NGHIÊN cứu TÁCH CHIẾT POLYSACCHARIDE TỪ NẤM SÒ TRẮNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HUẾ
KHOA HÓA

BÁO CÁO
NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT POLYSACCHARIDE
TỪ NẤM SÒ TRẮNG – Pleurotus Florida
TRỒNG TẠI THỪA THIÊN HUẾ VÀ TẠO DẪN XUẤT SULFATE HÓA

Giảng viên cố vấn:

Sinh viên thực hiện:

1. Nguyễn Tường Diễm Châu
2. Phạm Thị Khánh Linh
3. Huỳnh Thị Kim Anh

ThS. Lê Trung Hiếu

Huế, 01/ 2016

1


TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

-

Nấm sò trắng: quan tâm và nghiên cứu.

-

Bị thu hút bởi hoạt tính của các hợp chất PS.

- Cấu trúc phong phú

tính chất; hoạt tính sinh học đa dạng: kháng khuẩn, ức chế ung thư,...

- Nghiên cứu cung cấp thông tin về thành phần hóa học của loài nấm này là rất cần thiết.

2


MỤC TIÊU ĐỀ TÀI

Cung cấp thông tin về thành phần, cấu trúc các loại polysaccharide tách chiết từ nấm Sò
trắng và tạo được dẫn xuất PS - sulfate (Pleurotus florida).

ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Polysaccharide tách chiết từ nấm Sò trắng (Pleurotus florida) trồng tại Thừa Thiên
Huế.

3


TỔNG QUAN
1. Tổng quan về nấm Sò trắng
Danh pháp khoa học

-

Bộ Agaricales

-

Họ Pleurotaceae

-

Chi Pleurotus

-

Loài Pleurotus Florida

Phân bố thực vật của chi Pleurotus

Thế giới: 2 vùng ôn đới và nhiệt đới
Ở Việt Nam có điều kiện tốt cho nấm Sò trắng sinh trưởng và phát triển quanh năm

4


- Thành phần chính được các nhà khoa học quan tâm là polysaccharide với các hoạt tính sinh
học kỳ diệu.

Polysaccharide

5

6

3.

Tách chiết, phân đoạn, tinh chế và định lượng PS trong nấm Sò

•

1.

Nghiên cứu cấu trúc của heteropolysaccharide

•

2.

Tạo dẫn xuất PS – sulfate

•

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

trắng


PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1. Chiết rắn-lỏng, lỏng-lỏng: chiết xuất và tinh chế các nhóm hợp chất

2. Định lượng: tổng carbohydrate, protein hữu cơ

3. Tạo dẫn xuất sulfate từ PS nấm Sò trắng

4. Phân đoạn PS

5. Xác định thành phần monosaccharide và vị trí liên kết glycoside của PS
7


Phương pháp chiết rắn - lỏng và chiết lỏng - lỏng

m (g) mẫu nấm

- Chiết: dung môi khác nhau, 5 lần
- Nhiệt độ chiết: nhiệt độ sôi của dung môi
- Thời gian: 5 giờ

Bã nấm

Dịch

Cất đuổi dung môi

Cao tương ứng với dung môi được sử dụng

Hình 1. Sơ đồ chiết cao chứa các nhóm hợp chất
hữu cơ
từ mẫu nấm Sò trắng.

8


Phương pháp chiết rắn - lỏng và chiết lỏng - lỏng

m (g) mẫu nấm
o
Loại tạp sơ bộ bằng EtOH 96 , 2 lần
0
100 C, 5 giờ

Mẫu đã loại tạp

o
Chiết hồi lưu bằng nước 100 , 5-6 lần

Bã nấm

Dịch nước

Tủa bằng ethanol 96

Dịch

o

o
Để qua đêm ở nhiệt độ – 4 C

Cao PS

Hình 2. Sơ đồ tách chiết PS thô từ mẫu nấm
9


Phương pháp chiết rắn - lỏng và chiết lỏng - lỏng

Cao PS

Hòa tan trong nước vừa đủ

Dịch nước

1. Cô
2. CHCl : n-butanol = 1:4
3
o
3. Tủa bằng EtOH 96 theo tỉ lệ xác định
4. Rửa lần lượt bằng EtOH, acetone, sấy khô

PS đã tinh chế

Hình 3. Sơ đồ tinh
10

chế PS.


Tạo dẫn xuất sulfate từ PS nấm Sò trắng

Hình 4. Quy trình tạo dẫn xuất PS-sulfate
từ PS
với tác nhân là phức SO -Pyr .

11


Phân đoạn PS
Cao PS
Hòa tan
Dịch PS
o
- Tủa trong dịch EtOH 96 ,V
:V
= 1: 0,5
dịch PS EtOH
o
- Để qua đêm ở nhiệt độ - 4 C

Dịch PS-E32

Cao PS-E32

o
1. Tủa bằng EtOH 96 , V
:V
= 1: 1
dịch PS EtOH
o

2. Để qua đêm ở nhiệt độ - 4

Cao PS-E46

Dịch PS-E46
o
1. Tủa bằng EtOH 96 , V

dịch PS
o
2. Để qua đêm ở nhiệt độ - 4 C

Cao PS-E68

:V
= 1: 2,5
EtOH

Dịch PS-E68

Hình 5. Sơ đồ phân đoạn PS theo độ phân cực của dung môi
ethanol có nồng độ khác nhau.

12


Phân đoạn PS

100 mL dung dịch PS-E68, 5 mg/mL

1. 100 mL (NH ) SO 60%
42 4
o
2. 25 C, để trong 24 giờ
3. Ly tâm 8500 vòng/phút, 20 phút

Kết tủa

Dịch phân tán tốt

 
 
 
 

1. Hòa tan bằng nước
2. Thẩm tách
o
3. Tủa bằng EtOH 96

1. Thẩm tách
2. Tủa bằng EtOH

 
 
 
PS-E68-2
 

PS-E68-1

 
 

Hình 6.  Sơ đồ phân đoạn PS-E68 theo khả năng tạo kết tủa với (NH 4)2SO4.
 
 

13


Xác định thành phần monosaccharide và
vị trí liên kết glycoside của PS

Hình 7 . Quy trình xử lý mẫu PS trước khi phân tích GC-MS để xác định liên kết glycoside.
14


5 (mg) mẫu PS Methyl hóa

o
4 mL TFA 2 M, 120 C, đun 2 giờ

Thủy phân PS

5 mL MeOH

Bay hơi bằng dòng N / 2 lần
2

O-methyl monosaccharide

4 mL NaBH 0,25 M/ NH OH 1M
4
4

5 mL CH COOH 10%/MeOH
3

Khử monosaccharide

Bay hơi bằng dòng N / 2 lần
2
O-methyl alditol
2 mL dd anhydride acetic : pyridin = 1:1 (v/v)/
o
100 C, 20 phút
Acetyl hóa alditol
5 mL MeOH

Bay hơi bằng dòng N / 2 lần
2

O-methyl-O-acetyl alditol acetate

Phân tích GC-MS

Hình 8. Quy trình xử lí mẫu PS trước khi phân tích GC-MS
để xác định thành phần monosaccharide.

15


KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

16


1. Độ ẩm mẫu
Bảng 1. Độ ẩm của mẫu nấm sò trắng

Độ ẩm (%)
Lần TN

mo (g)

m1 (g)

m2 (g)
Kết quả TN

1

53,17

55,17

54,75

21,00

2

58,59

60,59

60,14

22,50

3

50,19

52,19

51,75

22,00

Tương đối lớn

Yêu cầu

Trung bình

21,83 ± 1,89

17

2. Hàm lượng PS trong nấm Sò trắng
Bảng 2. Hàm lượng PS của mẫu nấm Sò trắng
và các mẫu nguyên liệu so sánh.

STT

Nguyên liệu

Xuất xứ

PS (%)

Thừa Thiên Huế

3,77 ± 0,06

Thừa Thiên Huế

4,24 ± 0,30

Thừa Thiên Huế

6,03 ± 0,01

Brazil

9,20

Nấm Sò trắng
1
(Pleurotus floride)

Nấm Sò xám
2
(Pleurotus sajor-caju)

Nấm Tràm
3
(Boletus feulles)
Nấm Sò trắng
4
(Pleurotus floride)

18


3. Nghiên cứu cao PS tách chiết từ mẫu nấm Sò trắng

Bảng 3. Hàm lượng protein và PS trong cao PS

Hàm lượng polysaccharide (%)

Hàm lượng protein (%)

Lần TN

Kết quả
Kết quả

Trung bình

thí nghiệm

Trung bình

thí nghiệm

1

55,29

2

53,93

3

54,99

Có thể có PS gắn với protein

31,45

54,74 ± 1,77

33,68

32,70 ± 1,14

32,98

19


4. Phân đoạn PS bằng ethanol
4.1. Hàm lượng PS và protein trong các cao phân đoạn PS-E
Bảng 4. Hàm lượng PS trong các cao phân đoạn PS-E
Hàm lượng PS trong PS-E (%)
 
Các phân đoạn PS-E

STT
Kết quả thí nghiệm

Trung bình

 

PS-E32

PS-E46

PS-E68

1

19,08

2

18,82

3

19,24

1

45,92

2

46,86

3

44,92

1

21,37

2

21,36

3

21,96

19,05 ± 0,53

45,90 ± 2,41

21,56 ± 0,85
20


Bảng 5. Hàm lượng protein trong các cao phân đoạn PS-E

Hàm lượng protein trong PS-E (%)
 
Các phân đoạn PS-E

STT
Kết quả thí nghiệm

 

PS-E32

PS-E46

PS-E68

1

31,52

2

31,11

3

31,40

1

26,83

2

26,20

3

26,16

1

37,02

2

37,89

3

37,32

Trung bình

31,34 ± 0,93

26,40 ± 0,93

37,41 ± 1,09
21


4.2. Cấu trúc của PS trong các cao phân đoạn

PS-E32

22


Bảng 6. Các dẫn xuất acetyl methyl alditol monosaccharide; liên kết glycoside và tỷ lệ tương ứng của PSE32
STT

Hợp chất

Liên kết glycoside

Tỷ lệ

1

1,5-di-O-acetyl-2,3,4-tri-O-methyl-α-D-ribopyranoside

→1-D-riboside

0,51

2

1,5-di-O-acetyl-2,3,4 -tri-O-methyl-α-D-xylopyranoside

→1-D-xyloside

0,29

3

1,5,6-tri-O-acetyl-2,3,4-tri-O-methyl-α-D-glucopyranoside

→6-D-glucoside-1→

1,00

4

1,5-di-O-acetyl-2,3,4,6-tetra-O-methyl-α-D-galactopyranoside

→1-D-galactoside

0,37

5

1,5-di-O-acetyl-2,3,4,6-tetra-O-methyl-α-D-glucopyranoside

→1-D-glucoside

0,59

6

1,4,5-tri-O-acetyl-2,3,6-tri-O-methyl-D-galactopyranoside

→4-D-galactoside-1→

0,27

23


PS-E46

24


Bảng 7. Các dẫn xuất acetyl methyl alditol monosaccharide; liên kết glycoside và tỷ lệ tương ứng sau khi
methyl hóa
phân đoạn PS-E46
Liên kết glycoside

STT

Hợp chất

1

1,4,5-tri-O-acetyl-2,3,6-tri-O-methyl-D-galactitol

→4-D-galactoside-1→

0,11

2

1,5-di-O-acetyl-2,3,4,6-tetra-O-methyl-D-glucitol

←1-D-glucoside

0,16

3

1,5,6-tri-O-acetyl-2,3,4-tri-O-methyl-D-glucitol

→6-D-glucoside-1→

0,42

4

1,5,6-tri-O-acetyl-2,3,4-tri-O-methyl-D-galactitol

→6-D-galactoside-1→

1,00

5

2,5,6-tri-O-acetyl-3,4-di-O-methyl-D-mannonitrile

→2,6-D-mannoside-1→

0,92

25

Tỷ lệ