Nghiên cứu phân lập và tinh chế notoginsennosid r1 từ nguyên liệu saponin toàn phần của tam thất làm chất chuẩn phục vụ công tác kiểm nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN VIỆT THÚY

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ
NOTOGINSENOSID R1 TỪ NGUYÊN LIỆU
SAPONIN TOÀN PHẦN CỦA TAM THẤT LÀM
CHẤT CHUẨN PHỤC VỤ CÔNG TÁC
KIỂM NGHIỆM

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI 2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN VIỆT THÚY

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ
NOTOGINSENOSID R1 TỪ NGUYÊN LIỆU
SAPONIN TOÀN PHẦN CỦA TAM THẤT LÀM
CHẤT CHUẨN PHỤC VỤ CÔNG TÁC

KIỂM NGHIỆM
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC - ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 60720410

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Đoàn Cao Sơn

HÀ NỘI 2017


LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin cảm ơn PGS.TS Đoàn
Cao Sơn- Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Bộ Y tế, người
thầy đã trực tiếp hướng dẫn, dành nhiều thời gian và tâm huyết giúp tôi hoàn
thành luận văn này.
Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám hiệu, phòng Quản
lý đào tạo sau đại học, bộ môn Hóa phân tích trường Đại học Dược Hà Nội
cùng các thầy cô đã trực tiếp giảng dạy và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học
tập tại trường cũng như trong quá trình thực hiện luận văn.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn ThS. Nguyễn Tuấn Anh, ThS. Trần Thị
Thu Trang là những người đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc và các đồng nghiệp tại Khoa
Kiểm nghiệm Đông dược Dược liệu - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương
đã hết sức giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có thể thực hiện và
hoàn thành khóa luận tốt nghiệp một cách thuận lợi.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã ủng hộ và động
viên tôi trong suốt quá trình học tập vừa qua.
Hà Nội, ngày 30 tháng 3 năm 2017
Học viên
Nguyễn Việt Thúy

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
ACN Acetonitril
13

C-NMR

13-Carbon nuclear magnetic resonance

C18

Octadecyl silance silica

CC

Column Chromatography

DAD

Diod Array Detector
Detector chuỗi (dãy) diốt phát quang

DĐVN

Dược điển Việt Nam

ESI

Electro Spray Ionisation

Ion phun hóa điện tử

FTIR

Fourier Transform Infrared Spectrophotometry
Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier

G

Ginsenosid

1

Proton nuclear magnetic resonance

H-NMR

HPLC

High Performance liquid chromatography
Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IR

Infrared Spectrophotometry
Phổ hấp thụ hồng ngoại

PHPLC

Preparative high performanceliquid chromatography

Sắc ký lỏng điều chế

LC-MS

Liquid chromatography - Mass Spectometry
Sắc ký lỏng – khối phổ

LOD

Limit of Detection
Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of Quantitation


Giới hạn định lượng
MeOH

Methanol

MS

Mass Spectometry
Phổ khối

NMR

Nuclear magnetic resonance

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

N-R1

Notoginsenosid R1

PA

Pure Analysis
Đạt tinh khiết phân tích

RP

Reversed phase
Pha đảo

Rf

Giá trị Rf

RSD

Realative Standard Deviation
Độ lệch chuẩn tương đối

SĐK

Số đăng ký

SKĐ

Sắc ký đồ

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

UFLC

Ultra Fast Liquid Chromatography
Sắc ký lỏng siêu hiệu năng

USP

Dược điển Mỹ

UV-VIS

Quang phổ tử ngoại – khả kiến

VKNTTW

Viện Kiểm nghiệm thuốc TW

VKNT TP.HCM Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp Hồ Chí Minh
WHO

World Health Organization
Tổ chức y tế thế giới

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN .....................................................................................3
1.1. Vài nét về chất đối chiếu ....................................................................................3
1.1.1. Vài nét về chất chuẩn ................................................................................3
1.1.2. Khái quát về thiết lập chất chuẩn từ dược liệu ..........................................4
1.2. Tổng quan về đối tƣợng nghiên cứu .................................................................5
1.2.1. Dược liệu Tam thất....................................................................................5
1.2.2. Nguyên liệu Saponin toàn phần của tam thất: ...........................................6
1.2.3. Tổng quan về nhóm hoạt chất saponin triterpenoid nhóm Damaran ........7
1.2.4. Tổng quan về notoginsengnosid R1 ...........................................................7
1.2.4.1. Đặc điểm và tính chất ..........................................................................7
1.2.4.2. Tác dụng dược lý của notoginsenosid R1: ...........................................8
1.2.5. Vài nét về Rg1 ............................................................................................8
1.2.6. Vài nét về Rb1 ............................................................................................9
1.3. Tổng quan về phƣơng pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế ..........................11
1.3.1. Vài nét về chiết xuất dược liệu .................................................................11
1.3.2. Vài nét về phân lập và tinh chế ................................................................11
1.4. Tổng quan một số phƣơng pháp hoá lý sử dụng trong nghiên cứu đề tài.........12
1.4.1. Sắc ký lớp mỏng.......................................................................................12
1.4.1.1. Nguyên tắc .........................................................................................12
1.4.1.2. Các đại lượng đặc trưng ....................................................................12
1.4.1.3. Ứng dụng............................................................................................13
1.4.2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao ......................................................................14
1.4.2.1. Nguyên tắc .........................................................................................14
1.4.2.2. Một số đại lượng đặc trưng của quá trình sắc ký ..............................14
1.4.2.3. Ứng dụng............................................................................................15
1.4.3. Phổ khối) ..................................................................................................16
1.4.3.1. Nguyên tắc .........................................................................................16

1.4.3.2. Ứng dụng............................................................................................16
1.4.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ..................................................................17
1.4.4.1. Nguyên tắc .........................................................................................17


1.4.4.2. Các đại lượng đặc trưng ....................................................................17
1.4.4.3. Ứng dụng............................................................................................18
1.4.5. Sắc ký cột .................................................................................................18
1.4.5.1. Cột ......................................................................................................18
1.4.5.2. Hóa chất dùng làm cột .......................................................................18
1.4.5.3. Dung môi ............................................................................................19
1.4.5.4. Ứng dụng: ..........................................................................................19
1.4.6. Đo nhiệt độ nóng chảy ............................................................................19
1.4.7. Quang phổ tử ngoại khả kiến ...................................................................20
1.4.8. Phương pháp đo phổ hồng ngoại .............................................................20
1.4.8.1. Nguyên tắc .........................................................................................20
1.4.8.2. Ứng dụng............................................................................................21
1.5. Tình hình chiết xuất, phân lập và tinh chế notoginsenosid R1 ....................21
1.5.1. Tình hình nghiên cứu ở trong nước ..........................................................21
1.5.2. Tình hình nghiên cứu ở ngoài nước: ........................................................22
1.6.Vài nét về phân tích định lƣợng notoginsenosid R1: .....................................26
CHƢƠNG II: NGUYÊN LIỆU, PHƢƠNG TIỆN, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU .............................................................................................30
2.1. Nguyên liệu .......................................................................................................30
2.2. Phƣơng tiện .......................................................................................................30
2.2.1. Thiết bị, dụng cụ ......................................................................................30
2.2.2. Dung môi, hóa chất, chất chuẩn ..............................................................31
2.3. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................31
2.3.1. Phân lập và tinh chế notoginsenosid R1 từ nguyên liệu saponin toàn phần
của tam thất ........................................................................................................31

2.3.2. Xác định cấu trúc, nhận dạng và đánh giá độ tinh khiết của chất chiết
được ....................................................................................................................32
2.3.3. Xây dựng và thẩm định phương pháp HPLC định lượng notoginsenosid
R1 tinh chế được .................................................................................................32
2.3.4. Xây dựng và thẩm định phương pháp HPLC xác định giới hạn tạp chất
liên quan của notoginsenosid R1 tinh chế được.................................................32


2.3.5. Đưa ra dự thảo tiêu chuẩn cho chất chuẩn phòng thí nghiệm
notoginsenosid R1 ..............................................................................................32
2.3.6. Áp dụng định tính, định lượng notoginsenosid R1 trong dược liệu tam
thất lưu hành trên thị trường ..............................................................................32
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu.................................................................................32
2.4.1. Phương pháp phân lập và tinh chế notoginsenosid R1từ nguyên liệu
Saponin toàn phần của tam thất .........................................................................32
2.4.1.1.Phân lập:…………………………………………………………….30
2.4.1.2. Tinh chế: ............................................................................................33
2.4.2. Xác định cấu trúc của chất notoginsenosid R1 tinh chế được .................34
2.4.3. Định tính và đánh giá độ tinh khiết của chất notoginsenosid R1 tinh chế
được ....................................................................................................................34
2.4.4. Xác định hàm lượng của notoginsenosid R1 tinh chế được .....................34
2.4.4.1. Khảo sát điều kiện sắc ký ...................................................................34
2.4.4.2. Thẩm định phương pháp phân tích ....................................................34
2.4.5. Sử dụng notoginsenosid R1 tinh chế được làm chuẩn làm việc tiến hành
định tính định lượng notoginsenosid R1 trong dược liệu tam thất theo DĐTQ
2010. ...................................................................................................................36
2.4.5.1. Định tính notoginsenosid R1 trong dược liệu tam thất......................36
2.4.5.2. Định lượng notoginsenosid R1 trong dược liệu tam thất bằng phương
pháp HPLC .....................................................................................................37
2.4.6. Phương pháp xử lý số liệu ......................................................................37

2.4.7. Phương pháp đánh giá kết quả ................................................................37
CHƢƠNG III: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ................................................38
3.1. Xây dựng qui trình phân lập và tinh chế notoginsenosid R1 từ nguyên liệu
Saponin toàn phần của tam thất ............................................................................38
3.1.1. Định lượng hàm lượng notoginsenosid R1 trong nguyên liệu Saponin
toàn phần của tam thất .......................................................................................38
3.1.2. Xây dựng quy trình phân lập notoginsenosid R1 .....................................39
3.1.2.1. Nghiên cứu lựa chọn phương pháp phân lập ....................................39
3.1.2.2. Quy trình phân lập notoginsenosid R1 trên cột silicagel ..................42
3.1.2.3. Kiểm tra độ lặp lại trên quy trình phân lập .......................................51


3.1.3. Tinh chế ...................................................................................................51
3.1.3.1. Nghiên cứu lựa chọn phương pháp tinh chế ......................................51
3.1.3.2. Quy trình tinh chế ..............................................................................52
3.2. Xác định cấu trúc, nhận dạng chất tinh chế đƣợc ........................................57
3.2.1. Tính chất: Sản phẩm là dạng bột vô định hình, màu trắng......................57
3.2.2. Nhiệt độ nóng chảy: Chất tinh chế được sấy khô ở 50C đến khối lượng
............................................................................................................................63
3.2.3. Phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến: ................................................................57
3.2.4. Phổ hồng ngoại........................................................................................57
3.2.5. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ..................................................................59
3.2.6. Phổ khối ...................................................................................................62
3.3. Đánh giá độ tinh khiết của notoginsenoside R1 tinh chế đƣợc ....................63
3.3.1. Xây dựng và thẩm định phương pháp để định tính, định lượng
otoginsenosid R1 tinh chế được bằng HPLC với detector DAD ........................63
3.3.1.1. Lựa chọn phương pháp ......................................................................63
3.3.1.2.Thẩm định phương pháp phân tích .....................................................64
3.3.1.3. Định tính, định lượng notoginsenosid R1 trong chất tinh chế được
bằng phương pháp HPLC đã thẩm định .........................................................70

3.4. Xác định giới hạn tổng cộng các tạp chất liên quan của notoginsenosid R1
tinh chế đƣợc............................................................................................................72
3.4.1. Xây dựng phương pháp ...........................................................................72
3.4.2. Thẩm định phương pháp ........................................................................73
3.4.3. Kết quả .....................................................................................................77
3.5. Áp dụng định tính, định lƣợng notoginsenosid R1 trong dƣợc liệu tam thất
...................................................................................................................................78
3.5.1. Định tính bằng phương pháp SKLM ........................................................78
3.5.1.1. Điều kiện sắc ký .................................................................................78
3.5.1.2. Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch thử .....................................78
3.5.1.3. Tiến hành............................................................................................78
3.5.1.4. Kết quả ...............................................................................................79
3.5.2. Định tính, định lượng bằng phương pháp HPLC với detector DAD .......79
3.5.2.1. Điều kiện sắc ký .................................................................................79


3.5.2.2. Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch thử .....................................80
3.5.2.3. Kết quả ...............................................................................................80
3.6.1. Phân lập và tinh chế ginsenosid Rg1 .......................................................83
3.6.1.1.Quá trình phân lập và tinh chế ginsenosid Rg1..................................84
3.6.1.2.Xác định hàm lượng G-Rg1 của cắn E ...............................................85
3.6.2. Phân lập và tinh chế ginsenosid Rb1 .......................................................86
3.6.2.1.Quá trình phân lập và tinh chế G-Rg1 ...............................................86
3.6.2.2.Xác định hàm lượng G-Rg1 của cắn F ...............................................87
CHƢƠNG IV: BÀN LUẬN ....................................................................................89
4.1. Về quy trình phân lập và tinh chế notoginsenosid R1 từ nguyên liệu
Saponin toàn phần của tam thất ............................................................................89
4.2. Về xác định cấu trúc và nhận dạng chất tinh chế đƣợc................................89
4.3. Về định tính, định lƣợng, giới hạn tạp chất liên quan của notoginsenosid
R1 tinh chế đƣợc bằng phƣơng pháp HPLC ........................................................89

4.4. Về việc sử dụng notoginsenosid R1 tinh chế đƣợc làm chất chuẩn phòng thí
nghiệm để định tính, định lƣợng notoginsenosid R1 trong dƣợc liệu tam thất 90
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................91
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC BÀNG
Bảng 1.1: Một số điều kiện phân tích N-R1 .............................................................27
Bảng 2.1: Các dung môi hóa chất sử dụng trong đề tài ............................................31
Bảng 2.2: Các phương pháp phân tích N-R1 sử dụng trong đề tài ...........................33
Bảng 2.3: Chương trình pha động phân tích N-R1 trong dược liệu tam thất ...........37
Bảng 3.1: Kết quả định lượng N-R1 trong nguyên liệu ...........................................39
Bảng 3.2: Kết quả định lượng N-R1 trong mẫu thử (cắn B) ....................................47
Bảng 3.3: Kết quả định lượng N-R1 trong mẫu thử (cắn C) ....................................51
Bảng 3.4: Kết quả kiểm tra độ lặp lại của quy trình phân lập ..................................51
Bảng 3.5: Độ lặp lại của quá trình tinh chế ..............................................................54
Hình 3.17: Sơ đồ tóm tắt quá trình phân lập và tinh chế N-R1 của đề tài ...............56
Bảng 3.6: Dữ liệu đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân...................................................60
Bảng 3.7: Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký ...............................64
Bảng 3.9: Kết quả khảo sát độ lặp lại .......................................................................67
Bảng 3.10: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp ..........................................68
Bảng 3.11: Kết quả khảo sát LOD của phương pháp ...............................................69
Bảng 3.12: Kết quả các giá trị đáp ứng của mẫu thử nồng độ 0,00438 mg/ml ........70
Bảng 3.13: Chương trình pha động xác định giới hạn tạp liên quan ........................72
Bảng 3.14: Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký .............................73
Bảng 3.15: Kết quả xác định LOD ...........................................................................76
Bảng 3.16: Kết quả các giá trị đáp ứng của mẫu thử nồng độ 0,002924 mg/ml ......77
Bảng 3.17: Kết quả xác định hàm lượng tạp chất.....................................................77
Bảng 3.18: Chương trình pha động định lượng N-R1 trong dược liệu tam thất ......80

Bảng 3.19: Kết quả định lượng N-R1 trong các mẫu dược liệu tam thất .................82
Bảng 3.20: Kết quả xác định hàm lượng Rg1 trong cắn E .......................................85
Bảng 3.21: Kết quả định lượng G-Rb1 trong cắn F .................................................87


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Công thức cấu tạo của 2 genin ...................................................................7
Hình 1.2: Công thức cấu tạo của notoginsenosid R1 .................................................8
Hình 1.3: Công thức cấu tạo của Rg1.........................................................................9
Hình 1.4: Công thức cấu tạo của Rb1.......................................................................10
Hình 1.5: Sơ đồ cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao ...................................14
Hình 1.6: Sơ đồ chiết xuất notoginsenosid R1 .........................................................24
Hình 1.7: Sơ đồ dự kiến phân lập và tinh chế N-R1 từ Saponin toàn phần của
tam thất ....................................................................................................26
Hình 3.1: Sắc ký đồ mẫu chuẩn và mẫu thử phân tích N-R1 trong nguyên liệu ......39
Hình 3.2: Sắc ký đồ bản mỏng phân tích nguyên liệu ban đầu ................................40
Hình 3.3: Sắc ký đồ bản mỏng pha thuận ở các tỉ lệ dung môi ................................41
Hình 3.4: Sắc ký đồ bản mỏng pha đảo ở các tỉ lệ dung môi MeOH-H20 khác nhau ..42
Hình 3.5: Sắc ký đồ phát hiện sự có mặt của N-R1 trong các bình hứng ở giai đoạn 143
Hình 3.6: Sắc ký đồ so sánh nguyên liệu ban đầu và cắn A sau phân lập................44
Hình 3.7: Sắc ký đồ phát hiện sự có mặt của N-R1 trong các bình hứng giai đoạn 2 .......45
Hình 3.8: Sắc ký đồ so sánh nguyên liệu ban đầu và cắn B sau phân lập thô ..........46
Hình 3.9: Sắc ký đồ mẫu chuẩn N-R1 và mẫu thử (cắn B) ......................................46
Hình 3.10: Sắc ký đồ phát hiện sự có mặt của N-R1 trong các bình hứng phân lập tinh..48
Hình 3.11: Sắc ký đồ bản mỏng sắc ký pha thuận so sánh nguyên liệu ban đầu và
cắn C sau phân lập tinh .............................................................................................49
Hình 3.12: Sắc ký đồ bản mỏng sắc ký pha đảo so sánh nguyên liệu ban đầu và cắn
C sau phân lập tinh ....................................................................................................50
Hình 3.13: Sắc ký đồ mẫu chuẩn và mẫu thử (cắn C) ..............................................50
Hình 3.14: Sắc ký đồ bản mỏng mẫu thử (cắn C) ở các tỷ lệ dung môi aceton - nước

khác nhau...................................................................................................................52
Hình 3.15: Sắc ký đồ phát hiện sự có mặt của N-R1 trong các bình hứng giai đoạn
tinh chế ......................................................................................................................53
Hình 3.16: Sắc ký đồ bản mỏng pha thuận mẫu thử (cắn D) ở hai hệ dung môi
khác nhau .................................................................................................................54
Hình 3.18: Phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến của cắn D chiết được và N-R1 chuẩn ....57


Hình 3.19: Phổ hồng ngoại của cắn D (N-R1 tinh chế được) ..................................58
Hình 3.20: Phổ hồng ngoại của N- R1 chuẩn...........................................................58
Hình 3.21: So phổ hồng ngoại của mẫu thử (cắn D) với N-R1 chuẩn .....................59
Hình 3.22 : Phổ 13C-NMR của chất cắn D ...............................................................59
Hình 3.23: Phổ 1H-NMR của chất cắn D .................................................................60
Hình 3.24: Công thức cấu tạo phân tử Notoginsenosid R1 ......................................62
Hình 3.25: Phổ khối của mẫu thử (cắn D) và mẫu chuẩn N-R1...............................63
Hình 3.26: Sắc ký đồ độ đặc hiệu của phương pháp ................................................65
Hình 3.27: Đồ thị thể hiện sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích .....66
Hình 3.28: Đồ thị biểu diễn sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic
N-R1(xác định LOD) ................................................................................................69
Hình 3.29: Sắc ký đồ mẫu chuẩn và mẫu thử định lượng N-R1 ..............................71
Hình 3.30: Chồng phổ UV-VIS pic N-R1 của mẫu chuẩn và mẫu thử ....................71
Hình 3.31: Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu của phương pháp ..................................75
Hình 3.32: Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữ nồng độ và diện tích píc
N-R1 ..........................................................................................................................76
Hình 3.33: Hình ảnh SKLM dược liệu tam thất ở ánh sáng thường ........................79
Hình 3.34: Hình ảnh SKLM dược liệu tam thất ở ánh sáng tử ngoại 366 nm .........79
Hình 3.35: Các sắc ký đồ định lượng N-R1 trong dược liệu tam thất......................81
Hình 3.36: So phổ UV -VIS, hệ số march 0,9996 ....................................................82
Hình 3.37: Sơ đồ phân lập và tinh chế ginsenosid Rg1 của đề tài ...........................84
Hình 3.38: Sắc ký đồ xác định sự có mặt của G-Rg1 trong các bình hứng trong quá

trình tinh chế .............................................................................................................85
Hình 3.39: Sắc ký đồ định lượng Rg1 trong cắn E ..................................................86
Hình 3.40: Sơ đồ phân lập và tinh chế ginsenosid Rb1 của đề tài ...........................86
Hình 3.41: Sắc ký đồ xác định sự có mặt của G-Rb1 trong các bình hứng trong giai
đoạn tinh chế .............................................................................................................87
Hình 3.42: Sắc ký đồ định lượng Rb1 trong cắn F ...................................................88


ĐẶT VẤN ĐỀ
Từ xưa đến nay, con người luôn có xu hướng sử dụng dược liệu và các thuốc có
nguồn gốc thảo dược để bảo vệ và chăm sóc sức khỏe. Hầu hết các vị thuốc trong y
học cổ truyền đã được sử dụng từ rất lâu, được trải nghiệm lâu đời. Vì có nguồn gốc
từ thiên nhiên nên các vị thuốc này có tác hại rất thấp hoặc không có, có tác dụng
tương đối bình hòa: chỉ cần sử dụng đúng quy cách thì sẽ đạt được hiệu quả rõ rệt.
Nhiều vị thuốc có thể sử dụng trong một thời gian dài mà không gây độc hại cho cơ
thể và không xuất hiện hiện tượng kháng thuốc. Đây chính là một trong những ưu
điểm nổi bật của những vị thuốc có nguồn gốc thảo dược tự nhiên. Với nền hóa
dược phát triển như hiện nay, đi kèm với những thành tựu lớn lao, nhưng cũng tồn
tại song song nhiều bất cập, khiến cho mọi người có xu hướng quay lại với các bài
thuốc từ nguồn thảo dược thiên nhiên. Ngay tại Việt Nam, trong những năm gần
đây việc sử dụng các chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu đã và đang gia tăng. Thị
trường dược liệu và các sản phẩm từ dược liệu vì thế rất đa dạng và phong phú về
nguồn gốc và chủng loại. Ngoài ra, các sản phẩm thực phẩm chức năng có nguồn
gốc từ dược liệu đã và đang phát triển mạnh mẽ.
Nguồn cung cấp dược liệu ở nước ta chủ yếu là thu hái tự nhiên, trồng trọt và
nhập khẩu. Với số lượng dược liệu lưu thông trên thị trường là rất lớn, nguồn gốc
không rõ ràng khiến cho việc kiểm soát chất lượng dược liệu còn khó khăn. Có
những dược liệu là giả, hoặc dễ gây nhẫm lẫn vẫn song song tồn tại ảnh hưởng đến
sự an toàn và chất lượng của thuốc đông dược.Trong khi đó công tác kiểm tra, giám
sát chất lượng dược liệu cần nhất hiện nay là các chất chuẩn với vai trò là hoạt chất

hoặc chất đặc trưng cho dược liệu. Chất chuẩn dùng cho dược liệu hiện nay thường
được nhập từ Trung Quốc với giá thành tương đối cao và nguồn hàng thường không
ổn định, ảnh hưởng đến công tác nghiên cứu và công tác kiểm tra chất lượng thuốc
thảo dược, do đó việc tạo lập chất chuẩn là cần thiết.
Tam thất (Radix notoginseng) là một vị thuốc rất quý, vốn nổi tiếng trong dân
gian với tác dụng giảm viêm, giảm đau, cầm máu, bổ máu đặc biệt là cho phụ nữ
sau sinh. Tuy nhiên, dược liệu Tam thất trên thị trường hiện nay có giá đắt và có
nguy cơ bị giả mạo rất cao, nếu không phải là các nhà chuyên môn với các công cụ
phân tích hiện đại thì rất khó phân biệt được Tam thất với các cây khác có hình
dáng giống Tam thất (mà không có tác dụng điều trị hoặc tác dụng yếu hơn rất
1


nhiều). Mặt khác nếu gặp đúng dược liệu Tam thất thì vẫn còn có nguy cơ dược liệu
đó đã bị chiết xuất hết hoạt chất và tẩm vào đó các phụ gia cải thiện cảm quan của
dược liệu đánh lừa người mua.
Thành phần hóa học chính của Tam thất là các saponin thuộc nhóm dammaran
mà phần aglycon là hai chất: 20(S) protopanaxadiol và 20(S) protopanaxatriol, đã
xác định được các chất như ginsenosid-Rg1, Rb1, Re, Rd, notoginsenosid R1… là
các chất chiếm tỷ lệ lớn. Tuy nhiên, hiện nay chúng ta chưa sẵn có các chất chuẩn
đặc trưng cho Tam thất trong đó có notoginsenoside R1 để kiểm tra chất lượng
dược liệu đang sử dụng và lưu hành trên thị trường. Các chất chuẩn này thường
được nhập từ nước ngoài với giá cao, thời gian chờ đợi dài gây khó khăn cho công
tác kiểm nghiệm.
Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đòi hỏi phải có chất chuẩn nhằm bổ sung vào
quỹ chất chuẩn quốc gia phục vụ công tác kiểm tra và quản lí chất lượng dược liệu
Tam thất, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phân lập và tinh chế
notoginsenosid R1 từ nguyên liệu saponin toàn phần của tam thất để làm chất
chuẩn phục vụ công tác kiểm nghiệm” với các mục tiêu:
- Phân lập và tinh chế notoginsenosid R1 từ nguyên liệu cao tam thất. Xác

định cấu trúc, nhận dạng chất tinh chế được. Đánh giá độ tinh khiết của chất
chiết được, đảm bảo độ tinh khiết lớn hơn 95%.
- Xây dựng quy trình định tính, định lượng notoginsenosid R1.
- Kiểm nghiệm hoạt chất notoginsenosid R1 có mặt trong dược liệu Tam thất
lưu hành trên thị trường, dùng chuẩn notoginsenosid R1 tinh chế được.

2


CHƢƠNG I: TỔNG QUAN
1.1. Vài nét về chất đối chiếu (chất chuẩn)
1.1.1. Vài nét về chất chuẩn
Các chất chuẩn (chất đối chiếu) là chất đồng nhất đã được xác định là đúng để
dùng trong các phép thử đã được qui định về hóa học, vật lý, sinh học. Trong các
phép thử đó, các tính chất của chất đối chiếu được so sánh với các tính chất của chất
cần thử. Chất đối chiếu phải có độ tinh khiết phù hợp với mục đích sử dụng. Chất
đối chiếu được dùng trong các phép thử sau [7]:
- Định tính bằng phương pháp quang phổ hấp thụ hồng ngoại.
- Định tính, định lượng bằng phương pháp quang phổ tử ngoại - khả kiến,
quang phổ huỳnh quang.
- Các phép thử định tính, tạp chất và định lượng bằng phương pháp sắc ký.
- Định lượng bằng phương pháp vi sinh vật.
- Các phép chuẩn độ thể tích, phân tích trọng lượng.
- Các phép thử sinh học.
- Một số phép thử khác có hướng dẫn trong các chuyên luận riêng.
Ngoài ra, các chất đối chiếu còn được dùng để [1]:
- Thẩm định một phương pháp mới.
- Chuẩn hóa các chất đối chiếu khác.
- Khẳng định giá trị pháp lý của một phương pháp đã chuẩn hóa.
Các chất chuẩn theo Dược điển Mỹ (USPRS), Dược điển Châu Âu (EPRS),

Dược điển Quốc tế (ICRS) và chất chuẩn khu vực ASEAN (ARS) được thiết lập với
sự hợp tác của nhiều phòng thí nghiệm độc lập trên thế giới và được sản xuất tại các
trung tâm như:
- Hội đồng chất đối chiếu Dược điển Mỹ (USP Reference Standard
Committee);
- Ban thư ký Kỹ thuật thuộc Hội đồng Dược điển Châu Âu (Technical
Secretariat of the European Pharmacopoeia Commission);
- Trung tâm hợp tác về các chất chuẩn hoá học của Tổ chức Y tế Thế giới
(WHO Collaborating Centre for Chemical Reference Substances).

3


- Chất chuẩn khu vực ASEAN (ARS) được thiết lập với sự đánh giá hợp tác của
các nước trong khối ASEAN theo chương trình Hợp tác kỹ thuật giữa các nước
ASEAN về lĩnh vực Dược phẩm; và Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung Ương – Bộ
Y tế là thành viên chính thức đánh giá, thiết lập chất chuẩn.
Thông thường một chất đối chiếu được đánh giá bởi các nội dung chính [15]:
- Định tính.
- Định lượng.
- Mất khối lượng do làm khô.
- Tạp chất liên quan.
- Độ tinh khiết.
1.1.2. Khái quát về thiết lập chất chuẩn từ dược liệu
Chất đối chiếu hóa học hiện nay ở bất kỳ quốc gia nào cũng đều được thiết lập
và sản xuất để phục vụ cho công tác kiểm tra giám sát chất lượng thuốc. Trong
những năm gần đây, có một số chất chuẩn là những hoạt chất của dược liệu được
sản xuất đạt mức độ tinh khiết nhất định, nhưng thường có giá rất đắt, càng có độ
tinh khiết càng cao thì giá càng đắt và nguồn cung cấp thường không ổn định.
Dược điển Mỹ hiện đang duy trì một số chất chuẩn đối chiếu hóa học của các

hợp chất chiết xuất từ thực vật như quercetin USP CRS, rutin USP CRS, silybin
USP CRS… Viện Kiểm nghiệm Dược phẩm và Sinh phẩm Trung Quốc (NICBPB),
Viện Kiểm nghiệm thuốc Hàn Quốc và Viện kiểm nghiệm thuốc Nhật Bản cũng đã
thiết lập được nhiều chất chuẩn đối chiếu hóa học chiết ra từ dược liệu dùng cho kiểm
nghiệm dược liệu, thuốc có nguồn gốc dược liệu và thuốc đông dược. Tại Việt nam,
cung cấp chất chuẩn chính thức gồm:
- Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương (VKNTTW) đã cung cấp hơn 300 chất
chuẩn tân dược và 10 chất chuẩn từ dược liệu gồm acid chlorogenic, conessin,
holothurin B, kaemferol, malloapeita, myricetin, nuciferin, phyllanthin và sylibin [16].
- Viện Kiểm nghiệm Thuốc TP. HCM (VKNT TP.HCM) cung cấp 213 chất
chuẩn tân dược và 18 chất chuẩn từ dược liệu gồm acid aristolochic, acid gallic, acid
oleanolic, asiaticosid, berberin HCl, colchicin, curcumin, damnacanthal, diacerein,
diosgenin, epigallocatechin (ECGC), ginsenosid-Rb1, ginsenosid-Rg1, hesperidin,
majonosid-R2, quercetin, rutin, syllibin [17].

4


Hiện nay, nếu VKNTTW và VKNT TP.HCM không chủ động được nguồn chất
chuẩn, đặt biệt là chất chuẩn chiết từ dược liệu thì ngành Dược nói chung và công tác
kiểm tra, giám sát chất lượng thuốc nói riêng sẽ gặp nhiều khó khăn, có thể kể đến như:
- Không kiểm nghiệm được chất lượng dược liệu một cách đầy đủ và toàn diện.
- Không kiểm tra giám sát chất lượng các dạng bào chế có nguồn gốc từ dược
liệu đang lưu hành trên thị trường một cách đầy đủ.
- Không tiêu chuẩn hóa được các thuốc sản xuất trong nước bào chế từ dược
liệu hoặc chiết xuất từ dược liệu về mặt hàm lượng dược chất, do đó không giúp
được ngành dược bào chế ra các thuốc có chất lượng cao phục vụ nhu cầu phòng và
chữa bệnh.
Từ những lý do trên cho thấy ngành Dược đứng trước nhiệm vụ cấp bách phải
chủ động nguồn chất chuẩn và xây dựng được Quỹ chất chuẩn quốc gia trong đó có

các chất chuẩn chiết ra từ dược liệu nhằm đáp ứng kịp thời công tác đảm bảo chất
lượng thuốc, phục vụ bảo vệ, chăm sóc và nâng cao sức khỏe nhân dân.
1.2. Tổng quan về đối tƣợng nghiên cứu
1.2.1. Dược liệu Tam thất [5,8,10,13,14]
Tam thất có tên khoa học là Panax notoginseng (Burk) F.H Chen, họ Nhân
sâm (Araliaceae). Dược liệu tam thất là rễ củ đã phơi khô của cây tam thất.
Phân bố:Tam thất là cây thuốc đã được trồng lâu đời ở Trung quốc, chủ yếu
ở tỉnh Vân Nam. Hiện nay người ta biết khoảng 14 loài panax trồng và mọc hoang.
Ở nước ta cây Tam thất được trồng ở các tỉnh giáp giới Vân Nam như Lào cai
(huyện Mườn Khương, Bát sát), Cao Bằng (Thông nông), Hà Giang (Đồng Văn) có
thể cũng xuất xứ từ Vân nam.
Đặc điểm thực vật: Cây thảo sống nhiều năm, cao khoảng 0,5m. Thân đơn, lá
kép hình chân vịt, cuống lá dài, mỗi lá thường có 3-5 lá chét, mép lá có khía răng
cưa nhỏ, trên gân chính có rải rác gân cứng thành gai. Cụm hoa tán đơn, có màu
xanh nhạt. Quả khi chín màu đỏ, có hạt hình cầu.
Bộ phận dùng: Rễ (Radix).
Thu hoạch, Chế biến: Cây thường 4 -5 năm trở lên mới thu hoạch rễ. Vào mùa
thu trước khi cây ra hoa , đào về rửa sạch, cắt rễ nhánh và thân rễ để riêng, rửa sạch,
phơi sấy khô.

5


Tính vị, quy kinh: Theo Đông y, Tam thất có vị ngọt hơi đắng, tính ôn, có tác
dụng hóa ứ, cầm máu, tiêu sưng, giảm đau. Theo DĐVN, tam thất dùng trị thổ
huyết, băng huyết, rong kinh, sau khi sinh nở huyết hôi không ra, ứ trệ , đau bụng,
kiết lỵ ra máu, lưu huyết, tan ứ huyết, sưng tấy, thiếu máu nặng, người mệt mỏi, hoa
mắt, chóng mặt, nhức đầu, ít ngủ.
Thành phần hóa học chính: Thành phần hoá học chính của Tam thất là các
saponin

thuộc

nhóm

dammaran

mà

phần

aglycon

là

2

chất 20(S)

protopanaxadiol và 20(S) protopanaxatriol như ở Nhân sâm. Các saponin thường
gặp trong rễ củ là:
a. Các saponin có phần aglycon là 20(S) protopanaxadiol: G-Rb1, G-Rb2, GRd, Gy-XVII, N-R4, N-Fa.
b. Các Saponin có phần aglycon là 20(S) protopanaxatriol: G-Re, G-Rg1, GRg2, G-Rh1, 20Glc-G-Rf, N-R1, N-R2, N-R3, N-R6.
Trong số các saponin trên, G-Rb1 có hàm lượng 1,8% và G-Rg1 1,9% còn
G-Rb2 và G-Rc thì rất thấp.
(Chú thích: G= Gingsenosid, Gy: gypenosid, N= notoginsenosid)
Các bộ phận khác của cây như rễ con, lá hoa đều có saponin nhóm dammaran.
Tam thất có tinh dầu ở rễ (trong đó α- guaien, β- guaien, stigmasterol,
daucosterol), polysaccharide (arabinogalactan: sanchinan A), muối vô cơ.
1.2.2. Nguyên liệu Saponin toàn phần của tam thất [40]:

Saponin toàn phần của tam thất chiết xuất từ nguyên liệu là rễ và thân rễ của
loài Panax notoginseng (Burk) F.H Chen, được quy định trong dược điển Trung
quốc 2010 như sau: Dược liệu được nghiền nhỏ, đun hồi lưu với ethanol 70%, lọc
lấy dịch chiết và thu hồi dung môi trong chân không lấy cắn. Cắn được đưa lên lên
cột đã nhồi sẵn chất hấp phụ không phân cực hoặc phân cực yếu với chất mang là
styrene đồng trùng hợp, rửa giải với nước và ethanol 80%. Loại bỏ nước, giữ lại
dịch rửa giải ethanol 80%, bốc hơi trong chân không đến khô.
Về cảm quan, nguyên liệu có màu gần trắng hoặc vàng nhạt, vị đắng nhẹ và hơi ngọt.
Thành phần của Saponin toàn phần của tam thất bao gồm: N-R1 khoảng 5%,
ngoài ra còn có 4 hoạt chất khác đó là ginsenosid (G) Rg1, Re, Rb1, Rd. Hàm lượng
saponin toàn phần khoảng 75% (đối với dạng uống) đến 85% (đối với dạng tiêm truyền).

6


1.2.3. Tổng quan về nhóm hoạt chất saponin triterpenoid nhóm Damaran
[5,8,10,13,14]
Đây là nhóm Saponin triterpenoid tetrayclic: phần aglycon gồm 4 vòng và 1
mạch nhánh (khung cyclopentanoperhydrophenantren). Khi tác dụng bởi acid thì
mạch nhánh đóng vòng tạo thành vòng tetrahydrofuran. Bằng các phương pháp đặc
biệt để cắt phần đường, người ta đã thu được các genin thật. Hai genin chính là
20(S) protopanaxadiol và 20(S) protopanaxatriol

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của 2 genin
Các saponin điển hình của nhóm này là các saponin phân lập được trong nhân
sâm (Panax ginseng), tam thất (Panax notoginseng).
1.2.4. Tổng quan về notoginsengnosid R1
1.2.4.1. Đặc điểm và tính chất
- Công thức phân tử: C47H80O18
- Phân tử lượng: 933,1273 g/ml

- Tên khoa học:
(2S,3R,4S,5S,6R)-2-[(2S)-2-[(3S,5R,6S,8R,9R,10R,12R,13R,14R,17S)-6[(2R,3R,4S,5S,6R)-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-3-[(2S,3R,4S,5R)-3,4,5trihydroxyoxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,12-dihydroxy-4,4,8,10,14pentamethyl-2,3,5,6,7,9,11,12,13,15,16,17-dodecahydro-1Hcyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-6-methylhept-5-en-2-yl]oxy-6(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol
- N-R1 có công thức hóa học như sau:

7


Hình 1.2: Công thức cấu tạo của notoginsenosid R1
- Tính chất:
+ Bột kết tinh màu trắng hoặc trắng ngà.
+Tan tốt trong nước và các dung môi phân cực như butanol, ethanol và
methanol. Độ tan trong nước là 1 mg/ml. Tan trong DMSO.
+ Hấp thụ UV ở bước sóng thấp 208 nm.
+ Nhiệt độ nóng chảy khoảng 215-2170C [30].
+ [α]D25= +150 (Dung dịch 1,0 mg/ml trong methanol) [30].
1.2.4.2. Tác dụng dược lý của notoginsenosid R1:
Tác dụng dược lý của N-R1 hiện nay vẫn chưa hoàn chỉnh và đang được tiếp
tục nghiên cứu trên thế giới. Một số tác dụng đã được công bố bao gồm:
+ Thúc đẩy sự gia tăng hoạt động của ALP tiền nguyên bào xương, tăng biểu
hiện của osteocalcin và chất khoáng, giúp ích cho quá trình tái tạo và khoáng hóa
xương [47].
+ Tác động lên các thụ thể estrogen, kích thích hoạt động sao chép của yếu
tố đáp ứng estrogen phosphorylated-luciferase và gây ra sự phosphoryl hóa trong
hBMSC, tác động lên quá trình phân hoá và khoáng hóa osteoblast [43].
+ Ức chế oxy hóa lipoprotein mật độ thấp sản xuất ra các cytokine gây viêm
trong tế bào nội mô người EAhy926, ức chế sản xuất TNF-α và interleukin (IL) làm
giảm đáng kể sự xuất hiện của khối u [21,22,36].
+ Giảm sự phá hủy của amyloid-β gây ra trong tế bào thần kinh bằng cách ức
chế các dạng oxy phản ứng và điều chỉnh MAPK kích hoạt. Có tác dụng rõ rệt trong
điều trị bệnh lý Alzheimer và các bệnh thuộc hệ thần kinh [18].

+ Ảnh hưởng đến sự tổng hợp các thành phần của hệ thống tiêu sợi huyết
trong nuôi cấy tế bào động mạch phổi và tế bào vi mạch nội mô da người, tăng tổng

8


hợp loại plasminogen kích thích (t-PA) và giảm loại plasminogen ức chế (PAI-1)
trong tĩnh mạch rốn nội mô người [45].

1.2.5. Vài nét về Rg1:
- Công thức phân tử: C42H72O14
- Phân tử lượng: 801 g/mol
- Tên khoa học: (2R,3R,4S,5S,6R)-2[[(3S,5R,6S,8R,9R,10R,12R,13R,14R,17S)-3,12-dihydroxy-4,4,8,10,14pentamethyl-17-[(2S)-6-methyl-2-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyhept-5-en-2-yl]2,3,5,6,7,9,11,12,13,15,16,17-dodecahydro-1Hcyclopenta[a]phenanthren-6-yl]oxy]-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol
- Rg1 có công thức hóa học như sau:

Hình 1.3: Công thức cấu tạo của Rg1

- Tính chất:
+ Bột kết tinh màu trắng hoặc trắng ngà.
+ Tan tốt trong nước và các dung môi phân cực như butanol, ethanol
và methanol. Tan trong DMSO. Tan trong hỗn hợp CHCl3-MeOH-H2O
(100/25/10, v/v/v).

9


+ Hấp thụ UV ở bước sóng thấp 203nm
1.2.6. Vài nét về Rb1:
- Công thức phân tử: C54H92O3
- Phân tử lượng: 1109 g/mol

- Tên khoa học: (2R,3R,4S,5S,6R)-2-[[(2R,3S,4S,5R,6S)-6-[(2S)-2[(3S,5R,8R,9R,10R,12R,13R,14R,17S)-3-[(2R,3R,4S,5S,6R)-4,5dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-3-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-12-hydroxy4,4,8,10,14-pentamethyl-2,3,5,6,7,9,11,12,13,15,16,17-dodecahydro1H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-6-methylhept-5-en-2-yl]oxy3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl]methoxy]-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5triol
- Rb1 có công thức hóa học như sau:

Hình 1.4: Công thức cấu tạo của Rb1

- Tính chất:
+ Bột kết tinh màu trắng hoặc trắng ngà.
+ Tan tốt trong nước và các dung môi phân cực như ethanol và
methanol (0,8-1,2 mg/ml). Tan trong DMSO.

10


+ Hấp thụ UV ở bước sóng thấp 203nm.
1.3. Tổng quan về phƣơng pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế
1.3.1. Vài nét về chiết xuất dược liệu [2,14]
Chiết xuất dược liệu có vai trò rất quan trọng trước hết là để lấy được các chất
có trong dược liệu dưới dạng cần thiết (dung dịch, bột) toàn phần hoặc tinh khiết
hơn cho mục đích nghiên cứu hoặc điều trị.
Phương pháp chiết xuất dược liệu bao gồm cả việc chọn dung môi, dụng cụ
chiết và phương pháp chiết
Có nhiều cách phân loại phương pháp chiết xuất dựa vào các yếu tố khác nhau:
- Căn cứ vào nhiệt độ: Chiết nóng, Chiết nguội
- Căn cứ vào chế độ làm việc: Phương pháp chiết gián đoạn; Phương pháp
chiết bán liên tục; Phương pháp chiết liên tục
- Căn cứ vào chuyển động tương hỗ giữa 2 pha: Phương pháp chiết ngược
dòng; Phương pháp chiết xuôi dòng; Phương pháp chiết chéo dòng.
- Căn cứ vào áp suất làm việc: Phương pháp chiết ở áp suất thường (áp suất
khí quyển); Phương pháp chiết ở áp suất giảm (áp suất chân không);
Phương pháp chiết ở áp suất cao (chế độ làm việc có áp lực)

- Căn cứ vào trạng thái làm việc của 2 pha: Phương pháp ngâm; Phương pháp
ngấm kiệt
- Dựa vào những biện pháp kỹ thuật đặc biệt: Phương pháp dùng siêu âm;
Phương pháp khí hoá lỏng; Phương pháp tạo dòng xoáy
1.3.2. Vài nét về phân lập và tinh chế [6,9,39,48]
Để phân lập và tinh chế ta có thể dùng các phương pháp sau:
- Tách phân đoạn bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau và không hòa
lẫn nhau.
- Tách bằng sắc ký cột
- Tách qua cột sắc ký nhiều lần với chất hấp phụ là polyamid, cellulose, silica
gel, C18, sephadex LH-20,...
- Kết tinh lại trong dung môi thích hợp.
- Tách bằng sắc ký lỏng điều chế.

11


1.4. Tổng quan một số phƣơng pháp hoá lý sử dụng trong nghiên cứu đề tài
1.4.1. Sắc ký lớp mỏng
1.4.1.1. Nguyên tắc
SKLM là một kỹ thuật sắc ký, trong đó pha tĩnh chứa chất hấp phụ được trải
thành lớp mỏng, mịn và đồng nhất, được cố định trên phiến kính hoặc phiến kim
loại, nhựa; pha động là một hệ gồm một dung môi đơn thuần hoặc hỗn hợp nhiều
dung môi phối hợp với nhau theo tỷ lệ quy định. Sắc ký được tiến hành khi cho pha
động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt các chất cần tách. Trong quá trình di
chuyển qua chất hấp phụ, các cấu tử (thành phần trong hỗn hợp mẫu thử) di chuyển
trên lớp mỏng theo hướng pha động với những tốc độ khác nhau dẫn đến việc tách
và phân bố khác nhau trên lớp mỏng. Kết quả thu được một sắc ký đồ trên lớp
mỏng, ở đó, các thành phần của mẫu thử phân bố rải rác dọc theo đường đi của
dung môi động. Cơ chế của sự tách có thể là hấp phụ phân bố, trao đổi ion, sàng lọc

phân tử hay phối hợp nhiều cơ chế, trong đó một loại nào đó trội lên ít hoặc nhiều,
tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi pha động [7,14].
Sau đó có thể nhận biết chất cần phân tích bằng ánh sáng thường (nếu các chất
phân tích có màu) hoặc soi tử ngoại ở các bước sóng 254 nm, 366 nm hoặc phun
thuốc thử hiện màu, hoặc quét lên bề mặt bản mỏng (thiết bị densitometer, một thiết
bị đo cường độ phản xạ ánh sáng tử ngoại hoặc khả kiến của chất cần phân tích)...
Tuỳ thuộc bản chất của chất cần phân tích ta có thể sử dụng một trong các phương
pháp trên để phát hiện vết chất trong hỗn hợp cần phân tích [9].
1.4.1.2. Các đại lượng đặc trưng
* Hệ số lưu giữ Rf
Hệ số lưu giữ Rf là đại lượng đặc trưng cho mức độ dịch chuyển của các chất,
được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của chất phân tích và khoảng cách
dịch chuyển của pha động.

R

f



d
d

R

M

trong đó:
dR là khoảng cách từ điểm xuất phát tới tâm vết phân tích (tính bằng cm)
dM là khoảng cách từ điểm xuất phát tới mức dung môi pha động (đo trên

cùng đường đi của vết, tính bằng cm)

12