Ứng dụng CNSH để khai thác các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học

09/02/2015

Phần 1
Chuyên đề

Ứng dụng CNSH để khai thác
các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học

Hệ thống trao đổi chất
ở sinh vật

06/02/2015

Trao đổi sơ cấp
• Trao đổi chất sơ cấp là một loại trao đổi chất liên quan trực tiếp
đến sự sinh trưởng, phát triển và sinh sản bình thường của sinh
vật. Trao đổi chất sơ cấp liên quan trực tiếp đến các chức năng
sinh lý bình thường của sinh vật.
• Quá trình chuyển hóa xảy ra bên trong một tế bào hoặc một sinh
vật cần thiết để duy trì hoạt động sống. Trong trao đổi chất nhiều
chất bị phân giải để thu nhận năng lượng trong khi những chất
khác cần thiết cho sự sống lại được tổng hợp.
• Trao đổi chất sơ cấp xảy ra ở tất cả các sinh vật, mang tính đặc thù
loài, tế bào, mô.
• Ngược lại, trao đổi chất thứ cấp không liên quan trực tiếp đến các
quá trình trên nhưng có vai trò về chức năng sinh thái. Trao đổi
chất sơ cấp có mặt ở một số taxon (thực vật, nấm, vi khuẩn…).

•
•
•

•
•
•
•

Trao đổi thứ cấp
• Là một dạng trao đổi chất tạo ra các hợp chất hữu cơ không liên
quan trực tiếp đến sự sinh trưởng, phát triển và sinh sản bình
thường của một sinh vật. Không giống trao đổi chất sơ cấp,
không có hoặc thiếu chất trao đổi thứ cấp không ảnh hưởng
nghiêm trọng hoặc chết của sinh vật tuy nhiên lại ảnh hưởng
đến khả năng sống sót, mức độ sinh sản, thẩm mĩ, hình dạng
hoặc không ảnh hưởng gì.
• Trao đổi chất thứ chất thường chỉ hạn chế ở một số loài hoặc
nhóm sinh vật nằm trong một nhánh tiến hóa nhất định.
• Chất trao đổi thứ cấp thường liên quan đến khả năng đề kháng
của thực vật với động vật ăn lá, côn trùng.
• Đối với con người, chất trao đổi thứ cấp thường được dùng để
làm thuốc, hương liệu hoặc làm vật liệu trung gian để tổng hợp
hóa học.

Một số khái niệm

Con đường trao đổi chất
(Metabolic pathway)

Metabolism
Metabolite
Secondary metabolite
Antimetabolite

Metabolic control analysis
Metabolome
Metabolomics (the study of global metabolite
profiles in a system (cell, tissue, or organism)
under a given set of conditions.

• Là một loạt các phản ứng hóa học xảy ra trong
một tế bào thường được xúc tác bởi enzyme, ion
kim loại, vitamin, cofactor.
• Tập hợp các con đường trao đổi chất đan xen với
nhau được gọi là mạng lưới trao đổi chất.
• Các con đường trao đổi chất giúp duy trì mối cân
bằng động bên trong tế bào hoặc cơ thể.
• Catabolic pathway (con đường dị hóa) và
Anabolic pathway (con đường đồng hóa) trái
ngược nhau. Con đường đồng hóa tạo ra các
phân tử sinnh học mới.

1


09/02/2015

Trao đổi chất…
• Một con đường trao đổi chất liên quan đến sự biến đổi từng
bước của một phân tử ban đầu thành sản phẩm khác. Sản
phẩm trao đổi chất có thể được sử dụng theo 3 cách:
 Sử dụng ngay, khi sản phẩm cuối cùng của con đường trao đổi chất
vừa được tạo ra.
 Khởi động con đường trao đổi chất khác (tiền chất cho con đường

khác).
 Dự trữ trong tế bào.

• Một phân tử được gọi là cơ chất đi vào một con đường trao
đổi chất phụ thuộc vào nhu cầu của tế bào và mức độ sẵn có
của cơ chất đó. Khi nông đột chất trung gian của quá đồng
hóa và dị hóa tăng lên hoặc sản phẩm cuối cùng sẽ có thể ảnh
hưởng đến tốc độ trao đổi chất ở một con đường nhất định.

Carbohydrate metabolism

Tổng quan về con đường trao đổi chất
• Mỗi con đường trao đổi chất bao gồm một loạt chuỗi
phản ứng hóa học liên hệ chặt với nhau bởi cơ chất,
chất chuyển hóa trung gian và sản phẩm của chuỗi.
• Con đường trao đổi chất thường được xem là dòng
một chiều, mặc dù các phản ứng hóa học có tính chất
thuận nghịch. Chẳng hạn quá trình tổng hợp amino
acid theo một con đường nhất định nhưng quá trình
phân giải lại đi theo con đường riêng biệt.
• Một ngoại lệ là con đường đường phân (glycolysis)
phân giải glucose nhưng một số phản ứng trong con
đường đường phân lại tham gia vào quá trình tổng hợp
glucose (gluconeogenesis).

Glycolysis vs Glycogenesis

Vai trò của hormon trong điều hòa troa đổi chất

2

09/02/2015

Trao đổi chất kị khí

Metabolic pathways

Các thành phần chính của con đường trao đổi
chất và chất trao đổi sơ cấp

•
•
•
•
•
•

Trao đổi chất thứ
cấp

Amino acids and proteins
Lipid
Carbohydrates
Nucleotides
Coenzymes
Minerals and cofactors

Shikimic acid pathway

Mevalonate pathway

3


09/02/2015

Mevanonate and non-mevalonat pathway

Phần 2
Cơ chế điều hòa trao đổi chất

Cơ chế điều hòa trao đổi chất
• Điều hòa bởi enzyme
• Điều hòa bởi hormon
• Điều hòa bởi thụ thể

Tương tác không cộng hóa trị
Điều hòa dị lập thể
• Ức chế dị lập thể
– Tăng Km (giảm ái lực gắn của enzyme)
– Giảm Vmax (giảm tốc độ phản ứng enzyme)

Tương tác không cộng hóa trị
Điều hòa dị lập thể
• Chất hoạt hóa dị lập thể
– Giảm Km (tăng ái lực enzyme với cơ chất)
– Tăng Vmax (tăng khả năng xúc tác của enzyme)

Tương tác không cộng hóa trị

Tương tác protein – protein
• Calmodulin (CALcium MODULted proteIN)
– Gắn Ca++ với calmodulin dẫn đến thay đổi hình
dạng và cho phép gắn và hoạt hóa một số enzyme

4


09/02/2015

Gắn calcium vào Calmodulin thay đổi hình
dạng protein
Unbound Calmodulin on left
Calcium bound Calmodulin
on right. Stars indicate
exposed non-polar ‘grooves’
that non-covalently binds
proteins

Điều hòa hoạt động enzyme bằng tương tác
cộng hóa trị
• Enzymes activating enzymes allows for
amplification of a small regulatory signal

Điều hòa bởi tương tác cộng hóa trị
Phosphorylation và Dephosphorylation
• Gắn hoặc loại bỏ nhóm Phosphate (serine,
threonine, or tyrosine)  thay đổi hoạt tính
enzyme

Thay đổi số lượngenzyme
• Enzyme Cảm ứng vs Cơ định
• Cảm ứng bởi tăng tốc độ phiễn mã
– Hormones hoạt hóa các TFs
• Tăng tổng hợp mRNA
• Tăng tổng hợp một số enzyme

Hormones, Receptors, và Sự tương tác giữa các tế bào

• Thụ thể giữa các tế bào
• Các hormon hòa tan trong lipid

Phần 3

Hợp chất tự nhiên

• Các hormon steroid, vitamin D, retinoids, thyroxine

• Gắn với thụ thể protein
– Gắn với các yếu tố điều hòa (cis/trans) của gene
– Thay đổi tốc độ phiên mã
• Cảm ứng hoặc ức chế phiên mã

5


09/02/2015

Hợp chất tự nhiên

Những nhóm hợp chất tự nhiên quan trọng

Định nghĩa
• Terpenoid: tổng hợp từ Acetyl-CoA theo con đường

•

Là hợp chất hóa học được tạo ra một cách tự nhiên bởi sinh vật

mevalonic (sesquiterpene và các dẫn xuất)

có hoạt tính sinh dược học sử dụng để sản xuất dược phẩm,

• Phenol/polyphenol: những hợp chất chứa vòng thơm

thuốc…
•

được tổng hợp theo con đường acid shikimic hoặc acid

Hợp chất tự nhiên cũng bao gồm các hợp chất được tổng hợp

malonic (flavonoid)

hoàn toàn bằng con đường hóa học với các đặc điểm và tính

• Hợp chất chứa nitơ: từ các amino acid (alkaloid)

chất giống với các hợp chất được tổng hợp bởi sinh vật.

Ví dụ: Hợp chất tự nhiên ức chế ung thư

Ứng dụng hợp chất tự nhiên
•
•
•
•
•
•

Thuốc chữa bệnh (ung thư, trợ tim, thần kinh)
Kháng sinh, kháng viêm
Chống oxy hóa, tăng cường miễn dịch
Diệt côn trùng, ký sinh
Hương liệu
Chất màu bổ sung thực phẩm

•
•
•

Gắn với tubulin
Ức chế topoisomerase
Ức chế telomerase

6


09/02/2015

Tubulin và chất gắn với tubulin
•

Vi ống là những protein dạng sợi được cấu
tạo từ tubulin. Trong quá trình phân bào, các
NST gắn vào vi ống để di chuyển về phía
trung tử.

•

Các tế bào ung thư phân chia rất mạnh. Nếu
can thiệp vào quá trình gắn của các vi ống với
NST sẽ ức chế quá trình nhân lên của tế bào
ung thư.

•

Gắn với tubulin sẽ ức chế được tế bào ung

Tương tác của các chất
gắn tubulin sẽ dẫn đến
thay đổi cấu trúc và ảnh
hưởng đến chức năng của
tế bào

thư.

Topoisomerase

Topoisomerase

• Topoisomerase tham gia vào quá trình sao chép
và sửa chữa DNA.
• Topoisomerase kiểm soát trạng thái xoắn của
phân tử DNA bằng cách cắt và nối liên kết
phosphodiester của phân tử DNA.

Topoisomerase inhibitors
• Là những chất ức chế hoạt động của enzyme
Topoisomerase.
• Topoisomerase đang được coi là đích để phát
triển các chất chống ung thư. Ức chế hoạt động
của Topoisomerase các phân tử DNA sợi đơn
ngắn hoặc các đoạn DNA mạch kép bị cắt  thay
đổi tính toàn vẹn của genome.
• Nhưng tế bào bị đứt gãy DNA sẽ bị chết theo cơ
chế apoptosis.

7


09/02/2015

Nguồn hợp chất tự nhiên
•
•
•
•
•
•

Mô thực vật
Sinh vật biển (rong, tảo)
Động vật (trên cạn, biển)
Nọc độc
Nấm/vi nấm
Vi sinh vật

Những khó khăn trong khai thác
các hợp chất tự nhiên
• Chỉ có mặt ở một số loài sinh vật nhất định
• Chỉ có hoạt tính trong điều kiện nuôi trồng tự
nhiên
• Chỉ có hoạt tính khi ở dạng cấu trúc nhất định, các
dạng đồng phân khác không có hoạt tính hoặc
hoạt tính thấp
• Cải biến đặc hiệu vị trí bằng con đường hóa học
rất khó khăn (gắn các nhóm chức).
• Hàm lượng thấp, khó tinh sạch

8


09/02/2015

Khai thác hợp chất tự nhiên
Lên men vi sinh vật
Nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi vi tảo
Khó khăn: hoạt tính thấp hoặc không
có hoạt tính

Xu hướng khai thác các hợp chất tự nhiên

• Tách chiết từ các nguồn tự nhiên
• Tìm các nguồn hợp chất mới

Natural
compounds

Tách chiết từ thực vật, vi sinh
vật, nấm
Khó khăn: tinh sạch và triển
khai ở quy mô lớn, chi phí cao

• Tổng hợp hóa học
• Cải biến hóa học
• Cải biến bằng xúc tác enzyme
• Sử dụng hệ thống xúc tác tế bào để chuyển hóa
• Sử dụng các sinh vật chuyển gene

Tổng hợp hóa học
Khó khăn: sản phẩm phụ, độc, các đồng phân
không mong muốn

Chuyển hóa bằng enzyme
Khó khăn: hiệu quả cao nhưng rất đắt

Con đường tổng hợp các hợp chất tự nhiên

Sinh vật

Các con đường tổng hợp

Vi khuẩn

MVA hoặc MEP

Vi khuẩn cổ

MVA

Tảo lục

MEP

Thực vật

Shikimic, MVA, MEP

Động vật

MVA

Nấm

MVA

MVA và MEP

9

09/02/2015

Chuyển hóa sinh học

Chuyển hóa sinh học

Quá trình chuyển hóa sinh học tạo ra nhiều hợp chất có
đặc tính hóa học, sinh dược học

Nhà máy
tế bào

Tiền chất
Tiền chất

Sản phẩm

Tế bào
Giá trị thấp
Hoạt tính thấp
Khó cải biến bằng con đường hóa học

Tế bào bình thường
Tế bào cải biến di truyền

Giá trị cao
Hoạt tính mạnh
Bền vững

Làm thế nào để có tiền chất?
Plants

Mevalonate
pathway
(MEP)

Microalgae

Microbe

Sikimic acid
pathway

Công nghệ sinh học trong sản xuất
hợp chất tự nhiên

Non-mevalonate
pathway (MVA)

Tế bào có nhiều con đường trao đổi chất  có thể thu
được tiền chất

Nguồn gene
Khai thác dữ liệu
Các con đường trao đổi chất

Chuyển gene
mong muốn

Tiền chất

• Khai thác sinh khối hoặc hệ thống xúc tác
tế bào

Tế bào chủ
Kiểm tra hoạt tính
•
•
•
•

Ức chế ung thư
Chống oxy hóa
Diệt côn trùng
Bệnh cây

Phân tích
Chuyển hóa

Sản phẩm cuối cùng

Công nghệ sinh học

•
•
•
•
•

UV-vis
HPLC
Spectrofluorometer
NMR
MALDI MS

– Thực vật: photobioreactor
– Vi sinh vật (nấm, vi tảo): lên men

• Chuyển gene
– Thực vật: photobioreactor
– Vi sinh vật (nấm, vi tảo): lên men

Nâng quy mô lớn

Phát triển sản phẩm

10


09/02/2015

Reference data, Martin et al., 2001; Jackson et al., 2003; Martin et al., 2003; Ro et al., 2006; Takahashi et al., 2007, Asadollahi et al.,
2008; Wang et al., 2011a; Albertsen et al., 2011; Peralta-Yahya et al., 2011; Westfall et al., 2012

Ví dụ

Artemisinin

•

Tế bào nấm men được dùng, biểu
hiện gene mã hóa enzyme
amorphadiene synthase và
cytochrome P450 monooxygenase
(CYP71AV1)

Món ngon

Model of induction of l-glutamate production in C. glutamicum.

Paclitaxel

Artemisia annua

Chất chống sốt rét

Taxus brevifolia

Sử dụng dưới dạng paclitaxel (Taxol)
để chống ung thư hiệu quả trong
nhiều năm

Chuyển hóa thông qua con
đường tổng hợp terpen.
Toàn bộ cụm gene chuyển hóa
đã được đưa vào E.coli và nấm
men.

Ví dụ: Sản xuất axit glutamic

Nắm được các con đường trao đổi chất
(khai thác các CSDL)

Nakamura J et al. Appl. Environ. Microbiol. 2007;73:4491-4498

11


09/02/2015

Terpene production in E. coli: FPP source of host cell
Mevalonate vector

Acetyl-CoA

Pyruvate

Glyceraldehyde-3-phosphate

Acetyl-CoA

Acetyl-CoA acetyltransferase

pAC-Mev

Ptac

DXP synthase

CoA

P15A ori

DXP

Acetoacetyl-CoA

10.6 kbp

Acetyl-CoA

TrrnB
IPP
PMVA
HMG CoA HMG CoA
kinase isomerase reductase synthase

NADP+

CoA

MEP

HMG-CoA

Removal of the
HMG-CoA
reductase and

HMG-CoA
synthase genes

2NADPCoA

MVA
ATP

MVA kinase
ADP

CDP-ME

ATP

DPMVA decarboxylase

Terpenoids

HMB-PP synthase

HMB-PP

DPMVA

IPP
isomerase

Sesquiterpene

IPP
GPP
GPP synthase
IPP
FPP synthase

DMAPP

Sesquiterpene cyclase
MCS

Bổ sung các nhóm chức năng
Oxy hóa hoặc sắp xếp lại khung C

HMB-PP reductase

ADP, Pi, CO2

IPP

TrrnB
IPP
DPMVA
PMVA
MVA
Ptac kinase decarboxylase kinase isomerase

Terpenes

MEcPP synthase

MEcPP
ADP

Cmr
P15A ori

ATP

CDP-ME kinase
Mevalonolacto
ADP
CDP-ME-2-phosphate
ne

PMVA

8.5 kbp

Cải biến hóa học
Chuyển hóa bằng enzyme

Pi

ATP

PMVA kinase

pAC-Mv

CTP

MEP cytidyl transferase

2NADPH

HMG-CoA reductase

DPMVA
decarboxylase

NADPH

DXP reductoisomerase

HMG-CoA synthase

MVA kinase

Ví dụ
Chuyển hóa terpenoids

MEP pathway

MVA pathway

Cmr

FPP

quinone and cell wall
biosynthesis

Cytochrome P450

Cytochrome P450
Hệ thống enzyme oxy hóa khử vô
cùng hiệu quả

• Phản ứng phổ biến được xúc tác bởi P450 là phản ứng
monooxygenase (đưa một nguyên tử oxy vào cơ chất, trong khi
nguyên tử oxy khác sẽ bị khử thành nước).

• P450s được rất nhiều các nhà nghiên cứu quan tâm
• P450s sử dụng trong các phản ứng oxy hóa vào những vị trí khó
(tổng hợp hoặc chuyển hóa hóa học không thể thực hiện được).
1.
2.

Phản ứng oxy hóa định hướng (stereospecific conversion )
Có khả năng đưa nguyên tử oxy vào các vị trí liên kết đôi hoặc các liên kết
C-H chưa hoạt hóa, hoặc các vị trí nguyên tử C đã bão hòa (allylic
positions)

Tỉ lệ các thuốc kháng nấm được chuyển hóa bởi
enzyme Cytochrome P450

12

09/02/2015

Terpene cyclase
Là một enzyme vòng hóa, xúc tác phản ứng tạo
vòng trong hóa học

Valencene  nootkatone
Valencene là một sesquiterpene (hợp chất vòng thơm ở cam) rất
rẻ. Được tổng hợp từ FPP (farnesyl pyrophosphate) bởi enzyme
terpene cyclase.

FPP

Terpene cyclase

Valencene

Nootkatone là hợp chất hữu cơ tự nhiên và có phạm vi ứng
dụng rất lớn. Giá thành rất cao. Đó là một dạng sesquiterpene và
ketone.

Ví dụ: Ứng dụng của nootkatone
• Nootkatone được sử dụng ở dạng
phun xịt để xua đuổi, diệt muỗi,
gián, côn trùng
• Thân thiện với môi trường, không
độc cho người
• Sử dụng phổ biến làm chất bổ
sung thức ăn, mỹ phẩm, thuốc,
dược phẩm.

Deer tick

Cytochrome P450

Valencene

Nootkatone

13


09/02/2015

Chuyển hóa valencene thành nootkatone

Sử dụng vi tảo làm Bioreactor

Mục đích
• Sử dụng hệ thống tế bào để chuyển hóa các hợp
chất ít giá trị thành các hợp chất có giá trị cao
hơn nhiều.
• Ứng dụng để tạo ra các hợp chất mới có hoạt tính
sinh học cao hơn, giá thành rẻ hơn.
• Phát triển các sản phẩm ứng dụng trong nông
nghiệp, bảo vệ thực vật, thuốc, mỹ phẩm…

Hướng tiếp cận
• Khai thác cơ sở dữ liệu các hợp chất và các gene chuyển hóa cũng
như con đường chuyển hóa các chất đó.

• Sàng lọc tiền chất phù hợp
• Sử dụng các tế bào chủ
– Vi sinh vật (E.coli, Bacillus sp., S. pombe and yeasts…)
– Vi tảo (nước ngọt và nước mặn)
– Tế bào thực vật
• Sử dụng các tế bào chuyển gene
– Tách dòng gene hoặc cụm gene mong muốn từ các nguồn tự
nhiên hoặc tổng hợp gene
– Chuyển các gene vào vector và đưa vào tế bào chủ bằng nhiều
phương pháp khác nhau
• Các tế bào chủ: E.coli, S. pombe, cerevisiae, D. salina, C. vulgaris

Materials
Mevalonate vector
Cmr

pAC-Mev

Ptac

P15A ori

10.6 kbp

MVA kinase

TrrnB
IPP
PMVA
HMG CoA HMG CoA

kinase isomerase reductase synthase

DPMVA
decarboxylase

Removal of the
HMG-CoA
reductase and
HMG-CoA
synthase genes

Gene mong muốn:
Tách dòng từ các nguồn tự nhiên
Đặt tổng hợp từ các công ty (synthesized genes)

Cmr

pAC-Mv

Sử dụng các hệ thống vector biểu
hiện tương ứng ở các tế bào chủ khác
nhau.

P15A ori

8.5 kbp
TrrnB
IPP
DPMVA
PMVA

MVA
Ptac kinase decarboxylase kinase isomerase

MCS

14


09/02/2015

Ưu điểm khi sử dụng hệ thống
chuyển hóa bằng tế bào

Chuyển gene vào vi sinh vật
• Quy trình chuyển gene tương đối đơn giản
• Tốc độ sinh trưởng nhanh
• Dễ dàng chuyển cả cụm gene điều khiển bởi 1
promoter (multicistronic)
• Dễ dàng tiết ra ngoài môi trường
• Khó khăn: Dễ lẫn tạp, môi trường nuôi cấy chi
phí cao. Các con đường chuyển hóa hạn chế.
Cần phải cung cấp tiền chất

• Ưu tiên dùng các dạng đơn bào
• Có chứa các con đường chuyển hóa và tiền chất
• Sinh trưởng nhanh, ít lẫn tạp
• Môi trường nuôi cấy rẻ
• Dễ dàng mở rộng ở quy mô lớn
• Sử dụng các photobioreactor

Chuyển gene vào nấm men
• Quy trình chuyển gene tương đối đơn giản
• Có thể chuyển nhiều gene xen nhập vào
genome thông qua trao đổi chéo các đoạn
tương đồng
• Tốc độ sinh trưởng nhanh
• Dễ dàng tiết ra ngoài môi trường
• Khó khăn: Dễ lẫn tạp, môi trường nuôi cấy chi
phí cao. Các con đường chuyển hóa hạn chế,
cần phải cung cấp tiền chất

Chuyển gene vào thực vật
•
•
•
•

Sự phức tạp của hệ thống biểu
hiện gene ở thực vật
Mỗi gene chịu sự kiểm soát của 1
promoter
Kết hợp sử dụng hệ thống tái tổ
hợp ở nấm men để chuyển nhiều
gene vào 1 vector
Ưu điểm: Con đường trao đổi
chất rất phong phú

CaMV 35S promoter
HindIII (11702)
PstI (11694)

BamHI (11672)
SmaI (11669)
AvaI (11667)
XmaI (11667)

MCS
ClaI (11456)

NcoI (1)

P-INO (Promoter)

GUS 6 His tagged

EcoRI (10821)

ApaLI (1150)
ApaLI (1475)

LacZ Promoter
CaMV 35S promoter

3'UTR (polyA signal)

AvaI (9791)

RB (right border)

NcoI (9763)

AvaI (2485)

pCAMBIA-INO

NptII (Neomycin resistance)

AvaI (3115)

12463 bp

ClaI (8945)
AvaI (8913)

Left border
AvaI (4246)

Kanamycin resistance

AvaI (4726)
ApaLI (6995)

ClaI (5550)

ApaLI (6497)

Chuyển gene vào vi tảo
• Quy trình chuyển gene tương đối đơn giản
• Tốc độ sinh trưởng nhanh, ít lẫn tạp, môi
trường nuôi rẻ. Dễ dàng nâng quy mô lớn
• Dễ dàng tiết ra ngoài môi trường

• Khó khăn: Chưa có nghiên cứu nhiều

Bài tập
Viết tiểu luận trên cơ sở
bài báo được cung cấp

15