Phân lập và xác định đặc tính enzyme n acyl l homoserine lactone (AHL) lactonase của vi khuẩn nội sinh sử dụng trong phòng trừ bệnh thối nhũn củ khoai tây

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
--------***--------

NGUYỄN THỊ THU HÀ

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH
ENZYM N-ACYL-L-HOMOSERINE LACTONE
(AHL) LACTONASE CỦA VI KHUẨN NỘI SINH
SỬ DỤNG TRONG PHÒNG TRỪ BỆNH THỐI NHŨN
CỦ KHOAI TÂY

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2015

1


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
--------***--------

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH
ENZYM N-ACYL-L-HOMOSERINE LACTONE
(AHL) LACTONASE CỦA VI KHUẨN NỘI SINH
SỬ DỤNG TRONG PHÒNG TRỪ BỆNH THỐI NHŨN
CỦ KHOAI TÂY
Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60420103

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. Hoàng Hoa Long

HÀ NỘI - 2015
2


MỞ ĐẦU
Cây khoai tây (Solanum tuberosum L), thuộc họ Cà (Solanaceae) là loài
cây nông nghiệp ngắn ngày, trồng lấy củ chứa tinh bột. Khoai tây có nguồn
gốc ở vùng cao thuộc dãy núi Andes, Nam Mỹ, được người Pháp đưa vào
Việt Nam từ năm 1890. Có thời kỳ khoai tây được xem là cây lương thực có
tầm quan trọng thứ ba sau lúa và ngô.
Khoai tây có giá trị dinh dưỡng cao vì trong khoai tây có chứa các vitamin,
khoáng chất, caronoids và phenol tự nhiên. Khoai tây không chỉ là lương thực mà
còn là dược phẩm. Một nhà khoa học của Viện Thực phẩm Anh mới đây phát hiện
trong khoai tây chứa hợp chất sinh học cucoamin có tác dụng làm giảm huyết áp
nếu ăn thường xuyên. Trong một nghiên cứu khác gần đây, GS Venket Rao, Khoa
Dinh dưỡng Đại học Y Toronto Canada đã phát hiện thấy trong khoai tây có nhiều
chất chống oxy hóa. Nó có khả năng ngăn ngừa quá trình lão hóa, hạn chế sự phát
triển của ung thư và một số bệnh khác.
Theo thông tin của Cục Trồng trọt, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông
thôn, Việt Nam là quốc gia có khả năng phát triển mạnh khoai tây, nhiều nhất
ở đồng bằng Bắc Bộ, miền núi phía Bắc, Bắc Trung Bộ và Tây Nguyên, với
diện tích ước tính 200.000 ha. Tuy nhiên, hiện nay diện tích trồng khoai tây
chỉ đạt 30.000-35.000 ha, với năng suất 10-11 tấn/ha. Một trong những

nguyên nhân dẫn đến giảm năng suất và diện tích trồng khoai tây là do tình
trạng gây hại của sâu bệnh, đặc biệt là bệnh thối nhũn do vi khuẩn Erwinia
gây ra, phổ biến nhất là loài Erwinia carotovora subsp. carotovora (Ecc).
Bệnh gây ra chủ yếu trên các loài cây trồng có giá trị kinh tế cao thuộc họ cà,
họ thập tự, họ bầu bí, họ hành, một số loài hoa lan… Bệnh gây hại cho cây từ
khi còn được trồng ở ngoài đồng ruộng cho đến khi thu hoạch và bảo quản
trong kho. Đặc biệt khi điều kiện thời tiết nóng ẩm và mưa nhiều thì bệnh trở
nên trầm trọng hơn. Vi khuẩn Ecc sử dụng Quorum Sensing (QS) như một cơ

3


chế trao đổi thông tin giữa các tế bào và phụ thuộc mật độ quần thể để kiểm
soát gen liên quan đến tính độc và các hoạt động của tế bào vi khuẩn. Trong
cơ chế này, N-acyl-L-homoserine lactones (AHLs) đóng vai trò như các chất
tự cảm ứng (autoinducer) và cũng là các phân tử tín hiệu được tổng hợp và
tiết ra trong suốt quá trình phát triển của vi khuẩn. Khi nồng độ phân tử AHLs
tăng lên cùng với sự phát triển của quần thể vi khuẩn và đạt đến một ngưỡng
nhất định (quorum level), AHLs sẽ gây ra những hiệu ứng kiểu hình thông
qua việc điều hòa sự biểu hiện gen đích, mà ở vi khuẩn gây bệnh Ecc là gen
quy định tính độc đối với cây chủ.
Hiện nay, biện pháp phòng trừ bệnh chủ yếu dựa vào các phương pháp
truyền thống và sử dụng thuốc trừ sâu hóa học. Tuy nhiên, các biện pháp này
đều không mang lại hiệu quả cao, đặc biệt là việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa
học đang gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng nông sản và môi
trường sống của con người. Do đó biện pháp phòng trừ sinh học sử dụng các
vi sinh vật đối kháng trong tự nhiên ngày càng được đặc biệt quan tâm. Nhiều
nghiên cứu đã chỉ ra trong tự nhiên tồn tại một nhóm vi khuẩn cư trú bên
trong mô cây chủ và không gây triệu chứng bệnh cho cây được gọi là vi
khuẩn nội sinh (bacterial endophyte). Trong số chúng, có những vi khuẩn có

khả năng phân hủy AHLs qua cơ chế Quorum Quenching (QQ), là một hoạt
động xảy ra trong tự nhiên có tác dụng chặn đứng những bước quan trọng của
hệ thống QS như sự hình thành, tích lũy hoặc tiếp nhận phân tử tín hiệu. Dựa
vào cấu trúc phân tử AHLs, các nhà khoa học đã xác định được 3 nhóm
enzyme

phân

hủy AHLs: AHL-lactonase, AHL-acylase

và AHL-

oxidoreductase. Cho đến nay, enzyme AHL-lactonase được nghiên cứu nhiều
nhất. Enzyme này được phát hiện lần đầu tiên từ chủng vi khuẩn Bacillus sp.
240B có khả năng bất hoạt phân tử AHL. Gen mã hóa enzyme này khi được
chuyển vào chủng vi khuẩn gây bệnh E. carotovora SCG1 đã làm giảm đáng

4


kể sự giải phóng AHL, giảm hoạt động enzyme pectolytic ngoại bào và giảm
độc tính trên khoai tây, cà, cải bắp, cà rốt,… Kể từ đó trên thế giới, nhiều vi
khuẩn có hoạt tính AHL-lactonase đã được miêu tả như Bacillus thuringiensis
subsp. morisoni, Arthrobacter sp., Microbacterium testaceum. Tuy nhiên, ở
Việt Nam hiện chưa có nghiên cứu nào về cơ chế gây bệnh của vi khuẩn thối
nhũn cũng như sử dụng các chủng vi khuẩn nội sinh (VKNS) đối kháng để
phân hủy AHLs của vi khuẩn gây bệnh trong phòng trừ bệnh thối nhũn. Do
vậy, tôi đã tiến hành chọn nghiên cứu đề tài “Phân lập và xác định đặc tính
enzyme N-acyl-L-homoserine lactone (AHL) lactonase của vi khuẩn nội
sinh sử dụng trong phòng trừ bệnh thối nhũn củ khoai tây” với hy vọng

hướng nghiên cứu này sẽ góp phần đặt một trong những viên gạch để thiết lập
một biện pháp phòng trừ hiệu quả bệnh thối nhũn khoai tây do vi khuẩn Ecc
gây ra tại Việt Nam.
Mục đích của đề tài
Xác định được các hoạt tính của enzyme phân hủy N-acyl-Lhomoserine lactones (AHLs), AHL lactonase của các chủng vi khuẩn nội sinh
sử dụng trong phòng trừ bệnh thối nhũn củ khoai tây.
Yêu cầu của đề tài
- Phân lập và xác định khả năng phân hủy AHLs của vi khuẩn nội sinh từ
cà dại.
- Thử nghiệm ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy VKNS đến hoạt tính
enzyme AHL lactonase.
- Thử nghiệm các loại môi trường nuôi cấy VKNS ảnh hưởng đến hoạt
tính enzyme AHL lactonase.
- Xác định hoạt tính enzyme AHL lactonase của các chủng VKNS phân
hủy các loại AHLs tổng hợp C6, C8 và C10.

5


- Thử nghiệm hiệu quả phòng trừ bệnh thối nhũn củ khoai tây của các
chủng vi khuẩn nội sinh có hoạt tính enzyme AHL lactonase trong điều
kiện phòng thí nghiệm.
Ý nghĩa của đề tài
Ý nghĩa khoa học
- Thực hiện đề tài này giúp tôi có thêm kinh nghiệm, kiến thức về các kỹ
thuật phân lập, xác định khả năng phân hủy, xác định hoạt tính enzyme
phân hủy AHLs từ vi khuẩn nội sinh, đối tượng quan tâm, ngoài ra còn
cung cấp thêm hiểu biết về các kỹ thuật khác mà công nghệ sinh học hiện
đại đang áp dụng.
- Kết quả nghiên cứu của để tài sẽ cung cấp các vật liệu khởi đầu cho việc

nghiên cứu về enzyme phân hủy AHLs sẽ là tiền đề phát triển một chiến
lược phòng trừ bệnh thối nhũn khoai tây an toàn và bền vững sau này.
Ý nghĩa thực tiễn
Ngoài ý nghĩa về khoa học, các vấn đề nghiên cứu trong đề tài còn có ý
nghĩa trong thực tiễn. Các chủng vi khuẩn có ích mang enzyme phân hủy
AHLs sử dụng để ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh thối nhũn trên
nhiều loài cây trồng có giá trị hoặc chuyển những gen mã hóa enzyme này
vào cây trồng giúp cây trồng chống chịu được với bệnh hại.

6


Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Tổng quan về cây khoai tây

1.1.1. Nguồn gốc địa lý và sự phân bố của cây khoai tây
Khoai tây có tên khoa học Solanum tuberosum, thuộc họ Cà
(Solanaceae). Đây là loài cây nông nghiệp ngắn ngày, trồng lấy củ chứa tinh
bột. Cây khoai tây có nguồn gốc ở vùng cao thuộc dãy núi Andes, Nam Mỹ và
du nhập vào Tây Ban Nha vào khoảng năm 1570 và Anh Quốc vào năm
1590. Sau đó, nó được lan truyền khắp châu Âu và tiếp theo là châu Á
(Hawkes, 1994).
Sau nhiều thế kỷ chọn lọc và nhân giống, hiện nay đã có hơn một
nghìn loài khoai tây khác nhau. Hơn 99% các loài khoai tây được trồng hiện
nay trên toàn cầu có nguồn gốc từ nhiều giống khác nhau ở vùng đất thấp
Trung-Nam Chile, các giống này đã được di dời từ các cao nguyên Andes.
Trên thế giới, cây khoai tây được coi là cây lương thực có tầm quan
trọng đứng hàng thứ tư sau lúa mì, lúa nước và ngô (Steveson và cs., 2001).

Năm 1890, một người Pháp là Giám đốc Vườn bách thảo Hà Nội đem
hạt khoai tây trồng thử ở nước ta. Điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa, mùa
đông có nhiệt độ trung bình 15 – 250C, thuận lợi cho khoai tây sinh trưởng và
phát triển. Vào năm 1980, Việt Nam đã trở thành nước sản xuất khoai tây lớn
nhất Đông Nam Á với hơn 100.000 ha diện tích trồng (Batt., 2002). Khoai tây
trở thành cây lương thực có tầm quan trọng thứ ba sau lúa và ngô ở Việt Nam.
Tuy nhiên, theo thống kê của Tổ chức Nông lương Liên hợp quốc (FAO),
những năm gần đây diện tích trồng khoai tây chỉ dao động trong khoảng
35.000 - 40.000 ha (Bảng 1.1). Trong đó 90% diện tích tập trung ở các tỉnh
thuộc đồng bằng Bắc Bộ, một số ít ở miền núi phía Bắc và Trung Bộ, 0,5%
diện tích còn lại được trồng ở Đà Lạt (Lâm Đồng) (Phạm Xuân Tùng, 2001).

7


Bảng 1.1: Tình hình sản xuất khoai tây ở Việt Nam
giai đoạn 2005-2011
Năm

Diện tích (ha)

Sản lượng (tấn)

35.000

Năng suất
(Tấn/ha)
10,6

2005

2006

37.613

11,1

419.161

2007

38.450

11,4

436.710

2008

41.160

11,8

486.184

2009

37.544

11,7

442.791

2010

37.100

12,0

446.200

2011

40.046

11,2

448.710

370.000

(Nguồn: FAO, 2012)
Năng suất khoai tây trước đây thường đạt 8 tấn/ha, cao nhất là 18-20
tấn/ha. Từ năm 1981 đến nay, năng suất bình quân đạt gần 12 tấn/ha, cao nhất
đạt 35-40 tấn/ha, có thời điểm khoai tây đã xuất khẩu sang Nga (có năm tới
1.000 tấn). Khi lương thực lúa gạo và ngô dồi dào thì khoai tây được nghiên
cứu theo hướng chất lượng và hiệu quả.
1.1.2 Đặc điểm nông sinh học của cây Khoai tây
Khoai tây là thân thảo, tán gọn, ưa lạnh, phát triển khoảng 60 cm chiều cao,
khoai tây có thời gian sinh trưởng ngắn 80-100 ngày, cây chết sau khi ra hoa. Hoa
có màu trắng, hồng, đỏ, xanh, hoặc màu tím, nhụy hoa màu vàng. Khoai tây được

thụ phấn chủ yếu bởi côn trùng, ong vò vẽ mang phấn hoa từ cây này đến cây
khác. Sau khi khoai tây ra hoa, một số giống cho ra quả màu xanh lá cây giống
màu xanh trái cây cà chua anh đào, có thể chứa 300 hạt (Wikipedia).

8


1.1.3 Vai trò của cây Khoai tây
Khoai tây là một nguồn cung cấp lương thực dồi dào. Theo báo cáo của
Tổ chức Nông Lương Liên Hợp Quốc (FAO) sản lượng khoai tây toàn Thế
giới đến năm 2010 là 320 triệu tấn, trong đó hơn 2/3 là thức ăn trực tiếp của
con người, còn lại là thức ăn cho động vật và nguyên liệu sản xuất tinh bột.
Ở Việt Nam, khoai tây được nhập vào từ năm 1890. Do có giá trị
kinh tế cao, thuộc nhóm ưa lạnh nên có lợi thế trong sản xuất vụ đông, thời
gian sinh trưởng ngắn, dễ trồng, ít tốn công chăm sóc, phù hợp với nhiều
loại đất trồng nên khoai tây đang trở thành cây trồng xóa đói giảm nghèo
cho bà con nông dân ở nhiều địa phương thuộc các tỉnh miền Bắc như Thái
Bình, Lạng Sơn, Yên Bái,… (Nguồn báo điện tử: Thái Bình, Lạng Sơn,
Yên Bái).
Tuy nhiên, ngành Nông nghiệp Việt Nam mới cung cấp được 80% nhu
cầu tiêu dùng khoai tây trong nước, chúng ta vẫn phải nhập khẩu gần 100.000
tấn khoai tây hàng năm.
Khoai tây là thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, trong đó có 2%
protein bao gồm cả lysine (một axit amin thường không có trong protein thực
vật) nên phối hợp tốt với ngũ cốc. Trong protein khoai tây còn có một số axit
amin tự do và các chất kiềm purin. Giá trị sinh học của khoai tây tương đối
cao lên tới 75% (theo phương pháp Mittchell). Người ta đã tính khoảng hơn
200g khoai tây nướng cả vỏ cung cấp 844mg Kali (gấp đôi 1 quả chuối), 28%
khẩu phần sắt hàng ngày, 43% khẩu phần vitamin C, 35% khẩu phần vitamin
B6 và nhiều chất khác như niacin, thiamin, folat…

Việc sử dụng khoai tây làm thực phẩm còn được khuyến khích hơn nữa
khi một số nhà khoa học của Viện Thực phẩm Anh mới đây phát hiện, trong
khoai tây có hợp chất sinh học cucoamin có tác dụng làm giảm huyết áp nếu
ăn thường xuyên và chữa bệnh “ngủ” ở Châu Phi.

9


Không chỉ được sử dụng để làm lương thực và thực phẩm khoai tây còn
được sử dụng trong y dược. Qua nghiên cứu, GS Venket Rao, Khoa Dinh
dưỡng Trường đại học Y Toronto, Canada, phát hiện thấy trong khoai tây có
nhiều chất chống oxy hóa. Nó có khả năng ngăn ngừa quá trình lão hóa, hạn
chế sự phát triển của ung thư và một số bệnh khác. Còn các nhà nghiên cứu
Đại học Y Harvard, Mỹ, đã phát hiện ra rằng những người thường xuyên ăn
khoai tây có khả năng giảm ung thư tuyến tiền liệt.
1.2

Bệnh thối nhũn khoai tây

1.2.1 Tác nhân gây bệnh và tác hại của bệnh
Trong điều kiện thời tiết khí hậu nước ta những năm gần đây nắng
nóng, mưa nhiều đan xen nhiều cơn bão liên tục là điều kiện thuận lợi cho các
loài vi khuẩn gây bệnh trên cây trồng. Bệnh do vi khuẩn gây ra rất nguy hiểm
và gây nhiều khó khăn cho công tác phòng trừ và bảo quản. Thời gian ủ bệnh
rất khó phát hiện và đã gây ra những thiệt hại lớn trong thời kỳ sinh trưởng
cũng như trong thời gian bảo quản, lưu trữ nông phẩm. Đối với những khu
vực sản xuất thuộc vùng nhiệt đới bệnh thối nhũn ở khoai tây, cà rốt, hành
tây, bắp cải….chủ yếu là do vi khuẩn Erwinia gây nên. Những nghiên cứu
trước đây đã kết luận rằng vi khuẩn gây thối nhũn khoai tây có ba loài:
Erwinia carotovora pv. carotovora (Ecc), Erwinia carotovora pv. atroseptica

(Eca) và E. chrysanthemi (Ech). Trong đó Ecc là loài chủ yếu gây bệnh thối
nhũn củ khoai tây (Jerenial), (Randall và cs). Vi khuẩn này khá phổ biến trên
bề mặt, trên vết thương của củ khoai tây sau khi thu hoạch. Ecc gây bệnh ở cả
vùng khí hậu ôn đới và nhiệt đới, và có phổ ký chủ rộng. Ecc cư trú trong đất,
nước như sông, hồ thậm chí là đại dương. Vi khuẩn này có thể nhân lên và tồn
tại trong vùng rễ của rất nhiều cây chủ hoặc không phải là cây chủ cũng như
nhiều loài cỏ dại. Hai loài Eca và Ech là tác nhân chính gây ra bệnh thối đen

10


(blackleg) trên khoai tây. Tuy nhiên, đôi khi chúng cũng gây ra triệu chứng
thối nhũn củ. Eca gần như chỉ gây hại trên khoai tây ở vùng ôn đới. Chúng
không thể tồn tại trong đất hơn một năm, trừ khi chúng đã cư trú trong củ
khoai tây bị bệnh hoặc những phần cây khoai tây mục nát khác. Ngược lại,
Ech là tác nhân gây bệnh cho nhiều loài thực vật ở các cùng nhiệt đới và cận
nhiệt đới, nhưng cũng có thể ảnh hưởng đến một số cây trồng (ngô, thược
dược) ở vùng ôn đới. Nhiễm trùng tiềm ẩn của củ khoai tây bởi vi khuẩn gây
thối nhũn Erwinia là phổ biến và vì bệnh có xu hướng phát triển chỉ khi sức
đề kháng của cây chủ bị suy yếu, chúng được mô tả như là tác nhân gây bệnh
cơ hội (Pérombelon và Kelman, 1987; Perombelon và Salimond, 1995;
Perombelon, 2002; Prajapat và cs., 2003)
Vi khuẩn gây bệnh Ecc là loài đa thực, ký sinh và gây hại trên nhiều
loại cây trồng khác nhau. Tế bào hình gậy, hai đầu hơi tròn, có 2 - 8 lông roi
bao quanh mình (Hình 1.1). Vi khuẩn không có vỏ nhờn, nhuộm Gram âm,
hiếu khí, dịch hoá gelatin, tạo H2S, thuỷ phân tinh bột và không tạo NH3. Đặc
tính của vi khuẩn gây bệnh là sản sinh một lượng lớn enzyme phân hủy pectin
ngoại bào, một trong số những enzyme này phân hủy thành tế bào thực vật.
Nuôi cấy trên môi trường pepton saccaro, khoai tây - agar khuẩn lạc có màu
trắng xám, hình tròn hoặc hình bầu dục không đều, bề mặt khuẩn lạc ướt

(Hình 1.1). Trên môi trường có TZC khuẩn lạc của vi khuẩn có màu đỏ ở
giữa, rìa ngoài màu trắng đó là đặc trưng để nhận biết loài Erwinia sp. Vi
khuẩn phát triển thuận lợi trong phạm vi nhiệt độ khá rộng, nhiệt độ thích hợp
nhất là 27 – 37oC, nhiệt độ tới hạn chết là 50oC; phạm vi pH cũng khá rộng từ
5,3 - 9,2, thích hợp nhất là pH 7,2. Vi khuẩn có thể bị chết trong điều kiện khô
và dưới ánh nắng.

11


Hình 1.1. Khuẩn lạc vi vi khuẩn Ecc trên môi trường YPDA (ảnh a)
và tế bào vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora dưới
kính hiển vi điện tử (ảnh b) (Nguồn: Dong Hwan Lee và cs., 2013)

Hình 1.2: Bệnh thối nhũn trên khoai tây (Nguồn Wikipedia)
Hiện tượng thối hỏng là hậu quả của quá trình phá vỡ cấu trúc mô tế
bào do tác động chủ yếu của các enzyme phân giải của vi khuẩn. Triệu chứng
bệnh bắt đầu mềm và sũng nước, sau đó vết bệnh chuyển thành nhớt và bốc
mùi thối khó chịu (Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân., 1999). Đây là loại bệnh
phổ biến và gây thiệt hại nghiêm trọng đối với khoai tây trong quá trình bảo
quản, cất giữ, chuyên chở và xuất nhập khẩu (Hình 1.2).

12


Vi khuẩn xâm nhập chủ yếu qua vết thương, qua mắt củ. Vi khuẩn tồn
tại trong đất, trong tàn dư củ khoai tây. Bệnh thối nhũn củ khoai tây phát sinh
và phát triển mạnh trong điều kiện nhiệt độ và độ ẩm cao. Mức độ bệnh nặng
hay nhẹ phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó yếu tố nhiệt độ, độ ẩm và chất
lượng củ giữ vai trò quyết định. Mức độ gây hại của bệnh rất nguy hiểm bởi

vì vi khuẩn này có khả năng ký sinh, chọn lọc phạm vi kí chủ rất rộng bao
gồm nhiều loại cây trong nhiều họ thực vật khác nhau, trong côn trùng cũng
như trong đất (Hình 1.3). Hiện nay chưa có cách phòng trị hiệu quả, thiệt hại
do vi khuẩn này gây ra là rất lớn.

Hình 1.3. Các giai đoạn sống trong chu kỳ gây bệnh của vi khuẩn gây bệnh
thối nhũn các loại rau củ thuộc chi Erwinia, Pectobacterium và Dickeya
(Allen và cs., 2009)
Trên thế giới, bệnh thối nhũn được xem là nguyên nhân gây thiệt hại
đến sản xuất lớn nhất so với các bệnh vi khuẩn khác. Thiệt hại do vi khuẩn
thối nhũn sau thu hoạch được đánh giá từ 15-30% năng suất cây trồng sau thu

13


hoạch (Agror, 2006). Một đánh giá khác của Balus cho rằng thiệt hại do bệnh
thối nhũn củ khoai tây có thể xảy ra trong quá trình vận chuyển và bảo quản,
ước tính mất mát có thể lên đến 40% nếu như thiếu phương pháp bảo quản
thích hợp (Balus, Dahiru, 2006). Tại một số vùng trồng khoai tây chính ở
Zimbabwe mùa vụ 2009-2010, thiệt hại do bệnh thối nhũn gây ra bởi Erwinia
carotovora đã lên đến 65% (Elizabeth Ngadze, 2012). Trong một chương
trình kéo dài 9 năm khảo sát bệnh trên củ khoai tây giống nhập khẩu vào
Israel từ Bắc Âu của Tsror đã thống kê được sự nhiễm tiềm tàng Eca ở mức
độ 103 tế bào/g vỏ có ở 30% lô củ giống hàng năm (Tsror và cs, 1993). Cũng
một khảo sát khác của Tsror trên một lô khoai tây nhập khẩu từ châu Âu vào
Israel cho thấy 7% lô hàng bị nhiễm bệnh blackleg và thối nhũn củ khoai tây
gây ra bởi Erwinia spp. ở mức độ mạnh, 65% bị nhiễm ở mức độ trung bình
(Tsror và cs., 1999). Tại Keren County, California, Farrar đã theo dõi 30%
khoai tây sau thu hoạch bị tấn công bởi Ecc. Tiếp theo, họ đã thông báo
những thiệt hại nghiêm trọng gây ra bởi Ecc cho khoai tây sau thu hoạch tại

San Joaquin Valley (Farrar và cs., 2009).
Ở Việt Nam, đến nay tuy chưa có một con số thống kê cụ thể về thiệt
hại của bệnh thối nhũn khoai tây gây ra bởi vi khuẩn E. carotovora, nhưng bệnh
đã được thông báo có mặt ở tất cả các vùng trồng khoai tây trên cả nước. Đặc
biệt do thời gian bảo quản khoai tây ở nước ta tương đối dài (8-9 tháng), điều
kiện thời tiết nóng ẩm khiến cho bệnh là mối nguy hiểm nghiêm trọng gây thiệt
hại đến năng suất và chất lượng củ khoai tây. Khoai tây giống sau 8 tháng bảo
quản thường bị hao hụt khoảng 30-50%, thậm chí có nơi hao hụt lên tới 70%
tổng số khoai bảo quản. Một trong những nguyên nhân gây ra thiệt hại này là do
sâu bệnh và nấm mốc, trong đó có bệnh thối nhũn (Vũ Quốc Trung, 2005). Một
nghiên cứu chi tiết về diễn biến của bệnh trong quá trình bảo quản khoai tây sau

14


thu hoạch cho thấy bệnh xuất hiện với tỷ lệ thấp ở tháng 1 đến tháng 3 do nhiệt
độ không thuận lợi cho vi khuẩn xâm nhập gây bệnh. Trong những tháng mùa hè
bệnh thối nhũn củ phát triển mạnh nhất, cao nhất của bệnh vào tháng 6, 7, 8.
Bệnh tiếp tục phát sinh gây hại ở mức độ bệnh giảm dần khi điều kiện ngoại
cảnh không thuận lợi (tháng 10 đến tháng 12) (Trần Thị Thúy). Bệnh thối nhũn
củ khoai tây được đặt trong danh sách các bệnh cần phải kiểm nghiệm củ giống
khoai tây theo tiêu chuẩn quốc gia do Bộ NN & PTNT và Bộ Khoa học và Công
nghệ ban hành (TCVN 8549-2011).
1.2.2 Quorum sensing (QS) và mối liên quan đến khả năng gây bệnh thối
nhũn khoai tây của tác nhân gây bệnh.
Vi khuẩn Gram âm (trong đó có Erwinia) sử dụng một dạng “giao tiếp
của vi khuẩn” gọi là Quorum Sensing (QS). QS dựa trên cơ sở tổng hợp, giải
phóng, phát hiện và phản ứng với các phân tử tín hiệu AHLs của tế bào vi
khuẩn liền kề. Khi mật độ tế bào vi khuẩn tăng lên, các phân tử này sẽ được
tích lũy trong môi trường ngoại bào và thông qua đó giúp vi khuẩn có thể

kiểm soát được số lượng tế bào cũng như sự hiện diện của các loài vi khuẩn
khác. Những phân tử này khi đạt đến một ngưỡng nhất định sẽ kích hoạt tín
hiệu bên trong vi khuẩn và cực đại hóa hoạt động của một số gen đặc hiệu.
Điều hòa biểu hiện gen thông qua cơ chế QS có sự tham gia của gen luxR và
luxI mã hóa cho nhân tố phiên mã LuxR và AHL synthase (LuxI). Phân tử tín
hiệu AHL đóng vài trò là chất tự cảm ứng (autoinducer) vì nó kiểm soát quá
trình tổng hợp chính bản thân phân tử AHLs thông qua vòng điều khiển gen
sinh tổng hợp AHL synthase. Hầu hết vi khuẩn gây bệnh sử dụng hệ QS đã
được nghiên cứu đều cho thấy rằng QS có liên quan đến các gen gây bệnh
(Hình 1.4) (Coutteau và Goossens, 2013; Dong và cs., 2000; Whitehead và
cs., 2001)

15


Hình 1.4 Cơ chế Quorum Sensing ở vi khuẩn Gram âm.
(r: gen mã hóa cho nhân tố phiên mã LuxR (R);
i: gen mã hóa cho AHL synthase LuxI (I).
Ở các loài vi khuẩn gây bệnh thuộc chi Erwinia có tồn tại ít nhất hai hệ
thống QS và được xác định bởi bản chất của các tín hiệu hóa học liên quan: Nacyl homoserine lactones (AHLs; còn gọi là tín hiệu AI-1), được tổng hợp bởi
nhóm protein LuxI; và tín hiệu AI-2, được tổng hợp bởi nhóm protein tương
đồng LuxS. Hệ thống QS ở một số loài Erwinia đóng vai trò quan trọng trong
điều hòa biểu hiện gen, tổng hợp các chất trao đổi thứ cấp và khả năng gây bệnh
trên cây chủ. Nghiên cứu này của chúng tôi tập trung chính vào khả năng sản
sinh phân tử tín hiệu AHLs của loài vi khuẩn Erwinia carotovora subsp.
carotovora có liên quan đến khả năng gây bệnh thối nhũn trên khoai tây.
(Barnard và Salmond, 2006; Engebrecht và cs., 1983; Nasser và cs., 1998;
Schaefer và cs., 1996)

16

N-acyl homoserine lactone
(AHL)

Hình 1.5 Cấu trúc phân tử N-acyl homoserine lactones
(Barnard và Salmond, 2006)
Phân tử tín hiệu N-acyl homoserine lactones (AHLs) được đặc trưng
bởi một vòng homoserine lactone bất biến gắn với một chuỗi bên N-acyl. Các
phân tử tín hiệu AHLs khác nhau về cấu trúc của chuỗi bên N-acyl có thể thay
đổi (Hình 1.5). Mỗi tế bào trong quần thể vi khuẩn đều có khả năng sản sinh
ra các tín hiệu QS, cho biết sự hiện diện của chúng với các tế bào khác trong
quần thể. AHLs được tạo ra từ một phản ứng enzyme hóa, được xúc tác bởi
LuxI autoinducer synthase. LuxI tổng hợp N-AHLs: N-(3-oxohexanoyl)-Lhomoserine lactone (3-oxo-C6-HSL), sử dụng S-adenosyl methionine và
protein mang nhóm hexanoyl acyl làm cơ chất cho phản ứng. Các đồng phân
LuxI khác cũng xúc tác cho phản ứng tương tự để tạo ra các AHLs cần thiết
như: N-(3-oxooctanoyl)-L-homoserine lactone (3-oxo-C8-HSL), N-hexanoylL-homoserine lactone (C6-HSL)… (Toth và cs., 2003; Val và Cronan, 1998)

17


Bảng 1.2: Hệ thống QS sử dụng phân tử tín hiệu N-AHLs
của một số loài Erwinia (Barnard và Salmond, 2006)
Chủng vi khuẩn
Erwinia nhóm 1
Ecc EC153

Tín hiệu QS
chính

Đồng
phân
LuxI

Đồng
phân
LuxR

Tác động của QS

3-oxo-C8-HSL
và
3-oxo-C6-HSL
3-oxo-C8-HSL
và
3-oxo-C6-HSL

AhlI

ExpR

AhlI

ExpR1(ExpR)*, Gây bệnh, tổng
ExpR2
hợp enzyme ngoại
bào

Erwinia nhóm 2
Ecc ATCC39048

3-oxo-C6-HSL

CarI

CarR,
EccR(ExpR)*,
VirR

Ecc SCRI193

3-oxo-C6-HSL

Ecc 71

3-oxo-C6-HSL

Eca SCRI1043

3-oxo-C6-HSL

Ecc SCC3193

Tổng hợp enzyme
ngoại bào

Tổng hợp kháng
sinh, gây bệnh, tổng
hợp enzyme ngoại
bào

AhlI
ExpR,
VirR, Gây bệnh, tổng
[CarR
hợp enzyme ngoại
(cryptic)]
bào
AhlI
ExpR1(ExpR)*, Gây bệnh, tổng
(HslI)* ExpR2
hợp enzyme ngoại
bào
ExpI
ExpR, VirR
Gây bệnh, tổng
hợp enzyme ngoại
bào

Erwinia amylovora
OMP-BO 1077/7 3-oxo-C6-HSL EamI
Erwinia chrysanthemi
3937
3-oxo-C6-HSL, ExpI
C6-HSL,
C10-HSL

*Danh pháp thay thế

18

EamR
ExpR

Tổng hợp enzyme
pectinase


Theo như bảng 1.2 thì ở hầu hết các loài thuộc chi Erwinia có mối quan
hệ mật thiết giữa khả năng sản sinh phân tử tín hiệu AHLs và khả năng gây
bệnh trên cây chủ. Đây là cơ sở chính để chúng tôi tiến hành nghiên cứu này.
1.2.3 Các biện pháp phòng trừ bệnh
Bệnh thối nhũn củ khoai tây do vi khuẩn Ecc gây ra chủ yếu lây qua
củ giống và sẵn sàng lan rộng bởi những củ nhiễm tiềm tàng. Bên cạnh đó
vi khuẩn có thể lây qua không khí, côn trùng, động vật (côn trùng, chuột,..)
và các dụng cụ lao động. Nhiều phương pháp phòng trừ đã được tổng hợp
dưới đây nhưng ở mức độ thành công khác nhau (Czajkowski và cs., 2011).
Phương pháp tránh lây nhiễm và cấp chứng chỉ củ giống: Đây được
xem là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất và có những thành công
nhất định. Sử dụng nguồn củ giống khỏe, được cấp chứng chỉ sạch bệnh.
Trong quá trình canh tác, dụng cụ phải được rửa sạch. Loại bỏ củ thối trên
đồng ruộng và thu hoạch. Tránh làm xây sát củ. Trước khi bảo quản không
đổ khoai tây thành đống củ, cần phải giàn thành từng lớp, hong nhẹ dưới
ánh sáng tán xạ để giảm bớt lượng nước, vỏ củ khô và dần chuyển thành
màu hơi xanh. Khoai tây phải được bảo quản trong điều kiện thông gió, tốt
nhất trong phòng lạnh để làm giảm nguồn nhiễm và tránh bệnh lây lan.
Chế độ dinh dưỡng ảnh hưởng lên tính chống chịu bệnh. Dinh dưỡng
ảnh hưởng đến sự phát triển của cây, sự tương tác giữa cây trồng với tác nhân
gây bệnh cũng như với những vi sinh vật khác. Canxi đóng vai trò quan trọng
nhất quyết định đến tính chống chịu bệnh của cây do ion canxi cải thiện cấu
trúc và độ cứng của thành tế bào thực vật. Đất tự nhiên thiếu canxi có thể

được bổ sung CaSO4 (gypsum) không những làm tăng tính chống chịu của
cây với bệnh thối đen (blackleg) mà với cả bệnh thối nhũn củ khoai tây. Tuy
nhiên một chế độ dinh dưỡng cân bằng cùng với việc tăng hàm lượng Ca

19


trong đất không đủ để ngăn chặn được bệnh mà cần phải kết hợp với nhiều
biện pháp khác trong phương pháp phòng trừ tổng hợp.
Biện pháp chọn tạo giống: Chọn tạo giống bằng phương pháp truyền thống
được xem như biện pháp kém khả thi nhất. Trong tự nhiên không có giống khoai
tây nào mang tính chống chịu với bệnh thối đen và thối nhũn mặc dù cũng có một
số giống chống chịu cục bộ, cùng với sự kém đa dạng di truyền của nguyên liệu
chọn giống bố mẹ được sử dụng, Trong khi đó việc tạo ra những cây trồng biến
đổi gen lại được xem như là phương pháp hứa hẹn để thay thế cho phương pháp
truyền thống. Tuy đã có rất nhiều nghiên cứu khả thi nhưng thực tế cho đến nay
cũng chưa có dòng khoai tây chuyển gen nào được thương mại hóa. Mọi nghiên
cứu chỉ dừng ở quy mô nhà lưới, nhà kính nhằm kiểm tra tiến trình và đánh giá
những nguy hiểm tiềm năng đến môi trường của cây chuyển gen .
Sử dụng biện pháp lý học (xử lý nước nóng): Biện pháp này được áp
dụng trước khi bảo quản củ khoai tây. Đây được xem là biện pháp thân thiện
với môi trường. Biện pháp này có thể giúp loại trừ được vi khuẩn gây bệnh
thối nhũn cùng với một số vi khuẩn gây bệnh bề mặt củ khác. Tuy nhiện hạn
chế của nó là không diệt được vi khuẩn nằm sâu bên trong củ mà không làm
tổn thương củ, giá thành đắt và không áp dụng được trên quy mô lớn.
Biện pháp hóa học: Biện pháp này nhằm loại bỏ tận gốc tác nhân gây
bệnh và tạo ra một môi trường không thuận lợi cho bệnh phát triển. Một khi
bệnh đã phát triển, sự phòng trừ bệnh sẽ gặp khó khăn do sự nhân nhanh và
lây lan của vi khuẩn, và chất hóa học khó xâm nhập vào bên trong mô củ. Tuy
nhiên, biện pháp này nếu không được kiểm soát chặt chẽ sẽ gây hại đến môi

trường, sức khỏe con người và tạo ra tính kháng thuốc của tác nhân gây bệnh.
Biện pháp sinh học: Biện pháp này có thể thay thế biện pháp hóa học,
lý học và chọn tạo giống chống chịu trong tương lai. Đã có rất nhiều nghiên
cứu được thực hiện nhằm sàng lọc và phát hiện vi sinh vật có khả năng ức chế

20


sự xâm nhiễm của tác nhân gây bệnh. Tuy nhiên thực tế những nghiên cứu
cũng chỉ dừng lại ở mức độ in vitro và in vivo. Để có được một sản phẩm
phòng trừ sinh học được thương mại hóa cần phải đầu tư rất nhiều thời gian
và kinh phí để nghiên cứu và giải quyết được những vấn đề liên quan như tính
an toàn, độ bền vững của sản phẩm,…
1.3

Quorum Quenching (QQ) và hiệu quả kiểm soát bệnh thối nhũn

khoai tây
1.3.1 Cơ chế Quorum Quenching
Quorum quenching (QQ) đề cập đến một quá trình phá vỡ hệ thống QS
có liên quan đến phân tử tín hiệu AHLs (Yi-Hu Dong và cs., 2007). QS giúp
vi khuẩn “giao tiếp” với nhau trong quần thể nhưng không phải là yếu tố thiết
yếu cho sự sống sót hoặc sinh trưởng của tế bào vi khuẩn. Do đó, phá vỡ hệ
thống QS có thể ức chế các kiểu hình nhất định, ví dụ như làm giảm độc tính
của vi khuẩn gây bệnh.
Một số chiến lược QQ đã được sử dụng để phá hủy quá trình QS bao
gồm: i) Ức chế sinh tổng hợp AHLs bằng cách ngăn chặn hoạt động của
protein AHL synthase (LuxI-type synthase); ii) Phá hủy các phân tử AHLs
bằng enzyme AHL-acylase và AHL-lactonase, qua đó cản trở quá trình tích
lũy phân tử AHLs và iii) Ngăn chặn sự hình thành phức hợp AHL/LuxR

(Hình 1.6).

21


Hình 1.6 Cơ chế Quorum Quenching
(Lade và cs., 2014)
Cho đến nay, đã xác định được ba nhóm enzyme chính làm bất hoạt
AHLs trong cơ chế biến đổi/phân tách phân tử AHL. Enzyme AHL lactonase
thủy phân liên kết ester của vòng homoserine lactone (HSL) để tạo ra acylhomoserines (Dong và cs., 2000, 2001). Đây là nhóm enzyme có thể phân hủy
phổ rộng các loại phân tử AHL không kể kích thước và vị trí thay thế trong
chuỗi acyl. Nhóm thứ hai là enzyme AHL acylase phân tách liên kết AHL
amide tạo ra axit béo tự do và vòng homoserine lactone ring (Leadbetter và
Greenberg, 2000; Lin và cs., 2003). Không giống như AHL lactonase, AHL
acylase đặc hiệu cơ chất hơn có thể do việc nhận diện chuỗi bên acyl của phân

22


tử tín hiệu (Bokhove, 2010) (Hình 1.7). Nhóm thứ ba là enzyme AHL
oxidoreductase. Ngược lại với enzyme AHL lactonase và AHL acylase, oxy
hóa hoặc khử chuỗi bên acyl của phân tử AHLs làm biến đổi phân tử này. Các
phản ứng này không phân hủy phân tử tín hiệu mà sự biến đổi phân tử ảnh
hưởng đến tính đặc hiệu của nó và do đó tác động đến sự kết hợp giữa phân tử
tín hiệu và thụ quan của AHL (receptor).

Hình 1.7 Cơ chế phân hủy AHL bằng enzyme
(1) AHL lactonase và (2) AHL acylase
Kể từ khi được phát hiện ở loài vi khuẩn Bacillus sp. 240B1 (Dong và
cs., 2000), hoạt động enzyme AHL lactonase vẫn được tiếp tục tìm thấy và

nghiên cứu ở rất nhiều loài vi khuẩn khác như Agrobacterium tumefaciens
(Zhang và cs., 2002; Carlier A và cs., 2003), Arthrobacter sp. và
Rhodococcus sp (Park và cs., 2003), R. erythropolis (Uroz và cs., 2008), …
Ưu điểm của QQ khiến cho nó trở thành chiến lược phòng trừ bệnh
tiềm năng bởi mục đích của QQ nhằm tắt sự biểu hiện tính độc của vi khuẩn
gây bệnh nhưng không hạn chế sự phát triển tế bào, do đó khắc phục được
tính nhờn thuốc, bội nhiễm và kháng kháng thể (Chen và cs., 2013).

23


1.3.2 Ứng dụng của Quorum quenching
Ứng dụng công nghệ sinh học phân hủy AHL, một phương pháp mới,
đầy hứa hẹn cho việc đấu tranh với vi khuẩn gây hại, đã thu hút nhiều sự quan
tâm của các nhà nghiên cứu. Vì nhiều vi khuẩn gây bệnh cho người và động
vật sử dụng cơ chế QS dựa trên AHL để điều hòa sự tổng hợp yếu tố quyết
định tính độc hoặc sự hình thành màng sinh học, sự ứng dụng chiến lược QQ
có thể là một phương án phòng trừ những vi sinh vật này. Có thể nói những
nghiên cứu ứng dụng QQ hiệu quả nhất đã được thực hiện trên vi khuẩn gây
thối nhũn Erwinia.
Ứng dụng đầu tiên của chiến lược QQ trong việc bảo vệ cây trồng
chống lại vi sinh vật đã được tiến hành bởi Dong và cộng sự, 2000. Dong và
cộng sự đã phát hiện được gen aiiA240B1 mã hóa cho enzym AHL lactonase
AiiA từ chủng vi khuẩn Bacillus sp. 240B1. Vai trò của gen này trong sinh
tổng hợp được củng cố khi biểu hiện trong vi khuẩn gây bệnh E.carotovora
SCG1. Kết quả cho thấy vi khuẩn gây bệnh biểu hiện gen aiiA240B1 giảm khả
năng giải phóng AHLs và khả năng gây bệnh trên một số loài cây trồng như
khoai tây, cà rốt… Từ đó gen aiiA đã được chuyển thành công vào tác nhân
gây bệnh E. carotovora để làm giảm bệnh thối nhũn ở cải thảo. Chủng vi
khuẩn B. thuringiensis được phát hiện mang gen aiiA mã hóa enzyme

lactonase bởi Lee và cộng sự có khả năng phân hủy AHL. E. coli tái tổ hợp
sản xuất protein AiiA cũng có hoạt động phân hủy AHL và làm giảm độc tính
gây bệnh của E. carotovora trên cây (Lee và cs., 2002).
Hoạt động của enzyme AHL lactonase cũng được phát hiện ở chủng vi
khuẩn phân lập từ đất Arthrobacter sp IBN110. Vi khuẩn này phát triển nhanh
trên môi trường chứa N-3-oxohexanoyl-L-homoserine lactone (OHHL) và
phân hủy nhiều loại AHLs khác nhau. Khi đồng nuôi cấy Arthobacter sp.

24


IBN11 đặc tính của các chủng VKNS có khả năng phân hủy AHLs (do chủng vi
khuẩn Ecc tiết ra) bằng cách quan sát màu sắc tại vạch cấy chủng chỉ thị.
Chủng chỉ thị CV026 sản sinh violacein có khả năng cảm ứng với AHLs sẽ
chuyển màu tím nên mẫu nào chuyển màu sẽ không có khả năng phân hủy
AHLs và ngược lại chủng chỉ thị không chuyển màu là do chủng VKNS có
khả năng phân hủy AHLs do vi khuẩn gây bệnh Ecc sản sinh. Trường hợp các
chủng chỉ thị chuyển màu nhạt là do khả năng phân hủy AHLs yếu của
VKNS.
Như vậy, từ 70 chủng VKNS được phân lập từ cây cà dại, sau khi tiến
hành tuyển chọn khả năng phân hủy AHLs bằng phương pháp nuôi cấy vạch
song song, đã xác định được 9 chủng có khả năng phân hủy AHLs (Bảng 3.1).

40