NUÔI cấy mô tế bào THỰC vật THÀNH tựu

NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT
THÀNH TỰU

Nhóm 2


KHÁI NIỆM
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là kĩ thuật cho phép nuôi cấy dễ dàng những tế bào thực
vật hay mô phân sinh sạch bệnh trong môi trường nhân tạo thích hợp để tạo ra những khối
tế bào hay những cây hoàn chỉnh trong ống nghiệm.


CƠ SỞ SINH LÍ CỦA CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

Tính toàn năng của tế bào thực vật.
Sự phân chia, phân hóa, phản phân hóa của tế bào.
Các đặc tính trên được xác định dựa trên cơ sở là đặc điểm di truyền. Nhưng sự thay
đổi về môi trường cũng có ảnh hưởng trực tiếp đến các đặc tính trên.


ĐIỀU KIỆN NUÔI
CẤY

ÁNH SÁNG VÀ

VÔ TRÙNG

Dụng cụ và môi
trường

NHIỆT ĐỘ

Mẫu cấy


VÔ TRÙNG DỤNG CỤ VÀ MÔI TRƯỜNG
PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG KHÔ
Dùng cho các dụng cụ có tính chịu nhiệt.
Dụng cụ trước khi đem sấy phải được gói kín bằng giấy
nhôm. Thiết bị sử dụng là lò sấy.
Thời gian khử trùng khô với hầu hết các dụng cụ như sau:
Thời gian khởi động khoãng 60p, để tất cả các dụng cụ đạt
O
180 C.
Thời gian duy trì ít nhấp 120p.
Thời gian giảm dần nhiệt độ.


VÔ TRÙNG MẪU CẤY

Chọn mẫu cấy phải căn cứ vào: trạng thái sinh lý hay tuổi của mẫu, mẫu non trẻ có
sự phản ứng với các điều kiện nuôi cấy và môi trường nuôi cấy nhanh. Ngoài ra mô
non trẻ mới được hình thành, sinh trưởng nhanh, mức độ nhiễm bệnh ít hơn.
Kích thước và vị trí mẫu cấy.
Chất lượng cây cho mẫu cấy.
Mục đích và khả năng nuôi cấy.


VÔ TRÙNG MẪU CẤY
Phương pháp phổ biến hiện nay là sử dụng hóa chất có khả năng tiêu diệt vi sinh vật.
Một số hóa chất được lựa chọn cho quá trình vô trùng mẫu cấy phải đảm bảo 2 thuộc

tính: có khả năng tiêu diệt vi sinh vật tốt và không hoặc có mức độ độc thấp đối với
mẫu thực vật. VD: NaOCl và Ca(OCl)2.
Để tăng tính linh động của hóa chất diệt khuẩn người ta dùng thêm các chất làm giảm
sức căng bề mặt như Tween 20, Tween 80, fotoflo…hoặc có thể xử lý với cồn 70%.
Có thể dùng thêm chất kháng sinh cho vô trùng mẫu cấy (gentamixin và ampicilin).


VÔ TRÙNG MẪU CẤY

Hóa chất

Nồng độ sử dụng

Thời gian xử lý

Hiệu quả

(phút)

Hypoclorit canxi

5-15%(W/v)

5-30

Rất tốt

Hypoclorit natri

10-20%(V/v)

5-30

Rất tốt

Oxy già

10-12%(V/v)

5-15

Tốt

Clorua thủy ngân

0,1-1%(W/w)

2-10

Trung bình

Nitrat bạc

1%(W/w)

5-10

Trung bình

Chất kháng sinh

50-100mg/l

30-60

Khá tốt


MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

TÍNH THẨM
pH

Vô cơ

THÀNH PHẦN

Hữu cơ

Nguồn Cacbon

THẤU

Chất điều hòa sinh
trưởng

khác


THÀNH PHẦN HỮU CƠ

Môi trường sử dụng các loại vitamin (quan trọng nhất là các vitamin nhóm B)

Loại Vitamin

Liều lượng (mg/l)

Thiamin (B1)

0,1-5,0

Axit nicotinic (B3, PP, niacin)

01-5,0

Pyrydoxin (B6)

0,1-1,0

Biotin (H)

0,01-1,0

Axit folic (M)

0,1-5,0

Riboflavin (B2)

0,1-10,0

Axit ascobic (C)

1,0-100,0

Axit pantothenic (B5)

0,5-2,5

Tocopherol (E)

1,0-50,0


THÀNH PHẦN HỮU CƠ
Hàm lượng sử dụng của myo-inositol là ≈ 100mg/l môi trường. Myo-inositol có tác dụng
thúc đẩy sinh trưởng và phát triễn, trong nhiều trường hợp nó còn có vai trò như nguồn cacbon
của môi trường nuôi cấy.
Các aminoaxit và amit giữ vai trò quan trọng trong phát sinh hình thái.





L- arginin dùng cho nuôi cấy rể. 10-100mgl/l
L-tyrolin dùng cho nuôi cấy chồi. 10-100mgl/l
L-serin dùng cho nuôi cấy hạt phấn. 10-100mgl/l.

Các dạng amit được dùng là L-glutamin, L-asparagin … một số trường hợp còn tham gia
cảm ứng và duy trì trong quá trình phát sinh phôi vô tính.

THÀNH PHẦN HỮU CƠ
Thành phần hữu cơ phức hợp được dùng trong môi trường nuôi cấy để cung cấp thêm nito,
ainoaxit, vitamin và các chất khoáng….
Sử dụng thành phần hữu cơ phức hợp khi môi trường xác định không đạt được kết quả mong
muốn về sinh trưởng và phát triễn.

Nồng độ sử dụng là 0,025-0,20% (W/v). Chứa hàm lượng khá cao các
loại Thành
vitaminphần
nhómnước
B. dừa khá phong phú,
có chứa(W/v).
inositol và các chất thuộc
Nồng độ sử dụng là 0,05-0,10%
Nước ép cà chua 30% (V/v).
nhóm cytokinin như zeatin...
Nước ép cam 3-10% (V/v).
Hàm lượng sử dụng : 10-20% (V/v)
Nước ép chuối xanh 150g/l.

Nồng độ sử dụng là 0,05-0,10% (W/v)


CÁC CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG
Nhóm auxin đưa vào môi trường nhằm thúc đẩy sự sinh trưởng và giãn nở của tế bào và
tăng cường các quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất, kích thích hình thành rễ và tham gia
vào cảm ứng phát sinh phôi vô tính.
Các loại auxin thường được xử dụng cho nuôi cấy như IAA(1,0-3,0mg/l), IBA, NOA, α-NAA,
picloram, pCPA, Diacmba với hàm lượng từ 0,1-2,0mg/l.

CÁC CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG
Nhóm cytokinin kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trưởng của
chồi invitro. Các cytokinin có biểu hiện ức chế sự tạo rể và sự sinh trưởng của mô sẹo
nhưng có ảnh hưởng dương tính rõ rệt đến phát sinh phôi vô tính của mẫu nuôi cấy.
Các loại cytokinin thường dùng là Zeatin, Kinetin, BAP, TDZ, 2-ip với hàm lượng
0,1-2,0mg/l.
Ngoài axin và cytokinin người ta còn dùng gibberillin để kích thích kéo dài tế bào.


CÁC THÀNH PHẦN KHÁC
Các chất tạo gel quyết định trạng thái vật lý của môi trường nuôi cấy. Các môi trường
đặc có chứa hàm lượng chất tạo gel làm cho chúng đông lại ở nhiệt độ bình thường.
Than hoạt tính được sử dụng với hàm lượng 0,2-0,3% (W/v).


TÍNH THẨM THẤU CỦA MÔI TRƯỜNG
Các thành phần chính ảnh hưởng đến thế năng của nước trong môi trường:





Hàm lượng đường.
Hàm lượng agar
Một số thành phần muối khoáng.

Tính thẩm thấu của môi trường đặc biệt quan trọng trong:





Nuôi cấy mô sẹo
Nuôi cấy tế bào đơn và huyền phù tế bào.
Dung hợp và nuôi cấy tế bào trần.


CÁC BƯỚC TRONG KĨ THUẬT
NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ (các cây cho mẫu nuôi cấy).
Chọn môi trường nuôi cấy thích hợp.
Bước 2: Nuôi cấy khởi động
Bước 3: Nhân nhanh
Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Bước 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên


NUÔI CẤY BAO PHẤN THUỐC LÁ
Nguyên liệu và thiết bị:
Nụ hoa thuốc lá
Nước cất 2 lần vô trùng
Etanol 90%
Dung dịch hypoclorit 10%(V/v)
Thuốc nhuộm acetocacmin
Agar
Đĩa petri
Môi trường MS hoặc NN

Kính hiển vi giải phẩu
Dao, kéo, panh…dùng cho nuôi cấy.
Một số hóa chất để pha môi trường


Khử trùng bề mặt

Tách các bao phấn

Loại bỏ
chỉ nhị

Nhuộm acetocacmin

Cây đơn bội

Nuôi cấy trên môi trường đặc

Phát triễn phôi

Nuôi cấy trên môi trường lỏng


Quy trình nuôi cấy mô cây keo lai
1. Nguyên liệu và cách tiến hành
- Chọn mẫu là những cành bánh tẻ từ những cây có chồi và lá phát triển đều, cân đối.
- Mẫu được chọn rửa kỹ bằng nước xà phòng loãng, sau đó rửa lại dưới vòi nước chảy, cho mẫu vào bình
tam giác tráng qua cồn, rửa lại bằng nước cất vô trùng rồi tiến hành khử trùng mẫu.
2. Khử trùng mẫu
- Khử trùng mẫu bằng bằng dung dịch nước Javel (nồng độ 50%), sau đó đổ bỏ dung dịch khử trùng và rửa

lại mẫu bằng nước vô trùng.
- Dùng dao cấy cắt mẫu khoảng 1,5 cm có mang một đốt lá, sau đó cấy vào môi trường vào mẫu.
- Môi trường vào mẫu là môi trường MS (Murashige and skoog) có bổ sung đường 30g/l; agar 7g/l; BA;
NAA.


Quy trình nuôi cấy mô cây keo lai
3. Quy trình tạo chồi con in-vitro
- Chọn những mẫu sống khỏe, không bị nhiễm nấm, khuẩn được sử dụng làm nguyên liệu để tạo chồi.
- Dùng dao cấy cắt bỏ hai đầu của mẫu cấy, chỉ giữ lại đoạn mang chồi và cấy vào môi trường tạo chồi.
- Môi trường tạo chồi là môi trường MS có bổ sung đường 30g/l, agar 7g/l, BA, NAA
4.Quy trình tạo cụm chồi và nhân nhanh cụm chồi
- Mẫu cấy là các chồi con in-vitro được 3 – 4 tuần tuổi, phát triển tốt, không nhiễm nấm, khuẩn. Dùng dao cấy
tách cắt lấy chồi và để nguyên ngọn chồi cấy vào môi trường tạo cụm chồi.
- Môi trường tạo cụm chồi là môi trường MS có bổ sung đường 30g/l, agar 7g/l, BA, NAA, kinetin.


Quy trình nuôi cấy mô cây keo lai
5.Quy trình tạo cây hoàn chỉnh
- Mẫu cấy là các chồi được 3 – 4 tuần tuổi, phát triển tốt, không nhiễm nấm, khuẩn.Dùng dao cấy tách cắt lấy
ngọn chồi và cấy vào môi trường tạo cây hoàn chỉnh.
- Môi trường tạo cụm chồi là môi trường MS có bổ sung đường 30g/l, agar 7g/l, IBA.
6. Quy trình ra ngoài đồng
*Tiêu chuẩn cây giống
Cây con trong bình nuôi cấy đã qua huấn luyện, cây không bị nhiễm nấm, vi khuẩn, không cong queo, không cụt
ngọn, chiều cao từ: 3-5 cm, số rễ: 3-4 rễ.
*Hỗn hợp bầu đất ươm cây
Chuẩn bị ruột bầu đất ươm cây: trộn đất tầng B và cám dừa theo tỉ lệ 7:3. Sau đó đóng ruột bầu vào túi PE có
kích thước 7 x 12cm, xếp đứng bầu đất theo luống đểtiện việc chăm sóc cây sau này.

Quy trình nuôi cấy mô cây keo lai
*Xử lý cây mầm và bầu đất trước khi ươm cây
- Trước khi cấy cây vào bầu đất, phải xử lí bầu bằng cách tưới đẫm bằng dung dich Viben C nồng
độ 0,3% trước 24 giờ.
- Cây mầm sau khi được rửa sạch, cắt bớt rễ và cấy vào bầu đất. Cây cấy thường vào lúc chiều tối
để tránh ánh nắng chiếu trực tiếp vào luống cây mới cấy
*Điều kiện nuôi ươm
- Che luống cây mới cấy bằng một lớp nilon trong để duy trì độ ẩm và phủ bên ngoài lớp nilon bằng
lưới đen để giảm cường độ ánh sáng cho cây.
- Hai ngày sau khi cấy phun dung dịch Viben-C nồng độ 0,3% để diệt nấm.
- Nhiệt độ 30-350C, ánh sáng che phủ 50%, độ ẩm 80-85%.


KẾT QUẢ CỦA NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO

Nhân giống nhanh với số lượng lớn.
Có thể tiến hành ở một số loài TV mà phương pháp nhân giống bình thường không
thực hiện được.
Tạo ra giống sạch bệnh và tương đối đồng đều về mặt di truyền
Có thể cho ra cây giống quanh năm.
Có thể sử dụng cây nhân giống từ phương pháp nuôi cấy mô để làm cây mẹ cho
những phương pháp khác.
Hiệu quả kinh tế cao đối với người mua cây nuôi cấy mô về sản xuất kinh doanh


Ý NGHĨA CỦA NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO

Giúp cho nghành nông nghiệp trở nên chủ động hơn trong vấn đề về giống và đảm bảo sự phát
triển bền vững.

Thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn gấp nhiều lần tốc độ vốn có trong tự nhiên.Nhờ đó, tạo ra
hàng loạt cá thể mới giữ nguyên tính trạng di truyền của cơ thể mẹ và làm rút ngắn thời gian đưa ra
một giống mới.
Duy trì và bảo đảm được nhiều giống cây trồng quý hiếm.