Ứng dụng DT SHPT trong giám định hài cốt

Ứng dụng DT & SHPT trong giám định hài cốt
I. Giới thiệu
II. Ty thể
◦ 1. Ty thể là gì?
◦ 2. Hệ gen ty thể
◦ 3. Đặc điểm di truyền của hệ gen ty thể

III. Các bước trong giám định hài cốt
◦ 1. Chuẩn bị mẫu
◦ 2. Nhân bội AND bằng PCR
◦ 3. Giải trình tự gen
◦ 4. So sánh gen theo dòng mẹ

IV. Kết luận


I. Giới thiệu
Các phương pháp dùng trong giám định
hài cốt
H i ệ n h i ệ n n a y c ó 3 p h ư ơ n g p h á p c h í n h d ù n g t ro n g g i á m
định hài cốt:
2 .1G. G
i ái á
mmđđị n
v iậ x
t .ư ơ n g
ị nhh qhuì nah dtih á
( đi áò m
i hỏ
s ọi cpốhtả ibcằònng n g u y ê n v ẹ n )
3.G

đ iị nhhộ ph à
kỹ thuật phân tích hệ gen ty thể.

* Phương pháp giám định hài cốt thông qua
kỹ thuật phân tích vùng gen đặc trưng của
ty thể mang lại hiệu quả và độ chính xác
cao nhất.


II. Ty thể
1. Ty thể là gì?
- Ty thể là bào quan phổ
biến được tìm thấy hầu
hết trong các tế bào nhân
chuẩn.
- Chức năng chính của
ty thể là cung cấp năng
lượng (ATP) cần thiết cho
các hoạt động sinh tổng
hợp và vận động của tế
bào.


II. Ty thể
2. Hệ gen ty thể
- Ty thể là bào quan có hệ gen riêng, nhân bản độc lập với gen nhân.
- DNA ty thể người tồn tại ở dạng mạch vòng kép, có kích thước 16560 bp, gồm:
◦ 37 gen mã hóa cho 2 phân tử ARN ribosome
◦ 22 phân tử ARN vận chuyển
◦ 13 phân tử protein là thành phần cần thiết trong các phức hợp của chuỗi hô hấp

- So với hệ gen nhân, hệ gen ty thể chứa rất ít trình tự không mã hóa xen kẽ với
vùng mã hóa.
- Ngoài ra, gen ty thể còn có vùng không mã hoá gọi là vùng kiểm soát hay vùng
D-Loop có chứa nhiều đặc điểm cấu trúc ADN đặc trưng cho cá thể nhận vật liệu
di truyền theo dòng mẹ.


II. Ty thể
- Hệ gen ty thể (mtDNA) có thể tồn
tại lâu hơn sau khi tế bào bị phá hủy
so với hệ gen trong nhân do:
◦ Có cấu trúc dạng vòng bền vững.
◦ Trong mỗi tế bào có đến hàng nghìn ty
thể, chính vì thế cũng có đến hàng
nghìn bản sao của mtDNA trong khi
DNA trong nhân có hai bản sao với
mỗi nhiễm sắc thể.


II. Ty thể
3. Đặc điểm di truyền của hệ gen ty thể là theo dòng mẹ, giống như các
DNA ngoài nhân khác. Người mẹ truyền hệ gen ty thể cho các con, nhưng
chỉ có con gái của bà mới có thể truyền hệ gen nay cho thế hệ tiếp theo.
Cơ chế này có thể được giải thích như sau :


III. Các bước trong giám định hài cốt

Chuẩn bị

mẫu

Nhân bội
ADN

Giải trình tự gen

So sánh theo dòng mẹ


Bước 1: Chuẩn bị mẫu
- Lấy một lượng nhỏ xương hài cốt để tách chiết DNA ty thể.
- Mẫu được làm sạch, nghiền thành bột trong nitơ lỏng. Sau đó, mẫu bột
xương được ngâm vào các hoá chất đặc biệt.
- DNA được tách chiết từ mẫu bằng các hóa chất và thiết bị chuyên
dụng.
- Mọi công đoạn đều được thực hiện trong môi trường in vitro.


Bước 2: Nhân bội DNA bằng PCR
Sau khi tách đươc DNA ty thể từ hài cốt tiến hành nhân
bội DNA vùng D-loop để thu được một lượng lớn DNA ty
thể phục vụ cho việc giải trình tự.
PCR là phản ứng nhân bản trình tự DNA trong ống nghiệm. Phương
pháp này được thực hiện in-vitro với sự hiện diện của enzyme DNApolymerase.


Bước 2: Nhân bội DNA bằng PCR
Các thành phần tham gia:
◦ Mạch khuôn (DNA hoặc RNA)

◦ Đoạn mồi (Primers)
◦ Enzyme DNA polymerase chịu nhiệt (Taq)
◦ dNTP
◦ Dung dịch đệm (buffers)
◦ Ion Mg2+


Giai đoạn biến tính
• Phân tử DNA được biến tính
ở nhiệt độ 94-950C trong 30s
đến 1 phút.
• Cầu nối hydrogen nối 2 sợi
DNA bị phá vỡ tạo thành 2
mạch đơn.


Giai đoạn lai
• Nhiệt độ < Tm của mồi (55650C, tùy thuộc vào độ lớn
và Tm của mồi), các mồi bắt
cặp với khuôn.
• Thời gian từ 30s – 1 phút.
• Mồi xuôi gằn đầu 3’ của
mạch khuôn 5’-3’, mồi
ngược bắt cặp ở đầu 3’ của
mạch khuôn 3’-5’.


Giai đoạn tổng hợp
Ở 720C, DNA polymerase gắn tiếp
vào sợi trống, bắt đầu bám vào và

hoạt động dọc theo sợi DNA.
Thời gian khoảng 30s đến vài chục
phút tùy thuộc kích thước đoạn
DNA cần khuyếch đại.


Kết quả
Từ một hay một vài đoạn
mạch khuôn sau 1 thời gian
ngắn đã cho ra số lượng lớn
đoạn gen cần khuyếch đại.


Bước 3: Giải trình tự gen
Có 3 phương pháp:
1. Giải trình tự gen theo phương pháp hóa học
2. Giải trình tự gen theo phương pháp dideoxy
3. Giải trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự động


1. Giải trình tự gen theo phương pháp hóa học
Bước 1:
Biến tính phân tử DNA
Thành các mạch đơn,đánh dấu
đồng vị phóng xạ P32 ở đầu 5’

Bước 2:
Xử lý hóa học phân hủy
đặc trưng 1 loại nucleotid của
mạch DNA tạo các oligonucleotide

Gồm 4 loại phản ứng.


1. Giải trình tự gen theo phương pháp hóa học
Bước 3:
Điện di trên gel polyacrylamide
Bước 4:
Đọc kết quả bằng phóng xạ tự ghi,thu
trình tự các nucleotid của mạch đơn
DNA.
Nhược điểm:
Khó thực hiện vì phải xác định khá nhiều
thông số tối ưu cho thí nghiệm.


2. Giải trình tự gen theo phương pháp dideoxy
Nguyên tắc cơ bản: Enzyme DNA polymerase xúc tác gắn các nucleotide
vào mạch đơn DNA đang tổng hợp ở vị trí 3’OH,khi gặp nucleotide không
có nhóm 3’OH phản ứng tổng hợp bị dừng lại.
Thành phần cần thiết cho mỗi ống
◦ DNA khuôn
◦ Primer có đánh dấu phóng xạ P32
◦ Các loại dNTP
◦ Enzyme Taq DNA polymerase
◦ Dung dịch đệm
◦ 1% 1 loại ddNTP.


2. Giải trình tự gen theo phương pháp dideoxy
Bước 1:

Cắt, tách các đoạn AND thành các
sợi đơn và nhân dòng AND để tạo đủ
nguyên liệu nghiên cứu.
Bước 2:
Chuẩn bị môi trường và thực hiện các
phản ứng tổng hợp.
Bước 3:
Chạy điện di và so sánh kết quả các
chuỗi mạch đơn để xác định trình tự
mạch đơn


3. Giải trình tự gen bằng máy giải
trình tự gen tự động
Nguyên tắc: Dựa trên cơ sở phương pháp dideoxy.
Tiến hành: Tùy từng loại máy mà thực hiện các bước khác nhau.
Bước 1: Chuẩn bị Master mix
Bước 2: Thực hiện phản ứng nhân gen qua máy PCR
Bước 3: Chạy máy giải trình tự và xử lý kết quả.
Ưu điểm:
- Máy đọc trình tự trên cả 2 mạch đơn
- Các ddNTP không được đánh dấu phóng xạ mà được đánh dấu bằng các chất huỳnh quang
khác nhau
=> Có thể giảm các nhầm lẫn do kỹ thuật nên nhanh chóng,chính xác.


Bước 4: So sánh gen theo dòng mẹ
Cấu trúc AND ty thể người lần đầu tiên được Anderson giải trình tự năm
1981. Trình tự gốc này được sử dụng như trình tự chuẩn để so sánh trình tự
AND ty thể giữa các mẫu giám định.

Trong đó trình tự gen vùng điều khiển D’Loop có nhiều đặc trưng cho cá
thể.
Trong quần thể người AND ty thể di truyền nghiêm ngặt theo dòng mẹ nên
có thể so sánh trình tự của mẫu cần giám định với trình tự vùng D’Loop của
mẹ, dì, cậu…
So sánh các trình tự với nhau bằng phần mềm, thông qua trình tự chuẩn
Anderson để tìm ra mối quan hệ huyết thống giữa chúng.


IV. Kết luận
1. Ưu điểm:
◦ Thời gian thực hiện rất nhanh, chỉ cần khoảng
3 giờ để khuếch đại trinh tự DNA trong khi với
phương pháp tạo dòng mất khoảng 1 tuần.
◦ Đơn giản và ít tốn kém.
◦ Độ tinh sạch của mẫu không cần cao.
◦ Chỉ cần tìm mẫu đối chứng là trực hệ theo
dòng mẹ là xác định được.


IV. Kết luận
2. Nhược điểm
◦ Chỉ có thể xác định được huyết thống khi có mẫu
thuộc dòng mẹ.
◦ Nếu xương đã bị mủn thì không thể tách chiết
được DNA ty thể.
◦ Phương pháp PCR không hoạt động được với
những đoạn DNA lớn hơn 3kb. (Phương pháp được
sử dụng tốt nhất với các đoạn DNA có độ dài dưới
1,5kb)

◦ Độ ngoại nhiễm cao.
◦ Taq-polymerase cho tỷ lệ sai khá cao. (có thể khắc
phục bằng cách kết hợp Taq và Pfu polymerase để
hoan thiện cơ chế sửa sai exonuclease 3’ – 5’)


IV. Kết luận
Tóm lại, di truyền tế bào chất (ty thể) có nhiều ứng dụng có ý
nghĩa to lớn cho sự phát triển và nghiên cứu của loài người, cũng như
trong công cuộc tìm kiếm hài cốt liệt sỹ.
Sự hiểu biết về hoạt động của các gen ty thể nằm trong mối quan
hệ phức tạp với bộ máy di truyền nhân góp phần phát triển, hoàn thiện
vấn đề tổ chức và điều hòa hoạt động của hệ thống di truyền tế bào và
ứng dụng chọn giống (VD: xác định nguồn gốc các loài động vật đã bị
tuyệt chủng; ứng dụng bất thụ đực tế bào chất trong sản xuất giống lai..)


Cảm ơn thầy và các bạn
đã lắng nghe.