Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp Enzym nhằm định hướng ứng dụng trọng xử lyus nước thải hữu cơ (LV thạc sĩ)

Luận văn Thạc sĩ sinh học

Nguyễn Thị Hồng Hà

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
----------

NGUYỄN THỊ HỒNG HÀ
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC
CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG
SINH TỔNG HỢP ENZYM NHẰM ĐỊNH HƯỚNG
ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ NƯỚC THẢI HỮU CƠ
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60 42 01 03

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Thế Trang

Hà Nội, tháng 12 năm 2014
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

1



Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học

Nguyễn Thị Hồng Hà

CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

1. Nguyễn Thị Hồng Hà, Nguyễn Thế Trang, Nguyễn Thị Đà, Phạm Thị
Thu Phương, Lê Thị Thanh Xuân, Nguyễn Thúy Nga, Lê Quang
Sáng, Phạm Văn Duy (2014). Nghiên cứu đặc điểm sinh học và
phân loại một số chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp
xenlulaza phân lập từ nước thải sau hầm biogas. Tạp chí Khoa học
ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 30,6S.
2. Nguyễn Thế Trang, Nguyễn Thị Hồng Hà, Nguyễn Thúy Nga, Phạm Văn
Duy (2014). Ứng dụng một số chủng vi khuẩn xử lý nước thải giàu
hữu cơ sau hầm biogas, Tuyển tập báo cáo khoa học, Hội thảo khoa
học quốc tế “Năng lượng và tăng trưởng xanh khu vực ASEAN”, Hà
Nội 2014. Nhà xuất bản Khoa học tự nhiên và Công nghệ.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

2



Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học

Nguyễn Thị Hồng Hà

MỞ ĐẦU
Cùng với sự phát triển của các nhà máy chế biến nông sản (đồ hộp từ dứa,
dưa chuột bao tử, cà chua, ngô ngọt ...) một vấn đề đang làm bức xúc các nhà sản
xuất đó là: nước thải, phế thải từ các quá trình chế biến. Chất thải của các nhà máy
chế biến đồ hộp rau quả có hàm lượng các chất hữu cơ rất cao (các loại đường đơn,
axit hữu cơ, protein, xenluloza …), đây là nguồn dinh dưỡng thích hợp cho nhiều
loại vi sinh vật sinh trưởng. Sự sinh trưởng của các vi sinh vật trong môi trường
nước thải giàu hữu cơ từ nông sản khi không có sự kiểm soát của con người thường
tạo ra các sản phẩm có mùi hôi thối tác động xấu tới môi trường sinh thái. Do vậy,
các chất thải cần phải được xử lý trước khi thải ra môi trường tự nhiên. Có nhiều
phương pháp xử lý nước thải hữu cơ khác nhau như: Phương pháp cơ học, hóa học,
hóa lý và sinh học. Đối với nước thải hữu cơ thì phương pháp xử lý sinh học sẽ có
hiệu quả hơn, thân thiện với môi trường hơn, có nhiều ưu điểm cả về hiệu quả kinh
tế và kỹ thuật . Trong các nghiên cứu xử lý nước thải thì việc dùng biện pháp sinh
học đang là ưu tiên hàng đầu. Viê ̣c phân hủy chấ t hữu cơ dựa trên các vi sinh vâ ̣t tự
nhiên có sẵn trong nước thải còn gă ̣p nhiề u ha ̣n ch ế như thời gian phân hủy lâu, quá
trình phân hủy chưa triê ̣t để . Do đó, cầ n tuyể n cho ̣n những chủng vi sinh vật (VSV)
thích hợp bổ sung vào bên cạnh những VSV có sẵn để có thế giúp cho quá trình xử
lý đạt kết quả tốt hơn [1]. Vì vậy, đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số
chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzym nhằm định hướng ứng dụng
trong xử lý nước thải hữu cơ” được thực hiện là cần thiết.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

3



Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Luận văn Thạc sĩ sinh học

Nguyễn Thị Hồng Hà

PHẦN I. TỔNG QUAN
1.1 . TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU XỬ LÝ NƢỚC THẢI HỮU CƠ TRÊN THẾ
GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM
1.1.1. Tình hình nghiên cứu xử lý nƣớc thải hữu cơ trên thế giới
Sự phát triển của phương pháp thứ cấp để xử lý nước thải trong những năm
đầu thế kỷ XX được cho là cải tiến đáng kể nhất đối với y tế công cộng và môi
trường trong suốt thời gian này, đó là việc phát minh ra "bùn hoạt tính" cho quy
trình xử lý nước thải. Gilbert Fowler và cộng sự tại Đại học Manchester được tiến
hành tại Trạm Thí nghiệm Lawrence ở Massachusetts liên quan đến việc sục khí
vào nước thải trong bình đã được phủ một lớp tảo. Các đồng nghiệp của Fowler,
Edward Ardern và William Lockett, những người đã triển khai nghiên cứu cùng với
Văn phòng công ty đường sông Manchester ở công trình xử lý nước thải
Davyhulme. Thí nghiệm trên được thực hiện trong một lò phản ứng bằng cách hút
ra và thu vào, việc xử lý cho hiệu quả cao hơn. Họ sục khí liên tục cho nước thải
trong khoảng một tháng và kết quả đạt được là nitrat hóa hoàn toàn các nguyên liệu
mẫu. Điều đó chỉ ra rằng bùn đã hoạt hóa các chất (một cách tương tự như than hoạt
tính) quá trình được đặt tên là bùn hoạt tính. Kết quả đã được công bố trong công
trình tại Hội thảo 1914, và lần đầu tiên một hệ thống quy mô đầy đủ với dòng chảy
liên tục được lắp đặt tại Worcester hai năm sau đó. Do hậu quả của chiến tranh thế

giới thứ nhất phương pháp xử lý mới được truyền bá nhanh chóng, đặc biệt là Hoa
Kỳ, Đan Mạch, Đức và Canada [26]. Vào cuối những năm 1930, việc xử lý nước
thải bằng bùn hoạt tính là quá trình chủ yếu được sử dụng trên toàn thế giới. Trong
bùn hoạt tính có nhiều chi vi sinh vật khác nhau
Bacillus,

Bacterium,

Corynebacterium,

: Actinomyces, Arthrobacer,

Desulfotomacillium,

Micrococcus,

Pseudomonas, Sarcina … Chúng oxy hóa rượu , axit béo , paraffin, hydrocacbon và
các hợp chất khác.
Ở Mỹ, hàm lượng nitơ trong nước thải thường dao động trong khoảng 20 ÷
85 mg/l trong đó nitơ ở dạng hợp chất hữu cơ trung bình từ 8 ÷ 35 mg/l, hàm lượng
NH3 từ 12 ÷ 50 mg/l. Hàm lượng photphat trong nguồn nước không ô nhiễm nhỏ
hơn 0,01 mg/l. Theo quy định của Hà Lan, tiêu chuẩn của Việt Nam, hàm lượng
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

4

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Luận văn Thạc sĩ sinh học

Nguyễn Thị Hồng Hà

photphate trong nước uống không được vượt quá 6 mg/l. Theo tiêu chuẩn của cộng
đồng chung châu Âu, trong nước sinh hoạt, hàm lượng photphat không được vượt
quá 2,18 mg/l [4].
Xử lý nước thải của quá trình chế biến rau quả các nhà khoa học Thái Lan đã
sử dụng chủng nấm men Candida utilis CBS1517 có khả năng đồng hóa tốt các loại
đường và axit hữu cơ có nhiều trong thành phần nước thải, kết quả thu được cho
thấy sau 96 giờ xử lý trong điều kiện phòng thí nghiệm là COD giảm 89,9 % và pH
tăng từ 3,5 lên 8,5 [36]. Mô ̣t số kế t quả nghiên cứu xử lý nước thải chăn nuôi lơ ̣n
bằ ng quá triǹ h SBR hoă ̣c tương tự đươ ̣c tổ ng hơ ̣p : Trong nghiên cứu của Bortone
G. (1992) hiệu quả xử lý COD và T-N của quá trình SBR cấp nước một lần đạt khá
cao, tương ứng là khoảng 93 % và 88 ÷ 93 %. Tải trọng COD và T-N cũng đạt cao
lần lượt là 0,37 kg/(m3.ngày) và 0,13 kg/(m3.ngày) [28]. Nghiên cứu của Chang
Won Kim (2000) hiệu quả xử lý COD ở chế độ cấp nước một lần đạt 57 ÷ 87 %. Tải
trọng COD và T-N lần lượt là 1,0 kg/(m3.ngày) và 0,2 kg/(m3.ngày) [29]. Quá trình
sục khí luân phiên cấp nước liên tục trong nghiên c ứu của Jiang Cheng (2011) cho
hiệu quả xử lý khá cao, của COD là 57 %, T-N là 91 % [31]. Nghiên cứu của
Mohammad N. (2011) với quá trình SBR cấp nước một lần cho hiệu quả xử lý COD
và T-N lần lượt là 80,3 % và 61 % [34]. Trong nghiên cứu của Zang và đồng tác giả
(2006) cho hiệu quả xử lý cao hơn cả, đối với cả COD và T-N tương ứng là 96,3 %
và 97,5 %; tải trọng COD và T-N cũng đạt rất cao lần lượt là 2,1 kg/(m3.ngày) và
0,28 kg/(m3.ngày), nước thải trong nghiên cứu này có COD và tỉ lệ COD/T-N rất
cao và các tác giả đã đưa thêm các giai đoạn kỵ khí vào trước và giữa các giai đoạn
thiếu khí/hiếu khí, do đó đã nâng cao được tải trọng xử lý COD. Mặt khác, các tác

giả đã thực nghiệm ở thời gian lưu tương đối lớn, tỉ lệ COD/T-N và tỉ lệ lưu nước
(n=9) rất cao, vì vậy cũng đã nâng cao được hiệu suất xử lý T-N [38].
1.1.2. Tình hình nghiên cứu xử lý nƣớc thải hữu cơ ở Việt Nam
Xử lý nước thải hiện nay luôn là vấn đề thời sự nóng bỏng và nổi cộm ở Việt
Nam hiện nay, theo dự báo của Tổ chức Kinh tế thế giới thì Việt Nam sẽ là một
trong những nước có tốc độ phát triển kinh tế vào loại nhanh trên thế giới với tốc độ
tăng trưởng được dự báo là 7 % trong thập kỷ tới. Tuy nhiên, việc tăng trưởng kinh
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

5



Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Luận văn Thạc sĩ sinh học

Nguyễn Thị Hồng Hà

tế một cách nhanh chóng và mạnh mẽ cũng đồng thời tạo nên những thách thức áp
lực tác động về mặt môi trường, trong đó, tác động của chất thải rắn và nước thải
đang là vấn đề nổi cộm ở Việt Nam.
Hiện nay, ô nhiễm môi trường là vấn đề đang được quan tâm không chỉ ở
Việt Nam mà còn ở nhiều quốc gia trên thế giới. Theo báo cáo môi trường Quốc gia
năm 2010 của Bộ Tài Nguyên và Môi Trường, từ năm 2007 đến năm 2009, ô nhiễm
môi trường nước mặt ở tất cả các chỉ số đều vượt quá tiêu chuẩn cho phép theo
QCVN 40:2011/BTNMT. Các chỉ số COD, BOD đều vượt quá tiêu chuẩn từ 5 ÷ 10

lần. Hàm lượng NH4+ trong môi trường nước mặt của sông Nhuệ, sông Đáy và sông
Cầu đều vượt quy chuẩn cho phép QCVN 40:2011/BTNMT cho nước mặt phù hợp
với việc bảo tồn động thực vật thủy sinh là là 0,2 mg/l [17].
Nước thải chăn nuôi là một trong những nguyên nhân gây ô nhiễm nguồn
nước. Hàm lượng nitơ tổng số nước thải chăn nuôi nằm trong khoảng từ 512 ÷ 594
mg/l, trong đó NH3 từ 304 ÷ 471 mg/l, hàm lượng photpho tổng số từ 13,8 ÷ 62
mg/l [6]. Ngày nay, cùng với sự phát triển của dân số, rác thải sinh hoạt ngày một
gia tăng, nước rỉ rác từ các hố chôn lấp tại khu xử lý rác thải gây ảnh hưởng rất lớn
đến đời sống của người dân xung quanh, gây ô nhiễm nguồn nước mặt và nước
ngầm quanh khu vực. Tổng hàm lượng nitơ trong nước thải rỉ rác dao động trong
khoảng từ 200 ÷ 2000 mg/l, hàm lượng amoni cao, trung bình 200 mg/l, trong khi
đó tiêu chuẩn cho phép là 0,2 mg/l [11].
Với xu hướng hội nhập nền kinh tế quốc tế, đặc biệt từ khi Việt Nam gia
nhập WTO, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của quá trình công nghiệp hoá đất
nước, chất thải công nghiệp cũng đang ngày một gia tăng về khối lượng, đa dạng về
chủng loại và đang là vấn đề cấp bách của xã hội, đòi hỏi phải có nhận thức đúng
đắn và đầu tư thích đáng cho vấn đề xử lý nước thải. Hiện nay công nghệ xử lý
nước thải bị ô nhiễm các hợp chất hữu cơ trên thế giới và Việt Nam chủ yếu là sử
dụng các biện pháp sinh học, trong đó phương pháp xử lý hiếu khí và xử lý kị khí là
phổ biến nhất, với nguồn nước thải có mức độ ô nhiễm cao thông thường người ta
xử lý kết hợp kị khí và hiếu khí. Kết quả nghiên cứu của Vũ Thúy Nga và các cộng
sự cho thấy có thể cải thiện chất lượng nước thải chế biến tinh bột sắn bằng chế
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

6

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Luận văn Thạc sĩ sinh học

Nguyễn Thị Hồng Hà

phẩm vi sinh vật. Để nhằm khắc phục tình trạng ô nhiễm do nước thải chế biến tinh
bột sắn, công trình nghiên cứu tập trung tuyển chọn bộ giống vi sinh vật có hoạt
tính sinh học cao, sản xuất và ứng dụng chế phẩm vi sinh vật để nâng cao hiệu quả
xử lý nước thải sau biogas của nhà máy chế biến tinh bột sắn. Kết quả nghiên cứu
đã tuyển chọn được 3 chủng vi sinh vật gồm Bacillus velezensis, Streptomyces
fradiae và Nitromonas sp. có khả năng chuyển hóa tốt hợp chất hữu cơ trong nước
thải chế biến tinh bột sắn [15]. Nghiên cứu về ứng dụng vi khuẩn tích lũy polyphotphat trong xử lý nước thải của Lê Quang Khôi và các cộng sự cho thấy các
dòng vi khuẩn tích lũy poly-P được tuyển chọn có hiệu suất loại bỏ photphat hòa tan
cao. Hai dòng vi khuẩn Acinetobacter radioresistens TGT013L và Kurthia
sp.TGT025L có hiệu quả loại bỏ PO43- cao nhất trong môi trường tổng hợp sau 25
giờ thí nghiệm. Sự loại bỏ PO43- được thực hiện bởi hoạt động của gen ppk 1 dạng
IIA trong quá trình chuyển hóa photphat thành dạng poly-P tích lũy trong tế bào.
Kết quả nghiên cứu mang lại nhiều triển vọng ứng dụng 2 dòng vi khuẩn tích lũy
poly-P trên để xử lý photpho hòa tan trong nước thải chăn nuôi [14].
Với mục đích nghiên cứu phát triển công nghệ xử lý hiệu quả đồng thời hữu
cơ và chất dinh dưỡng trong nước thải ngành chăn nuôi lợn, trong nghiên cứu của
Phạm Thị Hải Thịnh và đồng tác giả, đã nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều
kiện vận hành như tỷ lệ COD/T-N (tỉ lệ giữa nhu cầu oxy hóa học và tổng nitơ) và
chế độ sục khí đến hiệu quả xử lý COD và T-N của quá trình SBR đối với nước
thải chăn nuôi đã qua xử lý kị khí. Với chế độ hai chu trình thiếu - hiếu khí thích
hợp, hiệu quả xử lý COD và T-N đạt khá cao, tương ứng là khoảng 90 % và 80 ÷
85 % [12]. Tuy nhiên nồng độ T-N trong nước thải chăn nuôi lợn là rất cao và thay
đổi trong khoảng khá rộng, vì vậy nghiên cứu nâng cao hiệu quả xử lý nitơ của quá

trình nhằm đáp ứng một cách ổn định các quy chuẩn xả thải là rất cần thiết. Theo
Phan Đỗ Hùng và cộng sự cho thấy ảnh hưởng của tỉ lệ cấp nước thải đến hiệu quả
xử lý của quá trình SBR hai chu trình thiếu - hiếu khí cấp nước hai lần và so sánh
với chế độ cấp nước một lần. Với quá trình SBR hai chu trình thiếu-hiếu khí, cấp
nước hai lần là một giải pháp để nâng cao hiệu quả xử lý T-N của quá trình. Thực
nghiệm cho thấy, khi tăng tỉ lệ cấp nước (tỉ lệ giữa lượng nước thải cấp lần thứ nhất
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

7



Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Luận văn Thạc sĩ sinh học

Nguyễn Thị Hồng Hà

và tổng lượng nước thải xử lý trong một mẻ), lúc đầu hiệu suất xử lý T-N sẽ tăng,
tuy nhiên đến một giới hạn nhất định hiệu suất xử lý T-N sẽ giảm trở lại. Hiệu suất
xử lý T-N ở cả ba tỉ lệ cấp nước nghiên cứu đều khá cao, trong đó ở tỉ lệ 2/3 đạt cao
nhất, trong khoảng 85 ÷ 90 %. Hiệu suất xử lý T-N thực nghiệm ở các tỉ lệ cấp
nước thấp 1/2 và 2/3 khá phù hợp với hiệu suất lý thuyết. Hiệu suất xử lý COD ở
chế độ cấp nước hai lần cũng khá cao, 85 ÷ 90 % ở tỉ lệ cấp nước 2/3, xấp xỉ với
trường hợp cấp nước một lần [5].
1.2. THÀNH PHẦN CƠ BẢN CỦA NƢỚC THẢI HỮU CƠ
1.2.1. Xenluloza trong nƣớc thải

Trong nước thải hữu cơ hàm lượng chiếm xenluloza là thành phần chủ yếu
của các tổ chức thực vật. Trong xác thực vật (nhất là trong thân và rễ) thành phần
hữu cơ chiếm tỷ lệ cao nhất bao giờ cũng là xenluloza. Hàm lượng xenluloza trong
thực vật thường thay đổi trong khoảng 30 ÷ 80 % (tính theo trọng lượng khô), trong
sợi bông hàm lượng này thường vượt trên 90 % [30].
Xenluloza là polysaccarit rất bền vững, được cấu tạo bởi rất nhiều gốc
anhydroglucoza, liên kết với nhau nhờ dây nối β-1,4-glucozit. Mỗi phân tử
xenluloza thường chứa từ 1.400 đến 10.000 gốc glucoza. Khối lượng phân tử
xenluloza rất khác nhau phụ thuộc vào từng loại thực vật (ở bông 150.000 ÷
1.000.000, ở sợi gai lên tới 1.840.000). Trên mỗi chuỗi glucan đơn vị lặp lại không
phải là glucoza mà là xenlobioza. Mỗi phân tử glucoza có dạng “ghế bành”, phân tử
này quay 180o so với phân tử và vị trí β của các nhóm hydroxyl đều ở mặt phẳng
nằm ngang của phân tử.
Xenluloza có cấu trúc lớp sợi song song, các phân tử và các chuỗi xenluloza
gắn với nhau nhờ mạng lưới liên kết hydro, còn các lớp gắn với nhau nhờ lực Vander-Van. Trong tự nhiên, các chuỗi glucan của xenluloza có cấu trúc dạng sợi, đơn
vị sợi nhỏ nhất có đường kính khoảng 3 nm. Các sợi sơ cấp hợp lại thành vi sợi có
đường kính từ 10 ÷ 40 nm, những vi sợi này hợp thành bó sợi to có thể quan sát
dưới kính hiển vi quang học. Toàn bộ lớp sợi này có một lớp vỏ hemixenluloza và
lignin rắn chắc bao bọc bên ngoài. Phân tử xenluloza có cấu trúc không đồng nhất
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

8



Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học

Nguyễn Thị Hồng Hà

gồm hai vùng: Vùng kết tinh có trật tự cao, rất bền vững và vùng vô định hình kém
trật tự và bền vững hơn. Vùng vô định hình có thể hấp thụ nước và trương lên, còn
vùng kết tinh mạng lưới liên kết hydrogen ngăn cản sự trương này. Xenluloza có
cấu trúc đặc, bền chắc cùng với sự có mặt của lớp vỏ hemixenlulo-lignin khiến cho
sự xâm nhập của enzym vào cấu trúc hết sức khó khăn và làm tăng tính kỵ nước của
chuỗi β-1-4-glucan, làm cản trở tốc độ của phản ứng thủy phân.
Xenluloza là hợp chất cacbon chiếm tỷ lệ trọng lớn nhất (50 %) trong tổng số
hydratcacbon tự nhiên và là thành phần hữu cơ chủ yếu của rác, trong giấy, gỗ, thân
cây, cành cây, lá cây, rơm rạ, sợi đay, vải bông, vv…

Hình 1.1. Hình ảnh hợp chất cao phân tử xenluloza [30]
Mầu nâu - cacbon, màu đỏ - oxy, màu trắng - hydro

Xenluloza có cấu trúc rất bền vững. Không tan trong nước, không bị tiêu hóa
trong đường tiêu hóa của người và động vật. Trong dạ dày của động vật nhai lại và
trong đất có nhiều vi sinh vật có khả năng phân giải được xenluloza.
1.2.2. Hemixenluloza trong nƣớc thải
Trong tế bào thực vật hemixenluloza đứng thứ hai về khối lượng. Trong
thành phần của hemixenluloza có nhiều loại đường khác nhau, chính vì vậy tên của
chúng thường được gọi theo tên của một loại đường chủ yếu nào đó có trong thành
phần của chúng. Khối lượng phân tử của hemixenluloza nhỏ hơn rất nhiều so với
xenluloza, thường chúng chỉ có khoảng 150 gốc đường. Các gốc đường đơn này
được nối với nhau bằng các liên kết β-1-4, β-1-3, β-1-6 glucozit. Các hemixenluloza
thường tạo mạch ngắn và phân nhánh, so với xenlulo thì hemixenluloza có cấu trúc
không chặt chẽ dễ bị phân giải bởi axit yếu và kiềm yếu, đôi khi còn bị phân giải
trong nước nóng [30].

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

9



Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Luận văn Thạc sĩ sinh học

Nguyễn Thị Hồng Hà

1.2.3. Protein trong nƣớc thải
Protein là hợp chất cao phân tử chứa nitơ (15 ÷ 17 % tính theo trọng lượng
khô). Protein là thành phần quan trọng của cơ thể động, thực vật. Sự phân giải
protein trải qua các quá trình thuỷ phân protein thành các polypeptit, sau đó là các
axit amin, tiếp theo là các quá trình amon hoá, nitrat hoá và phản nitrat hoá. Quá
trình amon hoá là quá trình chuyển hoá các hợp chất nitơ hữu cơ thành nitơ dạng
khoáng. Quá trình nitrat hoá là quá trình chuyển hoá các chất ammoniac ban đầu
thành axit nitơ sau đó thành axit nitric. Quá trình khử nitrat thành nitơ gọi là phản
nitrat hoá[ 16].
1.2.4. Tinh bột trong nƣớc thải
Tinh bột là một cacbonhyđrat cao phân tử bao gồm các đơn vị D-glucoza nối
với nhau bởi liên kết α-glucozit. Công thức phân tử gần đúng là (C6H10O5)n trong
đó n có giá trị từ vài trăm đến khoảng mười nghìn. Tinh bột có dạng hạt màu trắng
tạo bởi hai loại polyme là amiloza và amilopectin. Amiloza là polime mạch thẳng
gồm các đơn vị D-glucoza liên kết với nhau bởi liên kết α-1,4-glucozit. Amilopectin

là polime mạch nhánh, ngoài chuỗi glucoza thông thường còn có những chuỗi
nhánh liên kết với chuỗi chính bằng liên kết α-1,6-glucozit.
Trong tự nhiên, tinh bột là thành phần chủ yếu của các loại ngũ cốc, củ, quả.
Hàm lượng tinh bột có trong hạt và củ là 40  70 %, trong các phần khác của cây là
4  25 %. Chúng đóng vai trò là nguồn dự trữ năng lượng cho quá trình nảy mầm
của hạt, và là nguồn lương thực chủ yếu của con người. Enzym thủy phân tinh bột
phân hủy chủ yếu liên kết α-glucozit. Nhóm enzym này gồm các enzym: α-amylaza,
β-amylaza, glucoamylaza, dextrinaza [16].
1.2.5. Một số vi sinh vật gây bệnh khác trong nƣớc thải
Các vi sinh vật gây bệnh chủ yếu trong nước thải: Salmonella spp., một vài
loài Salmonella có thể hiện hiện trong nước thải đô thị, kể cả S. typhi (gây bệnh
thương hàn). Doran và cộng sự cho rằng số lượng 700 Salmonella/l; khoảng chừng
đó Shigellae và khoảng 1.000 Vibrio cholera/l thường phát hiện trong nước thải đô
thị của khu vực nhiệt đới. Shigellae và Vibrio cholera nhanh chóng chết đi khi thải
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

10



Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Luận văn Thạc sĩ sinh học

Nguyễn Thị Hồng Hà

ra môi trường. Do đó nếu chúng ta sử dụng một biện pháp xử lý nào đó để loại

được Salmonella thì cũng có thể bảo đảm là phần lớn các vi khuẩn kia đã bị tiêu
diệt. Enteroviruses: Có thể gây các bệnh nguy hiểm như sởi, viêm màng não. Số
lượng của chúng tương đối thấp hơn enteroviruses. Người ta đã chứng minh được
rằng việc loại bỏ các loài vi rút có quan hệ mật thiết với việc loại bỏ các chất rắn lơ
lửng. Ngoài vi sinh vật gây bệnh còn có một số ký sinh trùng: thường thì các bệnh
ký sinh trùng chủ yếu là do Ascaris lumbricoides, trứng của loài ký sinh trùng này
có kích thước lớn (45  70 m  35  50 m).
1.3. VI SINH VẬT PHÂN GIẢI NƢỚC THẢI HỮU CƠ
1.3.1. Vi sinh vật phân giải xenluloza
Xenlulaza đươ ̣c thu từ nhiề u nguồ n nguyên liê ̣u khác nhau như đô ̣ng vâ ̣t (các
nhóm thân mềm, lơ ̣n, bò, gà); thực vâ ̣t (trong ha ̣t ngũ cố c nảy mầ m là đa ̣i ma ̣ch , yế n
mạch, lúa mì, mạch đen) và vi sinh vật (nấ m sơ ̣i, nấ m men, xạ khuẩn và vi khuẩn ).
Tuy nhiên, vi sinh vâ ̣t là nguồ n thu enzym chủ yếu vì thời gian sống ngắn nên thu
đươ ̣c nhiề u lầ n trong năm và chủ đô ̣ng sử du ̣ng nguồ n nguyên liê ̣u rẻ tiề n để
cũng như dễ dàng điều khiể n có đinh
̣ hướng nguồ n enzym

nuôi

hoă ̣c gia tăng lươ ̣ng

enzym. Có rất nhiều chủng vi khuẩn , xạ khuẩn, nấ m mố c và mô ̣t số loài nấ m men
có khả năng sinh tổng hợp xenlulaza.
Các loài vi khuẩn cả hiếu khí lẫn ki ̣khí đề u có khả năng sinh xenlulaza như
Bacillus

subtilis,

Bacillus

licheniformis,

Bacillus

pumilis,

Acidothermus

cellulobuticus. Ngoài ra còn có các loài ưa kiềm như Cephalosporium sp.RYM-202
[9].
1.3.2. Vi sinh vật phân giải hemixenluloza
Có nhiều loại vi sinh vật có khả năng phân giải hemixenluloza. Các vi sinh
vật có khả năng phân giải xenluloza khi sản sinh ra xenlulaza thường sinh ra
hemixenlulaza. Một số loại vi sinh vật có khả năng phân giải hemixenluloza như:
Bacillus, Aspergillus, Clostridium, Streptomyces ...

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

11



Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Luận văn Thạc sĩ sinh học

Nguyễn Thị Hồng Hà

1.3.3. Vi sinh vật phân giải protein
Dưới tác dụng của các vi sinh vật hoại sinh, protein được phân giải thành các
axit amin. Các axit amin này lại được một số nhóm vi sinh vật phân giải thành NH3
hoặc NH4+ gọi là nhóm vi khuẩn amin hóa. Quá trình này gọi là sự khoáng hóa chất
hữu cơ vì qua đó, nitơ hữu cơ được chuyển thành dạng nitơ khoáng. Dạng NH4+ sẽ
được chuyển hóa thành dạng NO3-nhờ nhóm vi khuẩn nitrat hóa.
Nhóm vi khuẩn nitrat hóa bao gồm bốn chi khác nhau: Nitrosomonas,
Nitrozocystic, Nitrozolobus và Nitrosospira, chúng đều thuộc loại dị dưỡng bắt
buộc [3].
1.3.4. Vi sinh vật phân giải tinh bột
Có nhiều loại vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột, đó là vi khuẩn
Bacillus, Pseudomonas, Athrobacter, Achromobacter, Agrobacterium … Một số vi
sinh vật có khả năng tiết ra các loại enzym trong hệ enzym amylaza. Ví dụ như một
số vi nấm bao gồm một số loại trong các chi Aspergillus, Fusarium ... Xạ khuẩn
cũng có một số chỉ có khả năng phân hủy tinh bột. Đa số các vi sinh vật đều không
có khả năng tiết ra một hoặc vài enzym trong hệ đó, chúng chỉ có khả năng tiết ra
môi trường [3].
1.4. THÔNG SỐ CƠ BẢN ĐÁNH GIÁ NƢỚC BỊ Ô NHIỄM
Để đánh giá chất lượng nước cũng như mức độ ô nhiễm của nước nói chung
thì có rất nhiều các thông số. Tuy nhiên, mỗi loại nước với thành phần các chất có
trong đó mà ta chọn những thông số thích hợp nhất rồi so sánh với tiêu chuẩn cho
phép về thành phần hóa học và sinh học đối với từng loại nước sử dụng cho các
mục đích khác nhau. Các thông số cơ bản để đánh giá chất lượng nước thải hữu cơ
là: pH, độ đục, các chất rắn lơ lửng, oxy hòa tan … Đặc biệt hai chỉ số BOD và
COD có ý nghĩa rất quan trọng. Theo QCVN 40:2011/BTNMT - Quy chuẩn kỹ thuật
quốc gia về nước thải công nghiệp, một số thông số ô nhiễm trong nước thải công
nghiệp (bảng 1.1).

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

12



Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Luận văn Thạc sĩ sinh học

Nguyễn Thị Hồng Hà

Bảng 1.1. Một số thông số ô nhiễm trong nước thải công nghiệp [9]
Thông số

QCVN 40:2011/BTNMT

Đơn vị

Cột A

Cột B

C

40

40

-

6÷9

5,5 ÷ 9

Màu

Pt-Co

50

150

Chất rắn lơ lửng

mg/l

50

100

COD

mg/l

75

150

BOD5

mg/l

30

50

Tổng nitơ

mg/l

20

40

Tổng photpho

mg/l

4

6

NH4(N)

mg/l

5

10

Coliform

MPN/100ml

3000

5000

o

Nhiệt độ
pH

 Màu sắc
Nước bình thường không có màu, nước trong các ao hồ có thể có màu tùy
thuộc vào các chất có mặt trong đó. Nước thải thường có màu nâu đen, đỏ hoặc đỏ
nâu. Màu sắc của nước là do các chất hữu cơ, vô cơ có mặt trong nước gây nên.
Màu sắc của nước ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm khi sử dụng nước có màu
trong sản xuất [16].
Màu của nước là do:
+ Các chất hữu cơ và phần chết của thực vật gọi là màu thực vật, màu này rất
khó xử lý được bằng phương pháp đơn giản. Ví dụ rong tảo làm nước có màu xanh.
+ Các chất vô cơ là những hạt rắn có màu gây ra, màu này có thể xử lý.
Có nhiều phương pháp xác định màu của nước, nhưng thường dùng ở đây là
phương pháp so màu với các dung dịch chuẩn là Chlophantinat coban. Cường độ
màu của nước xác định theo phương pháp so màu khi lọc bỏ các chất vẩn đục [16].
 Mùi của nước

Nước tự nhiên sạch không mùi, nước thải và nước ô nhiễm thường có mùi
khó chịu từ nhẹ đến hôi thối.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

13



Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Luận văn Thạc sĩ sinh học

Nguyễn Thị Hồng Hà

Có thể xác định mùi của nước theo phương pháp đơn giản sau: Mẫu nước
chứa trong bình có nắp đậy kín, lắc trong khoảng 10 ÷ 20 giây, sau đó mở nắp, ngửi
mùi và đánh giá: không mùi, mùi nhẹ, trung bình, nặng và rất nặng. [16]
 Độ pH
pH của nướ c thải có một ý nghĩa quan trọng trong quá trình xử lý . Các công
trình xử lý nước thải áp dụng các quá trình sinh học làm việc tốt khi pH nằm trong
giới ha ̣n từ 7 ÷ 7,6. Môi trường thuâ ̣n lơ ̣i nhấ t để vi khuẩ n phát triể n l à môi trường
có pH từ 7 ÷ 8. Các nhóm vi khuẩn khác nhau có giới hạn pH hoạt động khác nhau .
Ví dụ vi khuẩn nitrit phát triển thuận lợi nhất với pH từ 4,8 ÷ 8; còn vi khuẩn nitrat
với pH từ 6,5 ÷ 9,3. Vi khuẩ n lưu huỳnh có th ể tồn tại trong môi trường có pH từ 1
÷ 4. Ngoài ra pH còn ảnh hưởng đến quá trình tạo bông cặn của các bể lắng bằng
cách tạo bông cặn bằng phèn nhôm [21].

Nước thải sinh hoa ̣t có pH từ 7,2 ÷ 7,6.
 Nhu cầu oxy sinh hóa - BOD
BOD là nhu cầu oxy sinh hóa hay nhu cầu oxy sinh học, là lượng oxy cần
thiết để oxy hóa các chất hữu cơ dễ phân hủy có trong nước bằng VSV (chủ yếu là
vi khuẩn) hoại sinh, hiếu khí [19].
Chỉ tiêu BOD là một trong những chỉ tiêu quan trọng nhất để xác định mức ô
nhiễm của nước. Nó chỉ biểu thị lượng chất hữu cơ có thể bị phân hủy bởi VSV.
Trong thực tế không thể xác định lượng oxy cần thiết để VSV oxy hóa hoàn
toàn chất hữu cơ có trong nước, mà chỉ cần xác định lượng oxy cần thiết khi ủ ở
nhiệt độ 20 oC trong 5 ngày ở phòng tối để tránh quá trình quang hợp, khi đó có
khoảng 70 ÷ 80 % nhu cầu oxy được sử dụng và kết quả được biểu thị là BOD5 [19].
 Nhu cầu oxy hóa học - COD
COD là nhu cầu oxy cần thiết để oxy hóa toàn bộ chất hữu cơ và các chất
khử có trong nước thành CO2 và H2O [19].
 Hàm lượng các chất rắn

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

14



Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Luận văn Thạc sĩ sinh học

Nguyễn Thị Hồng Hà

Các chất rắn có trong nước là: Các chất vô cơ là dạng các muối hòa tan hoặc
không tan như đất đá ở dạng huyền phù lơ lửng. Các chất hữu cơ như xác các vi
sinh vật, tảo, động vật nguyên sinh, động vật phù du …, các chất hữu cơ tổng hợp
như phân bón, các chất thải công nghiệp.
Chất rắn ở trong nước gồm có: Tổng chất rắn (TS) được xác định bằng trọng
lượng khô phần còn lại sau khi cho bay hơi nước trên bếp cách thủy rồi sấy khô ở
105 oC cho đến khi trọng lượng không đổi. Đơn vị tính bằng mg (hoặc g/l). Chất rắn
lơ lửng ở dạng huyền phù (SS). Hàm lượng các chất huyền phù là trọng lượng khô
của chất rắn còn lại trên giấy lọc sợi thủy tinh. Chất rắn hòa tan (DS). Hàm lượng
chất rắn hòa tan chính là hiệu số của tổng chất rắn với huyền phù: DS = TS – SS.
Đơn vị tính bằng g (hoặc mg) [22].
 Hàm luợng nitơ
Trong môi trường nước, hợp chất nitơ tồn tại chủ yếu ở dạng amoni (NH4+),
nitrat (NO3-), ít hơn ở dạng nitrit (NO2-) và trong một số hợp chất hữu cơ khác.
Thành phần được xem là bền đối với trường và không gây hiệu quả xấu cho môi
trường là khí nitơ (N2).
Các quá trình trong chu trình nitơ chuyển đổi nitơ từ dạng này sang dạng
khác đều được tiến hành bởi các nhóm vi sinh vật khác nhau với mục đích lấy năng
lượng hoặc để tích tụ nitơ thành một dạng cần thiết cho sự phát triển của chúng.
Các dạng nitơ hữu cơ từ nguồn động thực vật sau khi chết được các vi khuẩn amoni
hóa chuyển hóa thành dạng NH4+ ; sau đó NH4+ được chuyển hóa thành NO2- nhờ vi
khuẩn nitrit hóa; NO2- sinh ra được nhóm sinh vật nitrat hóa chuyển hóa thành NO3;
cuối cùng nitrat được nhóm sinh vật kỵ khí chuyển thành dạng nitơ phân tử nhờ quá
trình khử nitrat.
Hiện nay, kết hợp phương pháp sinh học trong xử lý đối với cả nitơ, photpho
trong nước ô nhiễm đang là một hướng nghiên cứu mới. Trong nghiên cứu của
Jorgensen và Pauli, một số chủng vi sinh vật có khả năng tích lũy photpho cũng có
khả năng khử nitrat [18].
 Hàm lượng photpho

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

15



Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Luận văn Thạc sĩ sinh học

Nguyễn Thị Hồng Hà

Các hợp chất chứa photpho trong tự nhiên thường khó phân giải [7]. Các
nguồn nước thải chăn nuôi, biogas...thường có hàm lượng photpho cao. Theo tiêu
chuẩn Việt Nam về nước thải, hàm lượng photpho trong nước thải vượt quá 6 mg/l
có thể dẫn đến hiện tượng phú dưỡng (dư thừa các chất dinh dưỡng), gây tác động
trực tiếp đến động vật, thực vật và gây ảnh hưởng đến môi trường sinh thái. Việc xử
lý nước thải giàu photpho thường khó thực hiện bằng còn đường sinh học do trong
tự nhiên số lượng loài vi sinh vật phân giải chuyển hóa photpho không nhiều. Một
số chủng vi sinh vật phân lập trong tự nhiên có khả năng tích lũy photphat cao thuộc
các chi: Acinetobacter, Aeromonas, Pseudomonas, Alcaligenes, Bacillus, … [8,9].
Kết quả nghiên cứu của Bao và cộng sự về khả năng thu nhận tích lũy photpho của
các chi vi khuẩn cho thấy sau 20 giờ vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas có khả năng
thu nhận 14,34 mg/l khi tiến hành ở điều kiện yếm khí, chi Enterobacteriaceae có
khả năng thu nhận 8,91 mg/l, chi Alcaligenes là 6,43 mg/l, Staphylococcus là 6,23
mg/l, Bacillus là 4,41 mg/l ở điều kiện hiếu khí [8]. Sự tích lũy photphat cung cấp
nguồn năng lượng cho vi sinh vật phát triển. Trong cơ thể vi sinh vật, photpho tích

lũy ở dạng chủ yếu là photphat. Photphat chiếm đến 12 % trọng lượng tế bào đối
với vi khuẩn có hoạt tính tích lũy photphat, trong khi ở vi khuẩn không tích lũy
photphat chỉ có khoảng 1 ÷ 3 %. Xử lý nước thải có chứa các hợp chất photpho
bằng phương pháp sinh học dựa trên khả năng của một số nhóm vi sinh vật tích lũy
lượng photpho nhiều hơn mức cơ thể chúng cần trong điều kiện hiếu khí. Thông
thường hàm lượng photpho trong vi sinh vật chiếm từ 1,5 ÷ 2,5 % khối lượng tế bào
khô, một số loài có khả năng hấp thu cao hơn, từ 6 ÷ 8 % [3], [14].
Nghiên cứu Van Bethum và cộng sự, cho thấy photpho trong cơ thể vi sinh vật
được tích lũy dưới dạng chủ yếu là photphat. Trong cơ thể của chúng, photphat có
thể chiếm đến 12 % trọng lượng tế bào đối với vi khuẩn có tích lũy polyphotphat,
và với vi khuẩn không tích lũy polyphotphat, chỉ chiếm khoảng 1÷ 3 % trọng lượng
tế bào [3].
 Chỉ số vệ sinh (E. coli)
Nước làm lan truyền các nguồn bệnh và trong thực tế các bệnh lây lan qua
môi trường nước là nguyên nhân chính gây ra nhiều loại bệnh có thể dẫn đến tử
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

16



Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Luận văn Thạc sĩ sinh học

Nguyễn Thị Hồng Hà

vong, nhất là ở các nước đang phát triển. Các tác nhân gây bệnh thường được bài
tiết ra trong phân của người và động vật bị bệnh, bao gồm các nhóm chính sau: Các
vi khuẩn, virus, động vật đơn bào, giun kí sinh. Chất lượng về mặt vi sinh của nước
thường được sử dụng rộng rãi nhất là chỉ số E. coli [20].
1.5. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN

SƢ̣ SINH TRƢỞNG CỦ A VI SINH

VẬT TRONG QUÁ TRÌ NH XƢ̉ LÝ NƢỚC THẢI
1.5.1. Ảnh hƣởng của nƣớc và nồ ng đô ̣ các chấ t dinh dƣỡng
Nước đóng vai trò rấ t quan tro ̣ng trong hoa ̣t đô ̣ng số ng của vi sinh vâ ̣t . Nước
hòa tan các chất dinh dưỡng nhờ đó mà chất dinh dưỡng dễ dàng

thẩ m thấ u qua

màng tế bào để cho vi sinh vật sử dụng . Nồ ng đô ̣ các chấ t dinh dưỡng trong nước
thải phải phù hợp với đặc điểm sinh lý của tế bào . Nồ ng đô ̣ các chấ t dinh dưỡng cao
quá mức giới hạn tế bào sẽ mất nước, nguyên sinh chấ t trong tế bào bi ̣keo tu ̣ la ̣i làm
hoạt động trao đổi chất bị ngưng trệ . Ngươ ̣c la ̣i, trong nước cấ t tế bào bi ̣trương lên
do xảy ra hiê ̣n tươ ̣ng thẩ m thấ u của nước qua màng tế bào làm cho tế bào bi ̣vỡ . Tỉ
lê ̣ các chấ t dinh dưỡng có ảnh hưởng lớn đế n hoa ̣t đô ̣ng số ng của vi sinh vâ ̣t

. Mỗi

loài vi sinh vật cũng có nhu cầu khác nhau về tỷ lệ các chất dinh dưỡ ng. Tỷ lệ C : N
: P phổ biế n cho nhiề u loài là 100 : 10 : 1.
1.5.2. Ảnh hƣởng của nhiêṭ đô ̣
Mỗi loa ̣i vi sinh vâ ̣t có đô ̣ giới ha ̣n nhiê ̣t đô ̣ sinh trưởng thích hợp khác nhau.
Đối với mỗi loại vi sinh vật có các giới hạn nhiệt độ sinh trưởng tố i thiể u , nhiê ̣t đô ̣
phát triển tối đa và nhiệt độ sinh trưởng thích hợp. Phầ n lớn vi khuẩ n có nhiệt độ

sinh trưởng thích hợp 30 ÷ 37 oC, có nhiều loài vi khuẩn có nhiệt độ sinh trưởng
thấ p 10 ÷ 20 oC (vi sinh vâ ̣t ưa la ̣nh ) và có nhiều loài nhiệt độ sinh trưởng khá cao
50 ÷ 60 oC (vi sinh vâ ̣t ưa nhiê ̣t ). Trong xử lý nước thải hầ u như viê ̣c điề u chin
̉ h
nhiê ̣t đô ̣ không thể thực hiê ̣n đươ ̣c mà thường xử lý ở nhiê ̣t đô ̣ tự nhiên của môi
trường. Vì vậy, người ta thường cho ̣n các loa ̣i vi sinh vâ ̣t có sẵn trong tự nhiên của
khu vực để chúng có khả năng thích nghi với nhiê ̣t đô ̣ môi trường tự nhiên [27].

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

17



Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Luận văn Thạc sĩ sinh học

Nguyễn Thị Hồng Hà

1.5.3. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng
Cũng tương tự như nhiệt độ , pH môi trường ban đầu cũng là yếu tố ảnh
hưởng lớn đế n tố c đô ̣ sinh trưởng của vi sinh vâ ̣t . Phầ n lớn cá c vi sinh vâ ̣t có pH
sinh trưởng tố i ưu từ 5,5 ÷ 7,5 có một số loài sinh trưởng tố i ưu ở pH thấ p (< 4,5) và
mô ̣t số loài sinh trưởng tố i ưu ở pH kiề m . Ở pH không thích hơ ̣p hê ̣ enzym của vi
sinh vâ ̣t hoa ̣t đô ̣ng yế u hoă ̣c bi ̣bấ t hoa ṭ do đó ảnh hưởng trực tiế p đế n quá trin
̀ h trao

đổ i chấ t của vi sinh vâ ̣t . Để vi sinh vâ ̣t sinh trưởng tố t cầ n duy trì pH thích hơ ̣p
trong suố t thời gian nuôi cấ y .
1.5.4. Ảnh hƣởng của oxy hòa tan
Mố i quan hê ̣ của vi sinh vâ ̣t đố i với o xy rấ t khác nhau . Vi sinh vâ ̣t hiế u khí
cầ n oxy để sinh trưởng . Vi sinh vâ ̣t yế m khí oxy la ̣i là tác nhân gây đô ̣c . Nhóm vi
sinh vâ ̣t trung gian giữa hai nhóm này là nhóm hiế u khí tùy tiê ̣n .
Trong xử lý nước thải ở các bể a eroten cầ n cung cấ p đủ oxy để vi sinh vâ ̣t
hiế u khí oxy hóa các chấ t hữu cơ có trong nước thải

. Còn xử lý yếm khí thì tiến

hành trong các bể kín để oxy không tan được vào trong nước thải gây ức ch ế các vi
sinh vâ ̣t yế m khí [23].
1.6. CÁC PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ NƢỚC THẢI GIÀU HỮU CƠ
Có nhiều biện pháp xử lý nước thải: Xử lý cơ học, xử lý hóa học, xử lý sinh
học, xử lý cơ-lý-hóa, và xử lý nhờ kết hợp các biện pháp sinh học và cơ-lý-hóa.
Trong các phương pháp trên thì phương pháp xử lý sinh học được sử dụng
nhiều với hiệu quả cao, đặc biệt là đối với nước thải chứa nhiều chất hữu cơ dễ bị
phân hủy, nhưng không mang hiệu quả đối với nước thải công nghiệp có chứa các
chất vô cơ độc hại (kim loại nặng, axit, kiềm) hoặc các chất hữu cơ bền vững (các
clobenzen, phenol …) và ít hiệu quả đối với một số loại vi khuẩn gây bệnh. Trong
các trường hợp này phải kết hợp phương pháp xử lý sinh học với các phương pháp
xử lý cơ-lý-hóa [29].

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

18

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Luận văn Thạc sĩ sinh học

Nguyễn Thị Hồng Hà

1.6.1. Phƣơng pháp xử lý cơ học
Phương pháp cơ học thường sử dụng ở giai đoạn xử lý sơ bộ, dùng để loại
các vật rắn có kích thước lớn và các tạp chất rắn không tan trong nước. Các chất này
có thể ở dạng vô cơ hoặc hữu cơ. Các phương pháp xử lý cơ học thường dùng: lọc
qua song chắn hoặc lưới, lắng, lọc qua lớp cát và quay ly tâm.
1.6.2. Phƣơng pháp xử lý hóa học
Phương pháp hóa học dựa trên cơ sở là các phản ứng hóa học, các quá trình
hóa lý diễn ra giữa chất ô nhiễm với các hóa chất bổ sung vào. Các phản ứng xảy ra
có thể là phản ứng oxy hóa khử, các phản ứng tạo chất kết tủa hoặc các phản ứng
phân hủy. Do vậy, có 3 phương pháp xử lý hóa học thường được sử dụng đó là:
Phương pháp trung hòa, phương pháp oxy hóa-khử, phương pháp điện hóa học.
1.6.3. Phƣơng pháp xử lý sinh học
Phương pháp phổ biến và kinh tế nhất để xử lý nước thải giàu chất hữu cơ là
phương pháp sinh học. Phương pháp này dựa trên cơ sở sử dụng hoạt động của các
vi sinh vật để phân hủy các chất hữu cơ gây ô nhiễm trong nước thải.
Các vi sinh vật sử dụng các chất hữu cơ và một số khoáng chất làm nguồn
dinh dưỡng và tạo năng lượng. Trong quá trình phát triển, chúng nhận các chất dinh
dưỡng để xây dựng tế bào, sinh trưởng và sinh sản nên sinh khối của chúng được
tăng lên. Quá trình phân hủy các chất hữu cơ nhờ vi sinh vật gọi là quá trình oxy
hóa sinh hóa [8].
Nước thải có thể xử lý bằng phương pháp sinh học sẽ được đặc trưng bởi chỉ

tiêu COD hoặc BOD. Để có thể xử lý bằng phương pháp này, nước thải cần không
chứa các chất độc và tạp chất, các muối kim loại nặng hoặc nồng độ của chúng
không được vượt quá nồng độ cực đại cho phép, đồng thời thỏa mãn: BOD/COD ≥
0,5.
1.7. TIÊU CHÍ TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT XỬ LÝ NƢỚC THẢI HỮU CƠ
Xử lý nước thải bằ ng phương pháp sinh ho ̣c chủ yế u dựa vào hoa ̣t đô ̣ng số ng
của các vi sinh vật dị dưỡng có khả năng phâ n giải chấ t hữu cơ . Các vi sinh vật dị
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

19



Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Luận văn Thạc sĩ sinh học

Nguyễn Thị Hồng Hà

dưỡng có t hể chia thành ba nhóm nhỏ : Vi sinh vâ ̣t hiế u khí , vi sinh vâ ̣t yế m khí và
vi sinh vâ ̣t tùy nghi . Khu hê ̣ vi sinh vâ ̣t sử du ̣ng trong quá trin
̀ h xử lý nước thải gồ m
vi khuẩ n , nấ m men, nấ m mố c , xạ khuẩn ... Trong đó , vi khuẩ n chiế m số lươ ̣ng lớn
nhấ t. Trong các bể xử lý sinh ho ̣c , vi khuẩ n đóng vai trò quan tro ̣ng hàng đầ u vì nó
chịu trách nhiệm phân hủy các thành phần hữu cơ trong nước thải . Do vâ ̣y, bên cạnh
viê ̣c lơ ̣i dụng những tính năng ưu viê ̣t của các loài vi sinh vâ ̣t thì chúng ta cầ n phải
lựa chọn những chủng vi sinh vâ ̣t thích hơ ̣p vừa có khả năng làm sạch, vừa tạo đô ̣

kế t lắ ng tố t vừa không gây đô ̣c hại cho môi trường. Các tiêu chí đươ ̣c xét: Có hoạt
tính sinh học cao: Có phức hệ enzym phân giải hữu cơ cao, ổn định. Sinh trưởng tốt
trong điều kiện thực tế của nước thải hữu cơ, cạnh tranh được với vi sinh vật có sẵn
trong nước thải. Nuôi cấy dễ dàng, sinh trưởng tốt trong môi trường tự nhiên, thuận
lợi cho quá trình nhân giống thu sinh khối.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

20



Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Luận văn Thạc sĩ sinh học

Nguyễn Thị Hồng Hà

PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Các chủng được tuyển chọn: Vi khuẩn NT01, NT03 và NT05 được lưu giữ
trong Bộ sưu tập giống Phòng Công nghệ vật liệu sinh học, Viện Công nghệ sinh
học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Nước thải sau hầm biogas tại hộ gia đình ông Bùi Vinh Nghê, xóm Văn
Miếu, thôn Đại Phùng, xã Đan Phượng, huyện Đan Phượng, thành phố Hà Nội.
2.1.2. Thiết bị và hóa chất

2.1.2.1. Thiết bị chính
Kính hiển vi quang học Olympius, Model CHD (Nhật Bản); máy đo pH,
Metter Toledo (Thụy Sỹ); cân điện tử AB 204, Metter Toledo (Thụy Sỹ); máy lắc
ổn nhiệt (Hàn Quốc); các loại pipetman Gilson, Biohit; nồi khử trùng ướt (Trung
Quốc); tủ sấy khô (Sellab - Mỹ); tủ lạnh, Hàn Quốc; máy đo OD; lò vi sóng; ống
đong: 100 ml, 500 ml, 1.000 ml; cốc đong: 100 ml, 200 ml, 1.000 ml, 2.000 ml;
máy sục khí; các dụng cụ khác …
2.1.2. Thiết bị và hóa chất
Cao thịt (Merck- Đức); cao nấm men (Merck - Đức); pepton (Merck - Đức);
thạch (Merck- Đức); bột xenlulo (Nhật); CMC; tinh bột tan, các loại đường: Dglucoza, saccaroza, D-fructoza, …(Merck- Đức); các hóa chất vô cơ khác: NaCl,
KH2PO4, MgSO4.7H2O, KNO3 …
+ Bộ Kit chuẩn hóa sinh 50 API CHB
+ Bộ kit TOPO TA Cloningđ bao gồm các thành phần cần thiết cho quá trình
tách dòng: Vectơ pCRđ2.1-TOPOđ, enzym, tế bào khả biến chủng TOP 10, và dung
dịch đệm cho từng loại enzym.
+ Để tinh sạch vectơ tái tổ hợp phục vụ cho mục đích đọc trình tự, sử dụng
bộ sinh phẩm S.N.A.P Miniprep Kit [2].
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

21



Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Luận văn Thạc sĩ sinh học

Nguyễn Thị Hồng Hà

+ Cặp mồi cho phân loại vi khuẩn:
Pr16F: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
Pr16R: TACGGTTACCTTGTTACCGACTT
- Cặp mồi tổng hợp gene 16S rARN được đặt tổng hợp tại hãng GENSET
(Singapore BioTech pte, Ltd).
2.1.3. Môi trƣờng nuôi cấy
Môi trường MPA (g/l): Cao thịt 3; pepton 5; NaCl 5; agar 20; nước cất 1.000
ml; pH 7.
Môi trường Winogradsky (g/l): NaNO21; K2HPO4 0,5; MgSO4.7H2O 0,3;
Na2CO3 1; NaCl 0,5; FeSO4 0,1; nước cất 1.000 ml
Môi trường Pikoskaya (g/l): Glucoza 10; Ca3(PO4)2 5; (NH4)2SO4 0,5; NaCl
0,2; MgSO4.7H2O 0,1; KCl 0,2; Cao nấm men 0,5; MnSO4 vết ; FeSO4. 7H2O vết;
nước cất 1.000 ml; pH 7 ÷ 7,2.
Môi trường xenlulo (g/l): NH4NO3 0,2; ure 0,1; cazein 0,2; KH2PO4 0,2;
MgSO4.7H2O 0,3; CaCO3 0,2; FeSO4.7H2O 0,05; bột giấy 20; cao nấm men 0,1;
cazamino axit 0,1; agar 20; nước cất 1.000; pH 7.
Môi trường xenlulo Glovina (g/l): CMC1,5; KNO3 0,5; KH2PO4 0,85;
MgSO4.7H2O 0,0625; cao nấm men 0,025; nước cất 1.000 ml; pH 7 ÷ 7,2.
Môi trường Gelatin: Môi trường MPA + 0,4 % gelatin; khử trùng ở 121 oC
trong 20 phút.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phƣơng pháp nghiên cƣ́u vi sinh vâ ̣t
2.2.1.1. Đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa của các chủng vi khuẩn
 Đặc điểm hình thái
Đặc điểm hình thái tế bào c ủa vi khuẩn được quan sát dưới kính hiển vi điện
tử và được chụp tại Khoa Hình thái, Viện 69 thuộc Bộ Tư lệnh bảo vệ Lăng Chủ
tịch Hồ Chí Minh.
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

22



Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Luận văn Thạc sĩ sinh học

Nguyễn Thị Hồng Hà

 Nhuộm Gram vi khuẩn [3]
Xác định các vi khuẩn phân lập được thuộc Gr (-) hay (+) căn cứ vào màu
thuốc nhuộm bắt màu trên tế bào vi khuẩn. Nếu vi khuẩn bắt màu hồng là Gr (-),
màu tím là Gr (+).
 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
 Khả năng sinh tổng hợp enzym
Thủy phân tinh bột: Cấy chấm điểm vi khuẩn trên môi trường MPA bổ sung
thêm 1 % tinh bột. Nuôi ở nhiệt độ 30 oC trong 48 giờ và thử bằng thuốc thử Lugol.
Nếu vi khuẩn có khả năng thủy phân tinh bột chúng sẽ tạo vòng phân giải xung
quanh chỗ vi khuẩn sinh trưởng [3].
Thủy phân xenlulo: Cấy vi khuẩn trên môi trường MPA bổ sung 1 % bột
giấy. Nuôi ở nhiệt độ 30 oC trong 48 giờ và thử bằng thuốc thử Lugol. Nếu vi
khuẩn có khả năng thủy phân xenlulo chúng sẽ tạo vòng phân giải xung quanh
chỗ vi khuẩn sinh trưởng.
Làm loãng gelatin: Cấy vi khuẩn vào môi trường gelatin đã vô trùng, nuôi ở
nhiệt độ 30 oC, sau 72 giờ lấy ra cho vào tủ lạnh 4 oC để trong 2 giờ. Sau 2 giờ môi

trường trong ống nghiệm không bị đông thì chủng đó có khả năng làm loãng
gelatin.
 Khả năng sử du ̣ng các nguồ n cacbon
Nuôi vi sinh vâ ̣t trên môi trường có bổ sung 1 % nguồ n đường, cacbon. Xác
đinh
̣ khả năng phát triể n của chúng.
 Khả năng chịu NaCl, chịu nhiệt, pH
Thay đổ i nồ ng đô ̣ NaCl và nuôi ở các thang nhiệt độ , pH khác nhau . Theo
dõi khả năng sinh trưởng của chúng.
*

Phương pháp phân tích nitơ tổng số
Nguyên tắc của việc phân tích nitơ tổng số là chuyển toàn bộ nitơ ở cả dạng

vô cơ và hữu cơ về dạng nitrat nhờ chất oxi hóa mạnh sau đó tiến hành so màu ở
bước sóng 220 nm [9].
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

23



Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Luận văn Thạc sĩ sinh học
*

Nguyễn Thị Hồng Hà

Phương pháp phân tích hàm lượng amoni NH4+

Khả năng chuyển hóa amoni của các chủng vi khuẩn được phân tích dựa trên
nồng độ amoni trong môi trường theo các khoảng thời gian nuôi. Phản ứng của
NH4+ và hypochlorit với sự có mặt của xúc tác phenol tạo thành hợp chất
indophenol blue. So màu ở bước sóng 640 nm [9].
*

Phương pháp thử khả năng chuyển hóa nitrit

Khả năng chuyển hóa nitrit (NO2-) thành nitrat (NO3-) của các chủng được
đánh giá thông qua sự giảm nồng độ nitrit trong môi trường nuôi cấy. Phản ứng
giữa nitrit và hỗn hợp sulfanylamit với naphtylendiamin tạo phức màu hồng ở pH 2.
So màu ở bước sóng 540 nm [9].
*

Đánh giá khả năng tích lũy photpho

Đánh giá khả năng tích lũy photpho của vi sinh vật thông qua hàm lượng
photphat còn lại trong môi trường. Hàm lượng photphat được đánh giá dựa trên
nguyên tắc tạo phức giữa gốc phosphat, amonium molypdat và kali antimon tatrat
thành một phức chất màu xanh đậm và được đo ở bước sóng 710 nm [11].
2.2.1.2. Phương pháp đánh giá tính đối kháng giữa các chủng vi khuẩn
Đối kháng giữa các chủng vi khuẩn: Cấy vi khuẩn sao cho các đường cấy
giao nhau trên môi trường MPA, nuôi ở 37 oC sau 24 giờ quan sát sinh trưởng của
các chủng ở các đường giao nhau [3].
2.2.1.3. Phương pháp nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của vi
khuẩn

+ Ảnh hưởng của thời gian: Trong quá trình nuôi cấy khi không thay đổi
môi trường thì thời gian nuôi cấy quyết định sự thay đổi của các tế bào vi sinh vật.
Vì vậy, sinh trưởng của vi sinh vật phụ thuộc vào thời gian, tùy từng thời điểm
lượng enzym sinh ra cũng khác nhau. Tiến hành thí nghiệm bằng cách nuôi cấy vi
khuẩn trong môi trường MPA, nuôi ở 37 oC, điều kiện lắc 200 vòng/phút trong 60
giờ. Cứ sau 6 giờ lấy mẫu một lần, xác định khả năng sinh trưởng (OD620 nm) [4].

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

24



Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Luận văn Thạc sĩ sinh học

Nguyễn Thị Hồng Hà

+ Ảnh hưởng của nhi ệt độ: Để nghiên cứu sự sinh trưởng của các chủng vi
khuẩ n ở các nhiệt độ khác nhau, sử dụng môi trường MPA dịch thể. Sau đó, cấy các
chủng vi sinh vật trong các ống nghiệm chứa môi trường đã vô trùng và để ở các
thang nhiệt độ: 25; 30; 35; 45 và 55. Sau 48 giờ nuôi cấy, xác định khả năng sinh
trưởng (OD620 nm).
+ Ảnh hưởng của pH : Sử dụng môi trường MPA có pH ban đầu là: 3; 4; 5;
6; 7; 8; và 9. Cấy vi sinh vật, nuôi ở 37 oC, sau 48 giờ xác định khả năng sinh
trưởng bằng cách đo OD620 nm.

+ Ảnh hưởng của nồng độ NaCl: Nuôi cấy vi khuẩn vào môi trường MPA
sau đó bổ sung NaCl với các nồng độ khác nhau lần lượt là (g/l): 0,3; 1; 3; 5; 7 và 9
và 11 nuôi ở 37 oC trong 48 giờ. Đánh giá sinh trưởng bằng chỉ số (OD620nm).
+ Ảnh hưởng của ngu ồn cacbon: Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên sinh
trưởng và sinh tổng hợp xenlulaza của các chủng vi sinh vật được tuyển chọn trên
các nguồn cơ chất khác nhau. Trên môi trường cơ sở có bổ sung tinh bột, CMC-Na,
glucoza, saccaroza, lactoza, rỉ đường. Vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường MPA
trong 48 giờ. Sau khoảng thời gian đó, kiểm tra sự sinh trưởng của vi khuẩn bằng
chỉ số (OD620nm).
+ Ảnh hưởng của nguồn nitơ: Giống vi sinh vật được cấy vào môi trường
cơ sở có bổ sung các nguồn nito khác nhau: pepton, cao men, cao thịt, KNO3 và
(NH4)2SO4. Vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường MPA trong 48 giờ. Sau khoảng
thời gian đó, kiểm tra sự sinh trưởng của vi khuẩn bằng chỉ số (OD620nm).
2.2.1.4. Phương pháp xác định hoạt tính enzym
Phương pháp đường khử : Làm các mẫu đường chuẩn với các nồng độ: 0.5; 1;
1.5; 2 và 3 (mg/ml). Pha loãng dịch enzym trong đệm ít nhất 2 nồng độ đến khi xấp
xỉ nồng độ 0,5 mg/ml đường (thể tích dịch sau khi pha loãng bằng 1 ml). Bổ sung 1
ml cơ chất, mix đều và ủ ở 37 oC trong 10 phút, sau đó thêm 3 ml DNSA, mix đều
rồi đun sôi các mẫu enzym, đường chuẩn, EB và S cùng nhau (khoảng 30 phút). Sau
đó làm lạnh bằng cách ủ vào đá rồi đo OD (540 nm). Chỉnh S về 0 rồi đo các mẫu
tiếp.
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

25



Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật