Bài giảng công nghệ lên men

MỤC LỤC
CHƯƠNG 1.

KHÁI NIỆM LÊN MEN VÀ ỨNG DỤNG ................................... 4

1.
2.

Khái niệm lên men ............................................................................................... 4
Ứng dụng của các quá trình lên men ................................................................. 5
2.1. Sản xuất sinh khối vi sinh vật .......................................................................... 5
2.2. Sản xuất enzyme vi sinh vật.............................................................................. 5
2.3. Sản xuất các chất trao đổi vi sinh vật .............................................................. 5
2.4. Sản xuất các sản phẩm tái tổ hợp .................................................................... 6
2.5. Hỗ trợ các quá trình biến nạp .......................................................................... 9
3. Quá trình phát triển của công nghiệp lên men ................................................. 9

CHƯƠNG 2. ĐỘNG HỌC TĂNG TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT TRONG
QUÁ TRÌNH LÊN MEN ......................................................................................... 10
1. Phân loại phương pháp lên men .............................................................................. 11
2. Phương pháp lên men mẻ........................................................................................ 11
3. Phương pháp lên men liên tục................................................................................. 15
4. Phương pháp lên men mẻ-bổ sung (fed-batch) ....................................................... 17
5. Lên men mật độ cao ................................................................................................ 19

CHƯƠNG 3. SƠ ĐỒ LƯU TRÌNH HỆ THỐNG LÊN MEN CÔNG
NGHIỆP
20
1. Giới thiệu ................................................................................................................ 20
2. Các công đoạn của qui trình lên men ...................................................................... 21
3. Hệ thống thiết bị liên quan đến qui trình lên men .................................................. 28

CHƯƠNG 4. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TRONG LÊN MEN CÔNG
NGHIỆP
34
1. Giới thiệu ................................................................................................................ 34
2. Thiết kế môi trường lên men................................................................................... 34
3. Các thành phần của môi trường lên men ................................................................ 37
4. Đánh giá môi trường ............................................................................................... 50
5. Phương pháp đường hóa tạo dung dịch glucose từ tinh bột.................................... 50
6. Phương pháp xử lý mật rỉ đường tạo dung dịch đường phục vụ cho lên men ........ 52

CHƯƠNG 5. KHỬ TRÙNG TRONG LÊN MEN CÔNG NGHIỆP .................. 54
1. Mục đích khử trùng trong lên men ......................................................................... 54
2. Yêu cầu khi khử trùng ............................................................................................ 55
3. Phương pháp khử trùng........................................................................................... 55
4. Động học sự chết của vi sinh vật bởi nhiệt ............................................................. 57
5. Khử trùng môi trường ............................................................................................. 60
5.1. Khử trùng theo phương pháp liên tục .............................................................. 60
5.2. Khử trùng theo phương pháp mẻ ..................................................................... 63
6. Khử trùng nồi lên men ............................................................................................ 64
7. Lọc không khí ......................................................................................................... 65

CHƯƠNG 6.

KIỂM SOÁT NUÔI CẤY ............................................................ 66

1. Kiểm soát tăng trưởng tế bào .................................................................................. 66
2. Kiểm soát pH .......................................................................................................... 70
3. Kiểm soát nhiệt độ .................................................................................................. 72
4. Kiểm soát hàm lượng oxygen hòa tan trong môi trường lên men .......................... 75

2


5. Kiểm soát tốc độ bổ sung môi trường dinh dưỡng trong quá trình lên men ........... 78
6. Phá bọt trong quá trình lên men .............................................................................. 80
6. 1. Tạo bọt và các nhân tố gây tạo bọt ................................................................. 81
6.2. Những trở ngại gây nên bởi bọt ....................................................................... 81
6.3. Kiểm soát bọt ................................................................................................... 81
7. Theo dõi và tính toán kết quả lên men .................................................................... 84
1. Nồng độ sản phẩm .............................................................................................. 84
2. Sản lượng ............................................................................................................ 85
3. Hiệu suất ............................................................................................................. 85

CHƯƠNG 7.

TỐI ƯU HOÁ HỆ THỐNG LÊN MEN ...................................... 89

1. Cải tiến giống ......................................................................................................... 89
2. Cải tiến thiết bị ...................................................................................................... 90
3. Tăng cường các điều kiện thích hợp trong quá trình nuôi cấy......................... 90

CHƯƠNG 8. NHIỄM TẠP KHUẨN VÀ NGUYÊN TẮC PHÒNG
CHỐNG TẠP NHIỄM ............................................................................................. 96
1. Hậu quả của sự nhiễm tạp khuẩn ............................................................................ 96
2. Phát hiện tạp nhiễm................................................................................................. 96
3. Nguyên nhân tạp nhiễm .......................................................................................... 97
4. Nguyên tắc phòng chống nhiễm trong lên men ...................................................... 97
5. Cách phát hiện - đánh giá nguồn gốc tạp nhiễm ..................................................... 99
6. Một số điểm cần lưu ý khi truy tìm nguồn gốc gây tạp nhiễm ............................. 101

CHƯƠNG 11. BÀI TẬP ÁP DỤNG ................................................................... 102
1. Bài tập .................................................................................................................. 102
2. Bài giải ................................................................................................................. 104

TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 110
PHẦN PHỤC LỤC ................................................................................................. 111

3


CHƯƠNG 1.

KHÁI NIỆM LÊN MEN VÀ ỨNG DỤNG

1. Khái niệm lên men
Thuật ngữ “lên men” bắt nguồn từ động từ “fervere” trong tiếng Latin, có nghĩa
là làm sôi bọt (nổi bọt), nhằm mô tả hiện tượng hoạt động của nấm men trong dịch
chiết trái cây hoặc dịch chiết đại mạch. Hiện tượng sôi bọt này là do CO2 sinh ra bởi
sự phân giải hiếu khí của các loại đường hiện diện trong dịch chiết. Tuy nhiên, đối với
các nhà sinh hoá và các nhà sinh vật học thì thuật ngữ lên men còn có ý nghĩa khác.
Về phương diện sinh hóa thì lên men có ý nghĩa liên quan đến sự sinh năng lượng bởi
quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ, trong khi đó, về phương diện vi sinh vật học
trong công nghiệp thì nghĩa của lên men rộng hơn.
Sự phân giải đường là một quá trình oxy hoá dẫn đến việc tạo thành các phân tử
pyridine nucleotides ở dạng khử và sau đó các phân tử này lại tiếp tục bị oxy hoá cho
các quá trình tiếp theo. Trong điều kiện hiếu khí, sự oxy hóa các phân tử pyridine
nucleotides diễn ra bằng sự chuyển điện tử thông qua hệ thống cytochrome mà trong
đó oxygen đóng vai trò là chất nhận điện tử cuối cùng. Tuy nhiên, trong điều kiện kỵ
khí, sự oxy hoá các pyridine nucleotides dạng khử diễn ra cùng với sự khử của một

hợp chất hữu cơ mà thường là sản phẩm trung gian của một quá trình phân giải. Đối
với trường hợp về sự hoạt động của nấm men trong dịch nước trái cây hoặc dịch chiết
ngũ cốc, NADH được hình thành nhờ sự khử của acid pyruvic thành ethanol. Các
chủng vi sinh vật khác nhau có khả năng khử pyruvate thành các sản phẩm khác nhau
và rất đa dạng. Do vậy, thuật ngữ lên men được sử dụng đúng theo ý nghĩa sinh hóa là
một quá trình sinh năng lượng trong đó các chất hữu cơ đóng vai trò vừa là chất cho
vừa là chất nhận điện tử.
Quá trình sinh tổng hợp alcohol nhờ tác động của nấm men trong dịch chiết đại
mạch hoặc dịch chiết trái cây đã được thực hiện với qui mô lớn từ rất lâu và đã trở
thành chất trao đổi của vi sinh vật được sản xuất công nghiệp đầu tiên. Do vậy, các
nhà vi sinh vật học công nghiệp đã mở rộng khái niệm lên men để mô tả bất kỳ qui
trình sản xuất nào mà sản phẩm được sinh ra nhờ nuôi cấy vi sinh vật. Việc sản xuất
bia hoặc các dung môi hữu cơ được xem như là quá trình lên men theo cả nghĩa về
sinh hoá học và vi sinh vật học. Trong tài liệu này, thuật ngữ lên men được sử dụng
theo nghĩa rộng bao hàm cả hai.
Cần phân biệt các khái niệm:
Chất cho điện tử Chất nhận điện tử cuối cùng
Lên men (sinh hoá) Chất hữu cơ
Hô hấp hiếu khí
Chất hữu cơ
Hô hấp kỵ khí
Chất hữu cơ

Hợp chất hữu cơ
Oxygen
Hợp chất vô cơ (nitrate, sulphate)

Thuật ngữ lên men mở rộng bao gồm cả ba khái niệm trên.

4

2. Ứng dụng của các quá trình lên men
2.1. Sản xuất sinh khối vi sinh vật
Công nghiệp sản xuất sinh khối vi sinh vật có thể được chia thành hai qui trình
chính. (1) sản xuất nấm men dùng trong công nghiệp bánh mì, (2) sản xuất tế bào vi
sinh vật dùng trong thực phẩm cho con người và cho động vật (protein đơn bào). Nấm
men bánh mì được sản xuất theo qui mô công nghiệp từ những năm 1900 và nấm men
được sản xuất dùng làm thực phẩm cho con người ở Đức trong Đại thế chiến thứ I.
Tuy nhiên mãi đến những năm 1960 thì sản xuất sinh khối vi sinh vật mới được khai
thác mạnh mẽ. Và do vậy từ những năm 1970, các qui trình liên tục theo qui mô lớn đã
được thiết lập và đưa vào sản xuất sinh khối vi sinh vật phục vụ cho động vật.
2.2. Sản xuất enzyme vi sinh vật
Enzyme thương mại được sản xuất từ thực vật, động vật và vi sinh vật. Tuy
nhiên, enzyme vi sinh vật có nhiều ưu thế vượt trội là do có thể sản xuất với lượng rất
lớn bằng kỹ thuật lên men. Hơn nữa rất dễ dàng làm tăng sản lượng của hệ thống vi
sinh so với các qui trình sản xuất từ nguồn thực vật hay động vật. Bên cạnh đó, sự tiến
bộ của kỹ thuật DNA tái tổ hợp đã giúp có thể sản xuất các enzyme có nguồn gốc động
vật nhờ các chủng vi sinh vật. Các enzyme này được dùng chủ yếu trong công nghiệp
thực phẩm và các ngành công nghiệp có liên quan khác (Bảng 1. 1). Quá trình nuôi
cấy vi sinh vật để sản xuất enzymes được kiểm soát rất chặt chẽ. Ngày nay, người ta
sử dụng một số kỹ thuật sinh học phân tử để tăng cường năng suất sản xuất của các
chủng như tăng cường chất cảm ứng, đột biến genes, hay kỹ thuật tái tổ hợp genes.
2.3. Sản xuất các chất trao đổi vi sinh vật
Cùng với các giai đoạn tăng trưởng, sự thay đổi trong quá trình nuôi cấy một
chủng vi sinh vật có thể được mô tả thông qua sản phẩm mà chúng sinh ra trong các
phase khác nhau của đường cong tăng trưởng. Ở log phase, sản phẩm được sinh ra chủ
yếu là phục vụ cho tăng trưởng của tế bào, bao gồm các amino acids, nucleotides,
lipids, carbohydrates… Những sản phẩm này được xem là sản phẩm sơ cấp của sự
biến dưỡng, và phase này được gọi là trophophase.

Rất nhiều sản phẩm sơ cấp có giá trị kinh tế cao và ngày nay được sản xuất bằng
phương pháp lên men (Bảng 1. 2).
Sự tổng hợp các chất trao đổi sơ cấp của các chủng vi sinh vật hoang dại chỉ đủ
cho nhu cầu trong tế bào của chúng. Do vậy nhiệm vụ của các nhà vi sinh vật học công
nghiệp là phải làm sao cải biến các chủng này và cung cấp các điều kiện nuôi cấy cần
thiết để cải thiện năng suất sinh tổng hợp các chất này.
Trong phase ổn định, một số chủng tổng hợp ra các hợp chất mà chúng không
tổng hợp được trong log phase, các chất này không có vai trò rõ ràng đối với quá trình
biến dưỡng của tế bào và chúng được xem là chất trao đổi thứ cấp, và phase này gọi là
idiophase. Vi sinh vật tăng trưởng trong môi trường tự nhiên ở tốc độ thấp, điều này

5


khiến người ta cho rằng, trong tự nhiên thì idophase chiếm ưu thế hơn trophophase.
Không phải toàn bộ vi sinh vật đều có biến dưỡng thứ cấp, ví dụ như đối với trường
hợp của vi khuẩn Enterobacteriaceae thì không tìm thấy có sản phẩm thứ cấp. Đôi khi
rất khó để phân biệt một sản phẩm là sơ cấp hay thứ cấp và động học sinh tổng hợp
của những hợp chất nhất định có thể thay đổi tùy thuộc vào các điều kiện nuôi cấy.
Vai trò sinh lý của biến dưỡng thứ cấp trong các tế bào vi sinh vật được tranh
luận nhiều, nhưng người ta quan tâm đến vai trò quan trọng của các chất trao đổi trung
gian nhiều hơn. Có rất nhiều chất trao đổi thứ cấp có hoạt tính kháng khuẩn, là các
enzyme ức chế, một số chất thúc đẩy tăng trưởng và rất nhiều chất có dược tính. Do
vậy, sản phẩm của biến dưỡng thứ cấp đã hình thành nên cơ sở của nhiều qui trình lên
men khác nhau. Cũng giống như trường hợp đối với các chất trao đổi sơ cấp, các
chủng vi sinh vật hoang dại có khuynh hướng tổng hợp các chất trao đổi thứ cấp với
nồng độ thấp và sự tổng hợp này được kiểm soát bởi sự cảm ứng, sự ức chế dị hóa và
hệ thống phản hồi.
2.4. Sản xuất các sản phẩm tái tổ hợp
Sự phát triển của công nghệ DNA tái tổ hợp đã mở rộng tiềm năng ứng dụng của

công nghệ lên men, tạo ra các sản phẩm lên men khác nhau, phục vụ cho cuộc sống
của con người. Các genes của các sinh vật bậc cao có thể sẽ được đưa vào tế bào vi
sinh vật và các chủng này có khả năng tổng hợp ra các protein ngoại. Có nhiều chủng
vi sinh vật khác nhau được dùng làm tế bào chủ cho những hệ thống biểu hiện bao
gồm E.coli, Sac. cerevisiae và các nấm sợi. Các sản phẩm được sinh ra từ các chủng
được biến đổi di truyền như thế này gồm: interferon, insulin, albumin của huyết thanh
người, các nhân tố tăng trưởng biểu bì, chymosin của bê, và somatostatin của bò. Khi
thiết kế các hệ thống biểu hiện các sản phẩm tái tổ hợp cần chú ý đến một số vấn đề:
sự tiết của sản phẩm, giảm thiểu sự phân hủy sản phẩm và sự kiểm soát sinh tổng hợp
trong toàn bộ tiến trình lên men, cũng như tối ưu hóa biểu hiện của genes ngoại.

6


Bảng 1. 1. Các ứng dụng của enzyme trong thương mại.
Công nghiệp
Ứng dụng
Công nghiệp bánh mì và Giảm độ nhớt trong quá trình nhào bột, tăng cường độ mềm
mại, và duy trì độ tươi của bột
xay bột
Cải thiện cấu trúc, giảm thời gian trộn, tăng thể tích của ổ bánh
mì
Công nghiệp bia
Tăng cường độ nghiền nhừ
Chống lại ảnh hưởng của khí lạnh
Cải thiện độ lọc tinh
Công nghiệp ngũ cốc
Xử lý các thực phẩm ăn nhanh
Trong chế biến socola
Sản xuất các dịch si-rô

Coffee
Lên men hạt cà-fé
Trong xay café
Làm chế phẩm cà-fé cô đặc
Sản xuất các lọai bánh kẹo
Sản xuất các lọai siro có hàm lượng maltose cao
Siro bắp
Sản xuất các loại siro có chỉ số DE thấp
Sản xuất glucose từ siro bắp
Sản xuất siro fructose
Sản xuất dịch thủy phân protein
Chế biến sữa
On định sửa bay hơi
Sản xuất sữa đặc, kem, và các thức ăn tráng miệng dạng động
lạnh
Sản xuất sữa thô
Trong chiên-xào
Tách lọai glucose
Nước ép trái cây
Làm trong các loại dịch
Loại oxygen
Giặt ủi
Sử dụng làm chất tẩy
Thuộc da
Chống mọc lông
Thịt
Làm mềm mại

Amylase

Enzyme

Nguồn gốc
Nấm

Protease
Amylase
Protease
b-glucanase
Amylase
Pectinase
Pectinase
Pectinase, hemicellulase
Invertase, pectinase

Nấm/vi khuẩn
Nấm/vi khuẩn
Nấm/vi khuẩn
Nấm/vi khuẩn
Nấm
Nấm/vi khuẩn
Nấm
Nấm
Nấm/vi khuẩn

Amylase
Amylase
Amyloglycosidase
Glucoseisomerase
Protease

Protease
Lactase

Nấm
Vi khuẩn
Nấm
Vi khuẩn
Nấm/vi khuẩn
Nấm
Nấm men

Protease
Glucose oxidase
Pectinase
Glucose oxidase
Protease, lipase
Protease
Protease

Nấm/vi khuẩn
Nấm
Nấm
Nấm
Vi khuẩn
Nấm/vi khuẩn
Nấm
7


Trong y dược

Tráng ảnh
Dịch thủy phân protein
Chế biến thức uống
Công nghiệp dệt
Rau quả

Hổ trợ tiêu hóa
Chống đông máu
Trong các thử nghiệm lâm sàng
Thu hồi bạc từ film đã sử dụng
Trong sản xuất dịch thủy phân
Tạo sự ổn định
Chống sự xắp xếp theo kích thước của các sợi
Các chế phẩm dạng soup hoặc nghiền nhừ

Amylase, protease
Steptokinase
Numerous
Protease
Proteases
Glucose oxidase, catalase
Amylase
Pectinase,
amylase,
cellulase

Nấm
Vi khuẩn
Nấm/vi khuẩn
Vi khuẩn

Nấm/vi khuẩn
Nấm
Vi khuẩn
Nấm

Bảng 1. 2. Các sản phẩm sơ cấp của biến dưỡng vi sinh vật và ứng dụng trong thương mại
Chất trao đổi sơ cấp
Ethanol
Citric acid
Glutamic acid
Lysine
Nucleotides
Phenylalanine
Polysaccharides
Vitamins

Ý nghĩa thương mại
Thành phần hoạt tính trong các thức uống có cồn, sử dụng làm nhiên liệu thay thế xăng dầu.
Có nhiều ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm
Chất tăng vị
Chất hổ trợ thực phẩm
Chất tăng vị
Chất tiền thân của aspartame, chất gây ngọt
Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, tăng cường khả năng thu hồi dầu béo
Chất hổ trợ thực phẩm

8


2.5. Hỗ trợ các quá trình biến nạp

Các tế bào vi sinh vật có thể được sử dụng để chuyển một hợp chất vào một cấu
trúc liên quan có giá trị hơn vì chúng có tác dụng như các chất xúc tác với tính đặc
trưng vị trí và lập thể cao. Các quá trình vi sinh vật đặc trưng hơn các quá trình hóa học
và cho phép có thể thêm, loại bỏ hoặc thay đổi từng nhóm chức năng ở những vị trí đặc
trưng nhất định trên các phân tử phức tạp mà không cần dùng đến các hoá chất. Các
phản ứng được xúc tác bởi enzyme bao gồm phản ứng khử hydrogen, phản ứng oxy
hoá, phản ứng hydroxyl hoá, phản ứng khử nước, phản ứng khử carboxyl, amin hoá,
khử amin, phản ứng chuyển vị. Các quá trình vi sinh vật còn có thêm một thuận lợi nữa
là thực hiện ở nhiệt độ và áp suất phản ứng thấp, không đòi hỏi các chất xúc tác như
các kim loại nặng.
3. Quá trình phát triển của công nghiệp lên men
Quá trình phát triển của công nghiệp lên men diễn ra qua năm giai đoạn được mô tả
trong Bảng 1. 3. Quá trình phát triển ngành công nghiệp lên men trước giai đoạn 1900
được mô tả là giai đoạn 1, các sản phẩm trong giai đoạn này chỉ đơn thuần giới hạn ở
dạng alcolhol uống được, hoặc dấm ăn.
Bảng 1. 3. Quá trình phát triển của ngành công nghiệp lên men.

9


Giai đoạn

Sản phẩm chính

Phương pháp
Kiểm soát quá trình
nuôi cấy

Loại bồn

Alcohol

- Bằng gỗ, đạt đến 1500
barrels
- Bằng đồng thau

Dấm

Bằng các thùng phuy, khay
hay trong các lớp lọc chảy
dòng

Kiểm soát
chất lượng

Các
thiết bị
pilot Chọn lọc giống

Sử dụng thiết bị đo
nhiệt độ, báo mực, Dạng mẻ
trao đổi nhiệt

Hầu như không
kiểm soát

Nấm men thuần
Không nhất sử dụng ở
Carlberg
có

(1886)

Dạng mẻ

Hầu như không
kiểm soát

Chọn lọc chủng
Không
lên men dấm
có
tốt

1. Trước 1900

3

Bồn bằng kim loại 200m
cho sản xuất
Nấm men bánh mì,
Sử dụng đầu dò pH, Dạng mẻ và hệ
acetone/butanol
glycerol, citric
Hầu như không
2. 1900-1940
đầu
dò kiểm soát thống
Sử dụng hệ thống phân phối
acid, lactic acid,
kiểm soát

fed- batch
Khuấy trộn được sử dụng nhiệt độ
acetone/butanol
trong trường hợp bồn lên
men có kích thước nhỏ.
Pennicillin,
Streptomicin
các kháng sinh
khác gibberelin,
3. 1940 đến nay
amino acid,
nucleotides,
các chất chuyển
hoá, enzyme

4. 1964- nay

5. 1979- nay

Sinh khối đơn bào,
protein,
hydrocarbon, các
chất phục vụ chăn
nuôi
Sản xuất các
protein khác dòng
(heterologous) bởi
vi sinh vật và tế
bào động vật, Sản
xuất kháng thể đơn

dòng bởi tế bào
động vật

Hầu như
Sử dụng giống
không
thuần nhất
có

Các bồn lên men có trang
bị hệ thống sục khí, vận
hành trong điều kiện vô
trùng- đúng nghĩa bồn lên
men

Sử dụng đầu dò pH,
DO có thể thanh
trùng được. Sử dụng
các thiết bị kiểm
soát mà sau này có
thể kiểm soát trên
máy tính

- Thông thường
là dạng mẻ và
fed-batch.
- Phát triển
nuôi cấy liên Rất quan trọng
tục cho lên men
bia và một vài

chất trao đổi sơ
cấp

Sử dụng các
Trở nên
chương
thông
trìnhđột biến và
dụng
chọn lọc cơ bản

Các bồn lên men chịu áp
lực, được thiết kế để giải
quyết vấn đề trao đổi khí,
nhiệt độ

Sử dụng máy tính
kiểm
soát các thông số
vận hành

Nuôi cấy liên
tục với việc hồi
Rất quan trọng
lưu môi trường
nuôi cấy

Rất quan Sử dụng kỹ
trọng thuật di truyền

Dạng mẻ, fedbatch, hoặc liên
Sử dụng nồi lên men được Phát triển các điều tục.
phát triển trong giai đoạn 3, kiện kiểm soát và Phát triển nuôi
Rất quan trọng
4. Và phát triển thêm nồi đầu dò như trong cấy liên tục
nuôi cấy tế bào động vật
giai đoạn 3, 4
dạng chảy tràn
để nuôi cấy tế
bào động vật

Rất quan Sử dụng kỹ
trọng thuật tái tổ hợp

10


CHƯƠNG 2.

ĐỘNG HỌC TĂNG TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT
TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN

1. Phân loại phương pháp lên men
Tuỳ theo đặc điểm mà việc phân loại lên men có khác nhau
1. Theo tính chất môi trường: Lỏng; Rắn; Bán rắn
2. Theo đặc tính sử dụng oxygen của chủng vi sinh vật: Lên men hiếu khí; Lên
men kỵ khí
3. Theo trạng thái: Trạng thái tĩnh (không khuấy trộn/sục khí); Trạng thái động
(có khuấy trộn/sục khí)
4. Theo mức độ kiểm soát của qui trình: Có kiểm soát (độ tạp nhiễm, cơ chất,

pH,…); Không kiểm soát (tự nhiên)
5. Theo qui trình lên men: Lên men theo mẻ (batch); Lên men theo dạng liên
tục (continuous); Lên men theo dạng bán liên tục (fed-batch, dạng mẻ-bổ
sung)
Nhằm đánh giá diễn tiến cụ thể của một chu kỳ lên men, phương pháp lên men
theo mẽ được chọn làm kiểu mẫu để đánh giá, trên cơ sở đó sẽ mở rộng đánh giá đối
với các phương pháp lên men còn lại.
2. Phương pháp lên men mẻ
Đây là một hệ thống nuôi cấy khép kín, giới hạn về dinh dưỡng, nghĩa là cơ chất
dinh dưỡng không được bổ sung trong suốt quá trình lên men, trải qua bốn phase khác
nhau.
Trong giai đoạn đầu (lag phase, (a)) của quá trình nuôi cấy, hầu như không có
sự tăng trưởng đáng kể nào xảy ra, chủ yếu là giai đoạn thích nghi của tế bào trong môi
trường mới. Trong thực tế sản xuất cần phải rút ngắn thời gian của phase này càng
nhiều càng tốt để đưa hệ thống lên men nhanh chóng bước vào giai đoạn tăng trưởng
và sinh tổng hợp sản phẩm quan tâm. Tiếp theo, vi sinh vật dần dần thích nghi, tăng
trưởng nhanh dần và đạt đến tốc độ tối đa - log phase (b).
Sự tăng trưởng trong phase này có thể được biểu diễn theo phương trình toán
học sau:
dx/dt = µx (2.1)
Trong đó x sinh khối vi sinh tại thời điểm nuôi cấy được t giờ, µ là tốc độ
tăng trưởng đặc trưng (hr-1), tốc độ này khác nhau tùy theo các giai đoạn trong chu kỳ
tăng trưởng.

11


Hình 2. 1. Hệ thống lên men theo phương pháp mẻ.
Từ phương trình trên ta có:
dx/x = µdt

t

t

to

to

∫ dx / x = µ ∫ dt
(2.2)
(ln xt - ln x0) = µ(t-t0)
x0: lượng sinh khối ban đầu (t0), xt: lượng sinh khối sau thời gian ni cấy t

Ln(nồng độ tế bào)

(giờ).
0.8
0.6
(a)

(b)

(d)

(c)

0.4
0.2
Thời gian nuôi cấy (giờ)
0

0

4

8

12

16

20

24

28

32

36

Hình 1. 1. Sơ đồ động học tăng trưởng của vi sinh vật khi ni cấy dạng mẻ. (a) lagpha, (b) log- pha, (c) pha ổn định, (d) pha suy vong.
Trong log phase, giàu dinh dưỡng, µ sẽ đạt µmax. Mỗi chủng vi sinh vật trong
những điều kiện tối thích nhất định sẽ có µmax khác nhau. Tốc độ tăng trưởng phụ thuộc
rất lớn vào nguồn dinh dưỡng của mơi trường ni cấy và thành phần các sản phẩm do

12


chính hoạt động của vi sinh vật tạo ra trong môi trường. Nếu vẫn duy trì việc bổ sung
dinh dưỡng vào môi trường nuôi cấy thì tăng trưởng vẫn đạt được ở tốc độ cao.

Bảng 2. 1. Một số giá trị µmax của một số chủng vi sinh vật trong điều kiện nuôi cấy đặc
trưng.
Chủng vi sinh vật

µmax (giờ )

Nguồn tham khảo

Vibrio natriegents
Methylomonas methanolytica
Aspergillus nidulans
Penicilium chrysogenum
Fusarium graminearum Schwabe
Nuôi cấy tế bào thực vật

4,24
0,53
0,36
0,12
0,28
0,01-0,046

Eagon (1961)
Dostalek et al (1972)
Trinci (1969)
Trinci (1969)
Trinci (1992)
Petersen & Alfermann (1993)

Nuôi cấy tế bào động vật

0,01-0,05

Lavery (1990)

-1

Sự tăng số lượng tế bào diễn ra trong log phase theo cấp số nhân với cơ số 2
theo phương trình:
N = N0.2n
(2.3)
trong đó, N0 và N là số lượng tế bào ban đầu và tại thời điểm khảo sát, n là số thế hệ.
lg(N/N0) = n.lg2
n = 3,32×lg(N/N0) (2.4)
Thời gian thế hệ tg
tg = t/n
(2.5)
với t là thời gian mà vi sinh vật nhân đôi qua n thế hệ.
Đối với vi khuẩn tg thường khoảng 20-60 phút, đối với nấm men tg thường
khoảng 1-3 giờ.
Hằng số tốc độ phân chia k là số lần phân chia sau 1 giờ nuôi cấy
k =1/g = n/t (2.6)
Trong giai đoạn ổn định (stationary phase, c), lượng sinh khối tạo thành có thể
mô tả bằng phương trình:
x = Y(si-sr) (2.7)
trong đó, x là hàm lượng sinh khối, Y là hiệu suất tổng hợp sinh khối, si là hàm lượng
cơ chất ban đầu, sr là hàm lượng cơ chất còn lại. Tăng trưởng của vi sinh vật sẽ dừng
lại khi sr = 0 hoặc khi mà trong môi trường có sự tích lũy các chất có thể gây độc hại
cho chủng. Giá trị Y nhằm giúp đánh giá hiệu suất chuyển đổi một cơ chất thành sinh
khối vi sinh vật. Do vậy có thể dùng Y để tính toán lượng cần thiết của một cơ chất khi

muốn tổng hợp một lượng sinh khối nhất định. Hiệu suất Y không phải là một hằng số
ổn định mà thay đổi tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, độ pH, hàm lượng
13


oxygen ho tan, s gii hn ca cỏc c cht,... S suy gim tng trng ph thuc vo
c cht gii hn khi cn kit trong mụi trng cú th c mụ t theo phng trỡnh
(theo Monod, 1942):
à = àmaxì sr/(Ks+sr) (2.8)
Trong ú Ks l hng s s dng c cht, Hỡnh 2. 2. i vi mt c cht nht
nh thỡ mi chng vi sinh vt cú Ks khỏc nhau (Bng 2. 2).
Khi sr = Ks thỡ à = 1/2àmax. Khi à = 0, bc vo giai on phase n nh. õy l
giai on chớnh ca vic sn xut cỏc cht trao i.
Bng 2. 2. Mt s giỏ tr Ks ca mt s chng vi sinh vt thụng thng.
Chng vi sinh vt

C cht Ks (mg/dm3 )

E.coli

Glucose

Sac. cerevisiae

Glucose

Nong ủoọ cụ chaỏt giụựi haùn

Pseudomonas sp. Methanol

6,8.10
25,0

-2

0,7

Tham kho
Shehata and Marr (1971)
Pirt and Kurowski (1970)
Harison (1973)

si
Ks
sr
T h ụ ứi g ia n n u o õi c a ỏy

Hỡnh 2. 2. S biu th tr s Ks.
S thay i hm lng cỏc cht trao i cú th biu din:
dp/dt = x (2.9)
trong ú, p l nng sn phm, l tc sinh tng hp c trng. Mt khỏc, s to
thnh sn phm tựy thuc vo hot tớnh ca chng (hiu sut trờn mt n v t bo):
dp/dx = Yp/x (2.10)
vi Yp/x l hiu sut to sn phm trờn mt n v sinh khi (nng sut sn xut).
T hai phng trỡnh trờn ta cú:
dx/dt = x/Yp/x
m
dx/dt = àx
Do vy ta cú: = à.Yp/x (2.11)
Nh vy tc sn xut c trng ph thuc vo à, v t giỏ tr cao nht khi à = àmax.

14


3. Phương pháp lên men liên tục
Khác với các giai đoạn trong nuôi cấy theo mẻ (gồm 4 pha riêng biệt lag phase,
log phase, phase ổn định và phase suy vong), đối với nuôi cấy liên tục, log phase được
duy trì bằng cách bổ sung nguyên liệu vào nồi lên men và quá trình này được lặp đi lặp
lại cho đến khi nồi lên men đầy. Trong nhiều trường hợp, người ta lắp đặt thêm hệ
thống thông lưu nhằm giữ mực (thể tích) của dịch lên men trong nồi luôn ở mức độ ổn
định cao nhất, và khi đó tốc độ nạp liệu và tốc độ chiết dịch được cân bằng, nồng độ tế
bào trong nồi lên men phụ thuộc vào tốc độ nạp liệu.
Ta có:
D = F/V
(2.12)
Trong đó, F: tốc độ nạp liệu (KL/hr), V là thể tích dịch lên men trong nồi (KL), D là độ
pha loãng (giờ-1).
Sự thay đổi mật độ tế bào trong dịch lên men có thể biểu diễn:
dx/dt = growth – output
dx/dt = µx – Dx
(2.13)
Trong điều kiện ổn định, nồng độ tế bào trong dịch không đổi, dx/dt = 0.
Lúc đó: µ = D
(2.14)
Tốc độ tăng trưởng đặc trưng phụ thuộc vào độ pha loãng và như vậy trong nuôi
cấy liên tục thì µ ≤ µmax.
Trong một số trường hợp, người ta dùng D để kiểm soát µ. Tăng trưởng của vi
sinh vật trong nuôi cấy liên tục được điều khiển bởi các chất trong thành phần của môi
trường nuôi cấy. Lên men theo cách này còn được gọi là chemostat. Theo Monod ta có:
µ = µmax s /(Ks+ s ) (2.15)
Ở trạng thái cân bằng, D = µ, nên D = µmax s r/(Ks+ s r), s r: nồng độ cơ chất ở

trạng thái cân bằng.
s = KsD/(µmax - D) (2.16)

Như vậy, nồng độ cơ chất còn lại phụ thuộc vào độ pha loãng. Trong thực tế,
điều này xảy ra do sự tăng trưởng của tế bào làm cạn kiệt nguồn dinh dưỡng khi mà
nguồn cung cấp cho tăng trưởng ngang bằng với độ pha loãng. Nếu tốc độ sử dụng cơ
chất của vi sinh vật nhỏ hơn tốc độ nạp liệu cho sự tăng trưởng tế bào thì một số đặc
điểm sau sẽ xảy ra: Tốc độ tăng trưởng của tế bào nhỏ hơn tốc độ pha loãng, và do vậy
tế bào sẽ bị chiết ra khỏi nồi lên men với tốc độ cao hơn tốc độ mà chúng được sinh ra.
Điều này gây nên suy giảm mật độ tế bào trong nồi lên men. Nồng độ cơ chất trong nồi
lên men sẽ tăng dần vì trong nồi lên men còn ít tế bào hơn để sử dụng. Khi nồng độ cơ
chất cao hơn, tốc độ tăng trưởng của vi sinh vật tăng lên và cao hơn tốc độ pha loãng
và khi đó, sinh khối tăng dần lên và trong trường hợp này thì trạng thái ổn định mới
được thiết lập.
15


Hình 2. 3: Sơ đồ hệ thống lên men liên tục.
(A): Hệ thống lên men liên tục đơn tầng, không hồi lưu sinh khối;
(B): Hệ thống lên men liên tục đơn tầng, hồi lưu sinh khối;
(C): Hệ thống lên men liên tục đa tầng.
Do vậy, người ta còn gọi chemostat là hệ thống nuôi cấy tự cân bằng theo giới
hạn dinh dưỡng, và có thể duy trì trong một giới hạn rộng của tốc độ tăng trưởng đặc
trưng phụ (sub- µmax).
Nồng độ tế bào trong nuôi cấy liên tục ở giai đoạn cân bằng ( x ) có thể được
biểu diễn:
x = Y(si + sf - sr)

(2.17)

Phương trình tạo sản phẩm:
16


Sự thay đổi nồng độ sản phẩm = (tổng sản phẩm – lượng sản phẩm đã chiết);
dp/dt = ρ.x - Dp
(2.18)
Ở giai đoạn ổn định, dp/dt = 0. Khi đó:
p = ρ. x /D

(2.19)

trong đó p là nồng độ sản phẩm ở giai đoạn ổn định. Trong nuôi cấy liên tục, người ta
còn chia ra nhiều kiểu nuôi cấy khác nhau:
1. Nuôi cấy dạng đa hệ thống: Dịch chiết ra từ hệ thống lên men này được đưa
ngay vào một hệ thống lên men khác. Ưu điểm của phương pháp này là có thể thay đổi
được nguồn nguyên liệu ở các giai đoạn khác nhau trong quá trình lên men.
2. Phương pháp hồi lưu tế bào vi khuẩn trong quá trình lên men: Dịch chiết ra
trong quá trình lên men ngoài sản phẩm còn chứa một lượng rất lớn tế bào vi khuẩn.
Nếu lượng tế bào này được thu hồi và tái bổ sung vào hệ thống lên men thì sẽ tăng
cường được sản lượng của hệ thống. Có thể dùng phương pháp lọc hay ly tâm tách tế
bào rồi cho hồi lưu vào hệ thống. Tuy nhiên, rất khó thực hiện việc hồi lưu toàn bộ tế
bào theo dịch chiết và vấn đề chống tạp nhiễm đối với hệ thống theo kiểu này cũng là
một trở ngại lớn.
4. Phương pháp lên men mẻ-bổ sung (fed-batch)
Lên men mẻ-bổ sung là phương pháp nuôi cấy mà nguyên liệu được bổ sung
vào nồi lên men liên tục hoặc gián đoạn, dịch lên men có thể được chiết ra trong quá
trình nuôi cấy. Ban đầu nuôi cấy theo mẻ, sau đó nguyên liệu được nạp vào nồi lên
men. Các cơ chất khi được bổ sung vào môi trường đang nuôi cấy có thể là (1) giống
như thành phần môi trường ban đầu hoặc chỉ một số cơ chất giới hạn. Đối với cơ chất

giới hạn khi bổ sung vào có thể (2) nồng độ tương đương với môi trường ban đầu, hoặc
(3) cao hơn hoặc (4) rất đậm đặc. Hệ thống mẻ-bổ sung theo cách (1), (2) gọi là mẻ-bổ
sung thay đổi thể tích; theo cách (3), (4) gọi là hệ thống mẻ-bổ sung cố định thể tích.
4.1. Lên men mẻ-bổ sung thay đổi thể tích
Động học của hệ thống này được mô tả lần đầu bởi Pirt (1975), được xem xét
như hệ thống nuôi cấy mẻ nhưng bị giới hạn bởi nồng độ của một cơ chất. Sinh khối tại
bất kỳ thời điểm nào trong quá trình nuôi cấy được trình bày theo phương trình:
xt = xo + Y(si - sr) (2.20)
trong đó xo là nồng độ giống nạp vào hệ thống.
Khi sr = 0 và xt = xmax; do x0 << xmax
xmax = Y.si
(2.21)
Nếu tại thời điểm sr = 0, môi trường được bổ sung vào với D < µmax thì toàn bộ
môi trường vừa mới được bổ sung sẽ được sử dụng ngay (ds/dt = 0), và ta có:
F.si = µ.(X/Y)
(2.22) với X = x.V.
17


Hình 2. 4. Sơ đồ tệ thống lên men mẻ-bổ sung.
(A): Lên men mẻ-bổ sung giới hạn thể tích
(B): Lên men mẻ-bổ sung không giới hạn thể tích
Theo cách này, tổng sinh khối sẽ tăng dần trong khi đó nồng độ tế bào hầu như
không tăng (dx/dt = 0), do vậy µ = D. Đây được xem như là trạng thái cân bằng. Khi
thể tích dịch lên men trong nồi tăng, tỷ lệ pha loãng giảm xuống, và như vậy:
D = F/(V0 + F.t)
(2.23)
Theo phương trình Monod, Khi sr giảm thì D sẽ giảm, do vậy sẽ x tăng lên. Tuy
nhiên trong hệ thống nuôi cấy mẻ-bổ sung thì ở bất kỳ giá trị nào của µ thì si >> Ks nên
trong thực tế sr thay đổi rất nhỏ. Do vậy, ở trạng thái được coi như là cân bằng ổn định

thì D < µmax và Ks << si.
Sự thay đổi nồng độ sản phẩm trong hệ thống này tương tự như trong nuôi cấy
liên tục được biểu diễn theo cân bằng:
dp/dt = ρx – Dp
(2.24)
Ở trạng thái cân bằng tức là lượng sản phẩm sinh ra cân bằng với độ pha loãng
do nạp dịch bổ sung vào thì nồng độ sản phẩm trong hệ thống sẽ không thay đổi, dp/dt
= 0, khi đó:
p = ρ.x/D
(2.25)
4.2. Lên men mẻ-bổ sung không thay đổi thể tích
Theo Pirt (1979), cơ sở của hệ thống này được xem như trong trường hợp nuôi
cấy mẻ trong đó do sự tăng trưởng của chủng đã gây nên sự cạn kiệt cơ chất giới hạn
đạt đến một mức nhất định. Sau đó cơ chất này được bổ sung với nồng độ cao, không
làm thay đổi đến thể tích dịch lên men. Động học trong hệ thống này được mô tả như
sau:
18


dx/dt = GY (2.26)
trong đó G là tốc độ nạp cơ chất.
Do dx/dt = µx, nên:
GY = µx
µ = GY/x
(2.27)
Nếu GY/x < µmax thì khi bổ sung cơ chất vào chúng sẽ được sử dụng ngay, lúc
đó ds/dt = 0. Tuy nhiên do dx/dt > 0 vì x và X tăng theo thời gian nên:
(2.28)
xt = x0 + GYt
Trong đó x0, xt là nồng độ tế bào khi bắt đầu và sau khi vận hành hệ thống mẻ-bổ sung

được t giờ nuôi cấy.
Khi x tăng lên, µ giảm dần. Nồng độ của chất giới hạn hầu như không thay đổi,
sinh khối tăng dần và nồng độ các chất không giới hạn trong môi trường giảm dần.
Sự cân bằng sản phẩm trong hệ thống này được biểu diễn như sau:
dp/dt = ρxt
(2.29)
dp/dt = ρ (x0 + GYt)
(2.30)
5. Lên men mật độ cao
Như đã đề cập trong phương pháp lên men mẻ, tổng lượng sinh khối sinh ra
trong quá trình lên men là từ nguồn dinh dưỡng nhất định trong môi trường chuẩn bị
ban đầu. Nồng độ các thành phần môi trường được thiết kế để bảo đảm tốc độ tăng
trưởng là tốt nhất. Do vậy, để tăng mật độ tế bào cần phải bổ sung dinh dưỡng trong
quá trình nuôi cấy và như vậy, lên men mật độ cao chỉ có thể đạt được trong trường
hợp nuôi cấy mẻ-bổ sung và thành phần bổ sung vào phải có nồng độ cao để thể tích
dịch lên men hoặc không thay đổi hoặc thay đổi ít.
Trong lên men sản xuất công nghiệp, cho dù sản phẩm sinh ra là nội bào hay
ngoại bào, với một điều kiện thích hợp thì chủng nuôi cấy sẽ có một giá trị về tốc độ
sản xuất đặc trưng (ρ) nhất định:
ρ = (P/X)/t (2.31)
P = ρ.X.t
(2.32)
trong đó P là tổng lượng sản phẩm thu được sau thời gian nuôi cấy t, X là tổng lượng
sinh khối tham gia sản xuất. Từ phương trình trên ta thấy, để thu được P nhiều, cần
phải tăng X.
X = x.V
(2.32)
với V là thể tích dịch lên men, x là nồng độ tế bào trong dịch lên men. Do thể tích dịch
lên men bị giới hạn bởi dung tích nồi lên men nên để đạt X cao cần phải tăng nồng độ
tế bào x trong quá trình lên men.

Vấn đề đặt ra là làm thế nào để tăng nồng độ tế bào và nồng độ tế bào này có thể
tăng được tới mức nào? Chúng ta sẽ đề cập vấn đề này trong những chuyên đề sau.
19


CHƯƠNG 3.

SƠ ĐỒ LƯU TRÌNH HỆ THỐNG LÊN MEN CÔNG
NGHIỆP

1. Giới thiệu
Trong phần này, chúng ta tập trung phân tích qui trình lên men công nghiệp theo
phương pháp chìm, hiếu khí, có kiểm soát vì đây là qui trình bao gồm đầy đủ các thành
tố của một qui trình lên men tiêu chuẩn. Qui trình này thường bao gồm các công đoạn
sau:
- Giữ giống
- Hoạt hóa giống
- Nhân giống (sơ cấp, thứ cấp)
- Lên men sản xuất
- Thu hồi sản phẩm lên men
- Xử lý các chất thải sinh ra trong quá trình sản xuất sản phẩm lên men
Tùy theo chủng vi sinh vật, yêu cầu của sản phẩm mục tiêu và hệ thống công
nghệ thiết bị mà điều kiện của từng bước trong qui trình lên men có thể khác nhau. Tuy
nhiên, để đảm bảo được hiệu quả sản xuất tốt và ổn định nhất thì toàn bộ các hoạt động
có liên quan đến lên men có một đặc điểm chung là cần được thực hiện trong điều kiện
có kiểm soát vô trùng.
Nếu không đề cập đến các yếu tố về kiểu nồi lên men, một hệ thống lên men căn
bản bao gồm sáu thành tố sau:
1. Công thức môi trường sử dụng trong qui trình nuôi cấy vi sinh vật từ giai
đoạn nhân giống cho đến giai đoạn lên men sản xuất.

2. Điều kiện vô trùng của môi trường nuôi cấy, nồi lên men và các thiết bị liên
quan trong hệ thống.
3. Bảo đảm nhân giống đủ số lượng với độ thuần nhất và chất lượng cao trước
khi nạp vào nồi lên men chính.
4. Sự tăng trưởng của chủng vi sinh vật trong sản xuất dưới điều kiện tối ưu để
tạo thành các sản phẩm mong muốn.
5. Chiết tách, tinh sạch và kết tinh sản phẩm.
6. Xử lý chất thải của quá trình sản xuất.
Các yếu tố này liên quan chặt chẽ với nhau theo một qui trình được mô tả trong
Hình 3. 2. Từng yếu tố độc lập có thể được nghiên cứu cải tiến phù hợp để cuối cùng
nâng cao hiệu quả sản xuất của toàn hệ thống.
Trước khi tiến hành xây dựng hệ thống lên men cần phải chọn lọc chủng giống
vi sinh vật bảo đảm sinh tổng hợp đúng sản phẩm mong muốn với hàm lượng cao. Việc
chọn lọc chủng giống thường được thực hiện bởi các phòng nghiên cứu có năng lực và
20


kinh nghiệm trong lĩnh vực phát triển chủng giống. Ngoài ra, cần phải thực hiện đánh
giá hiệu quả và tính ổn định của chủng trước khi đưa vào ứng dụng cho sản xuất. Việc
tuyển chọn chủng giống phục vụ sản xuất công nghiệp dựa trên một số tiêu chí sau:
- Đặc tính dinh dưỡng của chủng (dùng cơ chất thông dụng, rẻ tiền)
- Nhiệt độ tối thích của chủng (chọn chủng có nhiệt độ tối thích cao, giảm chi
phí hệ thống giải nhiệt trong lên men công nghiệp)
- Tính ổn định của chủng trong quá trình sử dụng
- Năng suất sinh tổng hợp sản phẩm cao
Dựa vào loại sản phẩm lên men và các yêu cầu về độ tinh sạch của sản phẩm, hệ
thống thu hồi chiết tách và tinh sạch sản phẩm được thiết kế để bảo đảm hiệu suất thu
hồi cao, đạt tiêu chuẩn như mong muốn. Trong quá trình vận hành sản xuất, cả ba yếu
tố chính: chủng giống, qui trình lên men, qui trình thu hồi cần phải được nghiên cứu cải
tiến liên tục nhằm thu nhận được nhiều sản phẩm với chất lượng cao.

Chủng giống vi sinh vật được thu thập (phân lập, tuyển chọn) và phân phối từ
các trung tâm lưu trữ giống danh tiếng trên thế giới (Xem phụ lục 4).
2. Các công đoạn của qui trình lên men
2.1. Giữ giống
Việc giữ giống có vai trò rất quan trọng đối với một qui trình lên men nhằm bảo
đảm được nguồn cung cấp giống ổn định cho nghiên cứu và sản xuất.
Quá trình giữ giống cần phải bảo đảm một số yêu cầu sau:
- Duy trì hoạt tính giống trong thời gian dài, không xảy ra hiện tượng thoái hóa
giống, giảm khả năng tăng trưởng hoặc/và giảm năng lực sản xuất của giống.
- Không bị tạp nhiễm
Các phương pháp giữ giống khác nhau trong công nghiệp bao gồm:
a. Giữ giống ở nhiệt độ thấp
a1. Giữ giống trên môi trường thạch nghiêng. Giống vi sinh vật có thể được giữ
trên bề mặt môi trường thạch nghiêng (đối với các chủng hiếu khí) với nhiệt độ giữ
giống từ –20 ~ 50C. Trong quá trình giữ giống, phải cấy chuyền theo chu kỳ khoảng 6
tháng một lần. Phương pháp cấy chuyền tuy đơn giản nhưng lại có những nhược điểm
sau:
+ Dễ bị tạp nhiễm và dễ mất chủng giống gốc.
+ Tốn nhiều công sức cấy chuyền.
+ Giống gốc có thể mất do sai sót khi dùng môi trường cấy chuyền không thích
hợp.
+ Chủng vi sinh vật có thể bị thay đổi các đặc điểm sinh học do đột biến phát
sinh qua nhiều lần cấy chuyền.
21


+ Phải nghiên cứu, theo dõi môi trường và thời gian cấy chuyền thích hợp đối
với các chủng bảo quản.
+ Mất hay nhầm lẫn nhãn hiệu giữa các chủng trong quá trình bảo quản.
Để khắc phục nhược điểm của phương pháp cấy chuyền, giúp giữ giống trong

thời gian dài người ta thường giữ giống trên bề mặt môi trường thạch nghiêng có phủ
một lớp dầu bảo vệ, thời gian giữ giống có thể kéo dài đến 1 năm.
a2. Giữ giống trong nitơ lỏng (đông sâu). Khi giữ giống ở nhiệt độ thấp (-150 ~
o
-196 C), hoạt động biến dưỡng của vi sinh vật giảm hẳn, hầu hết các phản ứng sinh hoá
đều không xảy ra, các phân tử nước tồn tại ở dạng liên kết hoặc tinh thể. Đây là
phương pháp giữ giống khá an toàn cho nhiều loài vi sinh vật khác nhau như vi khuẩn,
nấm mốc, nấm men, virus, tảo và cả tế bào động vật, thực vật. Tuy nhiên khi giữ giống
bằng phương pháp này thì tế bào có thể bị phá vỡ và làm tan mẫu trong quá trình bảo
quản lạnh do tích luỹ các chất điện giải và hình thành các tinh thể nước trong tế bào.
Thông thường người ta cho chủng vi sinh vật cần giữ phát triển đến phase ổn định, bổ
sung chất bảo vệ (thường là glycerol 10%; DMSO: dimethyl sulfoxide), sau đó làm
lạnh và giữ. Bên cạnh đó, sử dụng phương pháp này khá tốn kém cho thiết bị, nguồn
nitơ lỏng và một số rủi ro về vấn đề an toàn như cháy nổ.

Hình 3. 1. Hệ thống bình nitơ lỏng dùng để giữ giống.
b. Giữ trong điều kiện khử nước
b1. Nuôi cấy khô. Phương pháp này thường được áp dụng đối với bào tử nấm
sợi. Các bước tiến hành bao gồm ủ đất vô trùng với bào tử nấm khoảng vài ngày cho

22


phát triển, làm khô ở nhiệt độ phòng khoảng 2 tuần, sau đó cất giữ ở điều kiện không
khí khô hoặc tủ lạnh.
b2. Giữ ở điều kiện khử nước trong giá thể
+ Giữ giống trong cát
Phương pháp này thường dùng để giữ các vi sinh vật có bào tử. Các bước tiến
hành như sau: Cát sông được đem rửa sạch bằng nước nhiều lần, sấy khô, rây để bỏ các
hạt lớn; xử lý ngâm trong HCl đậm đặc sau đó đem đun sôi 1-2 giờ, rửa nhiều lần cho

đến khi pH đạt trung tính, có thể trung hòa bằng NaOH hoặc NaHCO3 nếu pH còn
thấp; sấy khô 100oC từ 3 - 4 giờ; chia cát khô vào các ống nghiệm và thanh trùng trong
tủ sấy 160 - 180oC từ 2-3 giờ hoặc thanh trùng trong autoclave 130oC trong 90 phút.
Trước khi sử dụng phải kiểm tra độ vô trùng bằng cách cho môi trường LB vào cát đã
vô trùng, nếu môi trường vẫn trong sau 48 giờ nuôi trong tủ ấm nghĩa là cát không
chứa các vi sinh vật lạ nên có thể dùng; nếu môi trường bị đục thì phải đem cát thanh
trùng lại. Chuẩn bị bào tử: các chủng vi sinh vật được nuôi trên môi trường agar thích
hợp để tạo nhiều bào tử, thời gian thường đối với một số loài như sau: vi khuẩn 7 ngày,
nấm mốc 7-8 ngày, xạ khuẩn 14 ngày; Trộn bào tử vào cát: cho 1-2g cát đã vô trùng
vào ống giống vi sinh vật đã hình thành bào tử dùng que cấy trộn đều bào tử với cát,
tránh làm cát bị ướt quá vón cục, cho cát đã có bào tử vào ống nghiệm vô trùng, đậy
nút bông và cho vào tủ sấy, giữ ở 40oC hoặc tủ sấy chân không có chất hút ẩm như
CaCl2 trong thời gia 2-3 ngày cho đến khi cát thật khô, dùng paraffin đặc đun nóng
chảy phết lên nút bông để tránh trường hợp hút ẩm trở lại, bảo quản trong phòng mát,
hoặc trong tủ lạnh 4oC, thời gian bảo quản từ 1 đến nhiều năm, giống trước khi dùng
được cấy ria trên môi trường thạch và chọn các khuẩn lạc điển hình.
+ Giữ giống trong đất
Một số vi sinh vật có bào tử Clostridium pastetianum thường được bảo quản tốt
trong đất. Các bước tiến hành: đất vườn đem nghiền nhỏ, rây lấy những hạt nhỏ bằng
nhau cỡ 1 mm. Nếu đất chua thì cần bổ sung 1-2% CaCO3 và thêm cát hoặc than hoạt
tính khoảng 2% để làm cho đất được tơi xốp. Cho vào mỗi ống nghiệm vô trùng
khoảng 1-2 g đất, đậy nút bông, thanh trùng 121oC trong 1 giờ với 2 lần liên tiếp mỗi
lần cách nhau 24 giờ. Cần phải kiểm tra vô trùng trước khi đem trộn với bào tử vi sinh
vật, sấy khô, bảo quản như phương pháp bảo quản trong cát. Thời gian bảo quản có thể
đến 10 năm.
+ Giữ giống trên silicagel
Cách làm: Silicagel nghiền mịn cỡ 1 mm, phương pháp tương tự như giữ giống
trên cát.
+ Giữ giống trên hạt ngũ cốc
Các hạt như lúa, ngô, kê… đều có thể được sử dụng để giữ giống vi sinh vật.

Cách làm: chọn loại hạt tốt, loại bỏ tạp chất, rửa sạch cho vào nước sôi theo tỷ lệ 100g
hạt / 30 ml nước sôi, khuấy đều, ngâm 30 phút, lọc bỏ nước, rải hạt lên khay sạch để
23


ráo nước, cho vào bình tam giác khoảng 15-16g/ bình 250ml, đậy nút bông, thanh trùng
121oC trong 40 phút, 3 lần, mỗi lần cách nhau 24 giờ. Bào tử của vi sinh vật đem hòa
vào nước vô trùng, dùng pipet cấy vào mỗi bình 3 ml, lắc đều nuôi ở nhiệt độ thích hợp
cho từng loại chủng trong thời gian 8-10 ngày, hằng ngày lắc nhẹ để phá vỡ các khối
hạt bết lại, làm khô trong tủ hút chân không cho đến khi độ ẩm còn khoảng 8%. Kiểm
tra độ thuần khiết và khả năng sống của giống trước khi dán paraffin trên nút bông và
bảo quản trong phòng mát.
b3. Phương pháp đông khô. Làm đông một dung dịch tế bào trong điều kiện
chân không, kéo theo sự thăng hoa của các phân tử nước. Huyền phù dịch nuôi cấy
được trong các môi trường bảo vệ như sữa, serum, hoặc glutamate natri, sau đó làm
đông khô và giữ trong tủ lạnh. Thời gian bảo quản có thể đến hơn 10 năm. Ưu điểm
của phương pháp này là tỷ lệ sống sót của vi sinh vật rất cao, các đặc tính di truyền của
vi sinh vật không bị biến đổi và thời gian giữ giống được kéo dài khá lâu, ít tốn công
sức để cấy chuyền nhiều lần.
Cách làm: nuôi vi sinh vật trên các môi trường thích hợp cho đến phase log, thu tế bào
và trộn với các chất bảo vệ, dùng pipet vô trùng phân từng 0,2 ml huyền phù vi sinh vật
vào các ống đông khô chuyên dùng, cho các ống giống vi sinh vật đã chuẩn bị vào làm
lạnh trong băng khô cacbonic + cồn etylic ở nhiệt độ -70oC đến -80oC, trong khoảng 15 phút. Tiếp theo đưa vi sinh vật vào làm khô trong thiết bị đông khô ở áp suất thấp,
thời gian làm khô tùy thuộc vào thiết bị và số lượng giống cần làm khô, trung bình 814 giờ, độ ẩm sau khi làm khô còn lại 1-4% . Để xác định độ ẩm còn lại người ta dùng
chất chỉ thị là CoCl2 tẩm trên các miếng giấy lọc, sấy khô và bỏ các miếng giấy có tẩm
CoCl2 vào các ống nghiệm kiểm tra, nếu giống đã được làm khô thì giấy có màu xanh
còn nếu độ ẩm còn thì miếng giấy sẽ có màu hồng. Các ống giống khi đã khô được hàn
kín để tránh bị ẩm trở lại và có thể bảo quản ở nhiệt độ phòng hoặc trong tủ lạnh. Một
số chất bảo vệ được trộn vào giống vi sinh vật để khi đông khô tế bào không bị chết do
sự hình thành các tinh thể nước cũng như chống các quá trình oxy hóa… Ví dụ trong

trường hợp giữ giống vi khuẩn Lactobacillus bằng phương pháp đông khô, các dung
dịch bảo vệ thường được dùng:
Glutamat 3%
Lactose 8% + pepton 1,2%
Vitamin C 0,5 % + thiourea 0,5% + NH4Cl 0,05%
Sacchrose 8% + sữa 5% + getalin 1,5%

24


N u o õi c a ỏy
g io ỏn g g o ỏc
(5 -1 0 m L )

N g u y e õn lie ọu

N u o õi c a ỏy la ộc
( 2 0 0 -1 0 0 0 m L )

M o õi trử ụ ứn g
T h a n h tru ứn g
M

N o i n u o õ i
c a ỏy m a m
(1 0 -1 0 0 L )

L y ta õm /lo ùc

S in h k h o ỏi

M

Dũch sau nuoõi caỏy

K h ớ v a ứo

D ũc h n o ói

X ử ỷ ly ự n ử ụ ực th a ỷi
C h ie ỏt x u a ỏt s a ỷn

p h a ồm

T in h c h e ỏ s a ỷn p h a ồm
ẹ o ựn g g o ự i
N o i le õn
s a ỷn x u a ỏt
(> 1 0 0 0 L )

T h a ứ n h p h a ồm

Hỡnh 3. 2. S lu trỡnh h thng lờn men trong cụng nghip.
2. 2. Hot húa ging
25


Hoạt hoá giống là bước rất quan trọng nhằm mục đích khôi phục lại hoạt tính
sau thời gian giữ giống. Phương pháp cấy chuyền thường được sử dụng để hoạt hoá
giống bằng cách cấy giống trên môi trường thạch nghiêng trong ống nghiệm hoặc trên

đĩa thạch, ủ ở nhiệt độ thích hợp đến khi vi sinh vật phát triển thành một lớp trên mặt
thạch. Môi trường sử dụng phải bảo đảm giàu dinh dưỡng, độ pH tối ưu; điều kiện nuôi
cấy như nhiệt độ, độ thoáng khí phải thích hợp cho sự tăng trưởng của chủng. Các
điểm cần lưu ý trong công đoạn này bao gồm:
- Bề mặt thạch cần phải đảm bảo độ ẩm nhất định, không được quá khô vì như
thế sẽ gây ảnh hưởng đến sự phát triển của chủng sau khi được cấy ria lên mặt thạch.
- Trong quá trình cấy ria, cần phải bảo đảm ria đều (theo đường zic-zăc) trên
mặt thạch, không ria quá gần mép thạch nghiêng vì ở đây lớp thạch mỏng, khô không
thích hợp cho sinh khối tế bào khi khuẩn lạc phát triển lớn.
- Cần phải kiểm soát tốt thời gian ủ để đạt được lượng sinh khối với hoạt tính tối
ưu và ổn định. Tránh trường hợp ủ thời gian quá dài, sinh khối tế bào phát triển quá
nhiều (over growth), lớp tế bào trên cùng của khuẩn lạc không được tiếp xúc trực tiếp
với dinh dưỡng của môi trường thạch trong thời gian dài sẽ ảnh hưởng đến chất lượng
của giống sau này.
2.3. Nhân giống
Mục đích của nhân giống là tạo một lượng sinh khối đủ lớn để đưa vào qui trình
sản xuất. Quá trình nhân giống thường dừng lại ở giai đoạn cuối của log phase, khi đó
hoạt tính của giống là tốt nhất. Quá trình nhân giống thường chia thành hai giai đoạn:
a. Nhân giống sơ cấp
Công đoạn nhân giống sơ cấp thường được thực hiện trong phòng nhân giống
(phòng clean room) ở qui mô 100-500ml với thiết bị sử dụng có thể là:
1. Máy lắc với bình tam giác có thể tích phải gấp tối thiểu 4 lần thể tích dịch
nuôi cấy để bảo đảm đủ không gian để lắc trộn dịch nuôi cấy và cung cấp đủ lượng oxy
cần thiết. Tốc độ lắc là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến tăng trưởng của chủng
trong quá trình nhân giống. Nếu lắc ở tốc độ thấp sẽ không bảo đảm cung cấp đủ độ
hòa tan oxy tốt trong dịch nuôi cấy, chủng sẽ phát triển chậm. Nếu lắc ở tốc độ quá
nhanh, dịch nuôi cấy sẽ tiếp xúc với phần nút bông (cotton plug) làm ẩm ướt nút bông
dễ gây ra hiện tượng tạp nhiễm và sẽ cản trở việc trao đổi không khí giữa bên trong và
bên ngoài của bình tam giác. Mặt khác, khi lắc ở tốc độ quá cao, tế bào vi sinh vật sẽ bị
ảnh hưởng bởi những tác động cơ học.

2. Nồi lên men nhân giống với kích thước nhỏ. Hệ thống này có đầy đủ các yếu
tố bảo đảm cho chủng phát triển tốt nhất như độ khuấy trộn, hệ thống cung cấp không
khí, hệ thống hiệu chỉnh pH, nhiệt độ…. Tuy nhiên do có nhiều hệ thống liên quan

26