bài giảng thực hành vi sinh ứng dụng

1

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.HCM
KHOA MÔI TRƯỜNG & CÔNG NGHỆ SINH HỌC






BÀI GIẢNG
THỰC HÀNH
VI SINH ỨNG DỤNG

Biên soạn: TS. Nguyễn Hoài Hương











2

- 2009 -
3

Giới thiệu môn học
Môn thực hành vi sinh ứng dụng nhằm giúp sinh viên làm quen với các phương pháp phân lập, khảo
sát các vi sinh vật được ứng dụng trong xử lý môi trường, công nghệ lên men . Các vi sinh ứng
dụng thường được phân lập từ môi trường tự nhiên, chúng có khả năng sử dụng các cơ chất khác
nhau, chuyển hóa vật chất trong tự nhiên. Nguồn phân lập chúng có thể từ đất, nước, động vật, thực
vật hay thực phẩm. Phân lập, xác định chức năng, định danh chúng là bước đầu đưa chúng vào ứng
dụng.
Trong khuôn khổ bài thực hành môn vi sinh ứng dụng sinh viên phân lập vi sinh vật chủ yếu từ môi
trường đất. Đất là một trong những cơ chất thuận lợi nhất đối với sự phát triển của các loại vi sinh
vật khác nhau. Số lượng vi sinh trong 1 g đất có tới hàng trăm triệu, thậm chí hàng tỉ tế bào. Hoạt
động sống của vi sinh vật đất có liên quan đến nhiều quá trình xảy ra trong đất, trước hết là các
vòng tuần hoàn của vật chất trong tự nhiên như chu trình carbon, chu trình nitơ, phospho và lưu
huỳnh.
Các bước chung của bài thực hành là
1. Phát hiện các nhóm vi sinh vật trong mẫu đất bao gồm đại diện của một số nhóm phân loại
2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh trưởng và hình thái tế bào học tế bào của các đại diện
thuộc vi sinh vật phân lập được.

NỘI DUNG THỰC HÀNH
BÀI 1: VI KHUẨN AMÔN HÓA
BÀI 2: VI KHUẨN NITRAT HÓA
BÀI 3: VI KHUẨN PHẢN NITRAT HÓA
BÀI 4: VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITƠ
BÀI 5: VI SINH VẬT PHÂN GIẢI CELLULOSE

4


BÀI 1: VI KHUẨN AMÔN HÓA

I. Lý thuyết
Quá trình amôn hóa là quá trình phân giải protein và các hợp chất hữu cơ khác có chứa nitơ tạo
thành amoniac. Các vi sinh vật có khả năng amôn hóa bao gồm nhiều loài sinh bào tử hoặc không
sinh bào tử, có khả năng sử dụng nhiều nguồn vật chất khác nhau. Ngoài ra còn nhiều loại xạ khuẩn
và nấm khuẩn ty. Tuy vậy, những vi sinh vật chỉ sử dụng riêng một loại protein thì không nhiều.
Các vi sinh vật này có khả năng tiết men phân giải protein vào môi trường, thủy phân thành các
amino acid. Khi đó, chúng sử dụng các amino acid này trong quá trình dị hóa và đổng hóa. Các sản
phẩm đặc trưng của quá trình phân giải protein là NH
3
và H
2
S.
Quá trình phân giải protein có thể xảy ra trong các điều kiện hiếu khí và kỵ khí. Trong điều kiện
hiếu khí, các hợp chất hữu cơ có chứa nitơ được phân giải bởi các loài trong giống Bacillus và
Pseudomonas, các đại diện trong họ Enterobacteriaceae, các xạ khuẩn và nấm khuẩn ty. Trong đó,
vai trò quan trọng và chủ yếu nhất là giống Bacillus. Trong điều kiện kỵ khí thì các loài trong giống
Clostridium tham gia quá trình chuyển hóa này. Còn trong điều kiện thông khí hạn chế, quá trình
amôn hóa được thực hiện bới các loài vi khuẩn và trực khuẩn kỵ khí tùy nghi.

II. Thực hành
Việc phát hiện và xác định số lượng các vi sinh vật amôn hóa được thực hiện bằng cách cấy các
mẫu phân tích vào môi trường lỏng và rắn canh thịt-peptone.
Việc cấy lên môi trường thạch được tiến hành bằng dịch huyền phù đã thanh trùng Pasteur nhằm
tiêu diệt các tế bào sinh dưỡng và chỉ còn giữ lại bào tử của các đại diện thuộc giống Bacillus –
giống đặc trưng nhất cho quá trình amôn hóa.
Ngoài ra, việc cấy lên môi trường thạch cho phép nhận định được các đặc tính khác nhau của
khuẩn lạc các vi khuẩn khác nhau này.
1. Môi trường - hóa chất
Môi trường canh thịt- peptone:
Cao thịt 5g

Peptone 10g
Nước 1000ml
Môi trường thạch:
Trộn vào môi trường lỏng 2% thạch.
5

Dung dịch pha loãng mẫu: dung dịch nước muối sinh lý tiệt trùng.
Giấy lọc loại thấm acetate chì
Giấy quỳ đỏ
Các loại thuốc nhuộm quan sát vi sinh vật: thuốc nhuộm Gram và thuốc nhuộm bào tử,
Thuốc thử Nessler
2. Dụng cụ
Các dụng cụ pha chế môi trường
Các dụng cụ cấy, khử trùng
Kinh hiển vi

3. Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị môi trường:
Môi trường canh thịt-peptone được phân vào khoảng 1/3 chiều cao ống nghiệm, khử trùng ở
1 atm, 15 min.
Các dải giấy quỳ và giấy lọc thấm acetat chì được cho vào đĩa petri, hấp khử trùng ở 0,5
atm.
Môi trường thạch canh thịt-peptone: sau khi hấp khử trùng được phân vào các đĩa petri, giữ
ở 30
O
C
Chuẩn bị mẫu:
Mẫu đất được pha với nước để thu dịch huyền phù
 Ủ vi sinh vật trên môi trường lỏng:
Cấy từ các dịch pha loãng nồng độ 10

5
– 10
10

Lấy 1ml dịch pha loãng cấy vào ống nghiệm có chứa môi trường canh thịt-peptone đã khử
trùng ở trên
Dùng kẹp lấy các dải giấy quỳ và giấy lọc thấm acetatechì gài vào giữa nút bông và ống
nghiệm
Ủ ở nhiệt độ 28-30
O
C trong 3 ngày đêm.
 Ủ vi sinh vật trên môi trường thạch:
Cấy từ các dịch pha loãng nồng độ 10
2
– 10
5

Lấy 0,5ml dịch pha loãng cho vào các đĩa petri có chứa môi trường đã khử trùng ở trên
Dùng que trang trải đều lên bề mặt thạch
Ủ ở nhiệt độ 28-30
O
C trong 3 ngày đêm.
Mỗi môi trường tiến hành thêm 1 mẫu đối chứng
6

4. Quan sát và ghi nhận kết quả
Đối với môi trường lỏng, quan sát:
Sự đục môi trường
Sự tạo bông, kết cạn
Nổi váng trên bề mặt

Phản ứng sinh hóa:
Màu kết tủa với thuốc thử Nessler: Nhỏ một giọt thuốc thử Nessler lên đĩa sứ trắng, thêm
một que cấy đầy đất vườn ủ trong peptone broth. Quan sát màu kết tủa:
Màu vàng nhạt – ít ammoniac
Vàng sậm – nhiều ammoniac
Nâu – rất nhiều ammoniac
Sự sinh NH
3
làm giấy quỳ hóa xanh
Sự sinh H
2
S làm giấy lọc thấm acetate chì hóa đen.
So sánh đối chứng và thí nghiệm.
Độ pha
loãng
Đục môi
trường
Tạo bông Tạo cặn Sinh NH
3
Sinh H
2
S




Nhận xét mức độ, tỷ lệ xuất hiện cao nhất trong 1g mẫu
Chọn một độ pha loãng có tỷ lệ vi sinh vật cao nhất làm tiêu bản và soi kính hiển vi
Trên môi trường thạch, ghi nhận:
Số lượng khuẩn lạc trên 1 đĩa ở mỗi độ pha loãng

Số khuẩn lạc đặc trưng
Quan sát hình thái khuẩn lạc, mô tả, ghi nhận vào bảng
Độ pha
loãng
Số khuẩn lạc Số khuẩn lạc
đặc trưng
Hình thái
khuẩn lạc
Xuất hiện
bào tử
Khả năng di
động



Chọn một đĩa có nhiều khuẩn lạc đặc trưng nhất làm tiêu bản và soi kính hiển vi
So sánh hình thái quan sát được giữa tiêu bản từ môi trường lỏng và môi trường thạch
7


BÀI 2: VI KHUẨN NITRAT HÓA
I. Lý thuyết
Nitrat hóa là quá trình oxi hóa NH
3
thành HNO
3
, cung cấp năng lượng cho vi sinh vật hoạt
động. Quá trình oxi hóa này xảy ra cùng với quá trình đồng hóa CO
2
. Hầu hết các vi sinh vật tự

dưỡng hóa năng vô cơ thuộc loại hiếu khí bắt buộc đều có khả năng thực hiện quá trình này.
Nitrat hóa qua 2 giai đoạn:
Đầu tiên là giai đoạn oxi hóa NH
3
thành nitrit bởi một số đại diện thuộc nhóm vi khuẩn nitrit hóa:
Nitrosomonas, Nitrosocystis, Nitrosococcus, Nitrosolobus, Tất cả chúng đều giống nhau về mặt
sinh lý, sinh hóa, chỉ khác nhau về mặt hình thái học và cấu trúc tế bào.
Các đại diện của giống Nitrosomonas không sinh nội bào tử, tế bào nhỏ bé hình bầu dục.
Trên môi trường lỏng, Nitrosomonas trải qua một số pha, phát triển tùy thuộc một số điều kiện. Hai
pha chủ yếu là pha di động- tế bào có 1 hay chùm tiên mao và pha tập đoàn khuẩn keo-các tế bào
không di động.
Giai đoạn 2 của quá trình nitrat hóa oxi hóa nitrit thành nitrat bởi một số vi khuẩn:
Nitrobacter winogradski, N. agilis, Nitrospina gracilis, Nitrococcus mobilis.
Tế bào đặc trưng của Nitrobacter trong dịch nuôi thường có dạng hình que tròn, hình hạt
đậu, hoặc hình trứng, có thể di động hoặc không di động. Khi điều kiện không thuận lợi chúng có
thể hình thành những tập đoàn khuẩn keo. Nitrospina gracilis là những trực khuẩn thẳng, mảnh dẻ,
thỉnh thoảng có dạng hình cầu, không di động, và có đặ trưng là hình thành những tập đoàn khuẩn
keo. Nitrococcus mobilis thì có dạng hình tròn, có tiên mao.
Vi khuẩn nitrat hóa không sử dụng các chất hữu cơ và chuyển hóa một cách chặt chẽ đối với
việc oxi hóa cơ chất-NH
3
và nitrit

II. Thực hành
Việc phát hiện và xác định số lượng vi khuẩn nitrat hóa được thực hiện bằng cách cấy dịch
huyền phù cần phân tích lên môi trường chọn lọc vô cơ Winogradski. Nguồn C duy nhất trong môi
trường này là CO
2
có trong không khí và trong thành phần của CaCO
3

. Nguyên liệu năng lượng và
nguồn N cho các vi khuẩn gây ra giai đoạn đầu của quá trình nitrat hóa là NH
3
và muối amon, còn
đối với vi khuẩn gây ra giai đoạn hai là nitrit.
Điều kiện cần thiết đối với sự phát triển của vi khuẩn nitrat hóa là việc thông khí đầy đủ vào
môi trường nuôi cấy. Số lượng vi khuẩn nitrat hóa được xác định bằng phương pháp pha loãng tới
hạn.
8

1. Môi trường- hóa chất
Thành phần môi trường Winogradski:
(NH4)
2
SO
4
2 g/l
K
2
HPO4 1 g/l
MgSO4 0,5 g/l
FeSO4 0,4 g/l
NaCl 2 g/l
Chia vào các bình thủy tinh 50ml, cho vào mỗi bình một ít CaCO
3
. Hấp khử trùng ở 1 atm
Dung dịch pha loãng mẫu
Các loại thuốc nhuộm quan sát vi sinh vật
Tinh thể diphenylamin
H

2
SO
4
đậm đặc
2. Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị môi trường: Môi trường đã hấp khử trùng được phân vào các ống nghiệm
Xác định vi sinh vật trên môi trường lỏng:
Pha loãng mẫu 10
2
- 10
5

Mỗi độ pha loãng lấy 1ml mẫu cấy vào ống nghiệm có chứa môi trường đả khử trùng ở trên
Ủ ở 28-30
O
C trong 2-3 tuần
Làm 1 ống nghiệm đối chứng

3. Quan sát và ghi nhận kết quả:
Ở mỗi độ pha loãng, ghi nhận sự thay đổi môi trường trong ống nghiệm
Những ống nghiệm nào ghi nhận có vi khuẩn phát triển, cần tiến hành thử nghiệm định tính.
Phản ứng định tính nitrat: Lấy vài tinh thể diphenylamin hòa tan trong 1 giọt H
2
SO
4
đậm đặc. Sau
đó thêm 1 giọt dịch cần kiểm tra. Tiến hành trên bản sứ trắng sẽ thấy xuất hiện màu xanh thẩm.
Ghi nhận kết quả vào bảng

Ống nghiệm

số
Độ pha loãng
10
2
10
3
10
4
10
5

NO
2-
NO
3-
NO
2-
NO
3-
NO
2-
NO
3-
NO
2-
NO
3-

9

Chọn ống nghiệm có kết quả dương tính làm tiêu bản quan sát dưới kính hiển vi. Cần lưu ý chọn
được cả những hạt CaCO
3
, vì xung quanh hạt này, tỷ lệ vi khuẩn là cao nhất. Miêu tả, so sánh hình
thái các tế bào vi khuẩn quan sát được (hình dạng, khả năng di động, khả năng tạo tập đoàn khuẩn
keo). Nhận xét loài nào chiếm ưu thế nhất.
10


BÀI 3. VI KHUẨN PHẢN NITRAT HÓA
I. Lý thuyết
Phản nitrat hóa là quá trình vi sinh vật thực hiện việc khử nitrat thành nitrogen phân tử, đồng
thời oxi hóa các chất hữu cơ như đường, rượu, axit hữu co thành CO
2
và H
2
O với chất nhận điện tử
cuối cùng là NO
3
. Năng lượng sinh ra khi oxi hóa cơ chất được vi sinh vật sử dụng trong quá trình
hoạt động sống của mình.
Quá trình phản nitrat hóa có thể xảy ra trong điều kiện hiếu khí lẫn kỵ khí, nhưng đặc biệt mạnh
trong điều kiện kỵ khí.
Các vi sinh vật thực hiện quá trình này phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Phần lớn chúng
thuộc loại dị dưỡng hóa năng hữu cơ, kỵ khí tùy nghi gồm một số giống Pseudomonas,

Achromobacter, Micrococcus …

II. Thực hành
Việc phát hiện vi khuẩn phản nitrat hóa và xác định số lượng của chúng được thực hiện bằng
phương pháp cấy mẫu lên môi trường chứa hợp chất C ở dạng oxi hóa, có nitrat và các hợp chất
khác cần cho quá trình sinh tổng hợp của tế bào. Khi đó, đáng chú ý là một số vi khuẩn nitrat sử
dụng nitrat như nguồn năng lượng chủ yếu hoặc duy nhất, tức dùng chúng làm chất nhận electron
nhưng không dùng làm nguồn N trong trao đổi kiến tạo, vì không thể khử NH3 thành NH4
+
. Vì vậy,
trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn phản nitrat hóa, người ta cho thêm peptone, asparagin hoặc
muối amon và hạn chế lưu khí trong quá trình nuôi cấy.
Số lượng vi khuẩn được xác định bằng phương pháp pha loãng tới hạn.
1. Môi trường- hóa chất
Môi trường Giltay:
Dung dịch A:
Asparagine: 1g
KNO
3
: 1g
Nước máy: 0.25l
Dung dịch B:
KNO
3
: 8,5g
K
2
HPO
4
: 1g

MgSO
4
: 1g
CaCl
2
: 0,2g
11

FeCl
2
: vết
Nước máy: 0,25l
Hòa 0,25l dung dịch A và 0,25l dung dịch B, sau đó thêm nước máy đến 1L dung dịch môi
trường Giltay hoàn tất.
2. Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị môi trường: môi trường Giltei với thành phần như trên được phân vào các ống nghiệm,
hấp khử trùng 0,5 atm
Xác định vi sinh vật trên môi trường lỏng:
Pha loãng mẫu 10
3
- 10
8

Lấy 1ml mẫu cấy sâu vào đáy ống nghiệm có chứa môi trường đã khử trùng ở trên
Ủ ở 28-30
O
C trong 7 ngày đêm
Làm 1 ống nghiệm đối chứng
3. Quan sát và ghi nhận kết quả
Dấu hiệu chủ yếu nhất cho sự phát triển của vi khuẩn nitrat hóa là sự sinh khí, làm đục và giảm pH

của môi trường
Quan sát các ống nghiệm ở các độ pha loãng khác nhau và ghi nhận vào bảng
Kiểm tra việc khử nitrat trong môi trường bằng phản ứng sinh hóa với diphenylamin
Độ pha loãng Đục môi trường Sinh khí pH môi trường NO
3
-
10
3

10
5

10
7

10
9


Chọn 1 ống nghiệm cho kết quả tốt nhất làm tiêu bản, quan sát kính hiển vi và ghi nhận hình thái
học của các vi khuẩn phản nitrat hóa phân lập được.
Kiểm tra việc khử nitrat trong môi trường bằng phản ứng sinh hóa với diphenylamin:
Lấy vài tinh thể diphenylamine hòa tan vào một giọt H2SO 4 đặc, sau đó thêm vào một giọt dịch
nghiên cứu. Nếu có mặt nitrate sẽ xuất hiện màu xanh thẫm.
12


BÀI 4. VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH NITƠ
I. Lý thuyết
Cố định N là khả năng đồng hóa N phân tử của một số vi sinh vật và dùng làm nguồn kiến tạo tế

bào. Các vi sinh vật cố định N sống tự do, có nhiều trong đất, nước gồm một số loài thuộc giống
Clostridium, Azotobacter, Pseudomonas, Bacillus, Aerobacter, vi khuẩn quan năng, vi khuẩn sinh
metan, vi khuẩn khử sulfat, nấm, tảo lam… Ngoài ra khả năng cố định N còn có ở các vi khuẩn nốt
sần sống cộng sinh trong rễ các cây họ đậu. Chúng có ý nghĩa quan trong trong việc chuyển N vô cơ
thành N hữu cơ, đặc biệt là vai trò của vi khuẩn nốt sần, các loài trong giống Clostridium và
Azotobacter.

II. Thực hành
Các loài Azotobacter thuộc loài vi sinh vật cố định nitrogen hoạt động nhất. Một số loài được
nghiên cứu hơn cả là Az. Chroococum-đặc trưng trên đất đồng cỏ, Az. Agilis và Az. Vinelandii trong
ao hồ. Các loài này khác nhau về đặc điểm sinh trưởng trên môi trường đặc, kích thước, hình thái tế
bào và một số đặc điểm sinh lý khác. Az. Chroococum tạo những khuẩn lạc nhầy, lồi hoặc lan, lúc
đầu không màu, sau chuyển thành màu nâu tối hoặc đen nhưng không lan màu sang môi trường. Az.
Agilis và Az. Vinelandii thì có khuẩn lạc trong, nhầy, sinh sắc tố huỳnh quang màu vàng lục hoặc
lam lục, và có sự khuếch tán vào môi trường. Khi còn non, tế bào Azotobacter hình que đầu tròn
đứng riêng lẽ hoặc xếp thành từng đôi chồng chất, tế bào chất nhuộm màu đồng đều, có khả năng di
động nhờ chu mao. Chiều dài tế bào thay đổi 2-3 đếm 4-6 μm, trong đó lớn nhất là tế bào của Az.
Agilis. Dần dần, các tế bào hình que chuyển thành hình cầu hoặc hình bầu dục với đường kính 4
μm, hình dạng không cố định. Khi đó tiên mao rụng đi và tế bào trở nên bất động, bọc bao nhầy, tế
bào chất xuất hiện dạng hạt với nhiều chất dinh dưỡng mỡ, glycogen… Ở tế bào Az. Chroococcum
và Az. Vinelandii các tế bào tròn có thể phủ lớp vỏ nhầy và chuyển thành kén. Hình dạng tế bào và
chu kỳ biến đổi của Azotobacter phụ thuộc tuổi của giống và điều kiện phát triển.
Tất cả các loài Azotobacter đều sống dị dưỡng, dùng nhiều nguồn cacbon khác nhau,
monosacharit, disacharit, polysacharit (dextrin, tinh bột), nhiều rượu và acid hữu cơ, các hợp chất
thơm…Nguồn nitrogen có thể là Nitrogen phân tử, cũng có thể là muối amon, nitrate, nitrit,
aminoaxit. Tùy thuộc nồng độ các hợp chất có nitrogen này trong môi trường mà quá trình cố định
nitrogen phân tử sẽ bị ức chế nhiều hay ít. Đồng thời Azotobacter có nhu cầu lớn đối với P và Ca.
Azotobacter nhận được năng lượng từ quá trình oxi hóa các hợp chất hữu cơ thành CO
2
và H

2
O.
13

Phần lớn các loài Azotobacter chỉ phát triển được ở pH lớn hơn 6, vì vậy hầu như không gặp chúng
ở đất chua. Đối với đất chua, đặc trưng là loài Az. Indicum có thể phát triển trong môi trường với
pH 3.
Azotobacter cần độ ẩm cao hơn so với nhiều vi khuẩn khác nên cũng ít gặp chúng ở các vùng đất
khô hạn.
Việc phát hiện Azotobacter được thực hiện trên môi trường chọn lọc Thompson-Sherman không
chứa nitrogen hợp chất, trong điều kiện hiếu khí và độ ẩm cao.
1. Môi trường- hóa chất
Thành phần môi trường Thompson-Sherman (N
2
-free glucose) tăng sinh
K
2
HPO
4
: 1g
MgSO
4:
0,2g
FeSO
4
: 0,2g
CaCl
2
: 0,1g
Na2MoO4: 0,001g

Glucose: 10g
Nước máy: 1000ml
Thành phần môi trường Thompson-Sherman (N
2
-free glucose) phân lập
K
2
HPO
4
: 1g
MgSO
4:
0,2g
CaCl
2
: 0,1g
Na2MoO4: 0,001g
Glucose: 10g
Nước máy: 1000ml
Agar: 3% thể tích môi trường
Chuẩn bị môi trường Thompson-Sherman với thành phần như trên, hấp khử trùng ở 121
O
C trong 15
phút 1 atm.
2. Tiến hành thí nghiệm
- Giai đoạn tăng sinh: Cân 1g đất cho vào erlen có 50ml môi trường Thompson-Sherman tăng sinh
đã hấp khử trùng với thành phần như trên. Ủ 4-7 ngày 30
O
C.
- Giai đoạn sau tăng sinh: Kiểm tra hình dạng, kích thước tế bào vi khuẩn có trong sinh khối đã tăng

sinh dưới kính hiển vi quang học. Nếu có đúng hình thái khuẩn lạc, chuyển sang môi trường phân
lập.
14

- Giai đoạn phân lập: Cấy sinh khối vi khuẩn vào môi trường Thompson-Sherman phân lập đã phân
vào đĩa petri và hấp khử trùng. Ủ 3-5 ngày, 30
O
C.
3. Quan sát ghi nhận kết quả
Quan sát và ghi nhận hình thái vi khuẩn đặc trưng sau giai đoạn tăng sinh.
Hình
dạng
tế bào
Bào tử Kích
thước
Sự sắp
xếp tế
bào
Có roi Di động Bao
nhầy
Hình
vẽ tế
bào
Loại 1

Loại 2



Ghi nhận các loại khuẩn lạc khác nhau xuất hiện sau giai đoạn phân lập. Mô tả các khuẩn lạc đó

Khuẩn
lạc loại
Hình
dạng
Bề mặt Độ trong Màu sắc Huỳnh
quang
Khuếch tán
màu vào
môi trường
Số lượng
khuẩn lạc loại
này
Loại 1

Loại 2


Chọn các khuẩn lạc đặc trưng nhất làm tiêu bản giọt ép đề quan sát bao nhầy. Soi kính hiển vi vật
kính 40X đề kiểm tra hình thái vi khuẩn: kích thước lớn, thường đứng thành đôi và có bao nhầy.
Ghi nhận các đặc điểm này vào bảng
Hình
dạng
tế bào
Bào tử Kích
thước
Sự sắp
xếp tế
bào
Bao
nhầy

Hình
vẽ tế
bào
Loại 1

Loại 2




BÀI 5:VI SINH VẬT PHÂN GIẢI CELLULOSE
15

I. Lý thuyết
Cellulose là thành phần cấu tạo cơ bản của thành tế bào thực vật. Việc tổng hợp cellulose có quy
mô phức tạp hơn hẳn việc tổng hợp những hợp chất khác. Do đó, vi sinh vật phân giải cellulose có
vai trò đặc biệt quan trọng trong chu trình tuần hoàn Cacbon.
Sự phân giải tiến hành trong điều kiện hiếu khí lẫn kỵ khí, môi trường kiểm hoặc acid, độ ẩm
thấp hoặc cao và ở các nhiệt độ khác nhau. Tất cả vi sinh vật tham gia vô cơ hóa cellulose đều thuộc
loại dị dưỡng hóa năng hữu cơ, có enzyme cellulosase xúc tác việc phân giải cellulose thành
cellobioase và glucose. Vi sinh vật dùng các hợp chất sinh ra này làm nguồn cacbon và nguồn năng
lượng.
Trong điều kiện hiếu khí, các vi sinh vật tham gia vào quá trình này gồm niêm khuẩn, một số
đại diện của các vi khuẩn không sinh bào tử và sinh bào tử, xạ khuẩn, nấm Trong đó, quan trọng
nhất là niêm khuẩn.
Niêm khuẩn có tế bào hình que nhỏ bé (03-0,4 x 0,7-10μm) hơi uốn cong, thường có đầu nhọn,
thành tế bào mỏng và nhuộm màu kém hơn so với các vi khuẩn khác. Trên cơ chất đặc niêm khuẩn
có chuyển động trượt, do sự tiết chất nhầy không đồng đều trên bề mặt tế bào. Vài loài niêm khuẩn
có tiên mao, có chu kỳ phát triển phức tạp. Đầu tiên, các tế bào hình que từ từ dầy lên, biến thành
những tế bào dạng nghỉ, hình cầu hoặc bầu dục, kích thước khác nhau.

Niêm khuẩn phân giải cellulose chủ yếu gồm các giống Cytophaga, Sporocytophaga,
Sorangium sống trong đất ít acid, trung tính và ít kiềm. Các loài thuộc giống Cytophaga có tế bào
đầu nhọn, không sinh vi kén. Các loài trong giống Sporocytophaga có hình thái tương tự như
Cytophaga nhưng khác ở chỗ có khả năng sinh vi kén. Các loài thuộc giống Sorangium là những
trực khuẩn đầu nhọn, có khả năng hình thành kén.
Trên bề mặt vật liệu có cellulose, niêm khuẩn phát triển trong dạng thể nhầy, không có hình
dạng xác định, lan rộng, không màu hoặc có màu vàng, da cam, đỏ tương ứng với chỗ cellulose bị
phân giải nhiều hay ít.
Ngoài niêm khuẩn, trong đất còn có các loài phân giải cellulose thuộc giống Cellvibrio, tế bào
uống cong, di động nhờ 1 tiên mao, không sinh nội bào tử, khuẩn lạc không màu hoặc có màu vàng
lục. Chúng chỉ dùng cellulose khi cạn kiệt các nguồn cacbon khác và khả năng phân giải không
mạnh mẽ bằng niêm khuẩn.
Trong đất chua, vai trò phân giải do các nấm thuộc giống Chaelomium, Trichoderma, Fusarium,
Aspergillus
II. Thực hành
Hầu hết tất cả những loài phân giải cellulose thuộc nhóm hiếu khí và ưa ẩm.
16

Việc phát hiện và xác định sô lượng các vi sinh vật phân giải cellulose trong điều kiện hiếu khí
được tiến hành bằng cách cấy dịch huyền phù nghiên cứu lên các đĩa chứa môi trường chọn lọc
Hutchinson có nguồn cacbon duy nhất là xellulose. Nuôi cấy trong điều kiện hiếu khí.
1. Môi trường và hóa chất
Môi trường Hutchinson (g)
KNO3 2,5
K2HPO4 1,0
MgSO4 0,3
CaCl2 0,1
NaCl 0,1
FeCl3 0,01
Agar 3%

Nước máy 1000ml
2. Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị các đĩa petri có môi trường Hutchinson với thành phần như trên, hấp khử trùng ở 1 atm.
Giấy lọc cắt thành những khoanh tròn kích thước tương ứng đĩa petri. Hấp khử trùng ở 1 atm.
Mẫu đất pha với nước máy để lấy dịch huyền phù
Cấy 0,1 ml dịch huyền phù từ độ pha loãng 10
1
đến 10
10
, trang đều lên bề mặt bằng que cấy trang.
Sau đó dùng kẹp sắt đã khử trùng trên ngọn lửa gấp 1 khoanh giấy lọc vô trùng đặt áp sát lên bề
mặt. Mỗi độ pha loãng lập lại 3 lần.
Đậy nắp đĩa petri đặt vào bình hút ẩm. Nuôi cấy 28-30
O
C trong 12-14 ngày đêm.
3. Quan sát và ghi nhận kết quả
Quan sát và đếm số lượng khuẩn lạc vi sinh vật mọc được trên khoanh giấy lọc trong mỗi đĩa petri.
Xác định xem khuẩn lạc là của nhóm vi sinh vật nào (niêm khuẩn, xạ khuẩn hay nấm khuẩn ty)
chiếm ưu thế trên giấy lọc. Để phân biệt các khuẩn lạc nhỏ của xạ khuẩn và nấm, có thể quan sát
trên kính hiển vi với vật kính 8X. Nhận xét sự khác nhau giữa các loại vi sinh vật phát hiện được.
Khuẩn lạc
loại
Hình dạng Kích thước Màu sắc Mức độ phân
giải cellulose
Số khuẩn lạc cùng
loại ghi nhận được
(khuẩn lạc/đĩa)
Loại 1

Loại 2

17

Mô tả khác khuẩn lạc khác nhau của niêm khuẩn, ghi nhận các dấu hiệu. Chọn khuẩn lạc đặc trưng
nhất làm tiêu bản cùng với các sợi cellulose từ những chỗ giấy lọc bị phân giải nhiều nhất. Lưu ý
hình dạng tế bào sinh dưỡng và vi kén hoặc bào tử nấm mốc

Khuẩn lạc loại Tế bào sinh
dưỡng
Vi kén Hình vẽ tế bào Hình vẽ vi kén
(nếu có)
Loại 1

Loại 2




Cùng bạn đọc.
Vi sinh vật (microorganisms) là những sinh vật nhỏ bé đến mức chỉ có thể thấy được chúng
dưới kính hiển vi quang học hay kính hiển vi điện tử. Vi sinh vật gây ra rất nhiều bệnh hiểm nghèo
cho người, cho gia súc, gia cầm. Tuy nhiên số vi sinh vật gây bệnh chỉ chiếm một phần rất nhỏ
trong thế giới vi sinh vật. Từ xa xưa người ta đã biết ứng dụng các vi sinh vật có ích (tuy chưa hề
biết tới sự tồn tại của chúng) để chế biến thực phẩm ( như nấu rượu, làm tương, mắm, nước mắm,
giấm, sữa chua, chao, muối dưa, muối cà, ), ủ phân, ngâm vỏ cây lấy sợi, xếp ải đất, trồng luân
canh với cây họ Đậu ; hoặc sử dụng các biện pháp để ngăn chặn tác hại của vi sinh vật (như ướp
muối thịt, cá, làm mứt, phơi khô củ cải, tôm, cá ).
Sau việc Leeuwenhoek phát hiện ra vi sinh vật và việc Louis Pasteur phát hiện ra bản chất
của các vi sinh vật- từ đó khai sinh ra ngành Vi sinh vật học (Microbiology)- thì nhân loại bắt đầu

quan tâm rất nhiều đến lĩnh vực khoa học mới mẻ này.
Vi sinh vật học trở thành nền tảng cho sự phát triển của Công nghệ sinh học(CNSH). Người
ta chia sự phát triển của CNSH ra thành 3 giai đoạn:
* CNSH truyền thống là các quá trình dân dã nhằm chế biến , bảo quản các loại thực
phẩm, xử lý đất đai, phân bón để phục vụ nông nghiệp
* CNSH cận đại là quá trình sử dụng các nồi lên men công nghiệp để sản xuất ở quy mô
lớn các sản phẩm sinh học như mỳ chính (bột ngọt), lizin và các axít amin khác, các acid hữu cơ,
các dung môi hữu cơ, chất kháng sinh, một số vitamin (như vitamin B2, B12, C ), nhiều loại
enzym
* CNSH hiện đại chia ra các lĩnh vực như CN di truyền (genetic engineering), công nghệ tế
bào (cell engineering), công nghệ enzym và protein (enzyme/protein engineering), CN vi sinh vật/
CN lên men (microbial engineering / fermentation), CN môi trường (environmental engineering).
CNSH hiện đại thường gắn liền với các cơ thể mang gen tái tổ hợp ( recombination gene).
Vi sinh vật học là khoa học nghiên cứu về các cơ thể hoặc các nhân tố quá nhỏ đến mức
không thấy được bằng mắt thường, tức là các vi sinh vật. Vi sinh vật học đang được giảng dạy
trong rât nhiều trường Đại học, Cao đẳng, Trung học chuyên nghiệp và cũng được đề cập đến ít
nhiều ở bậc phổ thông. Vi sinh vật học là những kiến thức liên quan đến cuốc sống của mọi người.
Bên cạnh giáo trình Vi sinh vật học đã được biên soạn từ lâu và đã được tái bản nhiều lần chúng
tôi muốn cung cấp thêm cho đông đảo bạn đọc, nhất là các thầy cô giáo đang giảng dạy về vi sinh
vật học tập tài liệu trình bày với nhiều tranh ảnh và sơ đồ, biểu đồ này. Có thể coi đây là phần
tham khảo để thiết kế các bài giảng nhằm mục tiêu cập nhật với các tiến bộ của ngành khoa học
luôn luôn đổi mới này.
Để giúp các bạn trẻ tiếp cận được với sách báo nước ngoài, nhất là cập nhật kiến thức qua
Internet chúng tôi cố gắng viết thêm tiếng Anh sau các thuật ngữ khoa học và để nguyên các chú
thích tiếng Anh trong hình vẽ. Thông qua việc giáo viên hướng dẫn sinh viên điền tiếng Việt vào các
hình vẽ sẽ giúp ích rất nhiều cho quá trình tự học của sinh viên.
Rất mong nhận được ý kiến đóng góp của các bạn đồng nghiệp và đông đảo bạn đọc.
Vì mục đích phục vụ phi lợi nhuận chúng tôi mong được lượng thứ việc đã sử dụng những
hình ảnh thu nhận qua Internet.

GS.TS. Nguyễn Lân Dũng
Trung tâm Công nghệ sinh học
Đại học Quốc gia Hà Nội
Bài 1
Lược sử nghiên cứu Vi sinh vật học

1546- Girolamo Fracastoro (1478, 1553). cho rằng các cơ thể nhỏ bé là tác nhân gây ra
bệnh tật. Ông viết bài thơ Syphilis sive de morbo gallico (1530) và từ tựa đề của bài thơ đó, người ta
dùng đề đặt tên bệnh
1590-1608- Zacharias Janssen lần đầu tiên lắp ghép kính hiển vi.
1676- Antony van Leeuwenhoek (1632-1723) hoàn thiện kính hiển vi và khám phá ra
thế giới vi sinh vật (mà ông gọi là anmalcules).
1688- Nhà vạn vật học người Ý Francisco Redi công bố nghiên cứu về sự phát sinh tự nhiên
của giòi.
1765-1776- Spallanzani
(1729-1799)
công kích thuyết Phát sinh tự nhiên
1786- Müller đưa ra sự phân loại đầu tiên về vi khuẩn
1798- Edward Jenner nghĩ ra phương pháp chủng mủ đậu bò để phong ngừa bệnh đậu mùa
1838-1839- Schwann và Schleiden công bố Học thuyết tế bào.
1835-1844- Basi công bố bệnh của tằm do nấm gây nên và nhiều bệnh tật khác do vi sinh
vật gây nên.
1847-1850- Semmelweis cho rằng bệnh sốt hậu sản lây truyền qua thầy thuốc và kiến nghị
dùng phương pháp vô khuẩn để phòng bệnh.
1849- Snow nghiên cứu dịch tễ của bệnh tả ở vùng London.
1857- Louis Pasteur (1822-1895) chứng minh quá trình lên men lactic là gây nên bởi
vi sinh vật.
1858- Virchov tuyên bố tế bào được sinh ra từ tế bào.
1861- Pasteur chứng minh vi sinh vật không tự phát sinh như theo thuyết tự sinh.
1867- Lister công bố công trình nghiên cứu về phẫu thuật vô khuẩn.

1869- Miescher khám phá ra acid nucleic.
1876-1877-

Robert Koch (1843-1910) chứng minh bệnh than do vi khuẩn Bacillus
anthracis gây nên.
1880- Alphonse Laveran phát hiện ký sinh trùng Plasmodium gây ra bệnh sốt rét.
1881- Robert Koch nuôi cấy thuần khiết được vi khuẩn trên môi trường đặc chứa gelatin.
Pasteur tìm ra vaccin chống bệnh than.
1882- Koch phát hiện ra vi khuẩn lao - Mycobacterium tuberculosis.
1884- Lần đầu tiên công bố Nguyên lý Koch.
Elie Metchnikoff (1845-1916) miêu tả hiện tượng thực bào (phagocytosis)
Triển khai nồi khử trùng cao áp (autoclave)
Triển khai phương pháp nhuộm Gram.
1885- Pasteur tìm ra vaccin chống bệnh dại.
Escherich tìm ra vi khuẩn Escherichia coli gây ra bệnh tiêu chảy.
1886- Fraenkel phát hiện thấy Streptococcus pneumoniae gây ra bệnh viêm phổi.
1887- Richard Petri phái hiện ta cách dùng hộp lồng (đĩa Petri) để nuôi cấy vi sinh vật .
1887-1890- Winogradsky nghiên cứu về vi khuẩn lưu huỳnh và vi khuẩn nitrat hoá.
1889- Beijerink phân lập được vi khuẩn nốt sần từ rễ đậu.
1890- Von Behring làm ra kháng độc tố chống bệnh uốn ván và bệnh bạch hầu.
1892- Ivanowsky phát hiện ra mầm bệnh nhỏ hơn vi khuẩn (virus) gây ra bệnh khảm ở cây
thuốc lá.
1894- Kitasato và Yersin khám phá ra vi khuẩn gây bệnh dịch hạch (Yersina pestis).
1895- Bordet khám phá ra Bổ thể (complement)
1896- Van Ermengem tìm ra mầm bệnh ngộ độc thịt (vi khuẩn Clostridium botulinum).
1897- Buchner tách ra được các men (ferments) từ nấm men (yeast).
Ross chứng minh ký sinh trùng sốt rét lây truyền bệnh qua muỗi.
1899- Beijerink chứng minh những hạt virus đã gây nên bệnh khảm ở lá thuốc lá.
1900- Reed chứng minh bệnh sốt vàng lây truyền do muỗi.
1902- Landsteiner khám phá ra các nhóm máu

1903- Wright và cộng sự khám phá ra Kháng thể (antibody) trong máu của các động vật đã
miễn dịch.
1905- Schaudinn và Hoffmann tìm ra mầm bệnh giang mai (Treponema pallidum).
1906- Wassermann phát hiện ra xét nghiệm cố định bổ thể để chẩn đoán giang mai.
1909- Ricketts chứng minh bệnh Sốt ban núi đá lan truyền qua ve là do mầm bệnh vi khuẩn
(Rickettsia rickettsii).
1910- Rous phát hiện ra ung thư ở gia cầm.
1915-1917- D’Herelle và Twort phát hiện ra virus của vi khuẩn ( thực khuẩn thể)
1921- Fleming khám phá ra lizôzim (lysozyme).
1923-Xuất bản lần đầu cuốn phân loại Vi khuẩn (Bergey’s Manual)
1928- Griffith khám phá ra việc biến nạp (transformation) ở vi khuẩn.
1929- Fleming phát hiện ra penicillin.
1931- Van Niel chứng minh vi khuẩn quang hợp sử dụng chất khử như nguồn cung cấp
electron và không sản sinh ôxy.
1933- Ruska làm ra chiếc kính hiển vi điện tử đầu tiên.
1935- Stanley kết tinh được virus khảm thuốc lá (TMV).
Domag tìm ra thuốc sulfamide.
1937- Chatton phân chia sinh vật thành hai nhóm: Nhân sơ (Procaryotes) và Nhân thật
(Eucaryotes).
1941- Beadle và Tatum đưa ra giả thuyết một gen- một enzym.
1944- Avery chứng minh ADN chuyển thông tin di truyền trong quá trình biến nạp.
Waksman tìm ra streptomycin.
1046- Lederberg và Tatum khám phá ra quá trình tiếp hợp (conjugation) ở vi khuẩn.
1949- Enders, Weller và Robbins nuôi được virus Polio (Poliovirus) trên mô người nuôi
cấy.
1950- Lwoff xác định được các thực khuẩn thể tiềm tan (lysogenic bacteriophages).
1952- Hershey và Chase chứng minh thực khuẩn thể tiêm ADN của mình vào tế bào vật chủ
(host).
Zinder và Lederberg khám phá ra quá trình tải nạp (transduction) ở vi khuẩn.
1953- Frits Zernike Làm ra kính hiển vi tương phản pha (phase-contrast microscope).

Medawar khám phá ra hiện tượng nhờn miễn dịch (immune tolerance).
Watson và Crick khám phá ra chuỗi xoắn kép của ADN
1955- Jacob và Monod khám phá ra yếu tố F là một plasmid.
Jerne và Burnet chứng minh lý thuyết chọn lọc clone (clonal selection).
1959- Yalow triển khai kỹ thuật Miễn dịch phóng xạ.
1961- Jacob và Monod giới thiệu mô hình điều hoà hoạt động gen nhờ operon.
1961-1966- Nirenberg, Khorana và cộng sự giải thích mã di truyền.
1962- Porter chứng minh cấu trúc cơ bản của Globulin miễn dịch G.
Tổng hợp được quinolone đầu tiên có tác dụng diệt khuẩn ( acid nalidixic).
1970- Arber và Smith khám phá ra enzym giới hạn (restriction endonuclease)
Temin và Baltimore khám phá ra enzym phiên mã ngược (reverse transcriptase)
1973- Ames triển khai phương pháp vi sinh vật học để khám phá ra các yếu tố gây đột biến
(mutagens).
Cohen, Boyer, Chang và Helling sử dụng vectơ plasmid để tách dòng gen ở vi khuẩn.
1975- Kohler và Milstein phát triển kỹ thuật sản xuất các kháng thể đơn dòng ( monoclonal
antibodies).
Phát hiện ra bệnh Lyme.
1977- Woese và Fox thừa nhận Vi khuẩn cổ (Archaea) là một nhóm vi sinh vật riêng biệt.
Gilbert và Sanger triển khai kỹ thuật giải trình tự ADN (DNA sequencing)
1979-Tổng hợp Insulin bằng kỹ thuật tái tổ hợp ADN.
Chính thức ngăn chặn được bệnh đậu mùa.
1980- Phát triển kính hiển vi điện tử quét
1982- Phát triển vaccin tái tổ hợp chống viêm gan B.
1982-1983- Cech và Altman phát minh ra ARN xúc tác.
1983-1984- Gallo và Montagnier phân lập và định loại virus gây suy giảm miễn dịch ở
người.
Mulli triển khai kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction).
1986- Lần đầu tiên ứng dụng trên người vaccin được sản xuất bằng kỹ thuật di truyền
(vaccin viêm gan B).
1990- Bắt đầu thử nghiệm lần đầu tiên liệu pháp gen (gene-therapy) trên người.

1992- Thử nghiệm đầu tiên trên người liệu pháp đối nghĩa (antisense therapy).
1995- Hoa Kỳ chấp thuận sử dụng vaccin đậu gà.
Giải trình tự hệ gen của vi khuẩn Haemophilus influenzae.
1996- Giải trình tự hệ gen của vi khuẩn Methanococcus jannaschii.
Giải trình tự hệ gen nấm men.
1997- Phát hiện ra loại vi khuẩn lớn nhất Thiomargarita namibiensis
Giải trình tự hệ gen vi khuẩn Escherichia coli.
2000- Phát hiện ra vi khuẩn tả Vibrio cholerae có 2 nhiễm sắc thể riêng biệt.




Janssen

Leeuwenhoek (1632-
1723)

Pasteur
(1822-1895)


Kính hiển vi của Leeuwenhoek




Bút tích miêu tả vi sinh vật của
Leeuwenhoek

Thí nghiệm bình cổ cong để

phản đối thuyết tự sinh
(Pasteur)



Robert Koch (1843-
1910)

Vi khuẩn lao chụp qua
kính hiển vi

Elie Metchnikoff
(1845-1916)




Alexander Fleming (1881-1955)

Nấm Penicillium sản