BÀI GIẢNG THỰC HÀNH VI SINH VẬT ỨNG DỤNG

THỰC HÀNH
VI SINH VẬT ỨNG DỤNG

1


NỘI DUNG

Bài 1: Xác định số lượng vi sinh vật trong một mẫu thực phẩm

Bài 2: Xác định khả năng chuyển hóa hydratcacbon của VSV

Bài 3: Xác định khả năng thủy phân protein và khả năng sinh tổng hợp enzym của vi sinh vật

2


Bài 1: Xác định số lượng vi sinh vật
trong một mẫu thực phẩm

I. Khái quát chung về công tác xác định số lượng VSV
Mục tiêu:
Giúp cho người nghiên cứu biết được mật độ vi sinh vật có trong mẫu thực phẩm là bao nhiêu, phục vụ cho công tác nghiên
cứu (tỷ lệ tiếp giống…), hoặc cho công tác công bố chất lượng thực phẩm
Các phương pháp xác định:
+ Phương pháp xác định trực tiếp
+ Phương pháp xác định gián tiếp

3

Bài 1: Xác định số lượng vi sinh vật
trong mẫu thực phẩm

II. Phương pháp xác định trực tiếp số lượng vi sinh vật
1. Nguyên tắc

-

Sử dụng khung đếm Goriaep (buồng đếm hồng cầu)

4


CẤU TẠO CỦA BUỒNG ĐẾM HỒNG CẦU

2
Đây là phiến kính dày, phần giữa phiến kính có khắc 1 lưới các ô vuông với diện tích là 1mm .

5


CẤU TẠO CỦA BUỒNG ĐẾM HỒNG CẦU

- Lưới khắc chia thành 25 ô vuông lớn  diện tích 1 ô vuông lớn là 1/25
mm

-

2

Mỗi ô vuông lớn lại chia thành 16 ô vuông nhỏ  Số ô vuông nhỏ
trên lưới khắc là 400 ô  diện tích 1 ô vuông nhỏ là 1/400 mm

-

Chiều sâu của mỗi ô là 1/10 mm

6

2


Phương pháp xác định trực tiếp số lượng vi sinh vật

2. Cách tiến hành
- Xác định số lượng tế bào nấm men của men bánh mì khô
- Pha loãng mẫu đến nồng độ 10

-4

- Nhỏ một giọt dịch huyền phù có vi sinh vật vào giữa khung đếm và đậy kín bằng lá kính, di chuyển nhẹ khung đếm làm dịch chiếm đầy các
khoang.
- Đặt khung đếm vào bàn kẹp tiêu bản của kính hiển vi, chọn vật kính 10x hoặc 40x rồi từ từ dùng ốc chỉnh thô đưa bàn kẹp tiêu bản lên trên
để buồng đếm gần chạm vào vật kính.

-

Dùng ốc vi chỉnh từ từ đưa tiêu bản xuống dưới để tìm ảnh và lấy nét. Tiến hành đếm số tế bào trong 5 ô vuông lớn hoặc 20 ô vuông
nhỏ.

7


Phương pháp xác định trực tiếp số lượng vi sinh vật

3. Tính kết quả:
n
3
- N = a. 10 .10 /h.s

-

-n
Trong đó N: số tế bào trong 1 gram men bánh mì; a là số tế bào trung bình trong 1 hình vuông của lưới ở nồng độ pha loãng 10 , h là
chiều sâu của khung đếm; n là độ pha loãng dịch huyền phù; s là diện tích một hình vuông của lưới

-

Lưu ý: số tế bào trong 1 ô lớn không vượt quá 20, số tế bào trong 1 ô nhỏ không vượt quá 10.

8


Bài 1: Xác định số lượng vi sinh vật
trong mẫu thực phẩm

III. Phương pháp xác định gián tiếp số lượng vi sinh vật thông qua phương pháp đếm khuẩn lạc

1.

Nguyên tắc:

Mẫu được đồng nhất và được pha loãng đến nồng độ thích hợp rồi cấy trên môi trường thạch chọn lọc cho từng nhóm, loài VSV.
Xác định số lượng khuẩn lạc trên bề mặt thạch sau thời gian nuôi trong tủ ấm.
Cách đếm: lấy bút chì kẻ 2 đường vuông góc ở đáy hộp petri. Đếm số khuẩn lạc trong từng góc theo thứ tự từ trái qua phải, từ trên
xuống dưới.

9


Phương pháp xác định gián tiếp số lượng vi sinh vật

2. Cách tiến hành:
- Yêu cầu xác định số lượng tế bào nấm men của men bánh mì khô
- Chuẩn bị môi trường Hansen:
+ Thành phần môi trường:
Đường saccarose: 30g/l; Pepton 10 g/l; K2HPO4: 3g/l; MgSO4.7H2O: 2 g/l; Agar: 20g/l; Nước: 1000ml.
0
+ Chuẩn bị 200ml môi trường, khử trùng ở 121 C/15 phút. Sau đó để nguội, đổ vào 9 đĩa petri đã khử trùng.

10


Phương pháp xác định gián tiếp số lượng vi sinh vật

2. Cách tiến hành:

-

Chuẩn bị dãy pha loãng mẫu đến nồng độ 10

-

Cấy dịch mẫu vào các đĩa thạch có chứa môi trường nuôi Hansen, mỗi độ pha loãng cấy vào 3 đĩa, nhỏ 0,1ml dịch vào chính

-6

– 10

-8

0
giữa đĩa thạch, trang đều, ủ ở 28 – 30 C

-

Đếm số khuẩn lạc sau 48h nuôi.

11


Phương pháp xác định gián tiếp số lượng vi sinh vật

3. Tính kết quả:

ΣC
N=
(n1 x f1 + n2 x f2) x v

N: Tổng số vi khuẩn hiếu khí (CFU/g hoặc CFU/ml)

C: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa
ni: Số lượng đĩa cấy tại nồng độ i
fi: Độ pha loãng đĩa i
v: Thể tích dịch (ml) cấy vào mỗi đĩa
12


Bài 1: Xác định số lượng vi sinh vật
trong mẫu thực phẩm
IV. Đặt thí nghiệm cho bài 2

1.

Thí nghiệm lên men rượu:

Chuẩn bị 100ml dung dịch đường saccharose 10% cho vào bình tam giác 250ml, thêm 0,1g nấm men Sac. cerevisiae hòa tan. Lên men ở
nhiệt độ phòng trong 48 h.
2. Thí nghiệm lên men lactic:
Chuẩn bị 100ml sữa tươi vào bình tam giác 250ml. Thêm vào 5g sữa chua. Lên men ở 40độ C trong 6h.
3. Đặt thí nghiệm lên men axetic:
0
Chuẩn bị 100ml bia + 1ml cồn 96 + 15ml dấm ăn vào bình tam giác 250ml. Lên men ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày

13


Bài 1: Xác định số lượng vi sinh vật
trong mẫu thực phẩm

V. Đặt thí nghiệm cho bài 3

1.

Thí nghiệm thủy phân protein

Chuẩn bị 5g thịt vụn + 150ml nước vào bình tam giác 250ml.
Đun sôi cách thủy trong 10 phút.
Để nguội, kiểm tra pH bằng giấy thử pH.
Kẹp 1 miếng giấy thử pH ở miệng bình tam giác để kiểm tra sự bay hơi của khí NH 3.
Ủ ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày.

14


Bài 1: Xác định số lượng vi sinh vật
trong mẫu thực phẩm

V. Đặt thí nghiệm cho bài 3
2.Thí nghiệm thử khả năng sinh tổng hợp enzyme amilase

-

Chuẩn bị môi trường:

+ Thành phần môi trường: NaNO3: 3g/l; K2HPO4: 1g/l; KCl: 0,5g/l; MgSO4.7H20: 0,5g/l; FeSO4: 0,1g/l; Tinh bột tan: 15g/l; Agar:
20g/l; Nước: 1000ml. (Chú ý: Tinh bột tan hòa trong nước ấm cho tan thành dạng hồ rồi mới đổ vào môi trường).
0
+ Chuẩn bị 200ml môi trường, khử trùng ở 121 C/15 phút. Sau đó để nguội, đổ vào 8 đĩa petri đã khử trùng.
- Cấy chấm điểm nấm mốc Aspergillus và Penecillium vào giữa các đĩa: mỗi giống nấm mốc cấy vào 4 đĩa.

15


Bài 2: Xác định khả năng chuyển hóa hydratcacbon của vi sinh vật

1.
-.

Quan sát trạng thái của bình lên men:

-.

Quan sát tế bào nấm men: Làm 1 tiêu bản tươi không nhuộm, quan sát ở vật kính 40X, xác định hình dạng, cách sắp xếp tế bào nấm

Quá trình lên men rượu:

men.

-.

Xác định tỷ lệ nấm men nảy chồi: Làm 1 tiêu bản tươi không nhuộm, quan sát ở vật kính 40X, đếm tổng số tế bào nấm men và số tế
bào nấm men nảy chồi ở 5 trường kính để tính.
Cách làm tiêu bản tươi không nhuộm: Nhỏ 1 giọt dung dịch chứa VSV vào giữa phiến kính, dùng lam kính đậy lại.

16


PHÂN CÔNG CÔNG VIỆC
Bài 1:
-8

-6
-8
Tổ 1: Chuẩn bị dãy pha loãng đến nồng độ 10 ; cấy 3 nồng độ (10 đến 10 ) vào 9 đĩa môi trường Hansen ; đếm số tế bào nấm men
ở nồng độ 10

-4

trong 5 ô lớn, tính kết quả.

Tổ 2: Chuẩn bị 200 ml môi trường Hansen; đổ môi trường Hansen vào 9 đĩa; đếm số tế bào nấm men ở nồng độ 10

-4

trong 20 ô nhỏ,

tính kết quả.

Tổ 3: Chuẩn bị 200 ml môi trường thử khả năng STH enzym amilase; đổ môi trường thử khả năng STH enzym amilase vào 8 đĩa; đếm
số tế bào nấm men ở nồng độ 10

-4

trong 5 ô lớn, tính kết quả.

Tổ 4: Đặt 3 TN của bài 2 và 1 TN thủy phân protein của bài 3; cấy 2 chủng nấm mốc vào 8 đĩa môi trường thử khả năng STH enzym
amilase; đếm số tế bào nấm men ở nồng độ 10

-4

trong 20 ô nhỏ, tính kết quả.

17


Bài 2: Xác định khả năng chuyển hóa hydratcacbon của vi sinh vật

1.
-.

Quá trình lên men rượu:
Xác định tỷ lệ nấm men sống: Làm 1 tiêu bản tươi nhuộm đơn bằng safranin, quan sát ở vật kính 40X, đếm tổng số tế bào nấm men
và số tế bào nấm men sống ở 5 trường kính để tính.
Cách làm tiêu bản tươi nhuộm đơn: Nhỏ 1 giọt dung dịch chứa VSV vào giữa phiến kính, nhỏ tiếp 1 giọt thuốc nhuộm safarnin,
trộn đều, dùng lam kính đậy lại, đếm trong vòng 3 phút.
Lưu ý: Tế bào nấm men sống không bắt màu, tế bào nấm men chết bắt màu của thuốc nhuộm

18


Bài 2: Xác định khả năng chuyển hóa hydratcacbon của vi sinh vật

2.
-.
-

Quá trình lên men lactic :
Quan sát trạng thái của bình lên men:
Xác định lượng axit lactic tạo thành: Cân 10g sữa chua vào bình tam giác 250ml, thêm 20ml nước, thêm 1-2 giọt
phenolphtalein, chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N .
1ml NaOH 0.1N = 0,009g lactic

-.

Quan sát vi khuẩn lactic: làm 01 tiêu bản cố định nhuộm Gram để quan sát: hình dạng, cách sắp xếp, loại Gram của các
chủng vi khuẩn lactic trong sữa chua

19


Bài 2: Xác định khả năng chuyển hóa hydratcacbon của vi sinh vật

2.
-.
-

Quá trình lên men axetic :
Quan sát trạng thái của bình lên men
Xác định lượng axit axetic tạo thành: Hút 10ml dịch lên men axetic vào bình tam giác 250ml, thêm 20ml nước, thêm 1-2
giọt phenolphtalein, chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N .
1ml NaOH 0.1N = 0,006g axetic

-.

Quan sát vi khuẩn axetic: làm 01 tiêu bản cố định nhuộm Gram để quan sát: hình dạng, cách sắp xếp, loại Gram của các
chủng vi khuẩn axetic trong dịch lên men.

20


Các bước nhuộm gram

Các bước nhuộm Gram

-

Cố định vết bôi: Đặt 1 giọt nước cất lên giữa phiến kính, lấy 1 vòng que cấy tròn sinh khối vi sinh vật hòa đều vào giọt nước cất
(hoặc lấy 1 giọt dung dịch chứa vi sinh vật đặt lên giữa phiến kính), dàn mỏng, hong khô.

-

Nhỏ dd Crystal violet (tím) thấm ướt hết giấy lọc. Để từ 1 – 2 phút ( nếu vi khuẩn lấy từ canh lỏng để 2 phút, lấy từ thạch
dinh dưỡng để 1 phút ). Rửa nước (trong 5 giây), hong khô. 

-

Tẩy lugol: Nhỏ dung dịch lugol (KI + I2) trùm lên vết thuốc nhuộm, giữ trong 1 phút, đổ dung dịch lugol đi.
- Tẩy cồn 96: 15 – 30 giây (vi khuẩn lấy từ canh lỏng tẩy 15 giây, từ thạch dinh dưỡng tẩy 30 giây ). Rửa nước, thấm (hong) khô.
Tẩy cồn bằng cách để nghiêng tiêu bản, cho cồn chảy từ từ ở mép trên phiến kính. Quan sát ở mép dưới cho đến khi giọt cồn vừa
mất màu tím. 

22


Các bước nhuộm Gram

-

Đặt miếng giấy lọc lên vết bôi, nhuộm lần 2 bằng cách nhỏ dung dịch safranin  kiềm loãng (màu hồng) để 1 phút. Rửa nước,
thấm (hong) khô tiêu bản. 

-

Quan
Vi

sát
khuẩn

bằng
G

vật
(+)

bắt

kính
màu

dầu,
tím

độ
Crystal

phóng
violet,

đại

vi

100
khuẩn

lần. 
G

bắt màu hồng.

-

Chú ý: Trước mỗi lần nhỏ thuốc nhuộm lên tiêu bản, phải đặt miếng giấy lọc phủ lên vết bôi. Sau mỗi lần nhuộm đều phải rửa
nước và thấm (hong) khô tiêu bản. 

23

(–)


Bài 3: Xác định khả năng thủy phân protein và khả năng sinh tổng hợp enzym của vi sinh vật

1.
-.
-.

Xác định khả năng thủy phân protein của VSV
Quan sát hiện tượng
Xác định định tính :

So sánh giá trị pH ở thời điểm đặt thí nghiệm và thời điểm đọc kết quả.

-.

Quan sát vi khuẩn gây thối rữa protein:
Làm 01 tiêu bản cố định nhuộm Gram từ dịch thủy phân để xác định: Hình dạng của các loài vi khuẩn, so sánh tỷ lệ vi khuẩn
G(+) và G(-) trong tiêu bản.

24


Bài 3: Xác định khả năng thủy phân protein và khả năng sinh tổng hợp enzym của vi sinh vật

2. Xác định khả năng sinh tổng hợp emzym amilaza

-

Thuốc thử: Dùng dung dịch Lugol (I2 và KI) đổ vào đĩa thạch có chứa tinh bột tan đã nuôi nấm mốc.

-

Xác định định tính khả năng sinh enzym amilase của VSV:
Xác định đường kính khuẩn lạc: d (mm)
Xác định đường kính vòng môi trường đã bị thủy phân: D (mm)
Hiệu số D – d là đại lượng định tính để xác định khả năng sinh enzym của vi sinh vật
So sánh khả năng sinh enzym amilase của 2 loài nấm mốc đã sử dụng

25