Xác định vitamin e trong một số loại dầu thực vật bằng phương pháp HPLC đảo pha

Trần Duy Anh - KTSH2-K59 - 20140228

Phân tích vitamin E trong một số loại dầu thực vật
bằng phương pháp HPLC đảo pha

1.Đặc điểm của chất cần phân tích:
Vitamin E là tên gọi của 1 nhóm hợp chất gồm các tocopherol và các
tocotrienol (gọi chung là các tocol). Chúng là những chất tan trong lipid, dễ bị oxi
hóa khi tiếp xúc với các điều kiện nhiệt, ánh sáng, môi trường kiềm. Cấu tạo của
chúng gồm vòng chromanol phân cực và nhóm 16 carbon kị nước (Hình 1).
Vitamin E tự nhiên tồn tại dưới 8 dạng khác nhau, trong đó có 4 tocopherol và 4
tocotrienol phân biệt bởi số và vị trí nhóm methyl trên vòng chromanol.

Hình 1. Cấu trúc hóa học của tocopherols và tocotrienols.
Các tocol đều có hoạt tính sinh học giống α-tocopherol. α-tocopherol trong tự
nhiên có hoạt tính cao nhất, β-, γ- and δ-tocopherols và α- and β-tocotrienols có
hoạt tính bằng 50%, 10%, 3%, 30% và 5% α-tocopherol. Là 1 chất chống oxy hóa,
các tocol làm chậm các quá trình phát triển của một số bệnh như tim mạch hay ung
thư. Ngoài ra chúng còn được chứng minh là có tác dụng điều hòa biểu hiện gene,
tín hiệu tế bào, đáp ứng miễn dịch và làm giảm mức cholesterol trong máu.


Trần Duy Anh - KTSH2-K59 - 20140228

Vì các tocol là các hợp chất dễ hòa tan trong lipid. Chúng dễ dàng hòa tan
trong dung môi hữu cơ. Sử dụng Methanol-Nước làm dung môi.
2.Nguồn gốc:
Tocopherols có mặt trong hầu hết các thực phẩm từ thực vật như dầu thực vật
và các loại hạt .Hầu hết các tocotrienols bắt nguồn từ dầu cọ và một số ngũ cốc ngũ
cốc, như lúa mì, lúa mạch và yến mạch.
Dầu ô liu và dầu đậu nành được sử dụng làm nguồn phân tích các tocopherol.

3.Cách chuẩn bị mẫu:
Chuẩn bị mẫu là bước tiêu tốn nhiều thời gian nhất khi phân tích và ảnh hưởng
đến độ chính xác. Để giảm sự mất mát của các tocol, việc chuẩn bị mẫu nên làm
đơn giản.
Các tocopherol dễ bị oxi hóa khi gặp các điều kiện như nhiệt độ, ánh sáng hay
kiềm. Để tránh mất mát Vitamin E, ta sử dụng những vật liệu tối màu và ánh sáng
hồng ngoại.
Với mẫu dầu không cần thiết phải chiết tách các Tocopherol ra khỏi dầu trước
khi chạy sắc kí do các thành phần khác của dầu như phytosterols hay carotenoids
có thời gian lưu khác với chất cần phân tích.
Các bước chuẩn bị mẫu:
-Dầu được pha với hexane (1:10).
-Sau đó 200 μl được chuyển sang ống có chứa 600 μl methanol và 200 μl dung
dịch chuẩn (300 μg/ml α-tocopherol acetate trong ethanol)
-Sau đó mẫu được trộn vortex và ly tâm (5000RPM,5mins).
-Có thể lọc qua màng lọc 0,45 μm trước khi đưa mẫu vào.
-50μl mẫu được nạp vào bộ nạp mẫu.
-Mẫu có thể được giữ trong bình tối màu ở -20 °C trong khoảng 1 tuần.
4.Điều kiện chạy sắc kí:


Trần Duy Anh - KTSH2-K59 - 20140228

HPLC là kĩ thuật được sử dụng rộng rãi để phân tích các tocol, bao gồm HPLC
thường (NP HPLC) và HPLC đảo pha (RP HPLC). Các tocol ổn định ở các điều
kiện HPLC, dễ tan vào các dung môi thích hợp và có thể kết hợp với nhiều loại
detector. Fluorescence detection (FLD) và ultraviolet detection (UV) được sử dụng
rộng rãi nhất. Khi cả 8 tocol cần được phân tách thì hay sử dụng NP HPLC. Nhưng
khi chỉ cần tách 1 số loại nhất định thì có thể dùng RP HPLC.
Với NP HPLC, mẫu được hòa tan trong dung môi hữu cơ không phân cực và

phân tách bởi sự hấp thụ. Sự phân cực của các tocol bị ảnh hưởng bởi số nhóm
metyl trên vòng chromanol.
RP HPLC cũng được dùng để phân tích các tocol. RP HPLC có lợi thể là sử
dụng pha động ít độc hại hơn NP HPLC (VD: methanol, ethanol, ...) Vì RP HPLC
có thể phân tách các chất cần phân tích mà có sự khác nhau lớn trong cấu trúc hóa
học, RP HPLC có thể dùng để phân tách cùng lúc các tocol và các hợp chất tan
trong chất béo khác.
4.1 Pha động:
Pha động được sử dụng là Methanol-Nước (96:4)
4.2 Dung môi:
Dung môi là Methanol-Nước. Dầu được pha với hexane tỉ lệ 1:10.
4.3 Cột sắc kí:
Sử dụng cột thẳng.
Kích
Hình
thước hạt dạng
hạt
5μm
Hình
cầu

Diện
tích bề
mặt
320
m2/g

Kích
thước
lỗ

150Å

Kích thước cột: 150x4,4 mm I.D.
Vật liệu nhồi cột: Silica gel
4.4 Pha tĩnh:

Thể tích
lỗ
1.15
mL/g

Nhóm
được gắn
vào
Octadecyl
C18-

Lượng
Carbon

Khoảng
pH

18.5%

2 - 7.5


Trần Duy Anh - KTSH2-K59 - 20140228

Silica gel được gắn với C18

5. Các yếu tố ảnh hưởng:
Tốc độ dòng chảy: 2 ml/min.
Nhiệt độ cột: 45°C
Sử dụng detector UV λ = 292 nm đo sau mỗi 6 phút chạy sắc kí.
6. Kết quả:
6.1 Kết quả điện di:


Trần Duy Anh - KTSH2-K59 - 20140228

Các tocol có hấp thụ ánh sáng UV ở λ = 290-300 nm và thường được sử đụng để
phát hiện và định lượng các mẫu có hàm lượng tocopherol cao như là dầu thực vật.
Do không chiết tách tocopherol trước khi chạy sắc kí , phần đầu của bảng là một
số thành phần khác của dầu như carotenoids hay phytosterols, chúng có thời gian
lưu khác với các tocopherol. Hỗn hợp dầu và hexane tỉ lệ 1:10 sẽ làm cho các peak
tách rời nhau.
6.2 Thẩm định phương pháp:
α-tocopherol acetate được sử dụng làm chất chuẩn do sẵn có và chất có cấu trúc
gần giống với chất cần phân tích. Tỷ lệ giữa diện tích peak giữa α-tocopherol và αtocopherol acetate (y) với khối lượng chuẩn của α-tocopherol (x) là tuyến tính
trong khoảng phân tích. δ-tocopherol cũng tuyến tính với hệ số tương quan lên đến
hơn 0.999 trong khoảng phân tích.

Độ chính xác trong quá trình chạy cũng được đo bằng cách tính RSD của αtocopherol và δ-tocopherol trong 10 mẫu dầu ô liu và 10 mẫu dầu đậu nành. Ở cả 2
trường hợp, kết quả cho ra đều chấp nhận được với nồng độ khoảng 1 μmol/l.


Trần Duy Anh - KTSH2-K59 - 20140228

Một phương pháp khác để kiểm tra độ chính xác của phương pháp là cho của αtocopherol và δ-tocopherol chuẩn vào với tường mức nồng độ khác nhau để đo
lượng mẫu thu hồi được. Kết quả thu được với của α-tocopherol là 100%,
107.05%, 102,02%, với của δ-tocopherol là 91.95%, 94.50%, 94.40%.
Để kiểm tra độ nhạy của phương pháp, đo giới hạn phát hiện (Detection limit) và
giới hạn định lượng (Quantification limit). DL của α-tocopherol và δ-tocopherol là
11.5 ng và 12 ng. Q của α-tocopherol và δ-tocopherol 23 ng và 25 ng.
6.3 Nhận xét:
Ưu điểm:
Chuẩn bị mẫu nhanh, đơn giản
Độ nhạy cao
Phương pháp có độ chính xác cao (RSD=2.69%) và lượng mẫu thu hồi được cao
(98,14%).
Mẫu dầu có thể được phân tích nhiều lần mà không làm ảnh hưởng đển chất
lượng của cột sắc kí.
Nhược điểm:
Cột C18 không phân tách được β- và γ- tocol.

7. Giới thiệu hệ thống thiết bị:
HPLC được tiến hành với bộ thiết bị sắc kí lỏng Hewlett Packard, bơm HP1050,
bộ nạp mẫu Rheodyne model 7125, Detector HP-1040 và cột sắc kí Tracer Extrasil
ODS-2.


Trần Duy Anh - KTSH2-K59 - 20140228

Tài liệu tham khảo:
Journal of Chromatography A: Volume 881 issue 1-2 2000 E Gimeno; A.I Castellote; R.M
Lamuela-Raventós; M.C de la Torre -- Rapid determination of vitamin E vegetable oils by RP
HPLC.

Analysis of Tocopherols and Tocotrienols by HPLC
/>