Xác định hàm lượng Rhodamin B trong hạt dưa và gia vị bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Tài liệu tập huẩn
PHẦN I. MỞ ĐẦU
Ô nhiễm thực phẩm là vấn đề đang được cả nhân loại quan tâm, ; nó không
chỉ ảnh hưởng tới sức khỏe của người tiêu dùng mà còn liên quan đến phát triển
kinh tế, thương mại, du lịch.
Muốn kiểm soát được ô nhiễm thực phẩm, chỉ có một biện pháp duy nhất là
thiết lập được hệ thống phân tích nguy cơ. Hệ thống pPhân tích nguy cơ là giải pháp
chủ động, dự phòng một cách tích cực, cơ bản, toàn diện, được thực hiện ở bất cứ
quốc gia nào nếu ở đó muốn có một thị trường thực phẩm an toàn.
Sau khi phát hiện Sudan đỏ trong các sản phẩm từ ớt bột ở Trung Quốc, mới
đây, người ta lại phát hiện Rhodamin B, loại chất để nhuộm len và lụa, có trong các
sản phẩm gia vị của Trung Quốc nhập khẩu vào Tây Ban Nha.
Bước đầu, cơ quan chức năng xác định chất nhuộm Rhodamin B đi vào các
sản phẩm ớt là xuất phát từ việc sử dụng thuốc trừ sâu tại các cánh đồng trồng ớt.
Tận dụng đặc tính phát quang của Rhodamin B, nông dân dùng chúng để giúp kiểm
soát lượng thuốc bảo vệ thực vật phun lên cây ớt. Một số loại dầu thực vật cũng phát
hiện thấy hóa chất phát quang này và người ta cũng nghi chúng bị dùng để kiểm soát
thuốc trừ sâu khi phun lên các loài cây lấy dầu.
Ngoài ra, không chỉ với ớt bột hay các chất gia vị nói chung, chất tạo màu
Rhodamin B có nguy cơ xuất hiện trong hầu hết sản phẩm lương thực, thực phẩm đi
từ cây trồng có dùng phân bón hóa học
Lo ngại nguy cơ xâm nhập của Rhodamin B vào các loại thực phẩm, Ủy
ban Gia vị châu Âu đang tìm cách ra lệnh cấm triệt để việc sử dụng Rhodamin B
trong tất cả các khâu liên quan đến quá trình sản xuất lương thực và thực phẩm.
Chi tử là quả của cây dành dành
Thị trường thực phẩm Việt Nam rất đa dạng, đặc biệt chúng ta nhập rất nhiều
loại thực phẩm từ Trung Quốc. Ngoài những thực phẩm nhập vào theo đường chính
thống, còn rất nhiều loại thực phẩm trôi nổi không được kiểm soát chất lượng an
toàn vệ sinh. Ở Việt Nam lần đầu tiên Rhodamin B được phát hiện trong cây chi tử -
một loại dược liệu để điều chế thuốcdùng trong đông y. Gần đây, thông tin về việc
Viện Kiểm nghiệm ATVSTP quốc gia 1

Tài liệu tập huẩn
hạt dưa bị nhiễm phẩm màu Rhodamin B gây ung thư đã khiến người tiêu dùng vô
cùng hoang mang lo lắng. Rhodamin B là một loại chất hoá học dùng để nhuộm
quần áo, cấm tuyệt đối trong thực phẩm và thuốc.
Trong bối cảnh đó, các kĩ thuật xác định Rhodamin B trong thực phẩm phù
hợp với điều kiện phòng thí nghiệm trong nước sẽ trở thành công cụ hữu hiệu giúp
các cơ quan chức năng kiểm soát tốt hơn vấn đề đảm bảo chất lượng vệ sinh an toàn
thực phẩm. Là cơ quan đầu ngành trong lĩnh vực an toàn vệ sinh thực phẩm, Viện
Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia đã tổ chức lớp tập huấn kỹ thuật:
“Xác định hàm lượng Rhodamine B trong hạt dưa và gia vị bằng sắc ký lỏng hiệu
năng cao”.
Viện Kiểm nghiệm ATVSTP quốc gia 2
Tài liệu tập huẩn
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
HPLC
PGS Phạm gia Huệ

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC-High performance liquid chromatography)
còn được gọi là sắc ký lỏng cao áp, hoặc chỉ đơn giản gọi là sắc ký lỏng vì ngày nay
nó đã trở thành quá thông dụng.
HPLC ra đời khi người ta sản xuất được chất nhồi cột có cỡ hạt khoảng 10
µm hay nhỏ hơn (5 và 3 µm), có hiệu suất tách rất cao. Cỡ hạt bé đòi hỏi dùng bơm
để nén dung môi qua cột. Với loại chất nhồi mới này và hệ thống máy vi tính,
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ra đời.
UPLC (Ultra performance liquid chromatography) hay sắc ký lỏng siêu hiệu
năng với hạt chất nhồi cột có đường kính dưới 2 µm, có hiệu suất tách cao hơn nữa.
Quá trình sắc ký và các đại lượng đặc trưng
1. Một số khái niệm mở đầu
1.1. Định nghĩa:
Sắc ký là một nhóm các phương pháp hoá lý dùng để tách các thành phần

của một hỗn hợp. Trong sắc ký các chất khác nhau được tách dựa trên sự phân chia
khác nhau của chúng vào hai pha luôn tiếp xúc và không hoà lẫn vào nhau : một pha
tĩnh và một pha động. Pha tĩnh được nhồi trên cột, pha động đi qua cột. Khi hỗn hợp
cần tách được pha động kéo qua cột, chất nào có ái lực mạnh hơn với pha tĩnh sẽ di
chuyển chậm hơn, vì vậy các chất có thể tách khỏi nhau.
1.2. Quá trình sắc ký:
Quá trình tách sắc ký thường bao gồm 3 giai đoạn chính:
a. Đưa hỗn hợp lên pha tĩnh: đưa hỗn hợp lên cột.
b. Cho pha động chạy qua pha tĩnh: dung môi qua cột, kéo theo các chất di
chuyển trên pha tĩnh với tốc độ khác nhau, tách khỏi nhau và có vị trí khác nhau trên
cột tạo thành sắc đồ (sắc ký đồ). Giai đoạn này gọi là khai triển sắc ký
(development).
Nếu tiếp tục cho pha động chạy thì các chất có thể lần lượt bị kéo ra khỏi cột.
Đó là quá trình rửa giải (elution) và dung môi được dùng là dung môi rửa giải
(eluent), dịch hứng được ở cuối cột gọi là dịch rửa giải (eluate).
Viện Kiểm nghiệm ATVSTP quốc gia 3
Tài liệu tập huẩn
Nếu các chất được tách trên pha tĩnh (sắc ký khai triển) ta có thể lấy từng
phần pha tĩnh có mang chất (phân đoạn bột trên cột) đem chiết lấy chất.
Nếu các chất được tách ra ngoài pha tĩnh (sắc ký rửa giải) ta có thể hứng lấy
các phân đoạn dịch rửa giải có chất.
c. Phát hiện các chất : các chất màu có thể phát hiện dễ dàng, các chất không
màu có thể phát hiện bằng đèn tử ngoại hay bằng các thuốc thử. Trong sắc ký rửa
giải có thể phát hiện các chất khi chúng đi ra khỏi cột bằng cách cho dung dịch rửa
giải đi qua một bộ phận phát hiện gọi là detectơ (detector) đặt sau cột.
1.3. Phân loại các phương pháp sắc ký.
-Sắc ký hấp phụ (adsorption chromatography): pha tĩnh là chất rắn có khả
năng hấp phụ. Pha động có thể là chất lỏng hay chất khí.
-Sắc ký phân bố (partition chromatography): pha tĩnh được giữ trên bề mặt
một chất rắn gọi là chất mang (support), chất mang phải là chất trơ, không tham gia

vào quá trình sắc ký. Pha động có thể là chất lỏng hay chất khí.
-Sắc ký trao đổi ion (ion-exchange chromatography): pha tĩnh là chất nhựa
trao đổi ion (hợp chất cao phân tử có mang những ion có khả năng trao đổi với các
ion cùng dấu của hỗn hợp sắc ký).
-Sắc ký theo loại cỡ (size-exclusion chromatography) còn gọi là sắc ký trên
gel. Các phân tử cỡ lớn sẽ được loại, các phân tử nhỏ hơn sẽ được tách theo kích
thước, phân tử bé di chuyển chậm.
Các phương pháp sắc ký khác: sắc ký ái lực, sắc ký điện…
Ghi chú: Trong sắc ký khí, chủ yếu là sắc ký phân bố và sắc ký hấp phụ
2. Cơ sở lý thuyết sắc ký (Giới thiệu sơ lược):
Có hai yếu tố quyết định quá trình tách sắc ký :
- Tốc độ di chuyển của các chất: Các chất khác nhau phải có tốc độ di
chuyển khác nhau, cho các pic ở vị trí khác nhau trên sắc đồ.
- Sự mở rộng dải hay sự doãng pic (band broadening, peak spreading), do
các tiểu phân của cùng một chất di chuyển với tốc độ khác nhau.
Hai pic ở gần nhau trên sắc đồ nếu bị doãng nhiều sẽ trùm lên nhau (xen phủ lên
nhau), không tách được khỏi nhau.
Ta hãy xét hai vấn đề nêu trên :
2.1. Tốc độ di chuyển của các chất:
2.1.1. Tốc độ di chuyển của một chất:
Viện Kiểm nghiệm ATVSTP quốc gia 4
Tài liệu tập huẩn
Tốc độ di chuyển của một chất có thể được mô tả bởi các đại lượng về sự lưu
giữ của chất đó trên pha tĩnh (thời gian lưu, thời gian lưu hiệu chính).
a- Thời gian lưu (retention time): Trên sắc đồ, trục tung chỉ cường độ tín hiệu
của detectơ, trục hoành là trục thời gian (hoặc thể tích dung môi).
Hãy quan sát sắc đồ, trường hợp có một chất (hình 1).
Thời gian lưu t
R
(phút) là thời gian cần để một chất di chuyển từ nơi tiêm mẫu

qua cột sắc ký, tới detectơ và cho pic trên sắc đồ (tính từ lúc tiêm đến lúc xuất hiện
đỉnh của pic).
t
0
: là thời gian lưu của một chất không bị lưu giữ (là chất di chuyển với tốc
độ của pha động). t
0
thường được gọi là thời gian chết.
t
R
càng lớn, chất tan bị lưu giữ càng mạnh và di chuyển càng chậm.
b-Thời gian lưu hiệu chính t’
R
được tính theo công thức:
t’
R
= t
R
- t
0


Hình 1: Sắc đồ một chất
2.1.2. Tốc độ di chuyển tỷ đối của hai chất:
Viện Kiểm nghiệm ATVSTP quốc gia 5
w
Thời gian, phút
w = chiều rộng pic
đường nền
t

o
Tín hiệu
đến
detector
w
Thời gian, phút
w = chiều rộng pic
đường nền
t
o
Tín hiệu
đến
detector
t
R

Tiê
m
Tài liệu tập huẩn
Được đặc trưng bởi đại lượng thừa số chọn lọc hay hệ số chọn lọc α
(selectivity factor), còn gọi là hệ số tách:
α =
'
'
RA
RB
t
t
Theo qui ước, B là chất bị lưu giữ mạnh hơn A vì vậy α luôn luôn lớn hơn 1.
α còn được gọi là độ lưu giữ tỷ đối (relative retention).

Để tách riêng hai chất, cần có α > 1, thường chọn α trong khoảng 1,05 đến
2,0. α càng lớn hai chất càng tách ra khỏi nhau, với α quá lớn thời gian phân tích sẽ
kéo dài.
2.2 Sự doãng píc và hình dáng píc.
Như trên đã trình bày, hình dáng của pic và sự doãng píc liên quan chặt chẽ đến
sự tách sắc ký. Hình dáng lý tưởng của píc là píc đối xứng. Trên thực tế píc sắc ký
thường chỉ gần đối xứng. Để đánh giá tính bất đối của píc người ta dùng hệ số bất
đối AF (Asymmetry Factor).

AF = b / a

h
b = phần chiều rộng phía sau của píc.
a = phần chiều rộng phía trước của píc. a b
w
1/10
= a+b = chiều rộng của píc được 10% h
đo ở 1/10 chiều cao của píc.
Hình 2
Tính bất đối của pic
Một cột được nhồi tốt sẽ có AF trong khoảng 0,9 -1,1.(xác địnhAF với píc
của các chất chuẩn).
Cũng có thể dùng hệ số đối xứng SF (symmetry factor):
SF= w
1/20
/ 2a trong đó w
1/20
được đo ở 1/20 chiều cao của pic
Sự doãng píc (peak spreading) hay sự mở rộng dải là một hiện tượng đặc biệt
quan trọng trong sắc ký và được nghiên cứu qua thuyết về đĩa và thuyết động học.

Sự doãng píc là kết quả của sự di chuyển nhanh chậm khác nhau của các
phân tử của cùng một chất trong khi đi qua cột sắc ký. Các píc ra muộn bao giờ cũng
tù hơn. Một cột sắc ký tốt (hiệu lực cao) sẽ cho các píc nhọn (ít bị doãng).
Viện Kiểm nghiệm ATVSTP quốc gia 6
Tài liệu tập huẩn
2.3 - Hiệu lực của cột và đĩa lý thuyết:
Hiệu lực của cột (column efficiency ) thường được đo bằng hai thông số: số
đĩa lý thuyết N và chiều cao đĩa lý thuyết H (hay HETP).
Ta có thể coi như cột sắc ký được chia thành N phần mỏng hay N lớp, ở mỗi
lớp sự phân bố chất tan vào hai pha lại đạt đến một trạng thái cân bằng mới (sắc ký
là một quá trình động, thực ra pha động chảy liên tục và thời gian không đủ để thiết
lập trạng thái cân bằng). Những phần mỏng (hay lớp)giả định này được gọi là đĩa lý
thuyết (vì không có thực). Nếu cột sắc ký có chiều dài là L thì ta có biểu thức:
H = L / N
Trong đó N: là số đĩa lý thuyết của cột.
L : chiều dài cột
H: là chiều cao của đĩa lý thuyết.
Cột có N lớn (hay có H nhỏ) là cột có hiệu lực cao.
a. Chiều cao đĩa lý thuyết và sự doãng píc.
Ta có thể xác định H và N dựa vào thực nghiệm.
Hình 3 Pic sắc ký (a) so sánh với đường cong phân bố chuẩn Gauss (b)
Dựa vào sắc đồ (xem hình 3a) ta có thể tính số đĩa lý thuyết N
N = 16
2









b
R
W
t
trong đó W
b
= chiều rộng píc ở đáy píc.
hay N = 5,54
2
2/1








W
t
R
với W
1/2
= chiều rộng píc đo ở nửa chiều cao của pic.
Và từ đó tính H : H = L/N
Qua đây ta thấy rõ : khi cột có hiệu lực cao (H nhỏ N lớn)
thì W
b

nhỏ (độ doãng píc nhỏ).
Viện Kiểm nghiệm ATVSTP quốc gia 7
t
R
Trục thời gian
t
R
Trục thời gian
Tín hiệu đo
Tài liệu tập huẩn
b. Độ phân giải và các yếu tố ảnh hưởng (sự tách hai chất).
Độ phân giải (Resolution) là đại lượng đo mức độ tách hai chất trên một cột sắc
ký. Xét trường hợp tách hai chất A và B (xem hình 4)
Độ phân giải R
S
được định
nghĩa như sau:
R
S
=
)(2/1
AB
RARB
WW
tt
+
−
hay

R

S
=
AB
RARB
WW
tt
,2/1,2/1
)(18,1
+
−
trong đó W là chiều rộng pic ở
đáy và W
1/2
là chiều rộng pic ở nửa
chiều cao
Hình 4 R
S
và sự tách 2 pic
Với hai pic có độ lớn tương đương thì:
R
s
= 0,75 hai pic không tách tốt, còn xen phủ nhau nhiều.
R
s
= 1,0 hai pic tách khá tốt,còn xen phủ nhau 4%
R
s
=1,5 hai pic tách gần hoàn toàn (chỉ xen phủ 0,3%)
2.4. Trường hợp tách nhiều chất, ảnh hưởng của thành phần dung môi và
nhiệt độ.

Khi có nhiều chất cần tách, trong sẵc ký lỏng thường có thể thay đổi thành
phần dung môi để tách riêng được tất cả các chất trong hỗn hợp. Có thể phải thay
đổi loại dung môi, cũng có thể chỉ cần thay đổi tỷ lệ giữa các thành phần.
2.4.1 Rửa giải đẳng dòng (isocratic elution, rửa giải thường) :
Đó là cách dùng một hệ dung môi có thành phần xác định trong suốt quá trình
phân tích. Hình 5 dưới đây cho sắc đồ của 4 lần phân tích 1 hỗn hợp 5 chất, mỗi lần
dùng 1 pha động có thành phần khác.
Viện Kiểm nghiệm ATVSTP quốc gia 8
Tài liệu tập huẩn
Hình 5. ảnh hưởng của thành phần pha động (hỗn hợp methanol-nước) đến
việc tách hỗn hợp 5 chất
Hình 5 cho thấy việc thay đổi thành phần dung môi có thể ảnh hưởng đến quá trình
tách mạnh mẽ như thế nào (thêm một ít nước vào Methanol 60% để có Methanol
50%: các pic 1, 2, 3, 4, 5 lần lượt được tách trên sắc đồ (c).
Trong 4 hệ dung môi, hệ c (50% methanol) là thích hợp nhất vì các pic được
tách tốt và chỉ cần 10 phút, hệ d tách rất tốt nhưng thời gian phân tích cần đến 20
phút.
2.4.2. Rửa giải gradient (gradient elution), chương trình hoá dung môi
(solvent programming)
Trong nhiều trường hợp, rửa giải đẳng dòng (dùng một hệ dung môi có thành
phần không đổi) không giải được bài toán tách các chất.
Trong những trường hợp này, người ta phải thay đổi thành phần dung môi
ngay trong quá trình phân tích (chương trình hoá dung môi hay rửa giải gradient).
Xem hình 6.
Viện Kiểm nghiệm ATVSTP quốc gia 9
Tài liệu tập huẩn
Hình 7 Rửa giải gradient cho phép tách hỗn hợp 10 chất, hình (b)
Trên hình 7 ta thấy nếu rửa giải với một hệ dung môi có thành phần cố định
(sắc đồ a) trong số 10 chất, thì 5 chất đầu không tách được (các pic quá gần nhau)
trong khi 5 chất sau ra chậm và quá tù. Bằng phương pháp chương trình hoá dung

môi (thành phần dung môi biến đổi dần trong quá trình chạy sắc ký, bắt đầu từ một
hệ dung môi yếu hơn và kết thúc bằng một hệ mạnh hơn so với hệ dung môi dùng ở
sắc đồ a) ta có sắc đồ b ở đó các pic được phân bố đều và tách rất tốt. Chương trình
dung môi có thể chia làm nhiều đoạn với các kiểu biến đổi thành phần dung môi
khác nhau.
Để giải các bài toán tách nhiều chất với yêu cầu thời gian phân tích càng ngắn
càng tốt, nếu không thể chọn một điều kiện sắc ký thích hợp, ta có thể dùng phương
pháp biến đổi dần dần điều kiện sắc ký theo một chương trình nào đó.
Trong sắc ký lỏng, hay dùng chương trình hoá dung môi (rửa giải gradient).
3. Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao:
Viện Kiểm nghiệm ATVSTP quốc gia 10
1
2
3
4
5
7
6
8
Tài liệu tập huẩn
Hình 8 giới thiệu sơ đồ nguyên tắc chung cho các máy HPLC


Hình 8
1-Bình chứa dung
môi ;
2- Lọc dung môi
3- Bơm cao áp;
4- Bộ tiêm mẫu5- Cột
sắc ký;

6- detectơ ;
7 - Máy ghi tín hiệu;
8 – Bình hứng.
3.1. Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi
Cần lọc loại các hạt vẩn trong dung môi và đuổi khí hoà tan trong dung môi.
Khí hoà tan có thể làm biến dạng các pic và sinh bọt khí làm nhiễu đường nền làm
xuất hiện các pic lạ Có thể đuổi khí dung môi bằng nhiều cách: dùng siêu âm, đun
và khuấy, sục khí trơ như heli, lọc dưới áp suất giảm
Trong phương pháp rửa giải thường chỉ cần một bình dung môi. Trong
phương pháp rửa giải gradient, thường dùng 2, 3, 4 bình chứa các dung môi khác
nhau và hệ dung môi rửa giải là hỗn hợp của các loại dung môi trên được trộn với tỷ
lệ biến đổi theo chương trình đã định.
3.2. Hệ thống bơm:
Các đơn vị áp suất hay dùng trong HPLC: 1Pa = 1 Nm
-2
; 1 bar = 10
5
Pa;
1 psi = 0,4536
×
9,81 / 0,0254
2
= 6897 Pa; 1 at = 1 kg cm
-2
= 1,01 bar
Trong phân tích hay dùng loại bơm dòng không đổi (constant flow). Bơm
kiểu piston là loại được dùng phổ biến, để khử xung người ta dùng bơm có hai
piston bơm luân phiên. Loại sau được dùng phổ biến vì có nhiều ưu điểm.
3.3. Hệ tiêm mẫu:
Viện Kiểm nghiệm ATVSTP quốc gia 11

Tài liệu tập huẩn
Phương pháp phổ biến là dùng van tiêm có vòng chứa mẫu (sample
loop) với dung tích xác định và chính xác. Có thể thay đổi các vòng mẫu dung tích
khác nhau: 5 đến 500 µl. Loại 20µl được dùng phổ biến. Tiêm bằng van tiêm có độ
chính xác cao. Hình 9 Mô tả một loại van tiêm
Van tiêm có hai vị trí của rô-to, vị trí (a) để nạp mẫu (load) vào vòng mẫu, vị
trí (b) để tiêm mẫu (inject) bằng cách cho dung môi qua vòng mẫu để đưa mẫu lên
cột.
3.4. Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao
Cột bằng thuỷ tinh dùng ở áp suất thấp (dưới 50 at), được bọc trong một vỏ
thép. Cột bằng thép không gỉ được dùng phổ biến.
Cột phân tích thường dài 10-30 cm có đường kính trong 4-10 mm, hạt chất
nhồi cỡ 5-10 µm. Với chất nhồi cỡ 3-5 µm có thể dùng các cột ngắn (3-10 cm) và
nhỏ (1- 4,6 mm). Loại cột này có hiệu lực rất cao, có số đĩa lý thuyết lên đến
100.000 đĩa cho 1 m cột. Đường kính ngoài của cột thường là 1/4 inch.
Cột điều chế có thể có kích thước lớn hơn cột phân tích nhiều lần. Cột bán
điều chế nhỏ nhất (để tách lấy lượng nhỏ chất để đem phân tích) thường có đường
kính trong 9-12 mm dài 50 cm hoặc hơn nữa.
Chất nhồi cột thường là silicagel hoặc có bọc một lớp mỏng chất hữu cơ. Bên
cạnh silicagel người ta còn dùng những hạt khác: nhôm oxyt, polyme xốp, chất trao
đổi ion.
3.5. Detector:
Viện Kiểm nghiệm ATVSTP quốc gia 12
Hình 9. Van tiêm mẫu:
1- Vòng chứa mẫu, 2- Bình dung môi và bơm, 3- Cột sắc ký
4- Nơi nạp mẫu vào vòng chứa mẫu 5- Phần mẫu còn thừa
Tài liệu tập huẩn
Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu được
ghi trên sắc đồ. Các loại detector được dùng phổ biến là:
- Detector đo chỉ số khúc xạ (RI) là detector vạn năng nhưng kém nhạy.

- Detector huỳnh quang và detector điện hoá có độ nhạy độ chọn lọc cao hay
dùng trong phân tích vết và phân tích y sinh học.
- Detector tử ngoại-khả kiến (UV-Vis), còn gọi là detector hấp thụ quang,
dùng đèn deuterium (đo ở 190-400 nm) và đèn wolfram (đo ở 380-600 nm), có thể
làm việc ở bước sóng tùy chọn theo tính chất hấp thụ ánh sáng của chất muốn phát
hiện. Loại này hiện nay được dùng nhiều nhất.
- Detector chuỗi diod (mảng diod) DAD hay PDA là detector hấp thụ quang
nhưng cho phép đo đồng thời tại nhiều bước sóng (đo phổ UV) trong quá trình sắc
ký, cho phép đánh giá độ tinh khiết của pic và góp phần xác định định tính thêm
chắc chắn.
- Detector khối phổ. Các chất sau khi được tách trên cột sắc ký, được đưa vào
máy khối phổ. Tại đây phân tử các chất được bắn phá, ion hóa, cho ta các ion mảnh
đặc trưng, giúp ta định tính các chất dựa vào phổ khối của chất (dựa vào khối lượng
của phân tử mẹ và các mảnh đặc trưng) và định lượng dựa vào việc đo mật độ
(abundance) của các mảnh đặc trưng. Việc phân tích bằng khối phổ 2 lần liên tiếp
làm tăng độ nhạy và độ chính xác của kết quả.
Hệ thống sắc ký-khối phổ có thư viện phổ khối cho phép xác định nhiều chất
chưa biết.
4. Các phương pháp sắc ký
4.1. Sắc ký phân bố (Partition chromatography)
Gồm 2 loại: Phương pháp sắc ký lỏng-lỏng và sắc ký pha liên kết
- Sắc ký lỏng-lỏng (LLC) pha tĩnh là chất lỏng được bao trên bề mặt của các
hạt chất mang (support). Pha tĩnh thường được dung môi hoà tan và mất dần. Hiện
tượng này làm cột mất dần hiệu lực (cột chảy máu). Ngày nay phương này ít được
dùng. Một ví dụ: tách thuốc trừ sâu dùng β-β’oxydipropionitril (ODPN) làm pha
tĩnh, isooctan làm pha động.
- Sắc ký pha liên kết (BPC - Bonded phase chromatography). Ở đây pha tĩnh
được gắn hóa học (liên kết) với chất mang (hạt silicagel) tạo nên hợp chất cơ-
siloxan:
Viện Kiểm nghiệm ATVSTP quốc gia 13

Tài liệu tập huẩn
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
| | | |
- Si - OH + Cl - Si – R → - Si – O – Si – R + HCl
| | | |
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
Nhóm silanol
của silicagel
Dẫn chất
Clorosilan
Dẫn chất
Siloxan
- Nếu R là một nhóm ít phân cực như octyl (C
8
), octadecyl (C
18

) hay phenyl và dung
môi phân cực như methanol, acetonitril thì có sắc ký pha đảo (pha ngược)
Ở đây pha tĩnh ít phân cực hơn pha động, trái với truyền thống của sắc ký trước đây
là pha tĩnh phân cực hơn pha động.
- Nếu R là nhóm khá phân cực như alkylamin - (CH
2
)n NH
2
hay alkylnitril - (CH
2)
n
CN và dung môi ít phân cực như hexan thì ta có sắc ký pha thuận (pha thường).
Hiện nay sắc ký pha đảo được dùng hết sức rộng rãi vì nó cho kết quả tách tốt
với rất nhiều đối tượng tách.
Cơ chế tách trong sắc ký pha liên kết là khá phức tạp, còn nhiều điều tranh
cãi.
- Cách chọn pha: thường chọn pha tĩnh có tính phân cực giống các chất cần
tách, và khác với pha động.
- Thứ tự rửa giải: Trong sắc ký pha thuận các chất ít phân cực ra trước.
Trong sắc ký pha đảo các chất phân cực ra trước rồi đến các chất ít và không phân
cực ra sau.
- Ứng dụng: sắc ký lỏng phân bố hiệu năng cao được dùng trong việc tách các
chất thuộc nhiều lĩnh vực như: dược, sinh hóa, thực phẩm (Đường nhân tạo, chất
chống oxy hoá, chất phụ gia, aflatoxin), độc chất (thuốc trừ sâu, diệt cỏ).
Ghi chú: Các chất khá phân cực, các ion có khối lượng nhỏ khó bị lưu giữ trên pha
tĩnh ít phân cực của sắc ký pha đảo. Các ion có thể tác dụng với các thuốc thử là ion
đối (trái dấu) có trong pha động, tạo thành cặp ion trung hoà điện và có thể được lưu
giữ trên pha tĩnh. Đó là cơ sở của phương pháp sắc ký pha đảo tạo cặp ion.
Viện Kiểm nghiệm ATVSTP quốc gia 14
Tài liệu tập huẩn

4.2. Sắc ký hấp phụ (sắc ký lỏng – rắn: LSC)
Là phương pháp phát triển sớm nhất và được dùng phổ biến. Trong phương
pháp này chất tan bị giữ trên bề mặt pha tĩnh tức là chất hấp phụ và bị dung môi đẩy
ra (phản hấp phụ). Sắc ký hấp phụ cũng thường được gọi là sắc ký pha thuận
(normal phase)
-Các pha tĩnh và động: pha tĩnh là những bột mịn, xốp, có diện tích bề mặt
riêng lớn (Spherisorb S 10W: 220 m
2
/g). Silicagel và nhôm oxyd là những chất được
dùng nhiều trong sắc ký hấp phụ nhưng silicagel là chất được ưa dùng hơn cả. Ở đây
các chất càng phân cực càng bị lưu giữ mạnh và ra chậm khi rửa giải.
Về pha động, dưới đây cho ta một dãy một số các dung môi với sức rửa giải
tăng dần: Hexan, benzen, cloroform, aceton, butanol, methanol.
Dãy này xếp theo khả năng đẩy các chất ra khỏi chất hấp phụ. Có thể dùng
hỗn hợp vào dung môi theo tỷ lệ thích hợp.
4.3. Sắc ký trao đổi ion:
Là phương pháp sắc ký trong đó các nhựa trao đổi ion.
- Nhựa trao đổi ion (ionit). Đó là những hợp chất cao phân tử có chứa nhóm
chức có khả năng trao đổi ion (nhóm trao đổi)
- Nhựa trao đổi cation (cationit) có 2 loại: Cationit acid mạnh có nhóm -SO
3
H
và được ứng dụng rộng rãi, cationit acid yếu có nhóm - COOH.
- Nhựa trao đổi anion (anionit) cũng có 2 loại: Anionit base mạnh có nhóm
amoni bậc 4 - N(CH
3
)
3
+
OH

-
và anionit yếu có nhóm trao đổi là các amin bậc 2 hay 3
Với cationit có sự trao đổi cation (ví dụ với dung dịch chứa Ca
++
)
2RSO
3
-
H
+
+ Ca
++
(R SO
3
-)

2
Ca
++
+ 2H
+
(1)
cationit (rắn) dung dịch rắn dung dịch
Với anionit, ta có ví dụ:
2R (CH
3
)
3
+
OH

-
+ SO
4

[ R (CH
3
)
3
]
2
SO
4

+ 2OH
-
(2)
Phương pháp này được dung để tách các ion vô cơ và hữu cơ.
4.4. Sắc ký lỏng trên gel (size exclusion; sk loại theo cỡ)
Sắc ký loại theo cỡ (size exclusion chromatogrphy) là một phương pháp mới
phát triển và được ứng dụng chủ yếu cho các chất có phân tử lượng lớn.
- Chất nhồi cột và các pha: chất nhồi ở đây là các hạt gel.
Viện Kiểm nghiệm ATVSTP quốc gia 15
Tài liệu tập huẩn
- Chất nhồi cho sắc ký loại theo cỡ là những hạt xốp của silicagel hay polime có
kích thước nhỏ (khoảng 10 µm). Pha tĩnh là dung môi nằm trong các lỗ xốp của hạt,
pha động là dung môi chảy giữa các hạt.
• Các phân tử chất tan có kích thước lớn (bằng cỡ lớn, cỡ trung bình của các lỗ
xốp) thì sẽ không bị lưu giữ và di chuyển theo dung môi (tức là bị loại).
• Các phân tử nhỏ hơn có thể khuếch tán vào lỗ xốp.
• Các phân tử rất nhỏ so với lỗ xốp sẽ đi sâu vào các lỗ này và coi như bị sa

bẫy, rất khó ra. Khi rửa giải các phân tử sẽ lần lượt ra theo cỡ từ lớn đến nhỏ.
Các gel ưa nước được dùng với pha động và dung dịch nước và phương pháp
được gọi là sắc ký lọc trên gel (gel filtration chromatography). Nếu các gel kỵ nước
thì dùng pha động là các dung môi hữu cơ không phân cực và phương pháp được
gọi là sắc ký thẩm thấu trên gel (gel permeation chromatography)
Có nhiều loại gel với các cỡ lỗ xốp khác nhau dùng để tách các phân tử thuộc
dải cỡ khác nhau .

5. Ứng dụng của sắc ký trong phân tích
Cần lưu ý là sắc ký chỉ là phương pháp tách, tách tinh tế và rất có hiệu quả,
được dùng rất phổ biến để nghiên cứu các thành phần trong một hỗn hợp.
Sau khi được tách và đi ra khỏi cột, chúng được đưa tới những detector và
được phát hiện, được định tính, định lượng dựa trên những đặc tính khác của chúng
như độ hấp thụ, chiết suất, độ dẫn nhiệt, khối lượng các phân tử hay các mảnh của
nó (tức là trên thực tế chúng được định tính định lượng bằng các kỹ thuật khác như
quang phổ hấp thụ, phổ huỳnh quang, phổ khối, các phương pháp điện hoá )
5.1. Định tính và thử độ tinh khiết :
Sắc ký được dùng rộng rãi để xác nhận sự có mặt hay vắng mặt các thành
phần của hỗn hợp một số giới hạn các chất mà ta đã biết. Ví dụ có thể phát hiện một
cách khá chắc chắn hơn 30 acid amin trên một sắc đồ phân tích dịch đạm thuỷ phân.
Việc định tính một chất dựa vào vị trí của pic của chất đó trên sắc đồ (tức là
dựa vào thời gian lưu t
R
). Nếu một pic của một chất chưa biết X trên sắc đồ trùng
với vị trí của pic của chất chuẩn A trên sắc đồ trong cùng điều kiện sắc ký, thì có thể
chất X đó là A. Kết luận X là A chỉ chắc chắn khi tiến hành sắc ký với nhiều hệ pha
tĩnh và động khác nhau về bản chất nhưng thời gian lưu của X và A luôn luôn bằng
nhau.
Viện Kiểm nghiệm ATVSTP quốc gia 16
Tài liệu tập huẩn

Định tính bằng sắc ký dựa vào t
R
không cho ta kết quả hoàn toàn chắc chắn.
Việc xác nhận một chất không có mặt trong hỗn hợp (vì không có pic tương ứng
trên sắc đồ) thường chắc chắn hơn xác nhận sự có mặt một chất. Dù sao cũng nên
nhớ là pic không xuất hiện có thể do lượng chất quá nhỏ, cũng có thể là do điều kiện
đo không thích hợp (ví dụ chọn nhầm bước sóng mà chất không hấp thụ).
Sắc ký thường được dùng để kiểm tra độ tinh khiết của mẫu thử (không được
có các pic ứng với các tạp chất).
5.2. Định lượng :
Sắc ký là phương pháp rất thuận lợi để định lượng một chất trong hỗn hợp vì
chất đó được tách khỏi các chất khác, và đồng thời được định lượng dựa vào việc đo
chiều cao hay diện tích của pic.
Với các pic nhọn thì phương pháp đo chiều cao cho kết quả chính xác hơn
Khi pic tù hay lệch thường đo diện tích tốt hơn.
Hiện nay hầu hết các máy sắc ký đều có phần mềm cho phép đo diện tích pic
bằng phương pháp tích phân.
Sau đây là một số phương pháp định lượng thường dùng trong sắc ký:
5.2.1. Phương pháp đường chuẩn. (Calibration curve).
Phương pháp dùng phổ biến hiện nay là phương pháp đường chuẩn. Pha một
số dung dịch chất chuẩn (hay chất đối chiếu) có nồng độ khác nhau đã biết. Thông
thường người ta pha 4-6, có thể tới 10 dung dịch. Môi trường pha dung dịch chuẩn
có thể là dung môi hay dung dịch có thành phần càng giống môi trường của mẫu thử
càng tốt. Nếu môi trường ít có ảnh hưởng thì có thể pha trong dung môi tinh khiết
thích hợp hay trong dung môi pha động của phương pháp sắc ký.
Đem các dung dịch chuẩn chạy sắc ký, đo chiều cao hoặc diện tích pic rồi lập
đường chuẩn tức là đường biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích hay chiều cao của
pic đối với nồng độ. Trên trục tung là chiều cao hay diện tích pic, trên trục hoành là
nồng độ hay hàm lượng chất. Thông thường người ta sử dụng các đường chuẩn có
dạng đường thẳng.

Sau đó đem chạy sắc ký dung dịch mẫu thử. Dựa vào diện tích hay chiều cao
của pic chất thử trên sắc đồ, đối chiếu với đường chuẩn có thể tìm được nồng độ
chất thử. Không được phép ngoại suy (extrapolation), nghĩa là nồng độ dung dịch
thử đem chạy sắc ký không được nằm ngoài khoảng các dung dịch chuẩn đem chạy
sắc ký.
Viện Kiểm nghiệm ATVSTP quốc gia 17
Tài liệu tập huẩn
Trong phương pháp trên, chất chuẩn được gọi là chuẩn ngoại (external
standard) vì nó không được đưa vào trong mẫu thử khi phân tích.
5.2.2. Phương pháp dùng chuẩn nội (internal standard).
Trong phương pháp dùng chuẩn ngoại, ta không thể đảm bảo là điều kiện sắc
ký mẫu chuẩn và mẫu thử là như nhau. Vì vậy kết quả phân tích dựa vào sự so sánh
các sắc đồ mẫu thử và mẫu chuẩn không chắc đã chính xác. Phương pháp chuẩn nội
cho độ chính xác cao hơn. Chuẩn nội là một chất khác với chất phân tích, cho pic có
vị trí trên sắc đồ gần với chất phân tích và tách khỏi các pic khác (R
S
> 1,25).
Chuẩn nội được thêm vào dung dịch chuẩn ngoại và dung dịch mẫu thử.
Đại lượng dùng trong phân tích ở đây sẽ là các tỷ số S
e
/ S
i
và S
t
/ S
i
hoặc
H
e
/H

i
và H
t
/ H
i

trong đó: S
e
,S
i
và S
t
là

các

diện tích pic chuẩn nội, chuẩn ngoại và chất thử,
: H
e
,H
i
và H
t
là

các

chiều cao pic chuẩn nội, chuẩn ngoại và chất thử.
Phương pháp chuẩn nội có thể cho sai số thấp (có thể đạt tới 0,5 - 1%).
5.2.3. Phương pháp đường chuẩn thêm (Standard addition)

Khi cần định lượng một chất trong một môi trường phức tạp, còn gọi là có
nền (matrix) phức tạp, như định lượng một chất trong thịt, người ta thường dùng
phương pháp đường chuẩn thêm. Trong phương pháp này, ta thêm những lượng chất
chuẩn khác nhau vào ngay trong mẫu thử rồi chạy sắc ký mẫu thử không thêm và
các mẫu thử có thêm chuẩn. Vẽ đường chuẩn diện tích (hay chiều cao) của pic thay
đổi theo lượng chuẩn thêm vào. Đường chuẩn kéo dài sẽ cắt trục hoành tại điểm ứng
với nồng độ chất cần xác định có trong mẫu thử. (xem hình 10 ở dưới đây).
Phương pháp này cho phép loại bớt ảnh hưởng của nền đối với kết quả định lượng.
Hình 10.
Đường chuẩn
thêm
5.2.4
Phương
pháp chuẩn
hoá (standardization)
Viện Kiểm nghiệm ATVSTP quốc gia 18
Tài liệu tập huẩn
Nếu các chất có pic trên sắc đồ của một hỗn hợp đều đáp ứng như nhau đối
với detector thì diện tích S
i
của pic một chất sẽ cho biết hàm lượng chất đó trong hỗn
hợp các chất.
C
i
(%) =
100
1
×
∑
=

n
i
i
i
S
S

trong đó
i
S
là diện tích pic của chất thứ i trong hỗn hợp,

∑
=
n
i
i
S
1
là tổng diện tích các pic ứng với các chất của hỗn hợp trên sắc đồ.
PHẦN II
TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU
NĂNG CAO HPLC
2.1 Nguyên tắc chung về phương pháp HPLC
Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và
pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn). Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách
dưới dạng dung dịch. Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố
liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc
phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của
chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau. Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác

nhau và tách ra khỏi nhau.
• Cấu tạo của hệ thống HPLC Nên chú thích tiếng việt trong hình
Viện Kiểm nghiệm ATVSTP quốc gia 19
Tài liệu tập huẩn
Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC
Cũng như tất cả các thiết bị sắc ký khác, thiết bị HPLC có thể hình dung gồm 3 phần
chính:
- Phần đầu vào cấp pha động có thành phần mong muốn và mẫu phân tích.
- Phần tách: là phần trung gian tâm của hệ sắc ký bao gồm cột tách, đôi khi có
cột phụ trợ.
- Phần phát hiện và xử lí số liệu: phần này bao gồm các detector, phần bộ phận
khuếch đại, computer máy tính và phần mềm xử lí số liệu, bộ phận ghi tín
hiệu.
• Sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm nhiều phương pháp có đặc thù riêng, đó
là sắc ký hấp phụ, sắc ký lỏng pha liên kết; sắc ký trao đổi ion; sắc ký cặp
ion, sắc ký điện di mao quản; sắc ký phân bố lỏng-lỏng; sắc ký rây phân
tử Phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất là sắc ký lỏng pha liên kết.
2.2. Pha tĩnh trong HPLC
Trong HPLC, pha tĩnh (stationary phase) chính là chất nhồi cột. làm nhiệm
vụ tách hỗn hợp chất phân tích. Đó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ,
từ 3 - 7µm. Tuỳ theo bản chất của pha tĩnh, trong phương pháp sắc ký lỏng pha
liên kết thường được chia làm 2 loại: sắc ký pha thường (NP-HPLC) và sắc ký pha
ngược (RP-HPLC)
Viện Kiểm nghiệm ATVSTP quốc gia 20
Tài liệu tập huẩn
• Sắc ký pha thường (hay pha thuận): pha tĩnh có bề mặt là các chất phân cực
(đó là các silica trần hoặc các silica được gắn các nhóm ankyl có ít cacbon
mang các nhóm chức phân cực : như -NH
2
, -CN được gắn trên trên silica.),

pha động là các dung môi hữu cơ không phân cực hay ít phân cực như: n-
hexan, toluene…Hệ này có thể tách đa dạng các chất không phân cực hay ít
phân cực.
• Sắc ký pha ngược (hay pha đảo): pha tĩnh thường là các chất không phân cực
như silica đã được ankyl hoácác alkyl mạch C8, C18, không phân cực, loại
thông dụng nhất là –C
18
H
37
, gắn (liên kết) trên silica; còn pha động là các chất
phân cực như : nước, methanol, axetonitrilacetonitril…Trong rất nhiều
trường hợp thì thành phần chính của pha động lại là nước nên rất kinh tế. Hệ
này được sử dụng để tách các chất có độ phân cực rất đa dạng: từ rất phân
cực, ít phân cực tới không phân cực [2].
2.3. Pha động trong HPLC [1]
Pha động trong sắc ký lỏng nói chung có những yêu cầu sau:
- Pha động phải trơ với tướng pha tĩnh
- Bền vững và không bị phân huỷ trong quá trình chạy sắc ký
- Hoà tan được mẫu
- Phải có độ tinh khiết cao
- Có độ nhớt thấp và phù hợp với detector
- Không quá đắt
Một pha động phù hợp là một dung môi hoặc hỗn hợp dung môi góp phần tốt
nhất có thể được vào phép tách. Phù hợp ở đây là phù hợp về độ phân cực, về
detector cũng như các tính chất cần thiết khác như khả năng tạo phức.
Có thể chia pha động làm hai loại: là pha động có độ phân cực cao và pha
động có độ phân cực thấp.
Loại thứ nhất có thành phần chủ yếu là nước, các alcol như methanol,
acetonitril, tuy nhiên để phân tích các chất hữu cơ, cần thêm các dung môi khác để
giảm độ phân cực. Pha động loại này được dùng trong sắc ký pha liên kết ngược.

Viện Kiểm nghiệm ATVSTP quốc gia 21
Tài liệu tập huẩn
Loại thứ hai là các dung môi ít phân cực như dicloromethan,
xyclopentancyclopentan, n-pentan, n-heptan, n-hexan, 2-chloropropan,
cacbondisulfua (CS
2
), chlorobutan, CCl
4
, toluene…Tuy nhiên pha động một thành
phần đôi khi không đáp ứng được khả năng rửa giải, người ta thường phối hợp 2 hay
3 dung môi để có được dung môi có độ phân cực từ thấp đến cao phù hợp với phép
phân tích. Tách các hỗn hợp mẫu phức tạp người ta phải dùng pha động có thành
phần là hỗn hợp các dung môi. Sự thay đổi thành phần pha động đôi khi diễn ra theo
thời gian, trường hợp này người ta gọi là rửa giải gradient nồng độ.
2.4. Các loại detector trong HPLC
Detector là bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phương pháp. Tuỳ
thuộc bản chất lí hoá của chất phân tích mà lựa chọn detector cho phù hợp
- Detector quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS: áp dụng cho các chất có khả
năng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại (UV) hoặc vùng khả kiến (VIS).
- Detector huỳnh quang RF: sử dụng để phát hiện các chất có khả năng phát
huỳnh quang. Đối với những chất không có khả năng như vậy, cần phải dẫn
xuất hoá chất phân tích, gắn nó với chất có khả năng phát huỳnh quang hoặc
chất phân tích phản ứng với thuốc thử để tạo thành sản phẩm có khả năng
phát huỳnh quang.
- Detector độ dẫn: phù hợp với các chất có hoạt tính điện hoá: các ion kim loại
chuyển tiếp…
Hiện nay, các detector hiện đại ngày càng được cải tiến, như diot-
araydetector mảng diod (DAD hay PDA), detector khối phổ (MS), nó giúp người
phân tích xác định chính xác chất phân tích. Ngoài ra do kĩ thuật tin học phát triển,
người phân tích có thể thực hiện phép tách theo chương trình định sẵn, có thể thực

hiện các phép tách tự động nhiều mẫu phân tích.
2.5. Một số đại lượng đặc trưng của HPLC
2.5.1 Thời gian lưu
Khi được nạp tiêm vào cột sắc ký, các chất phân tích sẽ bị giữ lại trên cột
trong một khoảng thời gian nhất định. Đó chính là thời gian lưu của nó, tính từ lúc
Viện Kiểm nghiệm ATVSTP quốc gia 22
Tài liệu tập huẩn
mẫu được nạp tiêm vào cột cho đến lúc chất tan được rửa giải ra khỏi cột ở điểm có
nồng độ cực đại
t
Ri
= t
o
+ t’
Ri
Trong đó: t
o
là thời gian chết (thời gian lưu của chất không bị lưu giữ)chất phân tích
nằm trong pha động)
t’
Ri
là thời gian lưu giữ thực của chất phân tích trên cột tách
2.5.2 Số đĩa lí thuyết
Hiệu lực của cột tách được đo bằng số đĩa lí thuyết N của cột.công thức dưới đây có
sửa
2
1/2
2
2
i

2
W
54,5
W
.16
RR
tt
N ==
Trong đó: t
Ri
: thời gian lưu của chất phân tích i trên cột tách
t
o
: thời gian không lưu giữ
W
i
: chiều rộng đáy chân pic
W
1/2
: chiều rộng đo ở nửa chiều cao pic
h: chiều cao

pic
A: diện tích pic
Giá trị N là quá nhỏ thì không có sự tách tốt đối với các chất phân tích, hoặc
sự tách không hoàn toàn. Còn nếu N là quá lớn thì cũng không cần thiết vì khi đó
các pic sắc ký của các chất sẽ cách nhau quá xa, khiến việc rửa giải tốn nhiều dung
môi. Thực tế với các mẫu của HPLC thường N nằm từ 4000 ÷ 7500 là vừa đủ.
2.5.3 Hệ số đối xứng pic
Để đánh giá tính đối xứng của pic sắc ký (xem có kéo đầu hay kéo đuôi

không), ta có thể dùng hệ số đối xứng F:
2a
W
=
F
:
W: chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao của pic
Viện Kiểm nghiệm ATVSTP quốc gia 23
Tài liệu tập huẩn
a: khoảng cách từ chân đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường
cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic.
Ta cũng có thể đánh giá tính cân đối xứng theo công thức:
A
B
S
=
A: khoảng cách từ chân đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường
cong phía trước tại vị trí 1/10 chiều cao pic.
B: khoảng cách từ chân đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đưòng
cong phía sau tại vị trí 1/10 chiều cao pic.
S = 1,0 ÷ 1,05 là pic rất đẹp (lí tưởng)
S = 1,5 là chấp nhận được
S = 2 là pic xấu
S = 4 là pic rất xấu
2.5.4 Hệ số tách chọn lọc α (selectivity factor), còn gọi là hệ số tách
Hệ số táchHệ số chọn lọc α là đại lượng đánh giá khả năng tách 2 chất bằng
phương pháp sắc ký và là tỉ số thời gian lưu của 2 chất: α = tt’
ARB
/t’
B

t’
RA
.
Theo quy ước, B là chất lưu giữ mạnh hơn, nên α luôn lớn hơn 1
- Điều kiện cần thiết để 2 chất A và B tách ra khỏi nhau là: α ≠ > 1.
α càng lớn hai chất tách khỏi nhau càng rõ ràng.
- Khi α = 1 thì hai chất không có sự tách do lúc này chúng cùng nằm trong
một pic.
- Khi α ≈ 1 thì hai chất có pic chung một vùng, tức là pic bị chập nhau, cũng
không thể tách ra thành hai pic riêng biệt đặc trưng.
2.5.5 Độ phân giải R (Resolution)
Độ phân giải R nói lên mức độ tách ra khỏi nhau của hai chất A và B công thức dưới
đây có sửa
Viện Kiểm nghiệm ATVSTP quốc gia 24
Tài liệu tập huẩn
BA
WW
)(2
+
−
=
RARB
tt
R
Ở đây: t’
RA
và t’
RB
là thời gian lưu thực của các chất A và B
W

A
và W
B
là chiều rộng đáy pic của A và B
Theo qui luật phân bố của Gaoxo và Rayley, điều kiện tối thiểu để cho 2 chất
A và B tách ra khỏi nhau thì cực tiểu của pic A nằm gần nhất vị trí cực đại của B, và
để tách hoàn toàn rõ ràng thì cực tiểu của pic phía sau B phải kề với cực tiểu phía
sau pic A, tức là R
AB
= W
A
+ W
B
2.6. Phân tích định tính và định lượng bằng HPLC
2.6.1 Phân tích định tính
Một trong các đại lượng đặc trưng cho sự tách sắc ký của các chất trong một
hệ pha đã chọn là thời gian lưu của các chất. Nghĩa là trong một hệ pha và trong các
điều kiện tách HPLC đã chọn thì mỗi chất phân tích sẽ có thời gian lưu khác nhau và
cố định. Chính đại lượng này là một tính chất hay thông số để định tính các chất
trong một hỗn hợp mẫu.
Vì vậy, sau khi đã chọn được các điều kiện tối ưu cho quá trình sắc ký, tiến
hành ghi sắc đồ của mẫu phân tích, và xác định thời gian lưu của từng pic ứng với
mỗi chất trong sắc đồ. Sau đó so sánh thời gian lưu của chất phân tích với thời gian
lưu của chất chuẩn, từ đó sẽ xác định được trong mẫu phân tích có những chất nào.
2.6.2 Phân tích định lượng
Trong HPLC có thể dùng một trong 2 phương pháp là phương pháp đường
chuẩn hoặc phương pháp thêm tiêu chuẩn để định lượng. Việc dùng phương pháp
nào trong hai phương pháp đó tuỳ thuộc vào loại mẫu phân tích và hàm lượng chất
phân tích
H

i
= k
1.
C
i
S
i
= k
2
. C
i
H
i
, S
i
là chiều cao pic và diện tích pic tương ứng của chất i
C
i
là nồng độ chất i
K
1
k
1
, k
2
là các hằng số thực nghiệm
Viện Kiểm nghiệm ATVSTP quốc gia 25