Báo cáo khảo sát hoạt tính INVERTASE

1

Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm

BÀI 1

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH INVERTASE
I.

NGUYÊN TẮC
Invertase là một enzyme thủy phân sacharose thành glucose và fructose. Dựa vào
tính chất Iod trong dung dịch kiềm có khả năng oxi hóa glucose để xác định lượng
glucose sinh ra bằng cách định phân Iod dư với dung dịch Na2S2O3
II. CÁCH TIẾN HÀNH
 Điều chế dung dịch invertase
Cân 1.04g men bánh mì
Cân đều
Cho
Lắc
Dung
men
vào
dịch
trong
bình
vàInvertase
hòa
định
5'.tan
Lắng,
mức

bằng
lọc
100ml,
50ml nước
định mức
cất tới vạch

Thực hiện 3 ống như sau:
Số ống
Dung dịch saccharose 10% (ml)
Nước cất (ml)
Dịch enzyme (ml)
Dịch enzyme đã đun sôi (ml)
Đểtừng
Đun
Ở
3 cách
ống
ống
ởthủy
nhiệt
húttrong
5ml
độ cho
phòng
2’, làm
vàotrong
bình
lạnh 30’
dưới

tam giác
vòi nước
250ml

Nhóm 1 : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền

Page 1

1
0
10
10
0

2
10
0
10
0

3
10
0
0
10


2

Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm

 Xác định glucose
Thêm
Để
Lấy
Chuẩn
yên
ra,vào
độ
thêm
trong
bằng
mỗi2ml
bóng
erlen
NaHtối10ml
trong
iod
20'0.1N, 15ml NaOH 0.1N *

* Chú ý nhỏ chậm từng giọt NaOH sao cho thời gian nhỏ kéo dài khoảng 2’
III.

TÍNH KẾT QUẢ
Kết quả chuẩn độ
Ống 1
Ống 2
Ống 3
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3
24.1 24.75 24.5

5.8
5.5
5.6
23.05
23
22.9

Hoạt tính của invertase được biểu thị bằng số mol saccharose thủy phân bởi lượng
enzyme có trong 1 g men trong một phút ở nhiệt độ phòng thí nghiệm
Trong đó:
V1: số ml dùng để định phân dung dịch ở ống nghiệm 1
V2: số ml dùng để định phân dung dịch ở ống nghiệm 2
A: thể tích tổng cộng trong mỗi ống nghiệm (ml)
B: tổng thể tích dịch trích enzyme có được từ m (g) men bánh mì (ml)
a: thể tích dung dịch đem xác định đường glucose (ml)
b: thể tích dịch trích enzyme cho vào mỗi ống nghiệm (ml)
t: thời gian thủy phân (phút)
Lần 1
Lần 2

Nhóm 1 : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền

Page 2


3

Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm

Lần 3

Trung bình
IV.

BIỆN LUẬN – GIẢI THÍCH
• Ống 1 do không có cơ chất là dung dịch saccharose 10% nên không xảy ra phản
ứng nên ống 1 dùng để định lương Iod khi glucose không được tạo ra
• Ống 2 có phản ứng xảy ra vì có cơ chất và ống 2 dùng để định lương Iod dư. Do
đó ta sẽ xác định được lượng glucose được tạo ra
• Ống 3 do dịch enzyme đã đun sôi nên đã mất đi hoạt tính vì vậy phản ứng không
xảy ra
• Sau khi tiến hành khảo sát hoạt tính Enzyme Invertase trong 3 ống nghiệm thì ta
nhận thấy nếu không có cơ chất hoặc enzyme đã gia nhiệt (enzyme mất hoạt tính)
thì sẽ không có phản ứng để tạo ra glucose

V.

VI.

CHỨNG MINH CÔNG THỨC

PHỤ LỤC
 Các phương pháp khác

1. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme invertase cố định trong gel alginate tại
những thời điểm xác định trong thiết bị phản ứng liên tục
Do giá trị hoạt tính của enzyme tỉ lệ thuận với lượng sản phẩm sinh ra, nên trong nghiên
cứu này, hoạt tính của invertase cố định tại một thời điểm xác định khi hoạt động trong
thiết bị phản ứng liên tục được đánh giá gián tiếp thông qua hàm lượng đường khử trong
dung dịch phản ứng ngay tại thời điểm đó. Chúng tôi qui ước lượng đường khử ngay tại
thời điểm bắt đần châm cơ chất vào cột tương đương với 100% hoạt tính của invertase cố

định. Từ đó, sau khi xác định được hàm lượng đường khử trong mẫu tại những thời điểm
xác định, chúng tôi có thể xác định được phần trăm hoạt tính invertase cố định so với
hoạt tính ban đầu (chính là hoạt tính của enzyme tại thời điểm bắt đầu châm cơ chất) tại
thời điểm đó.
Hàm lượng đường khử được xác định bằng phương pháp quang phổ so màu, sử dụng
thuốc thử 3,5-dinitrosalicylic acid [14].
Nhóm 1 : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền

Page 3


4

Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm

2. Cố định invertase trong gel alginate bằng phương pháp nhốt enzyme trong mạng
gel đặc
Trong nghiên cứu này, enzyme invertase được cố định trong gel alginate bằng phương
pháp nhốt theo quy trình như sau: Trộn đều dung dịch alginate natri nồng độ 2,5% (w/v)
với dung dịch enzyme invertase 1,33% (w/v) theo tỉ lệ 1:1 (v/v). Nhỏ hỗn hợp trên vào
dung dịch CaCl2 2% (w/v) để tạo hạt enzyme cố định. Tiếp tục ngâm hạt enzyme cố định
trong dung dịch CaCl2 2% trong 2 giờ để làm tăng độ bền của hạt. Sau 2 giờ, vớt hạt
enzyme cố định ra khỏi dung dịch CaCl 2 2% và rửa hạt 3 lần bằng nước cất. Hạt enzyme
cố định tạo thành có dạng hình cầu với đường kính trung bình 3-4 mm. Hạt enzyme cố
định được ngâm vào dung dịch đệm acetate 0,1 M pH 4,5 trước khi đem sử dụng.
3. Khảo sát quá trình thủy phân liên tục saccharose bằng enzyme invertase cố định
trong gel alginate
Quá trình thủy phân liên tục saccharose bằng enzyme invertase cố định trong gel alginate
được tiến hành trong cột phản ứng liên tục hình trụ với đường kính 32 mm và chiều cao
300 mm. Thể tích dung dịch trong bình phản ứng là 180 mL. Lượng enzyme cố định

trong cột phản ứng: 18 cm3 hạt enzyme cố định (tương đương với 0,095 g chế phẩm
enzyme dạng bột). Nồng độ dung dịch saccharose trong bình phản ứng: 200 g/L.
Thí nghiệm được tiến hành như sau: Cho dung dịch saccharose và enzyme cố định vào
cột phản ứng. Tiến hành lưu dung dịch cơ chất trong cột đến khi hiệu suất thủy phân
trong cột phản ứng không thấp hơn 85%. Sau đó, bắt đầu tiến hành châm cơ chất vào cột
từ phía đỉnh và tháo sản phẩm ra khỏi cột từ phía đáy với lưu lượng như nhau. Sau những
khoảng thời gian xác định, chúng tôi tiến hành lấy mẫu sản phẩm và xác định hàm lượng
đường khử trong mẫu.

BÀI 2
KHẢO SÁT ĐỘNG HỌC VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME UREASE
I.

NGUYÊN TẮC
Urease là một enzyme thủy phân đặc hiệu urea theo phản ứng:

Nhóm 1 : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền

Page 4


5

Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm

NH2 – C = O + H2O

NH3 + CO2

NH2

Khi thêm formaldehyde vào môi trường sẽ tạo thành hexamethylene tetramine và giải
phóng acid carbonic.
2(NH4)2CO3 + 6HCHO

( CH2)6N4 + 2 H2CO3 + 6H20

Dùng dung dịch kiềm chuẩn định phân lượng acid tạo thành sẽ tính được lượng urea bị
thủy phân
II.

TIẾN HÀNH
1. Điều chế dung dịch urease
Cân 10 g đậu nành
Cho vào bình định
Cân
Khuấy
mức
Lọc
đậu250ml,
và
nành
với
thu150ml
đã
được
định
xaymức
dịch
nước
thành

tới
lọc
cấtbột
vạch bằng nước cất

2. Khảo sát động học
Chuẩn bị 2 dãy ống nghiệm, mỗi dãy 6 ống
Ống nghiệm
1
Ure M/3 (ml)
0
Nước cất (ml)
5
Dd urease (ml)
5

Nhóm 1 : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền

2
1
4
5

Page 5

3
2
3
5

4
3
2
5

5
4
1
5

6
5
0
5


6

Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm

Chuyển
Sau 20'
quacho
erlen
Thêm
Định
thêm
Dãy
100ml,
3 phân

5ml
giọt
1 vào
formol
phenolphthalein
tráng
với
bể NaOH
ổn
ống
trung
nhiệt
nghiệm
0.05N
tính,
40 1%
lắc
bằng
trong
nước
2' cất

Xác định hoạt tính
Ống nghiệm
Ure 2% (ml)
Nước cất (ml)
Dd urease (ml)
Dd urease đã đun sôi (ml)

1

0
5
5
0

2
5
0
5
0

3
5
0
0
5

Chuẩn độ bằng
SauCho
NaOH
Đổ
20',tất
từng
thêm
Lắc
cả
0.05N
ống
ống
5ml

đềura
nghiệm
với
trong
formol
erlen
chỉ2'100ml
thị
để
trung
phenolphtalein
ở 40
tính
1%

III. TÍNH KẾT QUẢ
 Tính số mol ure ban đầu [S]
 Khảo sát động học
Kết quả chuẩn độ
• Trong tủ ấm 300C
Ống nghiệm
Nhóm 1 : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền

1
Page 6

2

3

4

5

6


7

Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm

NaOH dung chuẩn độ (ml)
Y = số mol ure bị thủy phân (mol)
[S] = số mol ure ban đầu
• Trong bể ổn nhiệt 400C
Ống nghiệm
NaOH dung chuẩn độ (ml)
Y = số mol ure bị thủy phân (mol)
[S] = số mol ure ban đầu

1

2

3

4

 Xác định hoạt tính
Kết quả chuẩn độ

Ống 1
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2
0.3
2.4
1.8
0.3
2.1

Ống 2
Lần 3
1.65

 Hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0.05N
K là tỷ số giữa nồng độ thực tế và nồng độ tính toán của NaOH
K=

=>

CTT
C LT
Chuẩn
Dung
Vài dịch
giọt
độ bằng
10ml
có
phenolphatalein
màu
NaOH

H hồng0.05N
nhạt

TÍNH TOÁN ANH TÍNH LUÔN
Chuẩn độ: V1 = ml
V2 = ml
V3 = ml
VTB =

3

= ml

Nhóm 1 : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền

Page 7

5

6


8

Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm

Hoạt tính urease được biểu diễn bằng số mol ure bị thủy phân bởi lượng enzyme
urease có trong 1g bột đậu nành trong thời gian 1 phút ở 400C
Trong đó:
V1,V2: số ml NaOH 0.05N dung định phân dung dịch trong ống nghiệm 1,2

a: thể tích enzyme cho vào ống nghiệm
A: tổng thể tích enzyme có được từ m (g) bột đậu nành
t: thời gian thủy phân (ml)
m: khối lượng mẫu cân
k: hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0.05N
TÍNH TOÁN ANH TÍNH DÙM EM ĐI NHA
IV.

BIỆN LUẬN – GIẢI THÍCH
 Khảo sát động học
Hằng số Km
- Do Km = [S] khi v = ½ V, trị số của Km cũng được biểu diễn bằng đơn vị đo nồng
độ cơ chất: mol, gam, %
- Km = 10-1 – 10-6
- Đối với phần lớn enzyme, có thể căn cứ vào Km để đánh giá ái lực giữa enzyme và
cơ chất
- Ở điều kiện xác định (to, pH,...), Km của 1 enzyme đối với 1 cơ chất là hằng số
 Khảo sát hoạt tính
Kêt quả chuẩn độ lần 1 đối với ống 2 do sai sót trong quá trình thực hành nên cần
phải dùng nhiều NaOH để chuẩn độ hơn
V. CHỨNG MINH CÔNG THỨC
Nồng độ mol (ký hiệu CM) của dung dịch cho biết số mol chất tan có trong 1 lít dung
dịch

VI.

PHỤ LỤC
 Các phương pháp khác
Đặc hiệu của enzyme urease
Enzyme urease (trong bột đậu nành) xúc tác cho phản ứng thủy phân urea

(CO(NH2)2) theo phương trình phản ứng sau:

Nhóm 1 : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền

Page 8


9

Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm

Tiến hành thí nghiệm
Bước 1: trích ly enzyme urease theo trình tự sau:
Ngâm đậu nành 2-3 giờ (sinh viên chuẩn bị sẵn)
Cân 2g đậu nành đã ngâm.
Nghiền nhuyễn trong cối
Thêm vào 20ml nước cất, cà đều.
Để lắng 5 phút
Gạn lấy dịch trong, đó chính là dịch chiết enzyme urease.
Bước 2: chuẩn bị 2 ống nghiệm, cho vào:
Ống 1: 3ml dung dịch urea 5%
Ống 2: 3ml dung dịch acetamide 5%
Bước 3: thêm vào mỗi ống 3ml dịch chiết enzyme urease.
Bước 4: đặt giấy quỳ đỏ ở miệng thành ống nghiệm, đậy chặt ống nghiệm bằng bông.
Bước 5: lắc đều.
Bước 6: quan sát sự đổi màu của giấy quỳ

BÀI 3
Phần 1: XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ LIPASE
I.

NGUYÊN TẮC

Nhóm 1 : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền

Page 9


10

Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm

Dưới tác dụng của lipase, lipid bị thủy phân và giải phóng acid béo. Hàm lượng acid
được chuẩn độ bằng kiềm. Hoạt độ của enzyme là lượng kiềm cần để trung hòa acid mới
được hình thành. Cơ chất tốt nhất đối với lipase chính là lipid của cùng một đối tượng
enzyme.
II. TIẾN HÀNH
m1 = g
m2 = g
m3 = g

Hạtấm
Erlen,
1ml
Trộn
Tủ
25ml
Chuẩn
đậu
dầu,

đều
cồn
thêm
30
độnành
5ml
hỗn
96
bằng
10ml
đệm
nghiền
hợp
NaOH
nước
acetate,
nhỏ
với
cất chỉ
5 giọt
thị toluene
phenolphthalein 1%

 Bình kiểm chứng
mkiểm chứng = 5g

Nhóm 1 : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền

Page 10

11

Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm

Hạtấm
Erlen,
1ml
Trộn
Tủ
25ml
Chuẩn
đậu
dầu,
đều
cồn
thêm
30
độnành
5ml
hỗn
96
bằng
10ml
đệm
nghiền
hợp,
NaOH
nước
acetate,

Đun
nhỏ
với
cất
sôichỉ
53giọt
- thị
5' toluene
phenolphthalein 1%

III. TÍNH KẾT QUẢ
 Kết quả chuẩn độ
V1 :
V2 :
V3 :
Vkiểm chứng :
 Hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0.1N
K là tỷ số giữa nồng độ thực tế và nồng độ tính toán của NaOH
=>

K=

CTT
C LT

Nhóm 1 : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền

Page 11

12

Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm

Dung
Chuẩn
Vài dịch
giọt
độ bằng
10ml
có
phenolphatalein
màu
NaOH
H hồng0.1N
nhạt

Chuẩn độ:
VTB =

V1 =
V2 =
V3 =

ANH TÍNH TIẾP ĐI NHA
 Hoạt độ của lipase được biểu thị bằng số ml NaOH 0.1N dùng để chuẩn độ lượng
acid tự do sinh ra do lipase trích từ 10g hạt thủy phân
Trong đó :
a: số ml NaOH để chuẩn độ trong bình thí nghiệm
b: số ml NaOH để chuẩn độ trong bình kiểm chứng

k: hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0.1N
m: khối lượng hạt sử dụng
ANH TÍNH TIẾP
BIỆN LUẬN – GIẢI THÍCH
 Đệm acetate
pH môi trường làm thay đổi cấu trúc không gian protein vì một số amino acid có
mạch nhánh phân ly (COO- và NH4+ tạo liên kết ion). Họat động tối ưu của protein phụ
thuộc vào cấu trúc không gian nhất định trong môi trường, nghĩa là phụ thuộc vào tỉ lệ
phân ly của mạch nhánh thành ion, hay nói tóm lại là phụ thuộc vào pH môi trường.
Dung dịch đệm cho thêm vào nhằm làm dung dịch có pH không thay đổi nhiều lắm
khi một lượng nhỏ acid (H+) hoặc base (OH-) được thêm vào. Như vậy, dung dịch đệm
Nhóm 1 : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền

Page 12


13

Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm

bao gồm một cặp acid base liên hợp (acid yếu và muối của acid yếu này hoặc base yếu và
muối của base này) và tỉ lệ của chúng sẽ quyết định pH của dung dịch.
Về nguyên tắc thì phối hợp các loại đệm có các khoảng đệm khác nhau thành 1
dung dịch là không có vấn đề gì. Tuy nhiên sử dụng các đệm nào còn tùy thuộc vào ứng
dụng sao cho thành phần của đệm không phản ứng với các cấu tử trong hệ phản ứng khảo
sát theo chiều hướng có hại. Các phản ứng thường thấy là phản ứng tạo kết tủa hay tạo
phức hoặc oxy hóa khử.
Dung dịch đệm acetate (pH = 3,6 – 5,6)
− Dung dịch acid acetic 0,2M (a): 11,55 ml CH 3COOH đặc và định mức đến 1000
ml.

− Dung dịch natri acetate 0,2M (b): 16,4 g CH 3COONa hoặc 27,2 g
CH3COONa.3H2O được hòa tan và định mức đến 1000 ml.
Dung dịch đệm có pH khác nhau phụ thuộc vào X ml dung dịch (a) và Y ml dung
dịch (b) và định mức đến 100 ml.
 Toluen
Toluen, hay còn gọi là mêtylbenzen hay phenylmêtan, là một chất lỏng trong suốt,
không hòa tan trong nước. Toluen là mộthyđrocacbon thơm được sử dụng làm dung
môi rộng rãi trong công nghiệp.
Toluen là một hyđrocacbon thơm, có khả năng tham gia phản ứng thế ái điện tử. Nhờ
có nhóm mêtyl mà độ hoạt động hóa học của toluen trong phản ứng này lớn gấp 25 lần so
với benzen.
Vì vòng thơm khá bền nên cần áp suất cao khi tiến hành phản ứng hyđro hóa toluen
thành mêtylcyclohexan.
Ứng dụng của toluen trong bài xác định hoạt độ lipase là chống vi sinh vật phát
triển

 Bình kiểm chứng

Ở bình kiểm chứng không xảy ra phản ứng thủy phân vì dịch enzyme đã được đun
sôi để làm mất hoạt tính
IV.

PHỤ LỤC
 Các phương pháp khác

Nhóm 1 : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền

Page 13

14

Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm

1. Phương pháp pH-stat
Được dùng để phát hiện ra hoạt tính của lipase trong dịch mô đồng thể thực vật, có
mặt của deoxycholate,sử dụng triolein được nhũ hóa với gum arabic như cơ chất. Kỹ
thuật pH-stat đã được dùng để xác định những hoạt tính lipase trong huyết thanh, plasma
và dịch tá tràng. Phương pháp pH-stat là một phương pháp định lượng cho kết quả khá
chính xác (nhạy) trong giới hạn 1mol axit béo được giải phóng trong 1 phút.
2.Thu nhận enzyme lipase từ nội tạng cá basa.
Nội tạng cá basa sau khi được rã đông, loại bỏ mỡ, cắt nhỏ đến kích thước 2 mm x 2
mm, xay nhuyễn và phối trộn với dung môi để trích ly trong các điều kiện thích hợp. Sau
đó, dịch trích được lọc và xác định hoạt tính các enzyme. Kết quả cho thấy hiệu suất thu
hồi là 93%; độ tinh sạch là 6,08 lần. Lipase là loại enzyme được ứng dụng rộng rãi trong
nhiều ngành công nghiệp như chế biến sữa, thực phẩm, chất tẩy rửa và công nghiệp dầu
sinh học.

3. Phương pháp xác định hoạt độ lipase bằng phương pháp chuẩn độ
 Nguyên lý
Dựa trên khả năng xúc tác thủy phân lipit của lipase, xác định lượng acid béo
tạo ra trong 15’ bằng lượng NaOH cần bổ sung để duy trì pH cố định. Hiệu số giữa
lượng NaOH sau và trước khi bổ sung enzyme đặc trưng cho hoạt tính xúc tác của
lipase
Tiến hành
Lấy 10ml dầu ăn + 200ml nước cất + 1% Gum arabic, sau đó đánh tan bằng
máy xay sinh tố trong 5’ để tạo huyền phù
Lấy 20ml dd huyền phù cho vào cốc thủy tinh đặt lên máy khuấy từ, điều
chỉnh nhiệt độ tới 650C
Thêm 470⑩L dd CaCl2 đo pH và điều chỉnh pH tới 8.3 (chuẩn độ bằng NaOH

10mM). Sau đó ổn định pH và nhiệt độ, đo độ thủy phân của dung dịch cơ chất
trong 15’ để giữ pH luôn luôn bằng 8.3 (lượng NaOH tiêu tốn là a ml)
Sau đó thêm 20⑩L dung dịch lipase vào hỗn hợp cơ chất và chuẩn độ bằng
NaOH 10mM để đạt pH = 8.3 và bắt đầu tính lượng tiêu hao NaOH trong 15’ để
giữ pH luôn luôn = 8.3 (lượng NaOH tiêu tốn là b ml)
Đơn vị hoạt độ lipase
Một đơn vị hoạt độ lipase (U) được xác định như là lượng enzyme có khả
năng chuyển hóa tạo 1 micromol acid béo trong thời gian 1’
Hoạt độ lipase trong 1ml dịch nổi được tính theo công thức

Nhóm 1 : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền

Page 14


15

Với

Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm

t: thời gian đo độ tự thủy phân
v: thể tích enzyme
a: lượng NaOH 10mM tiêu tốn khi chưa có enzyme
b: lượng NaOH 10mM tiêu tốn khi có enzyme
0.01: hệ số chuyển độ nồng độ

Phần 2: XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME AMYLASE THEO WOHLGEMUTH
I.

NGUYÊN TẮC
Phương pháp dựa vào tìm nồng độ enzyme thấp nhất có thể thủy phân tinh bột đến
Dextrin
Đơn vị Wohlgemuth là lượng enzyme cần thiết để thủy phân 1mg tinh bột sau 30
phút ở 370C có Cl- làm chất hoạt hóa
II. TIẾN HÀNH
 Chuẩn bị dịch chiết amylase
Dung
Ngâm
Định
dịch
Bình
10g
mức
15',
trong
định
malt
Lọc
tới
thỉnh
suốt
mức
2xay
vạch,
lần
thoảng
cả
chứa
100ml

lắc
vỏ enzyme
kỹ
lắc

 Tiến hành khảo sát hoạt tính amylase

Nhóm 1 : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền

Page 15


16

Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm

1 ml dung
NaCl
Tủ
10
dịch
0.5
điều
ống
%1ml
1ml
hồ
Lấy
nhiệt
nghiệm

tinh
H1ml
ddởbột
amilaza,
37
từ0.5%.
ống 1lắc
cho vào ống 2, lắc và lặp lại cho tới ống 10 thì hút 1 ml bỏ đi

• Ống 11 : 3 ml nước cất + 2 giọt Iod

Kết quả được thể hiện trong bảng, đánh dấu xanh (X), đỏ (Đ), nâu (N), vàng (V)

Ống nghiệm
Độ pha loãng
Nồng độ
enzym
Màu
III.

1
2

2
4

3
8

4

16

5
32

6
64

7
128

8
256

9
512

TÍNH KẾT QUẢ
 Lượng enzyme được cho vào ống nghiệm

Trong đó V1 : thể tích dịch chiết enzyme cho vào ống nghiệm ( 1ml )
Nhóm 1 : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền

Page 16

10
1024


17

Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm

V2 : thể tích dịch chiết enzyme ( 100ml )
m : lượng mẫu cân vật phẩm chứa enzyme ( mg )
Một đơn vị Wohlgemuth ( W )
Trong đó F : độ pha loãng của ống nghiệm có nồng độ enzyme nhỏ nhất thủy phân hoàn
toàn tinh bột
 Số đơn vị Wohlgemuth có trong 1ml dịch chiết enzyme ( NW)

IV.

BIỆN LUẬN – GIẢI THÍCH
Ta thấy 5 ống nghiệm (1,2,3,4,5) bị thủy phân hoàn toàn, ống 6 thủy phân được
phân nữa, còn các ống còn lại (7,8,9,10) hoàn toàn không bị thủy phân
Vì khi chúng ta pha loãng dung dịch và dịch enzyme amylase trong dung dịch lại
được pha loãng qua 10 ống nghiệm thì đến ống số 6 lượng tinh bột còn lại rất ít nên chỉ
thủy phân được phân nữa và đến 4 ống còn lại lượng enzyme không còn nên không thủy
thủy phân tinh bột
C6 H10O5 + nH 2O

to

→ nC H
6

O6

12

amylase

V.

CHỨNG MINH CÔNG THỨC
n=

m × V1
V2

1.
V1: Thể tích dịch chiết enzym cho vào ống 1 (1 ml)
V2: Thể tích dịch chiết (100 ml)
m: khối lượng malt
n' =

• Lượng malt có trong 1 ml enzym:
• Lượng malt có trong V1:
2.

W=

n=

m
V2

m × V1
V2

n
F ×5

Khối lượng enzym có trong ống 1:
C% của tinh bột là 0.5%
100ml 
0.5g

m=

Nhóm 1 : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền

n
F (F là độ pha loãng)

Page 17


18

Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm

1ml



1 × 0.5
= 0.005 g = 5mg
100

Khối lượng enzym phản ứng 1 ml hồ tinh bột 0.5%:
3.

NW =

W=

n
F ×5

n
V1 × W

Khối lượng enzym có trong 1 ml: m = W × V1
NW =

n
V1 × W

Số đơn vị có trong 1 ml enzym:
VI. PHỤ LỤC
 Các phương pháp khác
1. Xác định hoạt độ amylase theo phương pháp động học
Nguyên lý : amylase thuỷ phân 2-chloro-4nitrophenyl-maltotrioside (CNPG3)
thành 2-chloro-4Nitrophenyl (CNP), 2-Chloro-4Nitrophenyl-Maltodioside và glucose
(G),
Theo phản ứng sau:
Amylase
5 CNPG3  3CNP+2CNPG2+3G3+2G
Sự giải phóng CNP từ cơ chất và sự tăng hấp thụ của nó tỷ lệ thuận với hoạt độ

amylase huyết thanh.
Hiện nay người ta dùng Kit để xác định hoạt độ amylase máu, nước tiểu. Trị số bình
thường của nó phụ thuộc vào kỹ thuật và thuốc thử (chủ yếu là cơ chất như G3, G7). Các
Hãng khác nhau sẽ cho kết quả khác nhau, kết quả đơn vị đều tính là U/l. Trong đó G3 là
2-Chloro-4Nitrophenyl-Maltotriosid (CNPG3) và G7 là p-Nitrophenyl-Maltoheptaoside
(EPS).
2. Phương pháp vi lượng của V.Y.Rodzevich, O.P.Korenbiakina
Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi Enzyme glucoamylase có
trong chế phẩm nghiên cứu. Xác định lượng glucose tạo thành sẽ tính được hoạt độ Enzyme.
3. Xác định hoạt độ Enzyme α-Amylase theo Rukhliadeva:
Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi Enzyme có trong dịch chế phẩm
nghiên cứu với các dextrin có phân tử lượng khác nhau. Đo cường độ màu tạo thành giữa tinh bột
và các sản phẩm thủy phân của nó với iodine bằng máy so màu quang điện sẽ tính được
hoạt độ Enzyme.
Đơn vị hoạt độ Amylase là lượng Enzyme chuyển hóa được 1 g tinh bột tan thành
các dextrin có phân tử lượng khác nhau ở 30 0C trong thời gian 1 giờ ( pH
cho Amylase của malt là 4,8 – 4,9; của nấm là 4,7; của vi khuẩn là 6,0 …)

Nhóm 1 : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền

Page 18


19

Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm

BÀI 4
KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME BROMELIN
THEO PHƯƠNG PHÁP ANSON CẢI TIẾN

I.

NGUYÊN TẮC
Phương pháp này dựa trên sự thủy phân protein casein bằng enzym Bromelin
có trong dịch nghiên cứu, sau đó làm vô hoạt enzyme và kết tủa protein chưa bị
thủy phân bằng dung dịch acid trichloracetic (TCA). Định lượng sản phẩm được
tạo thành trong phản ứng thủy phân bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin. Dựa
vào đồ thị đường chuẩn của Tyrosin để tính lượng sản phẩm do enzyme xúc tác tạo
nên.

II. TIẾN HÀNH
 Chiết enzyme : Chọn thơm còn xanh

Nước
thơm
ly enzym
tâm lắc
6000v/p
10'
Địnhphần
Lấy
mứcđem
dịch
100ml,
đều
phíatrong
10
trên,bỏ
phút

bã

Cân
Gọt
20g
vỏ,mẫu
cắt nhỏ,
hòa tan
xayvới
nátnước
thơmcất

Nhóm 1 : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền

Page 19


20

Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm

 Chuẩn bị đường chuẩn Tyrosin

Các bước dựng đường chuẩn Tyrosin

Dung dịch hóa chất
Nhóm 1 : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền

Ống nghiệm
Page 20

21

Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm

1

2

3

4

5

6

Dung dịch Tyrosin chuẩn (ml)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Lượng Tyrosin tương ứng (µM)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Dung dịch HCl 0,2N (ml)

5,0

4,8

4,6

4,4

4,2

4,0

Dung dịch NaOH 0,5N (ml)

10

10

10

10

10

10

Thuốc thử Folin (ml)

3

3

3

3

3

3

Lắc mạnh, sau 10 phút đo OD ở bước sóng 660nm
Ống số 1 là ống thử không (TK), các ống còn lại là ống thí nghiệm (TN).

 Khảo sát hoạt tính
Lấy 2 ống nghiệm sạch,khô,tiến hành làm 1 ống thử thật, 1 ống thử không
Ống nghiệm
Thử thật
Thử không
Dung dịch Casein 1% (ml)
5
5
Dung dịch TCA 5% (ml)
0
10
Dung dịch enzym mẫu (ml)
1
1
o
Lắc đều và giữ ở 35,5 C trong 20 phút
Dung dịch TCA 5% (ml)
10
0
Để yên 30 phút, lọc lấy dịch trong
Dung dịch hóa chất

Lấy 2 ống nghiệm mới khác,cho vào ống thứ nhất 5ml dịch lọc của ống thử
thật và cho vào ống thứ hai 5ml dịch lọc của ống thử không.
Nhóm 1 : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền

Page 21

22

Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm

Tiếp tục thêm vào mỗi ống 10ml NaOH 0,5N và 3ml thuốc thử Folin,lắc
mạnh,sau 10 phút đo OD ở bước song 660nm.
Lặp lại thí nghiêm 3 lần.

III. TÍNH KẾT QUẢ
Định nghĩa đơn vị Anson: một đơn vị Anson là lượng enzym tối thiểu trong điều kiện
thí nghiệm (35,50C: pH 7,6 …) thủy phân Casein trong 1 phút tạo thành sản phẩm hòa
tan trong TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp thu OD ở bước sóng
660nm tương ứng với 1µM Tyrosin trong đường chuẩn.

Trong đó :
• X: hoạt độ enzyme bromelin (UI/g)
• V: tổng thể tích hỗn hợp trong ống thử thật hoặc ống thử không (ml)
• v: thể tích dịch lọc đem phân tích (ml)
• t: thời gian thủy phân (phút)
• m: khối lượng mẫu enzyme đem đi xác định hoạt tính (g)
• L: độ pha loãng enzyme
• µmTyro sin: lượng µmTyro sin trong v(ml) suy ra từ đường chuẩn.
IV.

V.

CHỨNG MINH CÔNG THỨC

PHỤ LỤC
 Các phương pháp khác

 Tách bromelin bằng phương pháp kết tủa enzyme
Nguyên tắc
Phá vỡ nước liên kết xung quanh phân tử enzym bằng cách bổ xung
vàodungdịch protein enzym các dung môi hoặc các hóa chất ưa nước có ái lực với
nướcmạnh hơn protein để lôi kéo nước ra khỏi phân tử protein đó, giúp cho protein
tủaxuống.-Dùng acetone và ethanol, hoặc các muối trung tính, ammonium
sunfate-Làm lạnh nước dứa ép 0 đến 40 độ C và acetone tinh khiết ở 20
Nhóm 1 : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền

Page 22


23

Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm

độ C-Tủa bromelin phải được rửa bằng aceton và làm khô thật nhanh để
bromelinkhông bị biến tính.-Dùng ammonium sunfate với nồng độ bão hoà là
0.7( 70% bão hòa) để làm tác nhân kết tủa bromelin (đặc biệt ở nhiệt độ thấp). Tủa
dễ dàng hoà tan bằng nướcvà muối có thể loại bỏ ra khỏi protein bằng phương pháp trầm
tính.
Cách tạo tủa với muối ammonium sulfate (NH4)2SO4
D ù n g 1 l í t d u n g d ị c h n ư ớ c d ứ a l y t â m -Cho từ từ 532g
a m m o n i u m s u n f a t e v à o v à k h u ấ y đ ề u - Để yên ở nhiệt độ phòng từ 10-15 phútLy tâm dung dịch với vận tốc 6.000 vòng/ phút trong 5 phút để thu nhận
tủa.-Thu tủachế phẩm bromelin và sấy khô tủa sau đó tinh sạch enzyme

Nhóm 1 : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền

Page 23