Khảo sát hoạt tính Enzyme Amylase từ 3 chủng Trichoderma

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***OOO***




KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP



KHẢO SÁT HOẠT TÍNH HỆ ENZYME AMYLASE
TỪ 3 CHỦNG TRICHODERMA




NGÀNH HỌC: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NIÊN KHÓA: 2002-2006
SINH VIÊN THỰC HIỆN: NGUYỄN NHƢ HIẾN



Thành phố Hồ Chí Minh
tháng 8/2006



2

LỜI CẢM TẠ

Em xin chân thành cảm tạ:
 Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ
nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến
thức cho em trong suốt quá trình học tại trƣờng.
 Ths. Vƣơng thị Việt Hoa đã hết lòng hƣớng dẫn, giúp đỡ em trong suốt thời
gian thực tập tốt nghiệp.
 Cô Trƣơng Phƣớc Thiên Hoàng đã tận tình giúp đỡ em trong quá trình nhận và
thực hiện đề tài.
 Ban Giám Đốc Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh - Trƣờng Đại Học
Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
 Ban chủ nhiệm, Thầy Cô khoa Công Nghệ Thực Phẩm.
 Các Anh Chị tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh đã tận tình giúp
đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian thực tập tốt nghiệp.
 Các bạn bè của lớp công nghệ sinh học khóa 28 đã chia sẻ cùng tôi những vui
buồn trong thời gian học cũng nhƣ hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian
thực tập.
 Các bạn bè ngoài lớp đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và
thực tập tốt nghiệp.

Sinh viên thực hiện
Nguyễn nhƣ Hiến

3

TÓM TẮT

 Đề tài “KHẢO SÁT HOẠT TÍNH HỆ ENZYME AMYLASE TỪ 3 CHỦNG
TRICHODERMA” thực hiện bởi sinh viên Nguyễn nhƣ Hiến, lớp DH02SH-
Khoa CNSH-Trƣờng Đại Học Nông Lâm dƣới sự hƣớng dẫn bởi Th.s Vƣơng
Thị Việt Hoa.
 Thời gian và địa điểm: Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 3/2006 đến tháng 6/2006,
Tại Phòng Vi Sinh - khoa Công Nghệ Thực Phẩm - trƣờng Đại Học Nông Lâm.
 Đề tài đƣợc thực hiện trên đối tƣợng vi nấm Trichoderm. sp gồm 3 chủng D13,
D14, D16. Chúng là vi nấm phân bố rộng rãi trong đất, có nhiều hệ enzyme
(cellulase, amylase…). Do đó, chúng tôi tiến hành khảo sát và đánh giá hoạt lực
hệ enzyme amylase của các chủng này (đƣợc cung cấp bởi phòng thí nghiệm
trƣờng Đại Học Khoa Học Tự Nhiên), để từ đó bổ sung vào các ứng dụng: công
nghệ thực phẩm, công nghệ dệt, xử lý môi trƣờng…đáng chú ý là trong lĩnh vực
bổ sung vào trong thức ăn gia súc và các dạng phân bón sinh học.
 Những kết quả đạt đƣợc.
Chọn ra đƣợc chủng Trichoderma có hoạt tính hệ enzyme amylase phân giải
cao.
Khảo sát đƣợc các yếu tố ảnh hƣởng đến hệ enzyme amylase tách chiết từ môi
trƣờng nuôi cấy (thời gian, nhiệt độ, pH).

4
MỤC LỤC

NỘI DUNG TRANG
Trang tựa
Lời cảm tạ ....................................................................................................................... 2
Tóm tắt ............................................................................................................................. 3
Mục lục ........................................................................................................................... 4
Danh sách các hình .......................................................................................................... 6
...........................................................................................................................................
Danh sách các bảng ........................................................................................................ 7
Danh sách các biểu đồ .................................................................................................... 8
I. MỞ ĐẦU. ..................................................................................................................... 9
II. Tổng quan tài liệu. .................................................................................................... 10
2.1. Giới thiệu về tinh bột .............................................................................................. 10
2.2. Quá trình thuỷ phân tinh bột. .................................................................................. 10
2.3. Giới thiệu về nấm Trichoderma.............................................................................. 17
2.3.1. Phân loại-Đặc điểm về hình thái. ........................................................................ 17
2.3.2. Đặc điểm về sinh lý, sinh hoá. ............................................................................. 18
III. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ........................................................................... 19
3.1. Vật liệu ................................................................................................................... 19
3.2. Phƣơng pháp. .......................................................................................................... 21

3.2.1. Phƣơng pháp định tính và sơ bộ định lƣợng hoạt độ enzyme amylase
bằng cách đo đƣờng kính vòng phân giải ...................................................................... 21
3.2.2 Phƣơng pháp nuôi cấy Trichoderma và tách chiết hệ enzyme amylase
từ môi trƣờng nuôi cấy. ................................................................................................ 22
3.2.3. Phƣơng pháp khảo sát động học hệ enzyme amylase ......................................... 22
3.2.4. Phƣơng pháp khảo sát ảnh hƣởng của pH đối vối enzyme amylase. .................. 23
3.2.5. Phƣơng pháp khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đối vối enzyme amylase ........... 24
3.2.6. Phƣơng phàp xác định hoạt tính hệ enzyme amylase.( Phƣơng pháp Heinkel ). 24





5

IV. KẾT QUẢ................................................................................................................ 28
4.1. Kết quả đếm số lƣợng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu. ..................................... 28
4.2. Kết quả định tính và sơ bộ định lƣợng hoạt độ enzyme amylase bằng cách đo
đƣờng kính vòng phân giải. ........................................................................................... 29
4.3. Kết quả khảo sát động học enzyme amylase. ......................................................... 31
4.4. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đối với enzyme amylase trên chủng
D13 ................................................................................................................................ 39
4.5. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của pH đối với enzyme amylase trên chủng D13. ... 41
V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................................................... 43
VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 44
PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 45

6
DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1. Cấu trúc bậc 3 của Enzyme Amylase. ............................................................ 14
Hình 2.2. Quá trình thủy phân Amylose........................................................................ 15
Hình 2.3. Quá trình thủy phân Amylopectin và Glycogen ............................................ 16
Hình 2.4. Khuẩn ty và cơ quan sinh bào tử của Trichoderma. ...................................... 18
Hình 2.5. Trichoderma harzianum KRL – AG2 phát triển trên môi trƣờng PGA ........ 18

7
DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1. Dung dịch đệm Mc Hvaice. .......................................................................... 23
Bảng 3.2. Các dung dịch đệm pH 3 – 6,5. ..................................................................... 23
Bảng 3.3. Bảng xác định hoạt tính enzyme amylase ..................................................... 26
Bảng 3.4. Nồng độ dung dịch tinh bột........................................................................... 26
Bảng 3.5. Các dung dịch của đồ thị tiêu chuẩn. ............................................................ 27
Bảng 4.1. Kết quả đếm số lƣợng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu ............................. 28
Bảng 4.2. Kết quả đo đƣờng kính vòng phân giải sau 66 giờ. ...................................... 29
Bảng 4.3. Kết quả đo đƣờng kính vòng phân giải sau 84 giờ. ...................................... 30
Bảng 4.4. Kết quả đo OD của đồ thị tiêu chuẩn. ........................................................... 31
Bảng 4.5. Hoạt độ Enzyme Amylase của chủng D13 theo thời gian nuôi cấy.. ............. 32
Bảng 4.6. Hoạt độ Enzyme Amylase của chủng D14 theo thời gian nuôi cấy. .............. 34
Bảng 4.7. Hoạt độ Enzyme Amylase của chủng D16 theo thời gian nuôi cấy.. ............. 36
Bảng 4.8. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đối với Enzyme Amylase của chủng D13 .............. 39
Bảng 4.9. Ảnh hƣởng của pH đối với Enzyme Amylase của chủng D13. ..................... 41

8
DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ
Đồ thị 4.1. Kết quả đo đƣờng kính vòng phân giải sau 66 giờ. ..................................... 29
Đồ thị 4.2. Kết quả đo đƣờng kính vòng phân giải sau 84 giờ. ..................................... 30
Đồ thị 4.3. Đƣờng chuẩn. .............................................................................................. 31
Đồ thị 4.4. Hoạt độ Enzyme Amylase của chủng D13 theo thời gian nuôi cấy. ............ 33
Đồ thị 4.5. Hoạt độ Enzyme Amylase của chủng D14 theo thời gian nuôi cấy. ............ 35
Đồ thị 4.6. Hoạt độ Enzyme Amylase của chủng D16 theo thời gian nuôi cấy. ............ 37
Đồ thị 4.7. Hoạt độ Enzyme Amylase của 3 chủng D13, D14, D16. ............................. 38
Đồ thị 4.8. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đối với Enzyme Amylase của chủng D13. ........... 40
Đồ thị 4.9. Ảnh hƣởng của pH đối với Enzyme Amylase của chủng D13. .................... 42

9
PHẦN I. MỞ ĐẦU
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ

Do áp lực kinh tế, việc tận dụng hiệu quả hơn nguồn thức ăn có hàm lƣợng dinh
dƣỡng thấp cho gia cầm ngày càng gia tăng. Mặt khác, các quy định trong sản xuất
thức ăn gia súc không cho phép sử dụng bất kỳ hoá chất hay thuốc khích thích nhằm
tăng trƣởng gia súc, nâng cao năng suất vật nuôi. Một phƣơng pháp phổ biến đang
đƣợc khuyến khích sử dụng rộng rãi để giải quyết vấn đề này là bổ sung các hệ
enzyme thủy phân vào thức ăn gia súc nhằm tăng cƣờng sự tiêu hoá và hấp thu các
chất dinh dƣỡng khó tiêu, hoặc loại bỏ các nhân tố kháng dinh dƣỡng .
Một trong những nguồn enzyme đáng chú ý là hệ enzyme từ vi nấm
Trichoderma. sp vi nấm này có nguồn enzyme phong phú, có hoạt lực mạnh và đƣợc
sử dụng nhiều mục đích khác nhau, chúng đƣợc ứng dụng trong các lĩnh vực nhƣ:

công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dệt, xử lý môi trƣờng… đáng chú ý là trong lĩnh
vực bổ sung vào thức ăn gia súc và các dạng phân bón sinh học.
Enzyme amylase là một enzym thủy phân tinh bột thông qua việc xúc tác thủy
giải liên kết glucosid trong tinh bột. Enzyme amylase cũng đã đƣợc nghiên cứu và khảo sát
một cách có hệ thống về các đặc điểm và cũng đƣợc phân lập và tách chiết từ nhiều nguồn khác
nhau nhƣ: từ thực vật ( từ mầm mạch, mầm đậu tƣơng …), từ vi sinh vật (vi khuẩn Bacillus
subtilis, nấm Aspegillus oryzae …).


Góp phần vào định hƣớng nêu trên, đƣợc sự ủng hộ của Bộ Môn Công Nghệ
Sinh Học và khoa Công Nghệ Thực Phẩm chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:
“Khảo sát hoạt tính hệ enzyme amylase từ 3 chủng nấm Trichoderma. sp”
1.2. MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI.
1. Chọn chủng Trichoderma sp. có hoạt tính hệ enzym amylase phân giải cao
2. Khảo sát hoạt tính hệ enzym amylase tách chiết từ môi trƣờng nuôi cấy Trichoderma.







10
PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về tinh bột
Tinh bột là sản phẩm quang hợp của thực vật, là chất dự trữ quan trọng tích lũy
trong cũ, quả, hạt( lúa: 60-80%; ngô: 65-75%; khoai tây: 12-20% …)
Trong thực vật tinh bột tồn tại dƣới dạng hạt tinh bột, đƣờng kính 0,002-0,15 mm.
Các loại thực vật khác nhau chứa các hạt tinh bột có hình dạng và kích thƣớc khác
nhau.

Tinh bột đƣợc tổng hợp ở thực vật gồm 2 thành phần chủ yếu:
 Amylose - polysaccharide tan trong nƣớc, cho phản ứng màu xanh với Iod.
Amylose có cấu tạo hoá học là chuỗi dài không phân nhánh của gốc
α – D - glucopyranose nối với nhau bằng lien kết α -1,4 glycoside. Phân tử
Amylose có trọng lƣợng khoảng 20000 - 50000, có dạng hình xoắn mỗi
vòng chứa 6 phân tử glucose.
 Amylopectin là polymer mạch nhánh chứa các đơn vị đƣờng đơn nối với
nhau bằng lien kết α -1,4 glycoside và α -1,6 glycoside . Amylopectin cho
màu tím đỏ với Iod. Trọng lƣợng phân tử thƣờng là vài triệu.
Đa số các dạng tinh bột chứa từ 15 - 25% Amylose và 75 - 85% Amylopectin.

2.2. Quá trình thủy phân tinh bột
2.2.1. Giới thiệu về enzyme
Enzyme là chất xúc tác sinh học, có bản chất là protein. Nó cho phép các phản
ứng cần thiết cho sự sống và sự sinh sản của tế bào diễn ra với tốc độ cao và với tính
chất đặc thù là không tạo ra các sản phẩm phụ nhƣ ở các phản ứng thông thƣờng.
Enzyme có trong tế bào của mọi sinh vật, không chỉ xúc tác cho các phản ứng trong cơ
thể sống mà còn xúc tác cho các phản ứng ngoài tế bào( invitro).
a) Tính chất hóa - lý. do enzyme có bản chất là protein nên chúng cũng có những tính
chất nhƣ các protein.
 Khi hòa tan trong nƣớc, enzyme cho một dung dịch keo với những tính
chất đặc trƣng nhƣ khuếch tán kém, áp suất thẩn thấu thấp, độ nhớt cao…
 Enzyme có tính lƣỡng cực.



11
 Mỗi enzyme có một điểm đẳng điện. tại điểm này, chúng có độ hòa tan
thấp nhất.
 Enzyme không chịu đƣợc nhiệt độ cao, dễ bị biến tính và mất hoạt tính

xúc tác.
 Enzyme cũng bị phá hủy bởi các tác nhân phá hủy protein nhƣ các
enzyme tiêu hóa( pepsin, tripsin…).
b) Các yếu tố ảnh hƣởng đến vận tốc phản ứng enzyme.
 Vận tốc ban đầu của phản ứng.
Nếu khảo sát lƣợng cơ chất đƣợc biến đổi theo thời gian, ngƣời ta nhận thấy rằng
đƣờng cong biểu diễn ban đầu là một đoạn thẳng với độ dốc không đổi, sau đó
đƣờng biểu diễn bị uốn cong cho thấy lƣợng cơ chất bị biến đổi giảm đi, nghĩa là
tốc độ phản ứng giảm đi và cuối cùng bị triệt tiêu khi tất cả các chất đều đƣợc
biến đổi.
V
o
= tgα
o
Trong đó: V
o
là vận tốc ban đầu.
α
o
là góc hợp bởi đƣờng biểu diễn và đƣờng nằm ngang ở thời
điểm t
o
.
 Nồng độ enzyme..
Tốc độ phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ enzyme..
 Ảnh hƣởng nồng độ cơ chất
Nếu nồng độ enzyme đƣợc giữ cố định và nồng độ cơ chất [S] thay đổi, ngƣời
ta nhận thấy đầu tiên vận tốc phản ứng gia tăng nhanh chóng. Nhƣng khi [S]
tiếp tục tăng, đƣờng biểu diễn uốn cong và với nồng độ [S] cao thì vận tốc
không còn gia tăng nữa và đƣờng biểu diễn tiệm cận với giá trị cực đại V

max
.
 Ảnh hƣởng nhiệt độ
Khi khảo sát vận tốc ban đầu của phản ứng theo nhiệt độ (in vitro), ngƣời ta
thấy xuất hiện hai kỳ (pha) riêng biệt tƣơng ứng hai hiện tƣợng khác nhau.
+ Ở nhiệt độ thấp (từ 0 – 40
o
C), vận tốc phản ứng tăng khi nhiệt độ tăng (do
nhiệt cung cấp năng lƣợng cho phản ứng).
+ Ở nhiệt độ cao sau đó (tùy thuộc vào từng enzyme), vận tốc phản ứng giảm
xuống do sự biến tính của protein. Đa số các enzyme mất hoạt tính



12
ở 80 – 100
o
C.
Khoảng nhiệt độ tối ƣu là khoảng nhiệt độ mà tại đó enzyme đạt hoạt tính cao
nhất.
Đa số các enzyme có nguồn gốc động vật nhiệt độ tối ƣu vào khoảng
40 – 50
o
C, và các enzyme thực vật khoảng 50 – 60
o
C.
 Ảnh hƣởng của pH.
Sự thay đổi pH gây nên:
+ Sự biến đổi ion hóa của các nhóm chức năng trên chuỗi polypeptide của
enzyme, làm thay đổi điện tích cần thiết cho sự tạo thành phức enzyme – cơ

chất và sự duy trì cấu hình ba chiều nguyên thủy của chuỗi polypeptide của
enzyme.
+ Sự thay đổi mức độ ion hóa của cơ chất, điều này cho phép hoặc ngăn cản sự
tạo thành phức enzyme – cơ chất trong trƣờng hợp phản ứng đòi hỏi cơ chất
phải ở dƣới dạng ion.
Nhƣ vậy, hoạt tính của enzyme thay đổi theo pH của môi trƣờng và ngƣời ta có
xác định giới hạn pH tối ƣu cho hoạt động của một enzyme. Ngoài pH tối ƣu,
vận tốc phản ứng giảm đi nhanh chóng và thông thƣờng ngoài giới hạn pH tối
ƣu khoảng hai đơn vị thì vận tốc phản ứng không đáng kể (thấp hơn ít nhất 100
lần).
 Tác nhân ức chế enzyme (inhibitor).
- Ức chế thuận nghịch:
+ Ức chế cạnh tranh (compertitive inhibitor) tâm xúc tác enzyme với cơ
chất. Chất ức chế cạnh tranh có hình dạng giống cơ chất do vậy dễ dàng tạo
phức EI ngăn cản tạo phức ES.
Cách khắc phục: tăng nồng độ cơ chất.
+ Ức chế không cạnh tranh:
Ức chế không cạnh tranh chung (noncompertitive inhibitor). Chất ức
chế gắn lên vị trí sát tâm hoạt động enzyme, không ngăn cản cơ chất
gắn lên tâm hoạt động.



13
Ức chế cạnh tranh riêng (uncompertitive inhibitor). Chất ức chế gắn
lên vị trí tâm hoạt động enzyme trong phức ES tạo thành, mà không
gắn lên enzyme tự do.
- Ức chế không thuận nghịch: xảy ra khi chất ức chế tạo liên kết hóa trị khá bền
vững với enzyme. Ngoài ra trong nhóm này còn có một số chất ức chế khá đặc
biệt, bình thƣờng chúng không hoạt động và chỉ hoạt động khi đƣợc gắn hóa trị

với tâm hoạt động và làm mất hoàn toàn hoạt tính enzyme do đó chúng đƣợc gọi
là chất ức chế tự sát (suicide inhibitor).
2.2.2 Giới thiệu về Enzyme amylase
Enzyme amylase là nhóm enzyme phân giải tinh bột (carbohydrate).
Enzyme amylase bao gồm: α-amylase, β- amylase, R-Enzyme (α-1,6-glycosidase),
Amyloglycosidase…
Tùy theo nguồn gốc mà mỗi loại enzyme có trọng lƣợng phân tử, hoạt tính, điều kiện
phản ứng khác nhau.
 α –amylase từ vi khuẩn (chủ yếu từ Bacillus subtilis var amyloliquefaciens và
var amylosacchariticus).
MW : 49000 Da ( theo Fisher và Stein – 1960)
Hoạt tính: 4x10
5
SKB/g protein enzyme
Điều kiện phản ứng:
T
op
: 65-70
o
C
pH
op :
6,5-7,5
 α –amylase từ nấm Aspergillus orizae
MW : 51000 Da
Hoạt tính: 50000 SKB/g protein enzyme
Điều kiện phản ứng:
T
op
: 50-60

o
C
pH
op
: 5
 α –amylase từ mầm mạch.
MW: 42000-54000 Da
Điều kiện phản ứng:
T
op
: 70
o
C



14
pH
op
: 5,5
(đơn vị SKB là lƣợng amylase thủy phân 1g dextrin giới hạn dạng β đến điểm mất
màu với Iod trong thời gian 1 giờ, điều kiện chuẩn).



Hình 2.1: cấu trúc bậc 3 của α - amylase.
2.2.3 Quá trình thủy phân tinh bột
Enzyme Amylase cắt tinh bột tạo Dextrin và đƣờng.
 α –amylase cắt các liên kết glycoside nằm bên trong phân tử tinh bột.
 β- amylase cắt từng cặp đƣờng đôi (maltose) từ phía đầu của mạch

carbohydrate.
 R-Enzime còn gọi là α-1,6-glycosidase cắt các liên kết α-1,6-glycoside tại
điểm xuất pháp mạch nhánh.
 Ngoài ra Enzyme Amyloglycosidase lại có khả năng cắt từng đơn vị đƣờng
đơn (glucose) từ đầu của mạch carbohydrate.




15


Hình 2.2: Quá trình thủy phân Amylose.



16


Hình 2.3. Quá trình thủy phân Amylopectin và Glycogen.






17

2.3. Giới thiệu về Trichoderma
Persoon ex Gray (1801) phân loại Trichoderma nhƣ sau:

Giới: Fungi
Ngành: Ascomycota
Lớp: Euascomycetes
Bộ: Hypocreales
Họ: Hypocreaceae
Giống: Trichoderma
Theo hai nhà khoa học Elisa Esposito và Manuela da Silva (1968 ), Trichoderma thuộc
họ Hypocreaceae, lớp Nấm túi Ascomycetes; các loài Trichoderma đƣợc phân thành 5
nhóm:
Trichoderma.
Longibrachiatum.
Saturnisporum.
Pachybasium.
Hypocreanum.
Trong đó, 3 nhóm Trichoderma, Pachybasium, Longibrachiatum có giai đoạn
teleomorph (hình thái ở giai đoạn sinh sản hữu tính) là Hypocrea; nhóm
Hypocreanum hiếm khi gặp dƣới dạng teleomorph độc lập; nhóm Saturnisporum
không tìm thấy hình thức teleomorph .
2.3.1. Đặc điểm hình thái
Trichoderma là một loài nấm bất toàn, sinh sản vô tính bằng đính bào tử từ khuẩn
ty .
Khuẩn ty của vi nấm không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ở cuối
nhánh phát triển thành một khối tròn mang các bào tử trần không có vách ngăn, không
màu, liên kết nhau thành chùm nhỏ ở đầu cành nhờ chất nhầy. Bào tử hình cầu, hình
elip hoặc hình thuôn. Khuẩn lạc nấm có màu trắng hoặc từ lục trắng đến lục, vàng
xanh, lục xỉn đến lục đậm. Các chủng của Trichoderma có tốc độ phát triển nhanh,
chúng có thể đạt đƣờng kính khuẩn lạc từ 2-9 cm sau 4 ngày nuôi cấy ở 20
O
C.

18

Hình 2.4: Khuẩn ty và cơ quan sinh bào tử của Trichoderma.
2.3.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá.
Các loài Trichoderma thƣờng xuất hiện ở đất acid.
Trichoderma phát triển tốt ở bất cứ pH nào nhỏ hơn 7 và có thể phát triển tốt ở đất
kiềm nếu nhƣ ở đó có sự tập trung một lƣợng CO
2
và bicarbonat .
Trichoderma có thể sử dụng nhiều nguồn thức ăn khác nhau từ carbonhydrat,
amino acid đến ammonia.
Hình 2.5. Trichoderma harzianum KRL-AG2 phát
triển trên môi trƣờng PDA (Vùng màu xanhchứa
bào tử).
Hình 2.4. Khuẩn ty và cơ
quan sinh bào tử của
Trichoderma



19
PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

3.1. Vật liệu
3.1.1. Thời gian và địa điểm
Thí nghiệm đƣợc thực hiện từ tháng 3/2006 đến tháng 6/2006.
Địa điểm thí nghiệm tại Phòng Vi Sinh khoa Công Nghệ Thực Phẩm trƣờng Đại Học Nông

Lâm..
3.1.2. Đối tƣợng thí nghiệm
Các thí nghiệm đƣợc thực hiện trên 3 chủng nấm Trichoderma : D13, D14, D16 đƣợc cung
cấp từ phòng thí nghiệm trƣờng Đại Học Khoa Học Tự Nhiên.
3.1.3. Dụng cụ và hóa chất
3.1.3.1. Dụng cụ
-Ống nghiệm : 100 ống.
-Đĩa Petri: 15 cái.
-Becher: 1000 ml, 500 ml, 250 ml, 100 ml
-Phễu thủy tinh:
-Pipet bầu : 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml
-Pipet thẳng: 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml
-Bình định mức : 100 ml
-Buret: 1 cái.
-Erlen: 100 ml ,250 ml
-Nồi hấp.
-Và các dụng cụ thông thƣờng trong phòng thí nghiệm.
3.1.3.2. Hóa chất – Môi trƣờng
 Môi trƣờng PGA ( môi trƣờng phân lập nấm mốc Trichoderma)
Khoai tây 200 g
Glucose 20 g
Agar 20 g
Nƣớc cất 1lit



20
Hấp khử trùng ở 121
o
C trong 30 phút, pH=6,8

 Môi trƣờng Zapeck ( môi trƣờng cảm ứng tổng hợp enzym amylase)
NaNO
3
2 g
K
2
HPO
4
1g
MgSO
4
0,5g
KCl 0,5g
FeSO
4
0,01g
Agar 20 g
Nƣớc cất 1000 ml
Tinh bột 10 g
hấp khử trùng 121
0
C , 30 phút, pH 5.0 -5.5
 Môi trƣờng bán rắn
Môi trƣờng nuôi cấy ba chủng Trichoderma. sp để thu dịch chiết khảo sát hoạt tính
enzym amylase
Trấu 55 g
Cám gạo 30 g
Đƣờng thùng 4g
Bã khoai mì 5 g
Bột bắp 5 g

(NH4)
2
HPO
4
0,1g
Ure 0,2g
CaCl
2
0,1g
KCl 0,05g
MgSO
4
0,05g
HCl 0,05g
Nƣớc bổ sung
Hấp khử trùng ở 121
o
C trong 45 phút




21
3.2. Phƣơng pháp
3.2.1. Phƣơng pháp định tính và sơ bộ định lƣợng hoạt độ enzyme amylase bằng cách đo
đƣờng kính vòng phân giải
Chọn ra một chủng cho hoạt tính enzyme amylase cao để tiếp tục khảo sát động học và các
yếu tố ảnh hƣởng.
Cách tiến hành :
 Chuẩn bị các môi trƣờng cảm ứng của các hệ enzym cần định hoạt tính và sơ bộ định

lƣợng .
+Chuẩn bị môi trƣờng Zapeck (0,5% tinh bột) cho 20 đĩa petri (400ml)
NaNO
3
0,8 g
K
2
HPO
4
0,4 g
MgSO
4
0,2 g
KCl 0,2 g
FeSO
4
0,004 g
Agar 8 g
Nƣớc cất 400 ml
Tinh bột 2 g
hấp khử trùng 121
0
C , 30 phút, pH 5.0 -5.5
 Cho vào ống nghiệm 20 ml môi trƣờng, hấp khử trùng 121
0
C trong 30 phút
 Sử dụng đĩa petri vô trùng, kích thƣớc bằng nhau. Cho 20 ml môi trƣờng trên từ ống
nghiệm vào.
 Cấy chấm mỗi chủng Trichoderma vào giữa đĩa Petri.
 Ủ nhiệt độ phòng ( 25-30

0
C ) trong 3 ngày
 Cho thuốc thử và đo đƣờng kính vòng phân giải.
Thuốc thử Lugol: 0,5g I
2
và 5g KI trong nƣớc thành 200 ml.






22
3.2.2. Phƣơng pháp nuôi cấy Trichoderma và tách chiết các hệ enzyme amylase từ môi
trƣờng nuôi cấy
- Chuẩn bị môi trƣờng
Trichoderma đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng bán rắn theo phƣơng pháp nuôi cấy
đƣợc cho vào các khay nhựa với hàm lƣợng 100 gam môi trƣờng/khay. Hấp khử trùng
nhiệt độ 121
0
C, 1atm trong 40 -45 phút
- Chuẩn bị nguồn giống
Tạo huyền phù bào tử trong 10 ml nƣớc cất vô trùng, tiến hành đếm bào tử
Trichoderma bằng phòng đếm hồng cầu , sao cho vào khay một thể tích dịch huyền phù
đạt mật độ là 1 -1.5X10
5
bào tử /g môi trƣờng .
- Nuôi cấy
Ủ nhiệt độ phòng trong thời gian thích hợp, sau đó, enzym đƣợc tách chiết bằng cách:
 Cân 10g canh trƣờng cho vào Erlen. Cho vào 100ml nƣớc cất và để trên máy lắc trong

1 giờ.
 Sau 1 giờ, tiến hành lọc qua vải lọc.
 Dịch lọc đƣợc đem ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút.
 Thu lấy dịch ly tâm, định mức tới 100ml, sử dụng nhƣ dịch enzyme thô.
3.2.3. Phƣơng pháp khảo sát động học hệ enzyme amylase:
 Sử dụng chủng Trichoderma có hoạt tính cao, tiến hành nuôi cấy trong môi trƣờng bán
rắn.
 Khảo sát sự biến đổi hoạt tính của hệ enzyme amylase thủy phân chủ yếu theo thời gian
nuôi cấy : 24h, 36h, 48h, 60h, 72h, 84h.. Tại mỗi thời điểm nuôi cấy, cho khoảng 10 g
môi trƣờng hoà tan trong 100ml nƣớc cất, đem lọc thu dịch lọc. Dịch chiết đƣợc đem xác
định họat tính hệ enzym amylase.







23
3.2.4. Phƣơng pháp khảo sát ảnh hƣởng của pH đối với hoạt tính của enzyme
 Chuẩn bị các dung dịch đệm ở các pH khác nhau
Dung dịch đệm Mc Hvaine ( pH 2,2-8)
A - Dung dịch acid citric 0,1M: 21,008 g acid citric trong 1 lit dung dịch.
B - Dung dịch Na
2
HPO
4
0,2M: 35,62 g Na
2
HPO

4
.2H
2
O (hoặc 71,7 g
Na
2
HPO
4
.12H
2
O) trong 1 lit dung dịch.
Bảng 3.1. dung dịch đệm Mc Hvaice (pH 2,2-8)
X pH X pH X pH X pH
19,60 2,2 12,90 3,8 8,85 5,4 3,53 7,0
18,76 2,4 12,29 4,0 8,40 5,6 2,61 7,2
17,82 2,6 11,72 4,2 7,91 5,8 1,83 7,4
16,83 2,8 11,18 4,4 7,37 6,0 1,27 7,6
15,89 3,0 10,65 4,6 6,78 6,2 0,85 7,8
15,06 3,2 10,14 4,8 6,15 6,4 0,55 8,0
14,30 3,4 9,70 5,0 5,45 6,6
13,56 3,6 9,28 5,2 4,55 6,8


Bảng 3.2. Các dung dich đệm pH 3-6,5 ( theo Mc Hvaice)
X
15,89 13,93 12,29 10,92 9,70 8,63 7,37 5,80
pH
3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5

Để nhận đƣợc các dung dịch có pH tƣơng ứng, cần thêm dung dịch “B” vào “X” ml

dung dịch “A” để đạt thể tích cuối cùng là 20 ml.







24

 Chuẩn bị canh trƣờng nuôi cấy Trichoderma, thời gian nuôi cấy là thời gian tối ƣu đã
đƣợc xác định ở mục trên.
 Sử dụng dịch chiết enzyme thô để khảo sát ảnh hƣởng của pH lên hoạt tính enzyme.
 Cân 10g canh trƣờng, thêm vào 100ml dung dịch đệm có pH cần khảo sát.
 Dựng đồ thị biểu diễn sự biến thiên của hoạt tính enzyme đối với pH. Suy ra pH tối ƣu
(pH
op
) của enzyme .
3.2.5. Phƣơng pháp khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đối với họat tính của enzyme
 Chuẩn bị canh trƣờng nuôi cấy Trichoderma, thời gian nuôi cấy là thời gian tối ƣu đã
đƣợc xác định .
 Sử dụng dịch chiết enzyme thô để khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đối với họat tính của
enzyme : cân 10g canh trƣờng, thêm vào 100ml dung dịch đệm có pH tối ƣu đã đƣợc
xác định .
 Xác định hoạt tính của enzyme ở các nhiệt độ : 30
o
C, 40
o
C, 50
o

C, 60
o
C, 70
o
C, 80
o
C.

Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên của hoạt tính enzyme đối với nhiệt độ nuôi cấy, suy ra
nhiệt độ tối ƣu ( t
op
) của enzyme.

3.2.6. Phƣơng pháp xác định hoạt tính của hệ enzym amylase
Phƣơng pháp HEINKEL (1956)
3.2.6.1 Nguyên tắc
 Xác định lƣợng tinh bột bị phân giải dựa trên cơ sở xác định mức độ giảm cƣờng độ
màu của hỗn hợp phản ứng với dung dịch Iod.
 Đơn vị hoạt động của enzyme là lƣợng enzyme có khả năng phân giải 1mg tinh bột sau
30 phút ở 30
o
C.

25
3.2.6.2 Hóa chất
-Dung dịch NaCl 0,1%: hòa tan 0,1g NaCl trong nƣớc thành 100ml.
-Dung dịch Sulfosalicylic acid 20%: hòa tan 20g Sulfosalicylic acid trong nƣớc thành 100ml.
-Dung dịch Iod (I
2
): hòa tan 1g Iod vào 5ml dung dịch có chứa 2g KI, thêm nƣớc cất đến
100ml. Khi dùng pha loãng dung dịch này 450 lần.
-Dung dịch NaH
2
PO
4
0,05M: hòa tan 1,9502 g NaH
2
PO
4
.2H
2
O trong nƣớc thành 250ml.
-Dung dịch Na
2
HPO
4
0,05M: hòa tan 0,8962 g Na
2
HPO
4
.12H
2
O trong nƣớc thành 50ml.

-Dung dịch đệm phosphate 0,05M, pH 6,0: trộn chung 87,7 ml dung dịch NaH
2
PO
4
0,05M,
12,3 ml dung dịch Na
2
HPO
4
0,05M và 100 ml nƣớc cất.
-Dung dịch tinh bột 1%: hòa tan 1g tinh bột trong dung dịch đệm phosphate 0,05M, pH 6,0
thành 100 ml.
-Dung dịch tinh bột tiêu chuẩn 1%: hòa tan 1g tinh bột trong nƣớc cất thành 100 ml. Từ dung
dịch này , chuẩn bị các dung dịch có chứa 2, 4, 6, 8, và 10 mg tinh bột trong 1 ml.
+ Lập đồ thị tiêu chuẩn: lấy 0,1 ml dung dịch đã chuẩn bị nhƣ trên, thêm 0,1 ml dung dịch
NaCl 0,1%, 0,2 ml dung dịch đệm phosphate, 0,1 ml nƣớc cất và 0,5 ml dung dịch
Sulfosalicylic acid 20%, lắc đều rồi thêm 9 ml dung dịch Iod đã pha loãng 450 lần. So màu ở
bƣớc sóng 560 nm.
+ Vẽ đồ thị tiêu chuẩn, trên trục hoành ghi số mg tinh bột , trục tung ghi hiệu số đọc đƣợc của
mẫu có tinh bột so với mẫu không có tinh bột .
3.2.6.3 Cách tiến hành
 Cho vào ống nghiệm 1 ml dung dịch tinh bột 1%, 1 ml dung dịch NaCl 0,1% và 2 sml
dung dịch đệm phosphate 0,05M, pH 6,0. Lắc đều, để ở 30
o
C trong 15 – 20 phút để
dung dịch đạt đến 30
o
C, thêm vào hỗn hợp 1ml dung dịch enzyme đã đạt đến 30
o
C. Lắc

đều và tiếp tục giữ ở 30
o
C trong 30 phút. Lấy ống nghiệm ra khỏi và cho ngay vào 5ml
dung dịch Sulfosalicylic acid 20% để làm ngừng phản ứng.
 Song song với mẫu thí nghiệm, làm mẫu kiểm tra cũng tƣơng tự nhƣ trên nhƣng cho
dung dịch Sulfosalicylic acid 20% vào trƣớc, rồi mới cho enzyme vào sau.