùng Võ Cẩm Hồng
Thành phố Hồ Chí Minh 2017
Phân tích hàm lượng β – Agonist
(Clebuterol & salbutamol) trong thịt heo
A. MỞ ĐẦU:
1. Lí do chọn đề tài:
Trong lĩnh vực dược phẩm, β-agonist là nhóm chất được sử dụng nhiều trong
điều trị bệnh hen suyễn, hai chất điển hình là salbutamol và clenbuterol . Salbutamol
được dùng cho người với tên biệt dược là albuterol, salbutamol… Clenbuterol được dùng
với tên biệt dược là broncodil, clenburol, ventolax, protovent.
(Theo tài liệu trên trang web />Trong chăn nuôi, các dược liệu này đã có lúc được đưa vào trong thức ăn gia súc
nhằm làm giảm lớp mỡ dưới da, tăng cơ, tăng trọng đối với thú vật nuôi. Theo nhiều
nghiên cứu, các loại dược liệu này gây hại cho gia súc và cả cho người nếu ăn phải thịt
thú vật nuôi bằng loại thức ăn có trộn các loại dược liệu trên, vì các hóa chất thuộc nhóm
β-agonist thường là những chất kích thích mạnh, làm suy nhược chức năng gan.
Tại Châu Âu và Châu Mỹ, những loại hóa chất trên bị cấm sử dụng. Ở Việt Nam,
các loại dược liệu thuộc nhóm β-agonist trong đó có clenbuterol và salbutamol được xếp
vào danh mục 18 hóa chất bị cấm của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn
(Quyết định số 54 ngày 20 tháng 06 năm 2002 của Bộ NN & PTNT). Tuy nhiên, các chất
này vẫn còn bị một bộ phận người dân lén sử dụng trong chăn nuôi và việc kiểm tra sự
hiện diện của chúng trong thức ăn gia súc, gia cầm vào những năm 2005-2008 phần lớn
chỉ dừng lại ở mức độ định tính và định lượng bằng ELISA với độ chính xác chưa cao.
Việc định lượng chính xác dư lượng của các β-agonist trong thức ăn chăn nuôi là vấn đề
cần được quan tâm trong công tác kiểm tra chất lượng sản phẩm. Đồng thời, việc xác
định tồn dư β-agonist trong thịt một số gia súc là rất cần thiết về mặt quản lý để đánh giá
tình hình mức độ sử dụng các chất này trong thức ăn chăn nuôi và đưa ra những cảnh báo
về vệ sinh an toàn thực phẩm nếu có.
Xuất phát từ tình hình thực tế, trên cơ sở khoa học của các công trình nghiên cứu
về Salbutamol (Sal) và Clenbuterol (Clen) được công bố trong và ngoài nước, chúng
tôi đã thực hiện đề tài “ Đánh giá hàm lượng các chất β-agonists (clenbuterol và
salbutamol) trong thức ăn gia súc và dư lượng trong thịt gia súc bằng kỹ thuật sắc ký lỏng
ghép khối phổ”. Nghiên cứu này sẽ góp phần vào việc bảo đảm vệ sinh an toàn thực
phẩm và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.
2
Phân tích hàm lượng β – Agonist
(Clebuterol & salbutamol) trong thịt heo
2. Mục đích nghiên cứu:
Đề tài này được thực hiện với mong muốn:
• Xây dựng được phương pháp phân tích dư lượng clen và sal trong thức ăn chăn nuôi, thịt
gia súc, gia cầm bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ đạt độ nhạy và độ chọn lọc cao,
đáp ứng được nhu cầu phân tích của các đơn vị kiểm nghiệm trong nước.
• Theo dõi mức độ tồn lưu của Clen và Sal trong thực phẩm gà, heo khi nuôi gà, heo với
thức ăn có chứa Clen và Sal.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
a. Mẫu thịt heo nuôi thử nghiệm với thức ăn có chứa nồng độ nhất định Clen và Sal
để kiểm tra khả năng tồn lưu của hai chất nầy.
b. Mẫu thịt dùng cho điều tra được lấy từ các chợ đầu mối trên địa bàn Tp Hồ Chí
Minh, là nơi phân bố nguồn thịt chủ yếu đi khắp các quận trên thành phố.
c. Thiết bị phân tích
• Máy sắc ký lỏng ghép khối phổ ba tứ cực LC/MS/MS TSQ Quantum Access của Thermo
Scientific (Công ty dịch vụ KHCN Sắc ký Hải Đăng – Thành phố Hồ Chí Minh).
• Máy sắc ký lỏng ghép khối phổ 1 tứ cực LC/MS 2010A của Shimadzu (Công ty dịch vụ
KHCN Sắc ký Hải Đăng – Thành phố Hồ Chí Minh).
4. Phương pháp nghiên cứu:
• Xây dựng phương pháp chuẩn bị mẫu để tách chiết và làm giàu chất phân tích
(Clenbuterol và Salbutamol) trước khi đưa vào máy sắc ký lỏng ghép khối phổ.
• Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ ba tứ cực để xác định khả năng
tồn dư Clen và Sal trong thịt heo.
3
Phân tích hàm lượng β – Agonist
(Clebuterol & salbutamol) trong thịt heo
B. Nội dung:
1. Tổng quan về Clenbuterol và Salbutamol:
1.1 Khái quát về họ β_agonist:
-Trong lĩnh vực dược phẩm, β_agonist là nhóm chất được sử dụng nhiều trong điều trị
bệnh hen suyễn, hai chất điển hình là Clenbuterol và Salbutamol
- Trong chăn nuôi, các dược liệu này đã có lúc được đưa vào trong thức ăn gia súc nhằm
giảm lớp mỡ dưới da, tăng cơ, tăng trọng đối với thú vật nuôi. Theo nhiều nghiên cứu,
các loại dược liệu này gây hại cho gia súc và cả cho người nếu ăn phải thịt thú vật nuôi
bằng loại thức ăn có trộn các loại dược liệu trên, vì các hoá chất thuộc nhóm β_agonist
thường là những chất kích thích mạnh, làm suy nhược chức năng gan.
Tại Châu Âu và Châu Mỹ, những loại hoá chất trên bị cấm sử dụng. Ở Việt Nam, các loại
dược liệu thuộc nhóm β_agonist trong đó có Clenbuterol và Salbutamol được xếp vào danh
mục 18 hoá chất bị cấm của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn. (Quyết định số 54
ngày 20 tháng 06 năm 2002 của Bộ NN&PTNT)
4
Phân tích hàm lượng β – Agonist
(Clebuterol & salbutamol) trong thịt heo
5
Phân tích hàm lượng β – Agonist
(Clebuterol & salbutamol) trong thịt heo
1.2 Giới thiệu về Clenbuterol và Salbutamol:
Hình 1: Clenbutmol
Hình 2: Salbutamol
6
Phân tích hàm lượng β – Agonist
(Clebuterol & salbutamol) trong thịt heo
Clenbuterol:
-Công thức phân tử : C12H8Cl2ON2
- Khối lượng phân tử: 276.0796 ( đvC)
- Công thức cấu tạo:
1.2.1
-Tên gọi: 2-(tert-butylamino)-1-(4-amino-3,5-diclophenyl) ethanol
- Tên thương mại: vetipulmin
- Hình dạng: tinh thể không màu, mịn.
- Nhiệt độ nóng chảy (℃): 174-175.5
- Nhiệt độ sôi (℃): 404.9
- pKa: 9.29
- Độ tan: tan nhiều trong nước, aceton, methanol; ít tan trong clorofom; không tan trong
benzen.
** Trong y học, Clenbuterol có tác dụng làm giãn phế quản, giãn cơ trơn ở cuống phổi,
Clenbuterol còn là dược phẩm được chỉ định để điều trị các chứng bệnh có liên quan
đến phổi như hen, suyễn, tuy nhiên có thể hại đến hệ thần kinh và tuần hoàn của con
người.
** Trong thú y,Clenbuterol được sử dụng để điều trị các căn bệnh dị ứng đường hô hấp ở
ngựa (tên thương mại là ventipulmin), điều trị bệnh đường hô hấp ở trâu bò,…Thuốc có
thể thải qua đường tiểu và qua phân nhưng với thời gian rất dài.
7
Phân tích hàm lượng β – Agonist
(Clebuterol & salbutamol) trong thịt heo
-
1.2.2 Salbutamol:
Công thức phân tử : C13H21O3N
Khối lượng phân tử: 239,152 (đvC)
Công thức cấu tạo:
-
Tên gọi: 2-(tert-butylamino)-1-(3-hydroxyethyl-2-hydroxyphenyl) ethanol.
Tên thương mại: Ventolin
Hình dạng: tinh thể màu trắng, mịn.
Nhiệt độ nóng chảy (℃): 157-158
Nhiệt độ sôi (℃): 433.5
pKa: 9.27
Độ tan: tan nhiều trong nước, aceton và ethanol; ít tan trong eter.
** Salbutanol được ứng dụng trong y học được dùng để điều trị bệnh hen suyễn rất hiệu
nghiệm. Thuốc điều trị hen suyễn có chứa Salbutanol có nhiều trên thị trường trong nước
cũng như trên thế giới.
** Tác dụng của Clenbuterol và Salbutamol lên động vật nuôi và người: Clenbuterol và
Salbutamol tích luỹ trong thực phẩm thịt sẽ làm ảnh hưởng đến sức khoẻ người tiêu dùng
thông qua dây chuyền thực phẩm, gây ra các triệu chứng rối loạn nhịp tim, tim đập nhanh,
tăng huyết áp, co thắt phế quản, phù nề, run cơ, liệt cơ, choáng váng,…
8
Phân tích hàm lượng β – Agonist
(Clebuterol & salbutamol) trong thịt heo
1.3 Những dấu hiệu nhận biết thịt gia súc, gia cầm có chứa Clenbuterol hoặc Salbutamol :
Với loại lợn siêu nạc tốt nhất ở nước ta hiện nay, người ta phải mất 5 tháng mới đạt được
trọng lượng 95-100 kg/con nhưng cho thêm 1 thìa cà phê salbutamol vào thức ăn (cho 10
con lợn loại 78-80kg/con), thời gian xuất chuồng rút ngắn chỉ còn 3 tháng.
Người sử dụng chất tạo nạc này chỉ cho lợn ăn không quá nửa tháng trước khi xuất
chuồng. nếu nuôi quá nửa tháng lợn sẽ tự khuỵu chân,vì hóa chất này làm xương giòn.
Khắp người con lợn sẽ bắt đầu xuất hiện những vết lở rỉ nước.
** Cách nhận biết thịt nào có chất tạo nạc hay thịt bình thường:
Theo ông Nguyễn Xuân Dương, Phó cục trưởng Cục Chăn nuôi (Bộ NN&PTNT): “
Nếu nhìn bằng mắt thường thì rất khó phân biệt thịt lợn được nuôi bằng thức ăn tạo nạc
và thịt nạc bình thường. Để biết thịt lợn nào bị nhiễm chất tạo nạc thì phải lấy mẫu thịt
để kiểm tra, phân tích mới có thể đưa ra kết luận chắc chắn. Tuy nhiên, người dân nên
tránh những loại thịt lợn phần nạc có màu đỏ giống thịt bò”.
9
Phân tích hàm lượng β – Agonist
(Clebuterol & salbutamol) trong thịt heo
Sau đây là 4 đặc điểm nhận biết thịt siêu nạc có hóa chất theo các chuyên gia
Cục Chăn nuôi:
1. Xem lớp mỡ bên dưới da miếng thịt, nếu lớp mỡ mỏng và lỏng lẻo nên tránh. Thông
thường lợn siêu nạc được ăn hóa chất nên lớp mỡ mỏng hẳn đi, có khi chỉ dày đến 1
cm (thông thường khoảng 0,4 cm), trong khi lớp mỡ của thịt lợn bình thường
khoảng 1,5-2 cm.
2. Nhìn màu sắc: Thịt lợn chứa các chất độc Ractophamine và Clenbuterol thường có
màu đỏ tươi khác thường, sáng và bóng.
3. Thái miếng thịt ra dày bằng 2-3 ngón tay, nếu thấy thịt mềm, không đứng thẳng
được trên bàn thì rất có thể thịt đã nhiễm chất tăng trọng.
4. Quan sát xem chỗ liên kết giữa phần nạc và mỡ, nếu thấy tách rời rõ rệt, đồng thời
có nước dịch màu vàng rỉ ra, chắc chắn đó là thịt siêu nạc.
Người tiêu dùng hãy luôn sáng suốt và thông minh để lựa chọn thịt tươi ngon, chất lượng
để gia đình luôn có những bữa ăn đảm bảo sức khỏe và dinh dưỡng.
10
Phân tích hàm lượng β – Agonist
(Clebuterol & salbutamol) trong thịt heo
2. Các phương pháp phân tích dư lượng salbutamol và clenbutarol trong thịt heo:
2.1 Phương pháp sắc kí khí ghép khối phổ GC/MS:
2.1.1 Giới thiệu chung:
Kết hợp kỹ thuật sắc ký khí và đầu dò khối phổ cho kỹ thuật sắc ký khí khối phổ, với cấu tạo
gọn nhẹ và giảm thời gian phân tích đi rất nhiều. Với loại thiết bị kết hợp này có thể cho khả
năng phân tích trong rất nhiều ứng dụng. Mặc dù không được dùng nhiều như LC/MS nhưng
GC/MS là công cụ hữu hiệu để xác định các hợp chất chưa biết, cho độ phân giải cao và nhiều
dữ liệu về điện tử và hóa học của hợp chất. Ứng dụng nhiều trong pháp y, xét nghiệm, dược
phẩm, hóa dầu, môi trường, phân tích sinh học…
2.1.2. Nguyên tắc hệ thống GC/MS:
GC/MS là kỹ thuật phân tích có độ chọn lọc cao để xác định các chất nhờ vào quá trình đo khối
lượng. Giống như trong sắc ký lỏng LC, sắc ký khí GC cũng gồm một pha động là pha khí, còn
trong sắc ký lỏng pha động là pha lỏng.
Lưu ý trong GC/MS là quá trình chuẩn bị mẫu và lựa chọn dung môi vì mẫu bị bẩn hoặc phân
hủy sẽ làm sai lệch độ nhạy của khối phổ rất nhiều. Các kỹ thuật chuẩn bị mẫu thường
dùng: Chiết pha rắn (SPE), chiết lỏng – lỏng (LLE), vi chiết pha rắn (SPME).
2.1.3. Quy trình định tính và định lượng β- agonists (salbutamol và clenbuterol):
Hầu hết các phương pháp phân tích sắc ký dùng phát hiện và định lượng salbutamol và
clenbuterol đều trãi qua ba giai đoạn như sau :
• Chiết chất phân tích ra khỏi nền mẫu (mẫu nguyên liệu)
• Làm sạch mẫu, loại tạp chất ra khỏi dịch chiết và làm giàu chất phân tích
• Sử dụng các phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ để định lượng chất phân tích.
2.1.4. Thiết bị , hóa chất và dung dịch thử:
2.1.4.1 Thiết bị:
Hệ thống máy LC-MS/MS Thermo Finnigan gồm:
• Hệ thống máy sắc ký lỏng: Bơm và hệ thống tiêm mẫu tự động
• Đầu dò khối phổ ba tứ cực TSQ Quantum Access với hai loại nguồn ion hóa ESI và
APCI
• Cột sắc ký lỏng pha đảo Purospher Star C18, 150 mm x 4,6 mm, kích cỡ hạt 5 µm, cột
bảo vệ pha đão C18 (hãng Merck)
• Phần mềm Xcalibur, điều khiển thiết bị và xử lý dữ liệu sắc ký
11
Phân tích hàm lượng β – Agonist
(Clebuterol & salbutamol) trong thịt heo
2.1.4.2 Hóa chất và dung dịch thử:
Nước cất 2 lần khử ion, CH3OH loại HPLC; H3PO4, p.a (pure analysis); HCOOH loại HPLC và
K2HPO4, p.a (pure analysis); Dung dịch thử K2HPO4 0,1M
Dung dịch pha động: MeOH (0,1% HCOOH) và H2O (0,1% HCOOH) (v/v)
2.1.5 Chất chuẩn và nội chuẩn:
Clenbuterol hydrochloride, Dr. Ehrenstorfer, 95% (C12H18Cl2ON2,HCl)
Clenbuterol–d9 (100 mg/L), Dr. Ehrenstorfer (C12H 9D9 Cl2ON2).
Salbutamol sulfate, Dr. Ehrenstorfer, 99 % (C13H22O3N, ½ H2SO4
Salbutamol–d3 (100 mg/L), Dr. Ehrenstorfer (C13H19D3O3N).
2.2 Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ đầu dò 3 tứ cực:
3. Xác định dư lượng β2-Agonist trong thịt heo bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khối
phổ (LC/MS/MS):
3.1 Phạm vi áp dụng:
Xác định dư lượng nhóm β2 Agonist gồm các chất Clenbuterol, Salbutamol và
Ractopamine trong thịt bò, thịt heo bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ.
Giới hạn định lượng của phương pháp cho mỗi chất là Clenbuterol 0,2 µg/kg, Salbutamol 5
µg/kg và Ractopamin.HCl là 10 µg /kg.
3.2 Nguyên tắc:
Dư lượng Clenbuterol, Salbutamol và Ractopamine tự do trong thịt heo được chiết ra từ
mẫu bằng hỗn hợp Axetonitrile và isopropanol. Sử dụng các muối natri clorit, natri
sunphat và magiê sunphate để tủa protein và loại nước có trong dịch chiết mẫu. Dịch
chiết được làm bay hơi dung môi đến khô, phần cặn hòa tan bằng dung dịch nước chứa
10% Axetonitril, làm sạch bằng n-hexan và đưa vào phân tích bằng kỹ thuật sắc ký lỏng
ghép hai lần khối phổ (LC-MS-MS) để xác định và định lượng Clenbutarol, Salbutamol và
Ractopamine có trong mẫu.
3.3 Thuốc thử:
Trong tiêu chuẩn này, chỉ sử dụng thuốc thử có cấp độ tinh khiết phân tích và nước cất hai
lần đã khử ion.
3.3.1 Chuẩn Clenbuterol.HCL (CLEN.HCl) , ≥ 98,5 %;
3.3.2 Chuẩn Salbutamol sunphat (SAL.SUL), ≥ 99 %;
3.3.3 Chuẩn Ractopamin.HCL (RAC.HCl), ≥ 98%;
3.3.4 Nội chuẩn Clenbuterol D9 (CLEN D9), > 99 %;
3.3.5 Nội chuẩn Salbutamol D3 (SAL D3), ≥ 98%;
12
Phân tích hàm lượng β – Agonist
(Clebuterol & salbutamol) trong thịt heo
3.3.6 Nội chuẩn Ractopamin.HCL D6 (RAC D6), > 99 %;
3.3.7 Axetonitril (ACN), loại dùng cho LC-MS;
3.3.8 Nước, loại dùng cho LC-MS;
3.3.9 Metanol (MeOH), loại dùng cho LC-MS;
3.3.10 Isopropanol (IPA), loại dùng cho HPLC;
3.3.1 n-Hexan, loại dùng cho phân tích;
3.3.12 Natri clorit (NaCl), loại dùng cho phân tích;
3.3.13 Natri sunphat (Na2SO4), loại dùng cho phân tích;
3.3.14 Magiê sunphat (MgSO4) khan;
3.3.15 Axit formic, độ tinh khiết tối thiểu 99 %;
3.3.16 Khí argon, tinh khiết 99,9%;
3.3.17 Khí nitơ, tinh khiết 99,9%.
3.3.18 Pha chế dung dịch chuẩn và nội chuẩn:
3.3.18.1. Dung dịch chuẩn gốc CLEN, SAL 1000 µg / ml trong metanol
Cân lần lượt 22.98 mg chuẩn CLEN.HCL (3.1) và 24.34 mg chuẩn SAL.SUL (3.2) vào các
bình định mức dung tích 20 ml (4.4). Hoà tan và định mức đến vạch bằng metanol (3.9) để
được dung dịch chuẩn gốc CLEN, SAL có nồng độ 1000 µg/ml. Dung dịch chuẩn gốc được
bảo quản ở -18°C trong 1 năm.
3.3.18.2. Dung dịch chuẩn gốc RAC.HCL 1000 µg / ml trong metanol
Cân 20 mg chuẩn RAC.HCL (3.3.3) vào bình định mức dung tích 20 ml. Hoà tan và định
mức đến vạch bằng metanol (3.3.9) để được dung dịch chuẩn gốc RAC.HCL có nồng độ
1000 µg / ml. Dung dịch chuẩn gốc được bảo quản ở -18°C trong 1 năm.
13
Phân tích hàm lượng β – Agonist
(Clebuterol & salbutamol) trong thịt heo
LƯU Ý:
- Lượng cân của chuẩn CLEN.HCl và SAL.SUL phải được điều chỉnh về dạng
CLEN và SAL (xem phụ lục) vì CLEN và SAL là chất phân tích cần quan tâm. Lượng cân
của chuẩn RAC.HCl không điều chỉnh về dạng RAC vì RAC.HCl là chất phân tích cần
quan tâm.
- Lượng chuẩn của các chất phân tích phải được điều chỉnh hợp lý để đạt nồng độ
các chuẩn gốc 1000 µg / ml sau khi tính toán và hiệu chỉnh theo giấy chứng nhận độ tinh
khiết của nhà sản xuất.
3.3.18.3. Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian CLEN: 2 µg / ml; SAL: 50 µg / ml;
RAC.HCL: 100 µg / ml (S1)
Hút lần lượt 40 µl chuẩn gốc CLEN 1000 µg/ml; 1000 µl chuẩn gốc SAL 1000 µg/ml và
2000 µl chuẩn gốc RAC.HCL 1000 µg/ml cho vào bình định mức 20 ml, định mức đến
vạch bằng metanol . Dung dịch bảo quản ở -18°C trong 6 tháng.
3.3.18.4. Dung dịch chuẩn hỗn hợp CLEN: 20 ng / ml; SAL: 500 ng / ml;
RAC.HCL: 1000 ng / ml (S2)
Hút chính xác 200 µl dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian (S1) cho vào bình định mức 20
ml , định mức đến vạch bằng axetonitril (3.3.7). Dung dịch bảo quản ở -18°C trong 3 tháng.
3.3.18.5. Dung dịch chuẩn hỗn hợp CLEN, SAL: 2 ng / ml; SAL: 50 ng / ml;
RAC.HCL: 100 ng / ml (S3)
Hút chính xác 2 ml dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian (S2) cho vào bình định mức 20 ml,
định mức đến vạch bằng axetonitril (3.3.7). Dung dịch bảo quản ở -20°C trong 3 tháng.
3.3.18.6 Dung dịch nội chuẩn gốc SAL D3 9.8 µg / ml trong metanol
Pha loãng 1ml dung dịch chuẩn gốc SAL D3 (3.3.5) có nồng độ 100 ng / µl (98%) trong
bình định mức 10 ml , định mức đến vạch bằng metanol (3.3.9). Dung dịch được bảo quản ở
-20°C trong 1 năm.
LƯU Ý:
Nồng độ của các nội chuẩn phải được tính toán và hiệu chỉnh theo giấy chứng
nhận độ tinh khiết của nhà sản xuất.
14
Phân tích hàm lượng β – Agonist
(Clebuterol & salbutamol) trong thịt heo
3.3.18.7. Dung dịch nội chuẩn gốc CLEN D9 100 µg / ml trong metanol
Lấy một ít metanol (3.3.9) cho vào lọ chứa 1 mg chuẩn gốc CLEN D9 (3.3.4), lắc cho đến
khi chất rắn tan hoàn toàn, sau đó cho dung dịch vào bình định mức 10 ml, tráng rửa ống
chứa chất chuẩn vài lần bằng metanol (3.3.9), gộp tất cả dung dịch vào bình định mức 10
ml, định mức đến vạch bằng metanol (3.3.9). Dung dịch chuẩn này được bảo quản ở -20 °C
trong 1 năm.
3.3.18.8. Dung dịch nội chuẩn gốc RAC.HCL D6 100µg/ml trong metanol.
Lấy một ít metanol (3.3.9) cho vào lọ chứa 1 mg chuẩn gốc RAC.HCL D6 (3.3.6), lắc cho
đến khi chất rắn tan hoàn toàn, sau đó cho dung dịch vào bình định mức 10 ml , tráng rửa
ống amplous chứa chất chuẩn vài lần bằng metanol , gộp tất cả dung dịch vào bình định
mức 10 ml , định mức đến vạch bằng metanol . Dung dịch chuẩn này được bảo quản ở
-20°C trong 1 năm.
3.3.18.9. Dung dịch hỗn hợp nội chuẩn CLEN D9, RAC.HCL D6, 10 µg / ml (IS1)
Hút lần lượt 1 ml nội chuẩn CLEN D9 (3.3.18.6) và RAC.HCL D6 (3.3.18.7) cho vào bình
định mức 10 ml , định mức đến vạch bằng metanol . Dung dịch bảo quản ở -20 °C trong 6
tháng.
3.3.18.10. Dung dịch hỗn hợp chuẩn nội làm việc 50 ng / ml trong axetonitril (IS2).
Hút lần lượt 100 µl dung dịch hỗn hợp nội chuẩn IS1 (3.3.18.8) và 102 µl dung dịch nội
chuẩn SAL D3 (3.3.18.5) cho vào bình định mức 10 ml , định mức đến vạch bằng
axetonitril (3.3.7). Dung dịch chuẩn này được bảo quản ở -20°C trong 3 tháng.
3.3.19. Pha động
A: axetonitril (3.3.7) .
B: Nước (3.3.8) + 0,1 % axit formic (3.3.15).
3.3.20. Dung dịch 10%ACN trong nước cất
Lấy 10 ml axetonitril cho vào bình định mức 100 ml rồi định mức đến vạch bằng nước cất,
lắc đều. Dung dịch pha trước khi sử dụng và bảo quản ở nhiệt độ phòng.
15
Phân tích hàm lượng β – Agonist
(Clebuterol & salbutamol) trong thịt heo
3.4.Thiết bị, dụng cụ:
Sử dụng thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:
3.4.1 Hệ thống máy sắc ký lỏng khối phổ LC-MS-MS
- Bơm 2 kênh dung môi biến đổi dòng;
- Đầu dò MS-MS;
- Máy tính và phần mềm phân tích;
- Cột sắc ký Hypersil GOLD C18, đường kính trong là 2,1 mm, kích thước hạt nhồi
là 1,9 µm, độ dài của cột là 100 mm.
3.4.2
Ống ly tâm nhựa, dung tích 50 ml có nắp;
3.4.3 Ống ly tâm thủy tinh, dung tích 10 ml;
3.4.4 Bình định mức thủy tinh, dung tích 10 ml, 20 ml, 25 ml, 50 ml, 100 ml; 1000 ml;
3.4.5 Pipet tự động, dung tích 50 µl, 100 µL, 250 µl, 1000 µl, 5000 µl;
3.4.6 Máy ly tâm lạnh, tốc độ 4000 vòng / phút;
3.4.7 Cân phân tích, có độ chính xác đến 0,1 mg;
3.4.8 Bơm hút chân không;
3.4.9 Màng lọc dung môi, đường kính 45 mm, kích thước lỗ 0,2 µm, làm bằng chất liệu
chịu được cả nước và dung môi hữu cơ;
3.4.10 Bộ lọc dung môi bằng thủy tinh;
3.4.11 Máy lắc, tốc độ tối thiểu 4000 vòng / phút;
3.4.12 Máy lắc ngang, tốc độ tối thiểu 300 vòng / phút;
3.4.13 Lọ đựng mẫu, dung tích 2 ml;
3.4.14 Màng lọc mẫu, đường kính 13 mm, kích thước lỗ 0,2 µm, làm bằng PTFE;
3.4.15 Bộ hút dung môi tự động, thể tích 25 ml;
3.4.16 Bộ bay hơi nitơ, có điều chỉnh nhiệt độ;
3.4.17 Máy xay thịt.
16
Phân tích hàm lượng β – Agonist
(Clebuterol & salbutamol) trong thịt heo
3.5 Lấy mẫu:
Việc lấy mẫu theo TCVN 4833 – 1: 2002 (ISO 3100-1:1991).
Mẫu phân tích tại phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc bị
biến đổi trong quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.
3.6 Chuẩn bị mẫu:
Cắt thịt thành từng miếng nhỏ, đồng hóa mẫu bằng cách cho mẫu đi qua máy xay thịt hai lần
và trộn. Chuyển mẫu đã đồng nhất sang dụng cụ đựng mẫu, đậy nắp kín và lưu trữ ở nhiệt độ
-10°C. Khi thực hiện phân tích, phải đưa mẫu về nhiệt độ phòng.
3.6.1 Chuẩn bị mẫu thử
Cân 5,0 g mẫu đã đồng nhất vào ống ly tâm 50 ml . Cho vào 50 µl dung dịch hỗn hợp chuẩn
nội làm việc IS1 50 ng / ml (3.3.18.9).
3.6.2 Chuẩn bị mẫu trắng
Mẫu trắng là mẫu thịt heo, thịt bò đã được xác định không nhiễm Clenbuterol, Salbutamol
và Ractopamin.HCl. Mẫu trắng được chuẩn bị như mẫu thử.
3.6.3 Chuẩn bị mẫu kiểm soát
Mẫu kiểm soát được chuẩn bị từ mẫu trắng như mẫu thử nhưng có bổ sung thêm 50 µL
dung dịch chuẩn hỗn hợp S2 (3.3.18.4) vào mẫu. Trộn đều bằng máy lắc, sau đó để yên 15
phút trước khi tiến hành các bước tiếp theo.
3.6.4 Chuẩn bị mẫu xây dựng đường chuẩn
Đường chuẩn được xây dựng dựa trên nền mẫu trắng. Cân 5 mẫu mỗi mẫu 5,0 g đã đồng
nhất vào ống ly tâm 50 ml, bổ sung 50 µl dung dịch hỗn hợp chuẩn nội làm việc IS1 50
ng / ml (3.3.18.9) vào các ống nghiệm chứa mẫu trắng. Tiến hành trộn đều bằng máy lắc
trong 15 giây, sau đó để yên 15 phút trước khi tiến hành các bước tiếp theo.
3.7 Tiến hành thử nghiệm:
3.7.1 Chiết mẫu và làm sạch mẫu
Cho 4 ml axetonitril (3.3.7) và 1ml isopropanol (3.3.10) vào các ống nghiệm chứa mẫu
trắng, mẫu kiểm soát, mẫu thử và mẫu trắng dùng để dựng đường chuẩn. Trộn đều bằng
máy lắc trong 2 phút. Tiếp theo, thêm vào mỗi ống 1,2 g NaCl (3.3.12), lắc mạnh 2 phút,
sau đó tiếp tục thêm vào mỗi ống 4 g Na2SO4 và 0,5 g MgSO4, lắc đều 2 phút trên máy lắc .
Sau khi lắc mẫu, ly tâm 4 phút ở tốc độ 4000 vòng / phút. Dùng pipet, chuyển 1 ml lớp trên
sang ống nghiệm thuỷ tinh. Sau đó cho bay hơi bằng bộ bay hơi N 2 (3.4.9) đến khô ở nhiệt
độ 40°C.
17
Phân tích hàm lượng β – Agonist
(Clebuterol & salbutamol) trong thịt heo
Sau khi bay hơi đến khô. Đối với mẫu trắng, mẫu kiểm soát và mẫu thử hoà tan bằng 1 ml
dung dịch 10% ACN trong nước (3.3.20). Đối với mẫu trắng dùng để dựng đường chuẩn,
thêm chuẩn theo các thể tích như ở bảng 1, lắc đều khoảng 30 giây trên máy lắc. Tiếp theo,
thêm 1 ml n-hexan. Trộn đều bằng máy lắc trong trong 10 giây , ly tâm 6 phút ở 4000
vòng / phút . Sau đó loại bỏ lớp trên. Hút lớp dưới lọc qua màng lọc vào lọ đựng mẫu .
Dung dịch sẵn sàng để phân tích trên thiết bị LC-MS/MS.
Bảng 1 - Xây dựng đường chuẩn
STT
CLE
N
SAL
RAC.
HCl
Mẫu 1
0
0
0
0
0
1000
Nồng độ dung
dịch nội chuẩn
IS, CLEN D9;
SAL D3 và
RAC D6 (ng /
ml)
0,5
Mẫu 2
0,1
2,5
5
0
50
1000
0,5
Mẫu 3
0,2
5
10
10
0
1000
0,5
Mẫu 4
0,4
10
20
20
0
1000
0,5
Mẫu 5
0,8
20
40
40
0
1000
0,5
Mẫu 6
1,6
40
80
80
0
1000
0,5
(*)
Nồng độ chuẩn (ng/ml)
Thể tích
dung dịch
chuẩn hỗn
hợp S3 sử
dụng (µl)
Thể tích
định mức(*)
(µl)
: Dung dịch dùng định mức: dung dịch 10% ACN trong nước.
3.7.2 Tiến hành thử nghiệm trên LC-MS-MS
3.7.2.1
Điều kiện HPLC
- Cột sắc ký Hypersil GOLD C18, đường kính trong là 2,1 mm, kích thước hạt nhồi
là 1,9 µm, độ dài của cột là 100 mm;
- Nhiệt độ cột: 40°C;
- Thể tích tiêm mẫu: 10 μl;
- Thời gian phân tích: 6 phút;
- Tốc độ dòng: 0,2 ml / phút;
- Pha động: chương trình gradient thể hiện theo bảng 2:
18
Phân tích hàm lượng β – Agonist
(Clebuterol & salbutamol) trong thịt heo
Bảng 2 - Chương trình pha động
Thời gian
Tốc độ dòng
Pha động A
Pha động B
(phút)
(mL / phút)
(%)
(%)
Initial
0,2
5
95
0,5
0,2
5
95
1,0
0,2
20
80
4,0
0,2
80
20
4,2
0,2
5
95
6,0
0,2
5
95
3.7.2.2
Điều kiện trên MS
Điều kiện trên MS như sau:
Kiểu ion hóa:
ESI (+);
Nhiệt độ nguồn ion hóa:
150°C;
Nhiệt độ hóa hơi dung môi:
400°C;
Tốc độ dòng khí làm bay hơi dung môi: 800 l / h;
Tốc độ dòng khí qua Cone Gas:
30 l / h.
Các điều kiện phân ly MS-MS như sau:
Bảng 3 - Điều kiện phân ly MS-MS
Tên hợp chất
Ion Mẹ
(m/z)
Ion Con
(m/z)
Năng lượng
(Sample Cone)
(V)
Clenbuterol
Clenbuterol D9
276,97
286,03
167,89
202,94*
168,80
18
18
Năng lượng
va chạm
(eV)
28
14
30
19
Phân tích hàm lượng β – Agonist
(Clebuterol & salbutamol) trong thịt heo
Tên hợp chất
Ion Mẹ
(m/z)
Ion Con
(m/z)
Năng lượng
(Sample Cone)
Năng lượng
(eV)
(V)
203,90*
Salbutamol
Salbutamol D3
Ractopamin.HCl
Ractopamin.HCl
D6
240,10
243,03
302,10
308,10
va chạm
16
148,01
18
16
222,01*
151,01
10
18
18
255,10*
121,01
10
28
20
164,06*
290,10
16
22
20
168,10*
16
GHI CHÚ: ion có kí hiệu (*) là ion dùng để định lượng.
3.7.3 Trình tự bơm mẫu
3.7.3.1 Bơm dung môi kiểm tra máy: dung dịch 10% ACN trong nước (3.3.20);
3.7.3.2 Bơm các dung dịch lập đường chuẩn;
3.7.3.3 Bơm mẫu trắng;
3.7.3.4 Bơm mẫu kiểm soát;
3.7.3.5 Bơm mẫu thử.
3.8. Tính toán và biểu thị kết quả:
3.8.1 Tính hệ số tín hiệu:
RF = Area ×
Tính cho từng chất cần phân tích theo phương trình:
ISConc
ISArea
Trong đó: RF: hệ số tín hiệu;
Area: diện tích pic của ion định lượng của chất cần phân tích;
ISConc: nồng độ của ion định lượng của nội chuẩn;
20
Phân tích hàm lượng β – Agonist
(Clebuterol & salbutamol) trong thịt heo
ISArea: diện tích pic của ion định lượng của nội chuẩn.
3.8.2 Xây dựng đường chuẩn
Xây dựng phương trình bậc nhất giữa hệ số tín hiệu với nồng độ chất chuẩn bổ sung vào
mẫu và chuẩn bị mẫu theo mục 3.3.6.4. Phương trình có dạng: RF = ax + b. Trong đó:
- RF: hệ số tín hiệu, tính theo mục 3.3.8.1;
- x: nồng độ chất chuẩn thêm vào mẫu, chuẩn bị theo mục 3.3.6.4;
- b: điểm cắt của đường chuẩn với trục tung;
- a: hệ số góc của đường chuẩn.
Phương trình đạt yêu cầu khi hệ số hồi quy 1 ≤ R2 ≤ 0.99.
3.8.3 Hàm lượng chất phân tích trong mẫu
Dư lượng các chất cần phân tích trong mẫu được tính theo phương pháp đường chuẩn xây
dựng theo mục 3.8.2. Nồng độ trong mẫu phân tích được tính theo công thức sau:
C = Cx
×V 3 ×V 1 × F
a ×V 2
Trong đó:
C: là nồng độ của Agonist có trong mẫu, tính bằng μg / kg;
Cx: là nồng độ Agonist đo được suy ra từ đường chuẩn, μg / l;
V1: là thể tích ban đầu mà chất phân tích có mặt trong đó (5 ml), tính bằng ml;
V2: là thể tích dịch trích mang đi phân tích (1ml), tính bằng ml;
V3: là thể tích định mức cuối cùng (1ml), tính bằng ml;
F: là hệ số pha loãng mẫu khi đo (nếu không pha loãng, F = 1);
a: là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g).
Kết quả được biểu thị bằng đơn vị μg / kg (ppb), hai số sau dấu phẩy.
21
Phân tích hàm lượng β – Agonist
(Clebuterol & salbutamol) trong thịt heo
C. KẾT LUẬN:
Chất tăng trưởng β2-Agonist là chất gây nguy hiểm cho sức khỏe của con người, có thể
khiến cơ thể bị nhiễm độc, gây rối loạn tiêu hóa, tuần hoàn, thậm chí ảnh hưởng đến tính
mạng.
Việc sử dụng Salbutamol và Clenbutarol trong chăn nuôi hiện nay đang là thực trạng
đáng báo động, cần được quan tâm nhiều hơn và có biện pháp chế tài thích đáng đối với
những hành vi của cá nhân, tổ chức gây hại sức khỏe công đồng bằng các hợp chất cấm như
salbutamol và clenbutamol trong chăn nuôi gia súc
Vấn đề phân tích dư lượng β2-Agonist trong thịt heo là rất cần thiết và hữu ích. Phương
pháp sắc kí lỏng ghép khối phổ là phương pháp hiệu quả, độ nhạy cao, độ chính xác cao.
Phương pháp này có thể phân tích được ở hàm lương siêu vết (ppm/ppb/ppt).
22
Phân tích hàm lượng β – Agonist
(Clebuterol & salbutamol) trong thịt heo
Tài liệu tham khảo:
1. TCNV: 2014 Thực phẩm- xác định dư lương 2- Agonist trong thịt gia súc _ Phương pháp
sắc kí lỏng ghép 2 lần khối phổ, do Cục Quản lý Chất lượng Nông lâm sản và thủy sản biên
soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất
lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
2. Nguyễn Văn Ri (2009), Giáo trình Các phương pháp tách, khoa Hóa học trường Đại học
Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.
3. Nguyễn Đình Thành (2011), Cơ sở các phương pháp phổ ứng dụng trong hóa học, Nhà
xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
4. Phạm Luận (1998), Cơ sở lý thuyết phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao, ĐH Quốc Gia
Hà Nội.
5. Tạ Thị Thảo (2010), Giáo trình Thống kê trong Hóa học phân tích, khoa Hóa học trường
Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.
23
Phân tích hàm lượng β – Agonist
(Clebuterol & salbutamol) trong thịt heo
MỤC LỤC:
24
