Nghiên cứ hệ phiên mã từ mô cơ của tôm sú Penaeus Monodon tại Việt Nam (LV thạc sĩ)

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

---- oOo----

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

NGHIÊN CỨU HỆ PHIÊN MÃ TỪ MÔ CƠ CỦA TÔM SÚ
PENAEUS MONODON TẠI VIỆT NAM.

NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM

MÃ NGÀNH: 60420114

Giáo viên hướng dẫn: PGS.TS Đinh Duy Kháng
Học viên thực hiện : Nguyễn Thị Minh Thư
Khóa học

: 2012 - 2014

LỜI CÁM ƠN
Hà Nội, 2014


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành được luận văn này trước tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân
thành tới PGS.TS Đinh Duy Kháng Phòng vi sinh vật học phân tử, Viện công
nghệ sinh học người luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian
thực hiện luận văn. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Đồng Văn Quyền,
Trưởng Phòng vi sinh vật học phân tử, Phó viện trưởng Viện công nghệ sinh học
đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi được nghiên cứu và thực hiện luận văn tại

phòng. Qua đây tôi xin cảm ơn TS. Nguyễn Thị Tuyết Nhung, ThS. Hà Thị Thu,
ThS. Nguyễn Thị Hoa, các cô chú, anh chị đang công tác tại phòng Vi sinh vật
học phân tử, những người luôn tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong lĩnh vực
chuyên môn cùng với tinh thần làm việc khoa học và nghiêm túc. Trong thời
gian thực tập, lãnh đạo phòng và các cô chú, anh chị trong phòng đã giúp tôi
trưởng thành hơn rất nhiều.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo Trường Đại Học Thái Nguyên, Viện
Sinh Thái và Tài Nguyên Sinh Vật, Viện Công Nghệ Sinh Học đã hướng dẫn và
truyền thụ kiến thức cho tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới những người than trong gia đinh
tôi, bạn bè và đồng nghiệp đã tạo điều kiện, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt
thời gian làm luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó./.

Hà nội, ngày 21 tháng 12 năm
2014 Học viên:

Nguyễn Thị Minh Thư


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt

Tên đầy đủ

cDNA

Complementary

ddNTP

Dideoxyribonucleotide

DNA

Deoxyribonucleotide axit

dNTP

Deoxyribonucleotide triphosphate

EST

Expressed sequence tag

FC

Flow Cell

GO

Gene Ontology

Kb

Kilo base

KEGG

Kyoto Encyclopedia of Genes and
Genomes

mRNA

RNA thông tin

NGS

Next Generation Sequencing

PCR

Polymerase Chain Reaction

RFLP

Restriction Fragement Length
Polymorphism

RNA

Ribonucleotide axit

SBL

Sequencing By Ligation

SBS

Sequencing By Synthesis

TF

Transcription factor


MỤC LỤC
CHƢƠNG I: MỞ ĐẦU........................................................................................1
1.1.
1.2.

Đặt vấn đề................................................................................................1
Mục tiêu đề tài......................................................................................... 3

CHƯƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU..............................................................4
2.1.Đại cƣơng về Tôm Sú............................................................................4
2.1.1. Đặc điểm sinh học của Tôm Sú............................................................4
2.1.2. Khả năng thích ứng với điều kiện môi trƣờng.....................................8
2.1.3. Đặc điểm sinh trƣởng của Tôm Sú...................................................... 9
2.2. Tầm quan trọng của việc lập bản đồ và giải mã hệ gen của Tôm Sú. 10
2.3. Các công trình nghiên cứu về Tôm Sú............................................... 12
2.3.1. Tình hình nghiên cứu trên Thế giới....................................................13
2.3.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam.................................................... 14
2.4. Khái quát về hệ phiên mã................................................................... 16
2.5. Giới thiệu về công nghệ giải trình tự thế hệ mới................................18
CHƯƠNG III: VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU... 27
3.1. Vật liệu..................................................................................................27
3.1.1. Đối tƣợng........................................................................................... 27
3.1.2. Trang thiết bị...................................................................................... 27

3.1.3. Sinh phẩm...........................................................................................27
3.2. Nội dung nghiên cứu.......................................................................... 28
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu................................................................... 29
3.3.1. Phƣơng pháp tách chiết và tinh chế mRNA tổng số từ mô Cơ..........29
3.3.3. Gắn Adaptor....................................................................................... 32
3.3.4. Khuếch đại các đoạn DNA đã gắn Adaptor........................................32
CHƯƠNG IV : KẾT LUẬN VÀ THẢO LUẬN
KẾT LUẬN
KIẾN NGHỊ........................................................................................................49
TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................. 50


DANH MỤC HÌNH
Hình 1 Hình ảnh tôm sú........................................................................................4
Hình 2: Vòng đời của Tôm sú..............................................................................8
Hình 3: Tôm sú thu từ vùng biển Nghệ An........................................................27
Hình 4. FC chứa 8 kênh (A), trong mỗi kênh của FC (B) đã được gắn hàng triệu
primer xuôi (F) và ngƣợc (R) bằng liên kết cộng hóa trị. Các mồi này
bắt cặp bổ sung với đầu gắn adaptor trên các đoạn cDNA tổng hợp từ
phân đoạn mRNA tôm sú.....................................................................34
Hình 5. Tổng hợp sợi DNA mới nhờ Taq DNA polymerase, primer gắn FC và
khuôn là cDNA sợi đơn gắn adaptor tổng hợp từ mRNA mô cơ tôm sú.
.............................................................................................................. 35
Hình 6. Sợi DNA tổng hợp mới gắn với một vị trí nhất định trên FC................35
Hình 7. Đầu 3’ của sợi mới tổng hợp bắt cặp bổ sung với primer xuôi (F) gắn
trên FC và quá trình kéo dài chuỗi nhờ Taq lại xảy ra..........................36
Hình 8. Quá trình hình thành cụm (Cluster) DNA đồng nhất trên mỗi vị trí của
FC nhờ hình thành cầu nối (A) và khuếch đại cầu nối (B), biến tính tạo
mạch thẳng (C) và cắt bỏ sợi nghĩa khỏi FC (D)..................................36
Hình 9. Giải trình tự bằng việc bổ sung các primer giải trình tự bắt cặp bổ sung

với adaptor ở đầu 3’ của các sợi gắn FC (A) và kéo dài chuỗi nhờ Taq
DNA polymerase với 4 bazơ gắn 4 chất màu khác nhau theo nguyên lý
kết thúc hồi tính (Reversible Terminator, B)........................................37
Hình 10. Các bước tách chiết, tinh chế phân cắt và tổng hợp cDNA.................39
Hinh 11. Các bước gắn adaptor, khuếch đại bằng PCR và chọn đoạn gen có độ
dài thích hợp để giải trình tự.................................................................41
Hình 15. Chất lượng trình tự theo vị trí trên trình tự đọc mô cơ sau khi tiền xử lý 45
Hình 16. Chất lượng trình tự theo vị trí trên trình tự đọc mô cơ sau khi tiền xử lý 45
Hình 17. Thống kê độ dài của toàn bộ trình tự đọc mô cơ sau khi tiền xử lý ...
45 Hình 18. Phân bố Contigs theo độ dài lắp ráp...............................................46


CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU
1.1.

Đặt vấn đề

Nuôi trồng thuỷ sản là ngành kinh tế quan trọng đóng góp một phần đáng kể
trong thị phần xuất khẩu của Việt Nam cũng nhƣ nhiều quốc gia trong khu vực.
Trong đó, ngành nuôi tôm là một trong những ngành mũi nhọn mang lại nguồn
ngoại tệ lớn. Chiến lƣợc phát triển ngành nuôi trồng tôm sú ở Việt Nam cũng
nhƣ của các nƣớc trong khu vực là làm sao để có đƣợc ngành sản xuất tôm sú
bền vững, hạn chế đƣợc tối thiểu các tác động tiêu cực đến môi trƣờng, sinh
thái. Nền tảng cho chiến lƣợc phát triển này là phát triển nguồn tôm bản địa với
các chƣơng trình nhân giống khoa học để nâng cao tỷ lệ sống và sự tăng trƣởng.
Để đạt đƣợc mục đích này, việc nghiên cứu cấu trúc và chức năng của toàn bộ
hệ gen (genome) tôm sú là một vấn đề khoa học cơ bản có định hƣớng ứng dụng
hết sức quan trọng.
Tôm sú (Penaeus monodon) là loài thủy sản đƣợc nuôi trồng và mang lại lợi
nhuận rất lớn nhờ xuất khẩu cho nhiều quốc gia ở châu Á - Thái Bình Dƣơng

(Thái Lan, Việt Nam, Hàn Quốc, Đài Loan, Malaysia, Indonesia, Ấn Độ,
Autralia v.v...). Năm 2008, tổng sản lƣợng tôm trên toàn thế giới đạt 6 triệu tấn,
đạt giá trị thƣơng mại 10 tỷ USD, chiếm 16% tổng kim ngạch xuất khẩu hải sản
(Leu và cs, 2010). Riêng ở Việt Nam, theo Hội nghị tổng kết xuất khẩu tôm năm
2012 do VASEP tổ chức vào ngày 28/12/2012 tại thành phố Hồ Chí Minh thì
kim ngạch xuất khẩu tôm năm 2012 đạt khoảng 2,25 tỷ USD. Ngày 2/11/2014,
tại hội nghị tổng kết nuôi tôm nƣớc lợ 2014 cho biết: 9 tháng đầu năm 2014 xuất
khẩu tôm cuả Viêṭ Nam đaṭ gần 2,94 tỷ USD , tăng 42% so vơí cuǹ g kỳ . Đến
cuối năm dự báo xuất khẩu tôm sẽ đạt mức 3,8 tỷ USD. Xuất khẩu tôm nhiều
năm liền độc chiếm ngôi đầu, chiếm trên 50% tỷ trọng xuất khẩu thuỷ sản của cả
nƣớc. Ở nƣớc ta nghề nuôi tôm sú Penaeus monodon đã và đang phát triển
mạnh
trong những năm gần đây. Thống kê cho thấy, năm 2012 tổng diện tích nuôi tôm
trên cả nƣớc là 530000 héc ta (ha). Dự kiến năm 2014, con số này sẽ tăng lên
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu –
6ĐHTN




đến 600000 ha và sản lƣợng dự kiến sẽ là 270000 tấn. Sản lƣợng nuôi tôm sú
qua các năm tăng mạnh kéo theo giá trị xuất khẩu tôm sú cũng tăng nhanh tạo ra
nguồn lợi đáng kể cho kinh tế nƣớc ta.Việt Nam xuất khẩu tôm vào 92 thị
trƣờng, trong đó tôm sú chiếm trên 50% giá trị xuất khẩu mặt hàng tôm.
Tuy nhiên, nghề nuôi tôm của nƣớc ta hàng năm chịu thiệt hại rất lớn do dịch
bệnh, trong đó dịch bệnh do virus đóng vai trò chủ yếu. Vì vậy, việc kiểm tra,
phát hiện kịp thời các tác nhân gây bệnh để đề ra biện pháp phòng chống, giảm
thiểu thiệt hại tới mức thấp nhất cho ngành nuôi tôm là vấn đề đƣợc nhiều cơ sở
nghiên cứu quan tâm. Cho đến nay, những hiểu biết cơ bản về sự sinh sản, hệ
miễn dịch và đặc biệt là sự điều khiển sinh trƣởng của tôm sú còn rất hạn chế do

những thiếu sót thông tin về genome và sự biểu hiện gen của chúng. Kích thƣớc
genome của tôm sú cũng rất lớn (khoảng trên 2 tỉ cặp base = 2/3 bộ gen ngƣời),
nên việc giải mã toàn bộ genome tôm sú đòi hỏi nhiều thời gian và chi phí rất
lớn, ƣớc tính hàng chục triệu đô la. Vì vậy một trong những hƣớng nghiên cứu
đƣợc lựa chọn là lập bản đồ di truyền liên kết genome tôm sú, lập bản đồ di
truyền từ DNA vi vệ tinh hay lập bản đồ gen tôm sú từ giải mã EST/cDNA, bằng
việc lựa chọn những gen ứng viên dự báo phù hợp với mục đích nghiên cứu, ta
có thể xây dựng đƣợc các chỉ thị phân tử phục vụ cho công tác chọn giống,
nghiên cứu cấu trúc và chức năng của các gen liên quan. Việc nghiên cứu giải
mã và lập bản đồ bộ gen thƣờng tập trung vào các đối tƣợng có giá trị kinh tế
cao. Nhƣ đã trình bày ở trên, tôm sú là đối tƣợng nuôi trồng có giá trị kinh tế
mang tính chiến lƣợc. Chính vì vậy việc phối hợp giữa các quốc gia nhằm giải
mã và lập bản đồ gen tôm sú sẽ mang lại lợi ích chung cho cộng đồng và cũng là
cho mỗi quốc gia.
Nghiên cứu hệ gen phiên mã (transcriptome) là một hƣớng nghiên cứu quan
trọng, tập chung nghiên cứu gen mã hóa protein và mức độ biểu hiện của chúng
trong từng loại mô cơ quan, từng giai đoạn của quá trình phát triển hay trong các
điều kiện môi trƣờng khác nhau.


Trong khuôn khổ của đề tài chúng tôi tiến hành nghiên cứu mô Cơ của Tôm
Sú. Hiện nay, kết quả nghiên cứu từ mô Cơ của Tôm Sú là những dữ liệu quan
trọng phục vụ cho việc giải trình tự hệ phiên mã.
Chính vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu hệ phiên mã từ mô Cơ
của Tôm Sú (penaues monodon) tại Việt Nam”
1.2.

Mục tiêu đề tài

- Tách chiết và tinh sạch đƣợc ARN thông tin (mRNA) từ mô cơ của Tôm Sú.

- Đánh giá đƣợc chất lƣợng mRNA đủ tiêu chuẩn cho việc giải trình tự hệ phiên
mã của Tôm Sú bằng máy xác định trình tự gen thế hệ mới
- Chuẩn bị đƣợc mẫu, cho đi giải trình tự gen bằng máy xác định trình tự gen thế
hệ mới
- Phân tích hệ phiên mã mô cơ của Tôm Sú


CHƢƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1.Đại cƣơng về Tôm Sú
2.1.1. Đặc điểm sinh học của Tôm Sú
Cơ thể tôm sú có màu xanh đậm, có những vân sắc tố trắng đen ở các đốt bụng.
Phần còn lại của thân biến đổi từ màu nâu sang màu xanh hoặc đỏ.
Trong các loài tôm nuôi, tôm sú là loài có kích thƣớc lớn (có thể lên đến 330
mm hoặc lớn hơn về chiều dài cơ thể) và là loài tôm thƣơng mại quan trọng.

Hình 1 Hình ảnh tôm sú
2.1.1.1. Phân loại
Tôm sú có tên tiếng Anh là Black tiger shrimp. Chúng thuộc ngành Arthropoda;
phân

ngành

Crustacea;

lớp

Malacostraca;

bộ

Decapoda;

phân

bộ

Dendrobranchiata; họ Penaeidea; giống Penaeus; loài Penaeus Monodon.
2.1.1.2. Cấu tạo
Phần đầu trên của tôm sú Penaeus Monodon có chủy cứng với các răng cƣa.
Phía trên của chủy có từ 7 đến 8 răng và phía dƣới chủy có 3 răng. Ở tôm sú,
mũi khứu giác và râu là cơ quan nhận biết và giữ thăng bằng cho tôm. Trong khi
đó 3 cặp chân hàm của tôm có tác dụng lấy thức ăn và và giúp cho việc bơi lội
thì 5 cặp chân ngực ngoài tác dụng để lấy thức ăn chúng còn đƣợc tôm sử dụng


khi chúng bò. Ngoài ra một cặp chân bụng khác cũng đƣợc dùng để bơi. Phần
đuôi của tôm sú có 1 cặp chân đuôi để tôm có thể nhảy xa và điều chỉnh lên cao
hay xuống thấp khi bơi. Bộ phận sinh dục của tôm sú thì nằm ở dƣới bụng.
Tôm sú thuộc loại dị hình. Tôm cái có kích thƣớc to hơn tôm đực. Khi tôm
trƣởng thành, sự khác biệt giữa tôm đực và tôm cái rất rõ rang thông qua sự
khác biệt của cơ quan sinh dục bên ngoài.Ở con đực, cơ quan sinh dục chính
nẳm ở phía trong phần đầu ngực. Bên ngoài có cơ quan giao phối phụ nằm ở
nhánh ngoài đôi chân ngực thứ 2. Lỗ sinh dục đực mở ra hốc hang đôi chân
ngực thứ 5. Tinh trùng của loài này thƣợng đƣợc chứa trong túi. Ở tôm cái,
buồng trứng nằm dọc theo mặt lƣng phía trên với hai ống dẫn trứng mở ra ở
khớp hang đôi chân ngực thứ 3. Bộ phận chứa túi tinh gồm 2 tấm phồng lên ở
đôi chân ngực thứ 4 và thứ 5 dƣới bụng tôm.
2.1.1.3. Phân bố
Tôm sú có phạm vi phân bố rộng, từ ấn Độ Dƣơng qua hƣớng Nhật Bản, Đài
Loan, phía Đông Tahiti, phía Nam châu Úc và phía Tây châu Phi (Racek - 1955,

Holthuis và Rosa - 1965, Motoh - 1981, 1985) Nhìn chung, tôm sú phân bố từ
kinh độ 30E đến 155E từ vĩ độ 35N tới 35S xung quanh các nƣớc vùng xích
đạo, đặc biệt là Indonesia, Malaixia, Philippines và Việt Nam. Riêng ở Việt Nam
Tôm Sú phân bố rộng từ Bắc tới Nam, từ ven bờ đến vùng có độ sâu 40m. Tròn
đó vùng phân bố chính là vùng biển miền Trung.
Tôm bột , tôm giống (Juvenile) và tôm gần trƣởng thành có tập tính sống gần bờ
biển và rừng ngập mặn ven bờ. Tuy nhiên, khi tôm trƣởng thành di chuyển xa
bờ vì những vùng nƣớc sâu là nơi sống ƣa thích của chúng. Sự phân bố của
Tôm Sú phụ thuộc vào giai đoạn phát triển
2.1.1.4. Chu kỳ sống của Tôm Sú
Ấu trùng tôm sú (Nauplli) đƣợc biến đổi theo 5 giai đoạn trong vòng từ 36 đến
51 giờ. Các ấu trùng tôm này thƣờng bơi từng đoạn ngắn rồi nghỉ. Đối với giai
đoạn này, ngƣời ta không cần cung cấp thức ăn vì chúng tự sống bằng noãn
hoàng. Chúng lột vỏ 4 lần, mỗi lần khoảng 7 giờ. Về kích thƣớc, nauplli 1 dài


khoảng 0.40mm, dày 0.20mm; nauplli 2 dài khoảng 0.45mm, dày 0.20mm;
nauplli 3 dài khoảng 0.49mm, dày 0.20mm; nauplli 4 dài khoảng 0.55mm, dày
0.20mm; nauplli 5 dài khoảng 0.61mm, dày 0.20mm;
Zoea đƣợc chia thành 3 giai đoạn diễn ra trong vòng từ 105 đến 120 giờ. Ở gian
đoạn này, các Zoea bơi liên tục gần mặt nƣớc và lột vỏ 2 lần, mỗi lần khoảng 36
giờ, ăn thực vật phù du. Về kích thƣớc, zoea 1dài khoảng 1mm, dày 0.45mm.
Vào thời điểm này zoea xuất hiện hai phần dầu và bụng rõ rệt. Zoea 2 dài
khoảng 1.9mm với sự xuất hiện mặt và chủy trong khi đó zoea 3 dài khoảng
2.7mm với gai trên bụng.
Mysis cũng đƣợc chia ra làm 3 giai đoạn, diễn ra trong vòng 72 giờ. Các mysis
bơi hƣớng xuống sâu và đuôi đi trƣớc, đầu đi sau. Về kích thƣớc, mysis 1 dài
khoảng 3.4mm, có hình dạng của tôm trƣởng thành. Ở giai đoạn này, tôm xuất
hiện các cặp chân bụng, đuôi và quạt đuôi. Các gai bụng đƣợc thu nhỏ lại.
Mysis 2: dài khoảng 4.0mm và mysis 3 dài khoảng 4.4mm, chân bụng dài hơn,

phân thành đốt nhỏ, xuất hiện răng trên chủy. Tôm phải trải qua giai đoạn
postlarvae là giai đoạn gần trƣởng thành, trƣớc khi phát triển thành tôm trƣởng
thành.
Tuổi thành thục của tôm đực và tôm cái từ tháng thứ 8 trở đi. Xác định sự thành
thục của tôm cái dễ hơn vì ngƣời ta chỉ cần quan sát xem có túi tinh ở cơ quan
sinh dục phụ hay không. Phƣơng pháp xác định thành thục ở con đực khó hơn
do phải vác định sự có mặt của tinh trùng ở cuối ống dẫn tinh. Thông thƣờng
ngƣời ta thƣờng dựa vào trọng lƣợng để xác định giới tính khi con đực nặng từ
50g trở lên. Hormone điều khiển sự thành thục sinh dục (gonal inhibiting
hormone- GIH) đƣợc sản xuất bởi tế bào thần kinh trong cơ quan X của cuống
mắt. Sau khi đƣợc tổng hợp, hormone này đƣợc vận chuyển tới tuyến giáp
sinap, rồi chúng đƣợc đƣa vào kho dự trữ và chỉ đƣợc tiết ra khi cần thiết. Sự
thành thục sinh dục của tôm sú thông qua tác động của tuyến nội tiết. Cắt mắt
tôm sẽ có tác dụng thúc đẩy chu kỳ lộ xác, dẫn đến sự thành thục nhanh hơn.


Số lƣợng trứng đẻ của tôm cái phụ thuộc vào chất lƣợng buồng trứng và trọng
lƣợng cá thể mẹ, trọng lƣợng càng lớn thì cho càng nhiều trứng. Con cái thành
thục ngoài tự nhiên thƣờng có trọng lƣợng từ 100 đến 300g và đẻ từ 300000
đến 1200000 trứng. Nếu cắt mắt và nuôi vỗ con cái trong bể xi măng, chúng sẽ
thành thục và đẻ với số lƣợng trứng dao động từ khoảng 200000 đến 600000
trứng.
Tôm sú cái thƣờng đẻ trứng vào ban đêm, khoảng 22 giờ đến 2 giờ sáng. Từ 14
đến 15 giờ sau khi đẻ đƣợc, ở nhiệt độ 27-28C trứng sẽ nở thành ấu trùng gọi là
Nauplii. Tôm sú đẻ quanh năm, nhƣng tập trung vào hai thời kỳ chính là tháng
3-4 và tháng 7-10.
Tôm sú đực có tuổi thọ là khoảng 18 tháng trong khi đó tuổi thọ của tôm sú cái
là khoảng 24 tháng.
Vòng đời của tôm sú có hai đặc điểm quan trọng cần chú ý. Sự tăng trƣởng của
tôm sú từ hậu ấu trùng cho đến lúc trƣởng thành đƣợc phát triển ở các vùng ven

bờ hay vùng cửa song đƣợc đặc trƣng bởi vùng nƣớc lợ. Khi tôm sú đã trƣởng
thành thì mọi hoạt động đều sảy ra ở ngoài khơi nơi có nồng độ muối giao động
trừ 28‰ đến 32‰ và ổn định.


Hình 2: Vòng đời của Tôm sú
2.1.2. Khả năng thích ứng với điều kiện môi trƣờng
2.1.2.1. Khả năng thích ứng với nhiệt độ
Tôm sú có biên độ giao động nhiệt cao từ 14oC đến 35oC và nhiệt độ thích hợp
là từ 28oC đến 30oC.
2.1.2.2. Độ muối
Tôm sú thích ứng rộng với độ muối từ 0,2‰ đến 40‰ và tôm sú thích hợp nhất
là nồng đồ muối từ 15‰ đến 32 ‰. Nồng độ muối thích ứng nhất cho các mô
hình nuôi bán thâm canh và thâm canh là ở 10‰ đến 18‰. Đối với ấu trùng
ƣơng nuôi trong bể thì nồng độ muối thích hợp nhất là tƣ̀ 28‰ đến 30‰.
2.1.2.3. Độ pH
Đối với tôm sú thì phạm vi pH thích ứng là 7,5 – 9. Khi môi trƣờng sống của
tôm sú có pH= 5 thì tôm sú sẽ chết sau 45 giờ và khi môi trƣờng sống có pH =
5,5 thì tôm sú sẽ chết sau 24 giờ. Và nếu môi trƣờng sống của tôm sú có pH
xuống thấp thì tôm sú sẽ đi mất khả năng vùi mình xuống bùn tôm sú sẽ yếu ớt,


màu sắc thay đổi đột ngột (tôm nhợt nhạt) và đôi khi tôm nhảy cả lên bờ. Trong
bể ƣơng ấu trùng thì pH luôn dao động trong khoảng tƣ̀ 7,5 đến 8,5.
2.1.2.4. Các chất khí hòa tan
Đối với hàm lƣợng oxythì tôm sú rất nhạy cảm với hàm lƣợng oxy hòa tan trong
nƣớc và phạm vi giới hạn của hàm lƣợng là từ 3mg/lít đến 11mg/lít.
Đối với hàm lƣợng CO2 thì tôm sú thích hợp nhất là 10mg/lít.
Hàm lƣợng H2S trong các ao nuôi thâm canh và bán thâm canh thì lƣợng H2S
cho phép là 0,03mg/lít và tối ƣu là bằng 0. Còn trong bể ƣơng ấu trùng thì hàm

lƣơng H2S luôn bằng 0.
2.1.2.5. Tính thích ánh sáng và hướng quang của tôm
Đặc tính của tôm sú là thích ánh sang yếu. Mọi hoạt động của tôm sú nhƣ: Giao
vĩ, sinh sản, bắt mồi… đều diễn ra vào ban đêm nhất là lúc chập choạng tối và
gần sáng. Tôm trƣởng thành có thể nhận biết đƣợc tầng ánh sáng 1 lux cách xa
từ 20-30m. Nhƣng nếu nguồn sáng không ổn định tôm sú có thể bỏ ăn. Đối với
ánh sáng tự nhiên trong bể ƣơng ấu trùng là không cần thiết mà chủ yếu là ánh
sáng nhân tạo.
2.1.2.6. Cơ chế lột xác của tôm
Mỗi lần tôm sú lột xác là một lần tôm sus tăng trƣởng về chiều dài và trọng
lƣợng trung bình từ 10-15% so với trƣớc khi lột xác. Sự lột xác của tôm sú là
do một loại hoocmôn ở cuống mắt quy định. Cuống mắt của tôm sú còn lại chứa
các tế bào kết tủa ion Canxi và ion Photpho làm cho vỏ tôm cứng lại sau khi lột
xác đƣợc 0,5 đến 1 giờ. Các tế bào này hoạt động đƣợc dƣới tác dụng của ánh
sáng mặt trời.
2.1.3. Đặc điểm sinh trƣởng của Tôm Sú
Giai đoạn ấu trùng tôm sú (nauplius) đƣợc trải qua 6 lần lột xác và sau 30 đến 35
giờ thì chuyển thành Zoea với kích thƣớc cơ thể tôm sú đạt khoảng 0,34mm.
Giai đoại Zoea trải qua 3 lần lột và xác thời kì lột xác từ giai đoạn zoea lần thứ1
đến giai đoạn zoea lần thứ 3 mất khoảng 4 ngày và kích thƣớc cơ thể tôm sú
đạt khoảng 2,5mm.


Giai đoạn mysis cũng phải trải qua 3 lần lột xác. Thời gian lột xác từ giai đoạn
mysis lấn thứ 1 đến giai đoạn mysis lần thứ 3 mất khoảng 3 ngày. Đầu giai đoạn
này kích thƣớc cơ thể trung bình đạt 2,83mm đến cuối giai đoạn kích thƣớc cơ
thể đạt 3,79mm.
Đầu giai đoạn postlarvae cứ một ngày lột xác một lần, từ postlarvae 5 trở đi thì
sau 1 đến 2 ngày tôm lột xác một lần (sự lột xác của tôm sú phụ thuộc vào nhiệt
độ và nồng độ muối). Ở giai đoạn này cơ thể gần giống tôm trƣởng thành, kích

thƣớc cơ thể đầu giai đoạn postlarvae đạt khoảng từ 4,9 đến 5mm. Đến cuối giai
đoạn kích thƣớc cơ thể đạt khoảng từ 2 đến 3cm.
Thời kì tôm con, tôm sú lớn lên phải trải qua các quá trình lột xác, mỗi lần lột
xác tôm tăng trƣởng về trọng lƣợng từ 10% đến 15% so với lúc ban đầu. Ở thời
kì tôm con cứ sau 2 đến 3 ngày tôm lột xác một lần.
Thời kì tôm trƣởng thành, tôm trƣởng thành lột xác ít hơn, thời gian giữa hai
lần lột xác phụ thuộc rất lớn vào nồng độ muối. Nồng độ muối thích hợp cho
tôm sú là 15‰ đến 20‰. Ở Đài loan trong các bể nuôi tôm sú thì nồng độ muối
dao động từ 10‰ đến 15‰. Trên thực tế cho thấy nếu nồng độ muối lớn hơn
25‰ thì tốc độ lột xác của tôm chậm và dẫn tới việc tôm chậm phát triển.
2.2. Tầm quan trọng của việc lập bản đồ và giải mã hệ gen của Tôm Sú
Việc nghiên cứu cấu trúc và chức năng của toàn bộ hệ gen (genome) Tôm Sú là
một vấn đề khoa học cơ bản có định hƣớng ứng dụng hết sức quan trọng. Những
nghiên cứu chi tiết về hệ gen (genome), (transcriptome) hệ phiên mã, hệ protein
(proteome) và bản đồ gen Tôm Sú sẽ cung cấp những thông tin sinh học giúp
cho việc xác định các gen liên quan đến tính trạng cần thiết nhƣ tính kháng
bệnh, tính chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trƣờng, tính trạng quyết định
năng suất, chất lƣợng cũng nhƣ khả năng sinh sản của tôm. Các chỉ thị phân tử
cũng nhƣ các thông tin quan trọng khác có đƣợc từ nghiên cứu hệ gen và lập
bản đồ gen Tôm Sú sẽ đóng góp một cách hết sức có ý nghĩa và mang tính quyết
định cho công tác chọn giống và nuôi trồng tôm.
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu –
1Đ0HTN




Chính vì vậy, ngay từ đầu thế kỷ này một dự án giải mã genome Tôm Sú đã
đƣợc đề xuất và vào ngày 2-3 tháng 10 năm 2004, hội nghị bàn về hợp tác giải
mã genome tôm sú đã đƣợc chính thức tổ chức tại Bangkok, Thái Lan. Hội nghị

với sự tham dự của 12 nƣớc (Úc, Canada, Trung quốc, Hồng Kông, Ấn Độ,
Nhật Bản, Malaysia, Singapore, Đài Loan, Thái Lan, Hoa Kỳ và Việt Nam) đã
đề xuất Ban chỉ đạo và chƣơng trình hành động để giải quyết từng khâu và tiến
tới giải mã toàn bộ hệ gen cũng nhƣ xây dựng bản đồ gen Tôm Sú. Các khâu
cần phải giải quyết để có thể tiến tới giải mã toàn bộ hệ gen cũng nhƣ xây dựng
bản đồ gen Tôm Sú bao gồm:
1. Giải trình tự EST, thiết lập Ngân hàng trình tự EST (khoảng 300.000 ngàn trình
tự EST).
2. Microarrays để đánh giá biểu hiện của các gen có chức năng khác nhau ở các
mô khác nhau.
3. Thiết lập thƣ viện nhiễm sắc thể vi khuẩn nhân tạo (BAC), xác định trình tự đầu
tận cùng (end sequencing) phục vụ việc lập bản đồ (physical map).
4. Lập bản đồ gen Tôm Sú.
EST là một phần nhỏ của trình tự DNA (thƣờng dài từ 200 – 500 nucleotid)
đƣợc tạo ra từ một hoặc hai đầu của gen biểu hiện (từ đầu 5’ hay đầu 3’ của
cDNA). Gồm có 5’ EST và 3’ EST
5’ EST đƣợc tạo ra từ một phần đầu 5’ của cDNA có khuynh hƣớng bảo tồn
giữa các loại và không thay đổi nhiều trong một họ gen
3’ EST đƣợc tạo ra từ một đầu 3’ của cDNA dạng này có thể sẽ rơi vào vùng
không mã hóa (non – coding) hay vùng không dịch mã. Do đó khuynh hƣớng
bảo tồn giữa các loại thấp hơn những trình tự mã hóa.
Một EST có thể sử dụng giúp cho việc xác định nhiều gen chƣa biết và lập bản
đồ của chúng trong một bộ gen. Tạo thƣ viện và giải mã các đoạn trình tự gene
biểu hiện (Expressed Sequence Tag, EST) là một phƣơng pháp hữu hiệu để
nghiên cứu hệ phiên mã.
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu –
1Đ16HTN

2.3. Các công trình nghiên cứu về Tôm Sú.
Công trình đầu tiên nghiên cứu về EST Tôm Sú đã đƣợc Lehnert SA và cs công
bố vào năm 1999. Trong công trình nghiên cứu này, 3 thƣ viện cDNA đã đƣợc
thiết lập từ 3 mô khác nhau của Tôm Sú, bao gồm chân bơi, gốc mắt và hạch
ngực. Các tác giả đã giải mã đƣợc 172 trình tự EST, trong đó có 88 trình tự từ
hạch ngực, 56 trình tự từ gốc mắt và 32 trình tự từ chân bơi (Lehnert SA và cs,
1999).
Ngân hàng dữ liệu EST thu đƣợc từ các mô khác nhau của Tôm Sú (P.
monodon) và tôm thẻ chân trắng (L. vannamei):
Tham vọng lớn nhất của dự án giải mã EST tôm là xác định đƣợc toàn bộ hệ
phiên mã (hệ phiên mã) của tôm. Dự án này đƣợc tiến hành với sự chỉ đạo của
GS. P.S. Gross thuộc Trung tâm khoa học Môi trƣờng và Sinh-Y biển, Trƣờng
Đại học Y khoa, South Carolina, Hoa Kỳ, với mục tiêu giải mã 100.000 EST ở
cả hai đầu 5’ và 3’ của tôm thẻ chân trắng (L. vannamei). Nhƣ vậy, tổng số trình
tự cần giải mã là 200.000. Nhóm nghiên cứu này đã công bố 13.656 trình tự
EST (O’Leary et al. 2006). Để có thể phát hiện đƣợc nhiều gen chức năng trong
các trình tự EST đã giải mã, nhóm tác giả này đã thiết lập các cDNA từ 6 mô
khác nhau (hemocyte, gan-thận, mang, tổ chức lymphô, gốc mắt, và huyệt thần
ki.nh) và giải mã đƣợc 7.896 EST từ ngân hàng cDNA của các mô này
(Robalino et al. 2007). Bởi vì nhóm này chủ yếu tập trung nghiên cứu các thành
phần tham gia vào hệ thống phòng vệ của tôm nên hầu hết các EST thu nhận đều
xuất phát từ các mô miễn dịch, bao gồm hemocyte, gan-thận, mang và tổ chức
lymphô. Hemocyte là các tế bào phòng vệ đầu tiên chống lại sự xâm nhập của
tác nhân gây bệnh ở tôm nên phần lớn các EST (gần 40%) đi ra từ nguồn này. Ở
các EST có nguồn gốc từ hemocyte, các gen liên quan tới các peptide kháng
khuẩn chiếm đa số. Ngoài ra, các gen mã hóa cho các chất ức chế protease, các
yếu tố làm đông kết, lysozyme và các proteins sốc nhiệt cũng đƣợc xác định.
Hai gen mã hóa cho các phân tử tạo tín hiệu miễn dịch là STAT và I-kappa-B

kinase cũng đƣợc tìm thấy trong EST từ hemocyte. Đây cũng là hai gen đầu tiên
đƣợc tìm thấy ở tôm. Một gen quan trọng nữa là gen điều khiển miễn dịch imd
(immune deficiency) cũng lần đầu tiên đƣợc phát hiện ở tôm. Cho đến năm
2010, số EST của L. vannamei đã đƣợc công bố là 176.198, trong số đó đã tìm
thấy 14.548 vùng nằm kề (contigs). Các trình tự này đã có trong Ngân hàng trình
tự EST của NCBI.
2.3.1. Tình hình nghiên cứu trên Thế giới
2.3.1.1. Nghiên cứu giải mã và lập bản đồ gen ở Thái Lan
Thái Lan là nƣớc đứng đầu thế giới về xuất khẩu tôm với thu nhập khoảng 2 tỷ
USD/năm. Chính vì vậy, ngay sau hội nghị quốc tế Bangkok 2004, Thái Lan đã
đầu tƣ khoảng 1,5 triệu USD cho giải mã EST và xây dựng bản đồ gen tôm sú.
Các nghiên cứu xây dựng Ngân Hàng EST và các EST liên quan tới nhiều tính
trạng quan trọng nhƣ giới tính của tôm, khả năng phòng vệ của tôm, tìm ra các
microsatellite phục vụ xây dựng bản đồ liên kết di truyền... đã đƣợc Trung Tâm
SHPT và Genomics của GS Tassanakajon tiến hành thành công và công bố kết
quảtrên các tạp chí khác nhau. Phân tích hơn 10 ngàn EST, Maneeruttanarungroj
và cs đã tìm ra đƣợc 997 EST có duy nhất 1 microsatellite marker. Sử dụng các
marker microsatellite kết hợp với các marker khác nhƣ AFLP, SNP, các nhà
khoa học Thái Lan đã phân ra đƣợc các nhóm liên kết gồm 47 nhóm liên kết
trên tôm đực và 36 nhóm liên kết trên tôm cái, chiếm tới 1/2 hệ gen tôm sú và
xây dựng thành công bản đồ liên kết di truyền(Maneeruttanarungroj và cs,
2006). Từ năm 2006 Tassanakajon và cs tại trƣờng Đại học tổng hợp
Chulalongkorn, Bangkok đã thực hiện một dự án lớn giải mã EST và thiết lập
Ngân hàng dữ liệu EST Tôm Sú. Khởi đầu bằng 15 thƣ viện cDNA từ các mô
khác khau trong điều kiện bình thƣờng hoặc stress nhằm tìm ra các gen đặc hiệu
kháng bệnh và thích ứng với stress. Trong công trình công bố vào năm 2006,
10.100 clone đã đƣợc giải trình tự, trong đó tìm đƣợc 4845 trình tự không trùng
lặp và một nửa trong số đó có độ tƣơng đồng cao với các gen đã biết

2.3.1.2. Nghiên cứu giải mã và lập bản đồ gen ở Đài Loan
Các công trình nghiên cứu về EST và các gen quan trọng mã hóa cho các tính
trạng liên quan tới biến đổi môi trƣờng và kháng bệnh cũng nhƣ xây dựng bản
đồ gen Tôm Sú đã đƣợc nhóm của Lo CF, Đài Loan công bố trong các tạp chí
khác nhau. Gần đây nhất, vào năm 2010, You EM và cs thuộc Viện Động vật
học, Trƣờng Đại học tổng hợp Quốc gia Đài Bắc đã xây dựng đƣợc bản đồ liên
kết di truyền tôm sú dựa trên các marker microsatellite và AFLP. Dựa trên 256
marker microsatellite và 85 marker AFLP, các nhà khoa học đã phân tích chỉ số
LOD score và tìm ra đƣợc 43 nhóm liên kết trong bản đồ gen tôm đực và 46
nhóm liên kết trong bản đồ gen tôm cái. Bản đồ liên kết di truyền tôm đực chứa
176 microsatellite và 49 AFLP marker với khoảng cách giữa các marker là 11.2
cM, Trong khi đó bản đồ gen tôm cái chứa 171 microsatellite và 36 AFLP
marker với khoảng cách giữa các marker là 13.8 cM. Xác định đƣợc 40 trong số
44 nhiễm sắc thể thuộc dạng metacentric, một thuộc dạng submetacentric và 3
thuộc dạng acrocentric
2.3.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam
Để đáp ứng nhu cầu nuôi tôm, việc nghiên cứu sinh sản nhân tạo tôm sú đƣợc
đặt ra nhƣ một nhiệm vụ hết sức quan trọng từ lâu. Trong giai đoạn 1987-1998,
Trung tâm nghiên cứu sản xuất tôm Vũng Tàu – Viện Nghiên cứu nuôi trồng
thủy sản 2 đã nghiên cứu thành công việc nuôi trong bể xi măng Tôm Sú bố mẹ
từ nhiều ngồn khác nhau nhƣ biển, đầm nuôi quảng canh. Kết quả sau 21-45
ngày nuôi tỷ lệ thành thục lớn hơn 30%, thu đƣợc ấu trùng từ 200.000300.000/cá thể, đồng thời xây dựng đƣợc qui trình sản xuất giống tôm sú chất
lƣợng cao (Phạm Văn Tình, 2000).
Giai đoạn 1988-1996, Trại thực nghiệm nuôi trồng Hải sản – Trƣờng Đại học
thủy sản Nha Trang đã thử nghiệm sản xuất giống Tôm Sú từ nguồn tôm bố mẹ
giao phối và cấy nghép tinh nhân tạo bằng phƣơng pháp cắt mắt trong bể xi
măng. Kết quả của tôm giao vỹ với tỷ lệ thành thục 88,8%, sức sinh sản thực tế

475.000 ấu trùng/con, tỷ lệ sống chuyển đến giai đoạn Zoael > 80%; đối với tôm
ghép tinh nhân tạo, tỷ lệ thành thục 83,3%, sức sinh sản thực tế 465.000 ấu
trùng/con, tỷ lệ sống chuyển đến giai đoạn Zoael >75% (Ngô Anh Tuấn, 1995).
Giai đoạn 1995-2000, Trung tâm nghiên cứu phát triển giống hải sản miền Bắc
(Cát Bà) – Viện Nghiên cứu Hải Sản (Nay thuộc Viện Nghiên cứu nuôi trồng
thủy sản 1) đã nghiên cứu thử nghiệm nuôi vỗ Tôm Sú bố mẹ tại Vịnh Hạ Long
và Cát Bà đồng thời sau đó áp dụng và từng bƣớc hoàn thiện công nghệ nuôi vỗ
Tôm Sú bố mẹ. Kết quả đã đạt đƣợc độ thành thục từ 77,7 đến 100%, sức sinh
sản thực tế 358.000 ấu trùng/con.
Giai đoạn 2000-2001, Trung tâm nghiên cứu sản xuất giống tôm Vũng Tàu (nay
là Trung tâm quốc gia giống hải sản Nam Bộ) - Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy
sản 2 đang tiến hành đề tài cấp Bộ NN&PTNT về nghiên cứu một số chỉ tiêu
sinh học và kỹ thuật nhằm làm cơ sở khoa học cho chƣơng trình cải thiện chất
lƣợng di truyền của Tôm Sú tại Việt Nam. Trong đó, với nội dung xây dựng đàn
Tôm Sú bố mẹ nhân tạo làm vật liệu phục vụ nghiên cứu đã bƣớc đầu nuôi vỗ
đƣợc đàn Tôm Sú trong điều kiện nhân tạo từ các nguồn gốc khác nhau. Kết quả
tỷ lệ thành thục đạt >30%, sức sinh sản thực tế 200.000 ấu trùng/con, (Nguyễn
Quốc Hƣng, 2004).
Việc nghiên cứu về hệ gen và lập bản đồ gen Tôm Sú để phục vụ cho việc nhân
giống tôm dựa trên nguồn tôm bản địa đảm bảo cho việc nuôi tôm bền vững vẫn
chƣa đƣợc xúc tiến tại Việt Nam. Trong khuôn khổ của một đề tài thuộc
Chƣơng trình Công nghệ sinh học thủy sản của Bộ Nông nghiệp và Phát triển
nông thôn, viện Công nghệ sinh học đã tiến hành nghiên cứu giải trình tự một
phần hệ gen phiên mã (cDNA/EST) và xây dựng cơ sở dữ liệu genome Tôm Sú.
Đề tài đã bƣớc đầu đạt đƣợc những kết quả nhƣ: thƣ viện cDNA/EST đƣợc
thiết lập từ các mô khác nhau của Tôm Sú; giải mã hàng chục trình tự cDNA
trong đó có các gen quan trọng liên quan đến sinh trƣởng và miễn dịch; xây
dựng cơ sở dữ liệu genome nhằm cung cấp thông tin di truyền hữu ích để xác
định các marker phân

tử phục vụ cho việc chọn giống (Nông Văn Hải, Kim Thị Phƣơng Oanh, 2008). .
Tuy nhiên, kết quả của đề tài còn khá hạn chế do sử dụng máy đọc trình tự thế
hệ cũ ABI PRISM® 3100 và 3100 Avant Genetic Analyzer (Applied
Biosystems), bằng phƣơng pháp Sanger. Các kết quả thu đƣợc vẫn còn rất nhỏ
so với các nƣớc trong khu vực nhƣ Thái Lan, Trung Quốc, Đài Loan.
Hiện tại phòng Vi Sinh Vật Học Phân Tử thuộc viên Công Nghệ Sinh Học đang
sử dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới (Next-Generation Sequencing NGS) đã ra đời. Công nghệ NGS mới này hình thành dựa trên sự phát triển đồng
loạt các kỹ thuật bao gồm: chuẩn bị mẫu (template preparation), nguyên lý đọc
trình tự mới (sequencing and imaging), so sánh và lắp ráp bộ gen (genome
alignment and assembly). NGS cho phép tạo ra một khối lƣợng dữ liệu khổng lồ
với giá thành rẻ, ví dụ nhƣ một số máy giải trình tự thế hệ mới có thể tạo ra một
tỉ những đoạn ngắn trên một lần chạy. Tƣơng tự nhƣ giải mã genome, giải mã
EST bằng phƣơng pháp Sanger tuy chất lƣợng tốt nhƣng hạn chế bởi giá thành
cao và tốn nhiều thời gian. Hiện nay, công nghệ giải trình tự thế hệ mới NGS
ứng dụng trong trƣờng hợp giải mã thƣ viện EST, còn gọi là công nghệ RNASeq đã tạo ra một cuộc cách mạng trong nghiên cứu transcriptome, với công
nghệ này có thể thu đƣợc số lƣợng lớn dữ liệu EST, thời gian nhanh và giá
thành rẻ
2.4. Khái quát về hệ phiên mã
Hệ phiên mã là một bộ các phân tử ARN hoàn chỉnh mà tại một thời điểm xác
định, thể hiện trong một tế bào, mô, sinh vật cụ thể. Đó là một bộ các ARN mã
hóa và không mã hóa. Hệ phiên mã trải qua các thay đổi về số lƣợng và chất
lƣợng, phản ánh các quá trình sinh lý tự nhiên hoặc do các kích thích bên ngoài.
Việc phân tích thành phần hệ phiên mã vì vậy có thể giúp hiểu thêm cách sinh
vật hoạt động nhƣ thế nào.
Ở sinh vật nhân chuẩn, quá trình phiên mã xảy ra sự cắt các đoạn intron, nối các
đoạn exon (splicing) để tạo nên phân tử mRNA hoàn chỉnh (mature mRNA).


Kết hợp nhiều cơ chế nhƣ “alternative promoters”, “alternative splicing” và

“mRNA editing”, số lƣợng phân tử mRNA trong transcriptome lớn hơn gấp
nhiều lần số lƣợng gen trong genome. Do đó, thông tin về transcriptome là rất
quan trọng để chú giải các vùng chức năng của của genome
Các thành phần tham gia vào hệ phiên mã
Enzym: Sinh vật eukaryote có ba loại enzyme RNA polymerase, mỗi loại
enzyme RNA polymerase có vai trò khác nhau trong phiên mã. Enzyme RNA
polymerase I xúc tác phiên mã tổng hợp khoảng 60% RNA của tế bào. Enzyme
RNA polymerase II xúc tác tổng hợp khoảng 30% tổng hợp RNA của tế bào
Enzyme xúc tác phiên mã tạo các phân tử RNA thông tin và một số loại RNA
nhỏ. Enzym RNA polymerase III xúc tác tổng hợp khoảng 10% RNA của tế bào
Các nhân tố khác: Tế bào sinh vật eukaryote có nhiều loại nhân tố phiên mã,
gồm nhân tố nhận biết vị trí khởi đầu phiên mã trên mạch gen, nhân tố hoạt hóa
và khởi động promoter. Trong mỗi quá trình phiên mã có sự tham gia của một
loại enzym RNA polymerase, cần có sự tham gia của các nhân tố phiên mã phù
hợp. Nhân tố phiên mã viết tắt là TF (transcription factor). Mỗi loại TF có vai
trò khác nhau trong sự tổng hợp mRNA. Tham gia phiên mã còn có nhiều loại
protein đặc hiệu nhƣ TATA TBP
Quá trình phiên mã tổng hợp mRNA: Vùng phiên mã đƣợc tính từ nucleotid đầu
tiên đƣợc phiên mã đến vị trí đuôi polyA của mRNA, vùng phiên mã bao gồm
các intron xen kẽ exon. Quá trình phiên mã tổng hợp mRNA gồm nhiều giai
đoạn kế tiếp và đan xen lẫn nhau:
Giai đoạn khởi động phiên mã: Nhân tố phiên mã TFIIH và TFIIB gắn vào vị trí
Pol II. Enzym Pol II xúc tác cắt các liên kết hydro làm cho hai mạch đơn của
phân tử DNA tách rời nhau. Nhân tố TFIIF khởi động phiên mã làm cho enzym
Pol II bắt đầu trƣợt trên mạch khuôn, các ribonucleotid tự do đƣợc lắp ghép
theo nguyên lý Chargaff cho đến khi phân tử mRNA đƣợc tổng hợp xong. Khi
enzym Pol II gặp tín hiệu kết thúc thì phiên mã dừng lại, phân tử tiền mRNA
đƣợc hình

thành. Giai đoạn biến đổi tiền mRNA thành phân tử mRNA hoàn chỉnh: Quá
trình biến đổi gồm gắn mũ, hình thành đuôi Poly A và cắt intron nối các exon.
Gắn mũ (capping): khi phân tử tiền mRNA mới hình thành đƣợc một đoạn, ở
đầu 5’ của phân tử tiền mRNA liên kết với một phân tử 7 – methy guanin, gọi là
gắn mũ. Mũ là yếu tố cần thiết cho các ribosom nhận biết trong sự khởi đầu dịch
mã, và tránh cho mRNA không bị phân hủy bởi các loại enzym nucleotid
Hình thành đuôi poly A: Phân tử tiền mRNA vừa tổng hợp xong, bị cắt bỏ
khoảng 20 nucleotid nằm trƣớc một trình tự AAUAAA,enzym poly A
polymerase xúc tác gắn thêm một số nucleotid loại A vào đầu 3’ của phân tử tiền
mRNA, tạo thành đuôi polyA. Số lƣợng A đƣợc gắn thay đổi tùy theo loài và
giai đoạn phát triển của tế bào. Độ dài đuôi polyA biểu hiện thời gian tồn tại của
mRNA trong tế bào. Đuôi polyA càng dài thì thời gian tồn tại trong tế bào của
mRNA càng dài
Quá trình cắt intron nối exon (splicing): Phân tử tiền mRNA đx gắn mũ và gắn
đuôi poly A tiếp tục biến đổi, các intron đƣợc cắt bỏ và các exon đƣợc nối với
nhau thành phân tử mRNA hoàn chỉnh. Quá trình cắt intron nơi exon có sự tham
gia của các phần tử ghép nối – spliceosom. Các phần tử RNA nhỏ có thể kết hợp
với protein đặc hiệu tạo thành nhân con. Các phân tử RNA nhỏ có khoảng 100300 ribonucleotid, giàu nucleotid Uracin. Các spliceosom tạo nên một vết cắt ở
biên giới exon thứ nhất với intron. Gốc 5’ phophat của Guanin ở phần đầu của
intron liên kết với gốc 3’OH của Adenin gần đầu kia của intron tạo cấu trúc
thòng lọng. Tiếp theo một vết cắt tại biên giới của intron đầu tiên với exon thứ
hai làm cho intron bị cắt bỏ còn các exon đƣợc nối với nhau. Quá trình tiếp tục
đến khi các intron bị cắt hết, các exon nối với nhau thành mRNA trƣởng thành.
Các phân tử mRNA trƣởng thành chui qua lỗ màng nhân ra tế bào chất tham gia
quá trình dịch mã
2.5. Giới thiệu về công nghệ giải trình tự thế hệ mới
2.5.1. Giới thiệu chung


Trong thế kỷ trƣớc,việc đọc trình tự DNA còn gặp nhiều khó khăn do máy móc

có giá thành cao, mất thời gian để đọc toàn bộ hệ gen do vậy chỉ phù hợp cho
kiểm tra các gen riêng lẻ và một số xét nghiệm chẩn đoán phân tử sử dụng trong
các phòng thí nghiệm y học nhƣ di truyền phân tử, di truyền dƣợc học, bệnh về
máu và vi sinh… Ngày nay, các công ty thƣơng mại đã cho ra đời các thế hệ
máy đọc trình tự dựa trên nhiều công nghệ mới (Next Generation Sequencing NGS). Các kỹ thuật đọc trình tự gen đã trở nên đơn giản và nhanh hơn nhờ sự
ứng dụng huỳnh quang phân tích tự động(Olsvik et al., 1993; Pettersson et al.,
2009). Các công nghệ đọc trình tự mới luôn hƣớng tới làm tăng dung lƣợng
(throughput), làm giảm thời gian và giá thành (Schadt et al., 2010). Mặc dù
vậy,phƣơng pháp Sanger (dựa trên cơ sở kết hợp của các dideoxynucleotide
(ddNTP) bằng DNA polymerase trong quá trình khuyếch đại DNA in vitro)
đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều năm trƣớc đây vẫn đƣợc thực hiện xen kẽ
khi cần thiết (Sanger et al., 1977).
Đọc trình tự đƣợc thực hiện sau phản ứng khuyếch đại DNA (nhƣ ở phƣơng
pháp Sanger) đƣợc thay thế bằng đọc trình tự thực hiện ngay trong giai đoạn
tổng hợp sợi DNA bổ sung cho sợi khuôn (phƣơng pháp pyrosequencing)
(Nyrén, 2007; Ronaghi et al., 1998). Đây là công nghệ khởi đầu cho kỹ thuật
“đọc trình tự bằng tổng hợp”, nền tảng của kỹ thuật đọc trình tự bộ gen hay còn
gọi là kỹ thuật đọc trình tự thế hệ mới sau này. Với ƣu thế thời gian đọc nhanh,
trình tự đọc đƣợc rất chính xác, cƣờng độ phát quang định lƣợng đƣợc nên dù
trình tự đọc đƣợc không dài (<100 bases) nhƣng pyrosequencing thể hiện rõ ƣu
thế hơn hẳn phƣơng pháp Sanger và trở thành một kỹ thuật không thể thiếu
trong các phòng thí nghiệm sinh học phân tử (Poehlmann et al., 2007).
NGS là một bƣớc tiến vƣợt bậc về công nghệ đọc trình tự, cho phép đọc đƣợc
từ 8Gb đến 600 Gb - tức là cho phép đọc trình tự nguyên bộ gen còn đƣợc gọi là
đọc trình tự bộ gen (whole genome sequencing). Sự phát triển mạnh mẽ của kỹ
thuật NGS là một cuộc cách mạng trong công nghệ đọc trình tự nói riêng và
trong công nghệ sinh học phân tử nói chung. Với các tiến bộ về thiết bị và hóa


chất, hiện nay đọc trình tự bộ gen của một cơ thể sống có thể đƣợc thực hiện tại

các phòng thí nghiệm đƣợc cấp kinh phí vừa phải với thiết bị đọc trình tự thế hệ
mới nhƣ solid, solexa, ion-proton, 454…trong thời gian ngắn (thậm chí chỉ
trong 24 giờ) thay vì phải kéo dài hàng năm và giá thành rẻ. Trình tự bộ gen vi
khuẩn hay virus có thể đƣợc đọc dễ dàng với các thiết bị có công suất nhỏ
khoảng 6 - 10Gbases mà không cần đến hàng trăm Gbases. NGS là một công cụ
mạnh nhất để phát hiện đƣợc các tác nhân gây bệnh, các đột biến với tỷ lệ thấp.
Chính vì vậy, đọc trình tự thế hệ mới là một công cụ không thể thiếu đƣợc trong
phát hiện và định lƣợng các đột biến trong ung thƣ, trong bệnh di truyền….
2.5.2. Nguyên lý đọc trình tự gen thế hệ mới
Nguyên lý đọc trình tự gen thế hệ mới:theo 2 nguyên lý chính. Nguyên lý thứ
nhất đọc trình tự bằng tổng hợp (sequencing by synthesis, SBS) đã đƣợc các thế
hệ máy Roche 454, Ion Torrent và Illumina sử dụng. Nguyên lý thứ hai đó là đọc
trình tự gắn nối (sequencing by ligation, SBL) đƣợc sử dụng ở máy SOLiD do
George Church phát minh. SBL đã đƣợc sử dụng để xác định trình tự genome
và là nền tảng cho các thiết bị đọc trình tự thế hệ mới.
Công nghệ đọc trình tự gen thế hệ mới đƣợc thực hiện theo 3 bƣớc chính nhƣ
sau:
-Chuẩn bị các đoạn DNA và gắn lên các giá bám: Trƣớc hết DNA bộgen đƣợc
cắt nhỏ thành các đoạn DNA ngắn nhờ siêu âm hay nhờ khí dung, sau đó 2 đầu
các đoạn DNA ngắn này đƣợc gắn 2 đoạn adaptor có trình tự nhận biết bởi các
đoạn dò và trình tự mồi PCR. Các đoạn DNA này sẽ đƣợc gắn lên các giá bám
là các hạt nano (Roche 454, Solid hay Ion Torrent) hay trên các vi bản
(Illumina) nhờ các đoạn dò đặc hiệu adaptor đã gắn sẵn trên các giá bám này.
-Khuyếch đại các đoạn DNA trên giá bám bằng mồi đặc hiệu adaptor: Nếu giá
bám là vi bản thì thành phần PCR đƣợc bơm trải lên vi bản và khi thực hiện
PCR sẽ có từng cụm sản phẩm khuyếch đại đƣợc gắn trên các vị trí tách rời
nhau. Nếu giá bám là các vi hạt thì phải nhũ hoá thành phần PCR để các giọt
nhũ chỉ chứa một vi hạt,nhờ vậy sau khi thực hiện PCR mỗi vi hạt chỉ có một
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu –
2Đ0HTN