bài báo cáo sắc ký lỏng hiệu năng cao (hplc)

ĐẠI HỌC CẦN THƠ
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

Bài báo cáo SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

GVHD: TS. ĐẶNG HUỲNH GIAO


Nội dung
1

2

GIỚI THIỆU CHUNG

CƠ SỞ LÝ THUYẾT

3

4

MÁY SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

THỰC HÀNH


1. GIỚI THIỆU CHUNG

Sắc ký là một nhóm các phương pháp hóa lý dùng để tách các thành phần của một hỗn hợp. Sự tách sắc ký được
dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất khác nhau vào hai pha luôn tiếp xúc nhưng không hòa lẫn vào nhau: một
pha tĩnh và một pha động.

Sắc ký lỏng là phương pháp tách sắc ký, trong đó pha động là một chất lỏng chảy qua pha tĩnh chứa trong cột.


2. CƠ SỞ LÝ THUYẾT

2.1. Khái niệm

HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn đã được
phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng
liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ.

Sắc ký lỏng được tiến hành chủ yếu dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố khối lượng, trao đổi ion, loại trừ theo
kích thước (sắc ký rây phân tử) hoặc tương tác hóa học lập thể.


2.2. Phân loại sắc ký và ứng dụng
Căn cứ vào cấu tạo của pha tĩnh và thành phần của pha động người ta đưa ra một số cách phân loại sắc ký khác
nhau.
2.2.1. Phân loại theo độ phân cực


2.2.2. Phân loại theo cơ chế phân tách

+ Sắc ký hấp phụ

+ Sắc ký phân bố lỏng lỏng

+ Sắc ký pha liên kết
- Sắc ký pha đảo (RP-HPLC)

- Sắc ký pha thuận (NP-HPLC)
- Sắc ký trao đổi ion (IE-HPLC)

+ Sắc ký rây phân tử (sắc ký gel)


2.3. Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột




2.4. Các đại lượng đặc trưng
Kết quả của quá trình tách các chất được detector phát hiện, phóng đại và ghi thành sắc ký đồ:


Các thông số chỉ sự lưu giữ

2.4.1. Thời gian lưu tR (Retention time)

tR = tM × (1 + k')

→

Thời gian lưu thực:

t R' = t R – t M

Trong một phép phân tích nếu tR nhỏ quá thì sự tách kém, còn tR lớn quá thì pic bị doãng và độ lặp lại kém, thời
gian phân tích dài. Để thay đổi thời gian lưu ta tìm cách thay đổi một hoặc nhiều yếu tố trong các yếu tố phụ thuộc trên
đây.

2.4.2. Hệ số phân bố (Distribution factor)

Là tỷ lệ giữa nồng độ chất tan trong pha tĩnh và trong pha động tại thời điểm cân bằng:
K = Cs /C m

2.4.3. Hệ số dung lượng k' (Capacity factor)
t−

k'

hoặc trên sắc đồ ta có:

=

Q s / Qm

=

K.Vs / Vm

k' = (tR – tM) / tM = tR / tM – 1

Nếu k' nhỏ thì tR cũng nhỏ và sự tách kém, k' lớn thì pic bị doãng, độ nhạy kém. Trong thực tế k' từ 1 đến 8 là
tối ưu.


2.4.4. Độ chọn lọc α (Selectivity-factor) hay còn gọi là Độ lưu giữ tỷ đối r:
α = r = k’A / k’B = (tRA – tM) / (tRB – tM) với k’A > k’B

Độ lưu giữ tỷ đối chưa hiệu chỉnh (rG): rG = tR2 / tR1

Trừ khi có hướng dẫn khác, các trị giá độ lưu giữ tỷ đối cho trong các chuyên luận DĐVN IV là độ lưu giữ tỷ đối
chưa hiệu chỉnh.


Các thông số về sắc ký

2.4.5. Pic sắc ký

wh = 1,18 wi


ttRR
wh

2.4.6. Hiệu năng của cột và số đĩa lý thuyết biểu kiến N (Theoretical plates)
Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc ký nhất định:

N thay đổi theo chất, theo cột cũng như theo thời gian lưu.
Thông thường, trong thực tế N nằm trong khoảng 2500 đến 5500 là vừa đủ, tối thiểu là 1000.


2.4.7. Độ phân giải R (Resolution)
Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc ký đã cho. Độ phân giải
của hai pic cạnh nhau được tính theo 1 trong 2 công thức sau:

Trong thực tế nếu các pic cân đối (dạng Gauss) thì độ phân giải để 2 pic tách tối thiểu là R = 1,0. Trong phép định
lượng: R ≥ 1,5 thì hai pic được tách đến đường nền.

+ Nếu R nhỏ thì các pic chưa tách hẳn, việc tính diện tích pic sẽ không chính xác, lúc này phải tìm cách tăng R theo 3
cách sau đây:
- Làm thay đổi k’
- Làm tăng số đĩa lý thuyết
- Làm tăng độ chọn lọc α

+ Nếu R lớn quá thì thời gian phân tích sẽ lâu, tốn nhiều pha động, độ nhạy sẽ kém, lúc này phải tìm cách làm giảm R
bằng cách :
Ứng dụng quá trình rửa giải Gradient để cho chất thứ hai ra nhanh hơn, hoặc thay đổi thành phần hoặc tỷ lệ pha
động.


2.4.8. Hệ số đối xứng As (Symmetry factor) hay hệ số kéo đuôi T (Tailing factor)
Hệ số đối xứng (As) (hay hệ số kéo đuôi T) của một pic được tính theo công thức:


2.4.9. Tỷ số đỉnh-hõm (Peak-to-valley ratio)
Tỷ số đỉnh-hõm (p/v) có thể được dùng như một thông số của tính phù hợp của hệ thống trong phép thử các tạp
chất liên quan khi hai pic không được tách đến đường nền.


Pic dạng đối xứng hình Gauss trên thực tế khó đạt được,
T nằm trong khoảng 0,8 – 2,0 thì phép định lượng được chấp nhận
Nếu T > 2,0 thì điểm cuối của pic rất khó xác định, cần thay đổi các điều kiện sắc ký để làm cho pic cân xứng hơn
theo các cách sau:
- Làm giảm thể tích chết, tức là đoạn nối từ cột đến detector.
- Thay đổi thành phần pha động sao cho khả năng rửa giải tăng lên.
- Giảm bớt lượng mẫu đưa vào cột

2.4.10. Tỷ số tín hiệu trên nhiễu (Signal-to-noise ratio)


2.4.11. Độ lặp lại của hệ thống (System repeatability)
Độ lặp lại của đáp ứng được biểu thị dưới dạng độ lệch chuẩn tương đối% (RSD%) của của một dãy liên
tiếp các kết quả phép tiêm và đo (≥ 3 lần tiêm) rồi tính theo công thức:


2.4.12. Các thông số động học và sự doãng pic

Phương trình Van Deemter mô tả ảnh hưởng của tốc độ dòng pha động và các thông số động học khác đến hiệu
lực của cột (đến chiều cao của đĩa lý thuyết H ):

B
H = A + ------ + C × U
U


I. ĐẲNG DÒNG:
a). Thành phần pha động: Lượng thành phần dung môi nhỏ có thể điều chỉnh ± 30% nồng độ tương đối hay ± 2%
nồng độ tuyệt đối tùy theo trị số nào lớn hơn. Không thành phần dung môi nào được thay đổi lớn hơn 10% nồng độ tuyệt
đối.
b). pH của thành phần nước trong pha động: ± 0,2 pH, trừ các chỉ dẫn khác, hoặc ± 1,0 pH khi chất phân tích không bị
ion hóa.
c). Nồng độ muối: Được thay đổi ± 10%.
d). Bước sóng detector: Không được điều chỉnh.

e). Thông số cột:
Không thay đổi loại pha tĩnh (VD: không thay C18 bằng C8)
Cỡ hạt: Giảm tối đa 50% và không được phép tăng.
[USP cho phép thay đổi cỡ hạt (dp) và chiều dài cột (L) sao cho tỷ số L/dp thu được nằm trong khoảng từ -25% đến
+50% so với khi không thay đổi].
Chiều dài cột: ± 70%
Đường kính trong của cột: ± 25%