Phân tích cấu trúc, hàm lượng của thuốc điều trị tiểu đường typ II metformin hydrochloride bằng các phương pháp hóa lý hiện đại

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
–––––––––––––––––––

TRẦN THỊ BÍCH HẢO

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC, HÀM LƢỢNG
CỦA THUỐC ĐIỀU TRỊ TIỂU ĐƢỜNG
TYP II METFORMIN HYDROCHLORIDE BẰNG
CÁC PHƢƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

THÁI NGUYÊN - 2016
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
–––––––––––––––––––

TRẦN THỊ BÍCH HẢO

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC, HÀM LƢỢNG
CỦA THUỐC ĐIỀU TRỊ TIỂU ĐƢỜNG
TYP II METFORMIN HYDROCHLORIDE BẰNG
CÁC PHƢƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI
Chuyên ngành: Hoá Phân Tích
Mã số: 60 44 0118

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. PHẠM THỊ THẮM

THÁI NGUYÊN - 2016
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tới
TS. Phạm Thị Thắm - nguyên giảng viên Trƣờng ĐH Khoa học - ĐH Thái
Nguyên nay là giảng viên Đại học Thủy Lợi đã tin tƣởng giao đề tài, định
hƣớng nghiên cứu, tận tình hƣớng dẫn và tạo những điều kiện tốt nhất cho tôi
hoàn thành luận văn thạc sỹ này.
Tôi xin gửi lời trân trọng cảm tới TS Dƣơng Nghĩa Bang, TS. Phạm Thế
Chính cùng các thầy cô khoa Hóa học, Trƣờng ĐH Khoa học- ĐH Thái
Nguyên đã ta ̣o điề u kiê ̣n , giúp đỡ tôi trong quá trình tri ển khai nghiên cứu,
thực hiện đề tài.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo cùng các thầy, cô, cán bộ, kĩ
thuật viên Phòng Hóa dƣợc, thuộc Viện Hóa học- Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam đã tận tình chỉ dạy và hƣớng dẫn tôi trong quá trình học
tập, thực nghiệm và thực hiện đề tài.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè lớp Cao
học khóa 2014- 2016 đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập
và làm luận văn.
Tác giả luận văn

Trần Thị Bích Hảo

a
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... a
MỤC LỤC ......................................................................................................... b
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................ e
DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................. g
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN ............................................................................... 2
1.1. Tổng quan về các phƣơng pháp xác định cấu trúc ..................................... 2
1.1.1. Phƣơng pháp phổ hồng ngoại (IR) .......................................................... 2
1.1.2. Phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) ................................ 3
1.1.3. Phƣơng pháp phổ khối lƣợng (MS) ........................................................ 5
1.2. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng - sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ........ 7
1.2.1. Khái niệm ................................................................................................ 7
1.2.2. Phân loại .................................................................................................. 8
1.2.3. Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo ................................................................. 8
1.2.4. Pha động trong sắc ký pha đảo................................................................ 9
1.2.5. Detector dad .......................................................................................... 10
1.2.6. Detector ms ........................................................................................... 11
1.3. Khái quát về bệnh tiểu đƣờng .................................................................. 13
1.3.1. Phân loại bệnh tiểu đƣờng ..................................................................... 13
1.3.2. Các thuốc điều trị bệnh tăng đƣờng huyết ............................................ 14
1.3.3. Quan niệm của y học cổ truyền về bệnh tiểu đƣờng ............................. 15

1.3.4. Các thuốc Đông y điều trị bệnh tiểu đƣờng .......................................... 15
1.4. Thuốc chữa bệnh tiểu đƣờng metformine hydrochloride ........................ 16
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc.......................................................... 16
1.4.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nƣớc ........................................................ 17
Chƣơng 2: THỰC NGHIỆM ........................................................................ 20
b
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




2.1. Hóa chất và thiết bị .................................................................................. 20
2.1.1. Hóa chất và dung môi ........................................................................... 20
2.1.2. Thiết bị xác định và phân tích cấu trúc ................................................. 20
2.1.3. Phân tích xác định cấu trúc, định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh
khiết của các sản phẩm tổng hợp đƣợc ........................................................... 21
2.2. Tổng hợp và phân tích cấu trúc của metformine hydrochloride .............. 21
2.2.1. Quy trình tổng hợp metformin hydrochloride....................................... 21
2.2.2. Phân tích cấu trúc của metformin hydrochoride bằng phổ IR ............. 22
2.2.3. Phân tích cấu trúc của metformin hydrochoride bằng phổ NMR ......... 22
2.2.4. Phân tích cấu trúc của metformin hydrochoride bằng phổ MS ............ 22
2.3. Nghiên cứu kết tinh metformine hydrochloride...................................... 23
2.3.1. Kết tinh metformin hydrochloride trong dung môi Aceton .................. 23
2.3.2. Kết tinh metformin hydrochloride trong dung môi MeOH .................. 23
2.3.3. Kết tinh metformin hydrochloride trong dung môi EtOH .................... 23
2.4. Nghiên cứu hàm lƣợng metformine hydrochloride theo phƣơng pháp
(HPLC) ............................................................................................................ 24
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 26
3.1. Tổng hợp và phân tích cấu trúc metformine hydrochloride .................... 27
3.1.1. Tổng hợp metformin hydrochloride ...................................................... 27

3.1.2. Phân tích cấu trúc của metformin hydrochloride bằng phƣơng pháp IR .... 27
3.1.3. Phân tích cấu trúc của metformin hydrochloride bằng phƣơng
pháp NMR ...................................................................................................... 28
3.1.4. Phân tích cấu trúc của metformin hydrochloride bằng phƣơng pháp MS . 30
3.2. Phân tích tìm kiếm các phƣơng pháp kết tinh metformine
hydrochloride để thu đƣợc độ sạch cao nhất ................................................... 31
3.3. Hàm lƣợng metformine hydrochloride theo phƣơng pháp hplc .............. 31
KẾT LUẬN .................................................................................................... 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 35
PHỤ LỤC
c
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




d
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

13

C- NMR

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân carbon-13 (13C Nuclear Magnetic
Resonance)

DMSO

Dimethyl sulfoxide

1

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton (1H Nuclear Magnetic
Resonance)

H- NMR

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IR

Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy)

MS

Phổ khối lƣợng va chạm điện tử (Electron Impact-Mass
Spectrometry)

H, C

Độ chuyển dịch hóa học của proton và cacbon

ppm

Phần triệu (parts per million)

s

singlet

dd

Double doulet

CHCl3

Clorofrom

EtOH

Ethanol

MW

Microwave

MeOH

Methanol

OMe

Methoxy

SOCl2

Sulfonylchlorua

e
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1.1: Quá trình tổng hợp calci cyanamid................................................ 16
Sơ đồ 1.2: Quá trình tổng hợp 1-cyanoguanidine. .......................................... 16
Sơ đồ 1.3: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride ............................... 17
Sơ đồ 1.4: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride theo Shapiro .......... 18
Sơ đồ 1.5: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride theo Shalmashi...... 18
Sơ đồ1.6: Chuyển hóa các tiền chất về metformin ........................................ 18
Sơ đồ 1.7: Tổng hợp các dẫn xuất của metformin .......................................... 18
Sơ đồ 3.1: Tổng hợp trực tiếp metformin hydrochloride ................................ 27

f
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Phổ hồng ngoại của benzyl ancol ..................................................... 3
Hình 1.2: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân của benzyl axetat ................................ 5

Hình 1.3: Phổ khối lƣợng của benzamit............................................................ 7
Hình 1.4: Cấu trúc của cột ODS. ...................................................................... 9
Hình 1.5. Sơ đồ nguyên lý hệ điot quang........................................................ 10
Hình 1.6. Các biện pháp cải tiến tăng độ nhạy của detector ........................... 11
Hình 2.2: Biểu đồ đƣờng chuẩn. ..................................................................... 25
Hình 3.1: Phổ IR của hợp chất metformin hydrochloride .............................. 27
Hình 3.2: Phổ 1H-NMR của chất metformin hydrochloride ........................... 29
Hình 3.3: Phổ 13C-NMR của chất metformin hydrochloride .......................... 29
Hình 3.4: Phổ MS của metformin hydrochloride............................................ 30
Hình 3.5: Biểu đồ đƣờng chuẩn định lƣợng.................................................... 32
Hình 3.6: Sắc kí đồ HPLC của metformin hydrochloride .............................. 33

g
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




MỞ ĐẦU
Metformin đƣợc mô tả năm 1957 nhƣ chất có hoạt tính hạ đƣờng
huyết và năm 1979 đƣợc đƣa ra thị trƣờng ở Pháp nhƣng đến tận 1994 mới
đƣợc FDA cho phép lƣu hành để chữa bệnh tiểu đƣờng Typ 2 ở Mỹ.
Metformin là một thuốc chống đái tháo đƣờng nhóm biguanid, có cơ chế tác
dụng khác với các thuốc chống đái tháo đƣờng nhóm sulfonylure.
Trƣớc đây, để xác định đƣợc cấu trúc phân tử một hợp chất hữu cơ đặc
biệt là cấu trúc và độ sạch của các hợp chất ứng dụng trong dƣợc phẩm không hề
đơn giản; có thể mất đến hàng năm hoặc vài năm. Để xây dựng đƣợc tiêu chuẩn
của hợp chất chính trong dƣợc phẩm là một công việc cực kì khó khăn và tốn
kém. Ngày nay, với các công cụ là các phƣơng pháp phân tích hóa lý hiện đại,
việc phân tích cấu trúc các hợp chất hữu cơ đã trở thành đơn giản, có khi chỉ tốn

thời gian tính bằng giờ. Việc xác định hàm lƣợng và độ sạch của các loại thuốc
cũng nhanh hơn nhiều lần do có phƣơng pháp HPLC.
Vì vậy, việc phân tích cấu trúc, hàm lƣợng của thuốc điều trị tiểu
đƣờng typ II metformin hydrochloride bằng các phƣơng pháp hóa lý hiện đại
là công việc rất quan trọng, là cơ sở để xây dựng tiêu chuẩn của sản phẩm và
là tiêu chí để đánh giá chất lƣợng giá thành của thuốc.
Do đó đề tài nghiên cứu phân tích cấu trúc, hàm lƣợng của thuốc điều
trị tiểu đƣờng typ II metformin hydrochloride bằng các phƣơng pháp hóa lý
hiện đại là có ý nghĩa khoa học và thực tiễn.

1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




Chƣơng 1
TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về các phƣơng pháp xác định cấu trúc
1.1.1. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR)
Trong số các phƣơng pháp phân tích cấu trúc, phổ hồng ngoại cho
nhiều thông tin quan trọng về cấu trúc của hợp chất.
Bức xạ hồng ngoại bao gồm một phần của phổ điện từ, đó là vùng bƣớc
sóng khoảng 10-4 đến 10-6 m. Nó nằm giữa vi sóng và ánh sáng khả kiến.
Phần của vùng hồng ngoại đƣợc sử dụng nhiều nhất để xác định cấu trúc nằm
trong giữa 2,5x10-4 và 16x10-6 m. Đại lƣợng đƣợc sử dụng nhiều trong phổ
hồng ngoại là số sóng (cm-1), ƣu điểm của việc dùng số sóng là là chúng tỷ lệ
thuận với năng lƣợng [3].
Khi chiếu các bức xạ hồng ngoại vào phân tử các hợp chất, bức xạ hồng
ngoại sẽ kích thích phân tử từ trạng thái dao động cơ bản lên trạng thái dao

động cao hơn. Có 2 lại dao động khi phân tử bị kích thích là dao động hóa trị
và biến dạng, dao động hóa trị (ν) là dao động làm thay đổi độ dài liên kết,
dao động biến dạng (δ) là dao động làm thay đổi góc liên kết.
Đƣờng cong biểu diễn cƣờng độ hấp thụ với số sóng của bức xạ hồng
ngoại đƣợc gọi là phổ hồng ngoại, trên phổ biểu diễn các cực đại hấp thụ ứng với
những dao động đặc trƣng của nhóm nguyên tử hay liên kết nhất định, (Hình 1.1).

2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




Hình 1.1: Phổ hồng ngoại của benzyl ancol
Căn cứ vào phổ hồng ngoại đo đƣợc đối chiếu với các dao động đặc
trƣng của các liên kết, ta có thể nhận ra sự có mặt của các liên kết trong phân
tử. Một phân tử có thể có nhiều dao động khác nhau và phổ hồng ngoại của
các phân tử khác nhau thì khác nhau, tƣơng tự nhƣ sự khác nhau của các vân
ngón tay. Sự chồng khít lên nhau của phổ hồng ngoại thƣờng đƣợc làm dẫn
chứng cho hai hợp chất giống nhau [3].
Khi sử dụng phổ hồng ngoại để xác định cấu trúc, thông tin thu đƣợc
chủ yếu là xác định các nhóm chức hữu cơ và những liên kết đặc trƣng. Các
pic nằm trong vùng từ 4000 - 1600 cm-1 thƣờng đƣợc quan tâm đặc biệt, vì
vùng này chứa các dải hấp thụ của các nhóm chức, nhƣ OH, NH, C=O,
C≡N… nên đƣợc gọi là vùng nhóm chức. Vùng phổ từ 1300 - 626 cm-1 phức
tạp hơn và thƣờng đƣợc dùng để nhận dạng toàn phân tử hơn là để xác định
nhóm chức. Chính ở đây các dạng pic thay đổi nhiều nhất từ hợp chất này đến
hợp chất khác, vì thế vùng phổ từ 1500 cm-1 đƣợc gọi là vùng vân ngón tay [3].
1.1.2. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (CHTHN) là phƣơng pháp vật lý hiện đại

nghiên cứu cấu trúc của các hợp chất hữu cơ. Phƣơng pháp phổ biến đƣợc sử
dụng là phổ 1H-NMR và

13

C-NMR. Hạt nhân của nguyên tử 1H và

13

C có

momen từ. Nếu đặt proton trong từ trƣờng không đổi thì moment từ của nó có
thể định hƣớng cùng chiều hay ngƣợc chiều với từ trƣờng. Đó là spin hạt
nhân có tính chất lƣợng tử với các số lƣợng tử +1/2 và -1/2 [2].
Độ chuyển dịch hóa học : Do hiệu ứng chắn từ khác nhau nên các hạt
nhân 1H và 13C trong phân tử có tần số cộng hƣởng khác nhau. Đặc trƣng cho
các hạt nhân 1H và 13C trong phân tử có độ chuyển dịch hóa học δ; đối với hạt
nhân 1H thì:
3
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN






 TMS  x 6
.10 ( ppm)
o

Trong đó: νTMS, νx là tần số cộng hƣởng của chất chuẩn TMS và của
hạt nhân mẫu đo, νo là tần số cộng hƣởng của máy phổ.
Đối với các hạt nhân khác thì độ chuyển dịch hóa học đƣợc định nghĩa
một các tổng quát nhƣ sau:


 chuan  x
.10 6 ( ppm)
o

Trong đó: νchuan, νx là tần số cộng hƣởng của chất chuẩn và của hạt
nhân mẫu đo, νo là tần số cộng hƣởng của máy phổ.
Hằng số chắn σ xuất hiện do ảnh hƣởng của đám mây electron bao
quanh hạt nhân nguyên tử, do đó tùy thuộc vào vị trí của hạt nhân 1H và 13C
trong phân tử khác nhau mà mật độ electron bao quanh nó khác nhau dẫn đến
chúng có giá trị hằng số chắn σ khác nhau và do đó độ chuyển dịch hóa học
của mỗi hạt nhân khác nhau. Theo đó proton nào cộng hƣởng ở trƣờng yếu
hơn sẽ có độ chuyển dịnh hóa học lớn hơn [1].
Dựa vào độ chuyển dịch hóa học  ta biết đƣợc loại proton nào có mặt
trong chất đƣợc khảo sát. Giá trị độ chuyển dịch hóa học không có thứ nguyên
mà đƣợc tính bằng phần triệu (ppm). Đối với 1H-NMR thì δ có giá trị từ 0-12
ppm, đối với 13C-NMR thì δ có giá trị từ 0-230 ppm.

4
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




Hình 1.2: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của benzyl axetat

Hằng số tương tác spin-spin J: Trên phổ NMR, mỗi nhóm hạt nhân
không tƣơng đƣơng sẽ thể hiện bởi một cụm tín hiệu gọi và vân phổ, mỗi vân
phổ có thể bao gồm một hoặc nhiều hợp phần. Nguyên nhân gây nên sự tách
tín hiệu cộng hƣởng thành nhiều hợp phần là do tƣơng tác của các hạt nhân có
từ tính ở cạnh nhau. Tƣơng tác đó thể hiện qua các electron liên kết. Giá trị J
phụ thuộc vào bản chất của hạt nhân tƣơng tác, số liên kết và bản chất các liên
kết ngăn giữa các tƣơng tác [1].
Hằng số tƣơng tác spin-spin J đƣợc xác định bằng khoảng cách giữa các
hợp phần của một vân phổ. Dựa vào hằng số tƣơng tác spin-spin J ta có thể rút ra
kết luận về vị trí trƣơng đối của các hạt nhân có tƣơng tác với nhau [2].
1.1.3. Phương pháp phổ khối lượng (MS)
Nguyên tắc chung của phƣơng pháp phổ khối lƣợng là phá vỡ phân tử
trung hòa thành ion phân tử và các mảnh ion dƣơng có số khối z = m/e. Sau
đó phân tách các ion này theo số khối và ghi nhận đƣợc phổ khối lƣợng. Dựa
vào phổ khối này có thể xác định phân tử khối và cấu tạo phân tử của chất
nghiên cứu [3,4].

5
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




Để phá vỡ phân tử ngƣời ta có nhiều phƣơng pháp: bắn phá bằng dòng
electron (EI), phƣơng pháp ion hóa hóa học (CI), phƣơng pháp bắn phá
nguyên tử nhanh (FAB)… Dùng dòng eclectron có năng lƣợng cao để bắn
phá phân tử là phƣơng pháp hay đƣợc sử dụng nhất. Khi bắn phá các phân tử
hợp chất hữu cơ trung hòa sẽ trở thành các ion phân tử mang điện tích dƣơng
hoặc bị phá vỡ thành các ion và các gốc theo sơ đồ:
2e (1) > 95%

ABC
ABC

e
ABC

2

3e (2)

ABC-

Sự hình thành các ion mang điện tích +1 chiếm hơn 95%, còn lại là các
ion mang điện tích +2 và điện tích âm (-). Năng lƣợng bắn phá các phân tử
thành ion phân tử khoảng 10 eV. Nhƣng với năng lƣợng cao thì ion phân tử
có thể phá vỡ thành các mảnh ion dƣơng (+), hoặc các ion gốc, các gốc, hoặc
phân tử trung hòa nhỏ hơn, nên ngƣời ta thƣờng thực hiện bắn phá các phân
tử ở mức năng lƣợng 70 eV [3].
ABC

A

ABC

AB

AB

A

BC
B
B

Sự phá vỡ này phụ thuộc vào cấu tạo chất, phƣơng pháp bắn phá và
năng lƣợng bắn phá. Quá trình này gọi là quá trình ion hóa.
Các ion ion dƣơng hình thành đều có khối lƣợng m và mang điện tích e,
tỉ số m/e đƣợc gọi là số khối z. Bằng cách nào đó tách các ion có số khối khác
nhau ra khỏi nhau và xác định đƣợc xác suất có mặt của chúng, rồi vẽ đồ thị
biểu diễn mối liên quan giữa xác suất có mặt (hay cƣờng độ I) và số khối z thì
đồ thị này đƣợc gọi là phổ khối lƣợng (Hình 1.3).
6
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




Hình 1.3: Phổ khối lượng của benzamit (C6H5CONH2).
Nhƣ vậy, khi phân tích phổ khối lƣợng ngƣời ta thu đƣợc khối lƣợng
phân tử của chất nghiên cứu, từ các pic mảnh ion trên phổ đồ có thể xác định
đƣợc cấu trúc phân tử và tìm ra qui luật phân mảnh. Đây là một trong những
thông số quan trọng để qui kết chính xác cấu trúc phân tử của một chất cần
nghiên cứu khi kết hợp nhiều phƣơng pháp phổ với nhau.
1.2. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng - sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
1.2.1. Khái niệm
Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968
trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phƣơng pháp sắc ký cột cổ điển. HPLC là
một phƣơng pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa
trong cột là chất rắn đã đƣợc phân chia dƣới dạng tiểu phân hoặc một chất

lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã đƣợc biến bằng liên
kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Phƣơng pháp này ngày càng đƣợc sử
dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định
lƣợng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt.
Phạm vi ứng dụng của phƣơng pháp HPLC rất rộng , nhƣ phân tích các
hợp chấ t thuốc trừ sâu , thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong
lĩnh vực thực phẩm, dƣợc phẩm, môi trƣờng…
7
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




1.2.2. Phân loại
Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, ngƣời
ta chia HPLC thành 4 loại:


Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography).



Sắc ký phân bố (partition chromatography).



Sắc ký ion (ion chromatography).



Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography).

Riêng SKPB đƣợc chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tƣơng đối giữa
pha tĩnh và pha động: sắc ký pha thƣờng - SKPT (normal phase
chromatography) và sắc ký pha đảo - SKPĐ (reversed phase chromatography).
Trong đó, sắc ký pha đảo đƣợc sử dụng nhiều hơn cả.
1.2.3. Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo
Trong sắc ký phân bố nói chung, pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ
đƣợc gắn lên chất mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu:


Pha tĩnh đƣợc giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật lý →
sắc ký lỏng-lỏng (liquid-liquid chromatography).



Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền → sắc ký pha liên kết (bonded
phase chromatography).
Trong quá trình sử dụng, ngƣời ta nhận thấy sắc ký pha liên kết có

nhiều ƣu điểm hơn sắc ký pha lỏng-lỏng vì một số nguyên nhân sau:
o

Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng-lỏng dễ bị hòa tan bởi pha động
nên dễ bị mất mát pha tĩnh trong thời gian sử dụng và gây nhiễm
đối với hợp chất phân tích.

o

Do pha tĩnh của sắc ký lỏng-lỏng dễ tan trong pha động nên ngƣời ta

không thể ứng dụng phƣơng pháp rửa giải gradient dung môi.

8
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




Vì vậy, ngƣời ta thƣờng chỉ quan tâm đến loại sắc ký phân bố pha liên
kết và phần lớn các loại cột sử dụng hiện nay trong sắc ký phân bố đều có cấu
trúc dạng này.
Trong SKPĐ, nhóm thế R trong hợp chất siloxan hầu nhƣ không phân
cực hoặc ít phân cực. Đó là các ankyl mạch dài nhƣ C8 (n-octyl), C18 (noctadecyl) còn gọi là ODS (octadecylsilan) hoặc các nhóm alkyl ngắn hơn
nhƣ C2; ngoài ra còn có cyclohexyl, phenyl trong đó nhóm phenyl có độ phân
cực cao hơn nhóm alkyl. Ngƣời ta nhận thấy các alkyl mạch dài cho kết quả
tách ổn định hơn các loại khác nên đây là loại đƣợc sử dụng nhiều nhất.

Hình 1.4: Cấu trúc của cột ODS.
1.2.4. Pha động trong sắc ký pha đảo
Pha động trong sắc ký lỏng nói chung phải đạt những yêu cầu sau:


Hòa tan mẫu phân tích.



Phù hợp với đầu dò.



Không hòa tan hay làm mòn pha tĩnh.



Có độ nhớt thấp để tránh áp suất dội lại cao.



Tinh khiết dùng cho sắc ký.

Trong sắ c ký pha đảo , dung môi pha động có độ phân cực cao. Trên lý
thuyết chúng ta có thể sử dụng khá nhiều dung môi nhƣng kinh nghiệm thực
tế cho thấy nƣớc, methanol, acetonitrile, tetrahydrofuran là đạt yêu cầu nhất.

9
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




Trong đó nƣớc là một dung môi đƣợc cho vào các dung môi hữu cơ để giảm
khả năng rửa giải.
Trong quá trình tách của SKPĐ, sự tƣơng tác giữa hợp chất cần phân
tích và pha động phụ thuộc rất nhiều vào moment lƣỡng cực, tính acid hoặc
tính base của dung môi. Do đó độ phân cực và độ rửa giải của dung môi có
tác động lớn lên khả năng phân tách của sắc ký.
Thông thƣờng pha động trong SKPĐ bao gồm một hỗn hợp nƣớc
hoặc dung dịch đệm với một hoặc nhiều dung môi hữu cơ phân cực tan
đƣợc trong nƣớc.
Thành phần pha động có thể cố định trong suốt quá trình chạy sắc ký

(chế độ isocratic) hoặc đƣợc thay đổi theo một chƣơng trình đã định sẵn
(chƣơng trình gradien dung môi) để có hiệu quả tách tốt hơn.
1.2.5. Detector dad
Trung tâm của thiết bị là một dãy diot hàng trăm chiếc (những máy
hiện nay có thể lắp 1024 diot) đƣợc sắp xếp cạnh nhau liên tục thành dãy trên
tấm silicon tinh khiết, kích thƣớc 1-6 cm, độ rộng của mỗi diot riêng là
0,0015 - 0,050 mm.

Hình 1.5. Sơ đồ nguyên lý hệ điot quang
10
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




Trên mỗi tấm silicon còn có một tụ điện, một công tắc cho mỗi diot. Hệ
thống đƣợc điều khiển bằng computer luôn ngắt mỗi công tắc làm cho tụ điện
đƣợc tích - 5V. Khi bức xạ chiếu vào mặt diot làm đóng mạch điện và tụ điện
phóng điện. Sự nạp điện lại đƣợc tiếp tục ở chu kỳ tiếp theo. Kết quả là dòng
điện tỷ lệ với lƣợng bức xạ chiếu vào, khuếch đại, số hóa và ghi lại vào bộ nhớ.

a) đường quang chữ Z,

b) đường quang bong bóng, c) đường quang phản xạ nhiều lần.

Hình 1.6. Các biện pháp cải tiến tăng độ nhạy của detector
(cải tiến flowcell)
1.2.6. Detector ms
Phƣơng pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS) là phƣơng pháp
nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lƣợng phân tử của

chất đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong
điện trƣờng hoặc từ trƣờng nhất định. Tỉ số giữa khối lƣợng và điện tích (m/z)
có ảnh hƣởng rất lớn đối với chuyển động này của ion. Nếu biết đƣợc điện
tích của ion thì ta dễ dàng xác định đƣợc khối lƣợng của ion đó.
Do quá trình phân tích với đầ u dò MS đòi hỏi mƣ́c đô ̣ ch ân không cao,
nhiê ̣t đô ̣ cao , các chất khảo sát phải ở trạng thái khí , vâ ̣n tố c dòng chảy nhỏ ;
trong khi hê ̣ thố ng LC la ̣i hoa ̣t đô ̣ng ở áp suấ t cao với mô ̣t lƣơ ̣ng dung môi
tƣơng đố i lớn , nhiê ̣t đô ̣ tƣơng đố i thấ p , các chất phân tí ch ở thể lỏng . Điều
này gây rấ t nhiề u khó khăn trong viê ̣c tim
̀ cách giải quyế t đƣơ ̣c sƣ̣ tƣơng thić h
giƣ̃a hê ̣ thố ng sắ c ký lỏng và đầ u dò khố i phổ.

11
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




Để khắ c phu ̣c nhƣ̃ng khó khăn trên, cầ n phải có mô ̣t kỹ thuâ ̣t trung gian
gọi là giao diện. Rấ t nhiề u kỹ thuâ ̣t giao diê ̣n (interface technology) nhƣ chùm
tia ha ̣t (FB), bắ n phá nguyên tƣ̉ nhanh dòng liên tu ̣c

(CF-FAB),… đã đƣơ ̣c

nghiên cƣ́u và ƣ́ng du ̣ng , nhƣng maĩ cho đế n cuố i thâ ̣p nhiên 80, mới có sƣ̣
đô ̣t phá t hâ ̣t sƣ̣ với kỹ thuâ ̣t ion hóa ta ̣i áp suấ t khí quyể n

(Atmospheric

Pressure Ionization - API).

Ƣu điểm nổi bật của API là khả năng hình thành ion tại áp suất khí
quyển ngay trong buồng ion hóa. Điều này khác biệt với các kiểu ion hóa sử
dụng trƣớc đó cho LC/MS nhƣ bắn phá nguyên tử nhanh với dòng liên tục
(continuous flow- fast atom bombardment CF-FAB) hay nhƣ tia nhiệt
(thermospray - TS) đều đòi hỏi áp suất thấp. Một thuận lợi nữa của API là sự
ion hóa mềm (soft ionization), không phá vỡ cấu trúc của hợp chất cần phân
tích nhờ đó thu đƣợc khối phổ của ion phân tử . Ngoài ra, với kỹ thuật này,
ngƣời ta có thể điều khiển đƣợc quá trình phá vỡ ion phân tử để tạo ra những
ion con tùy theo yêu cầu phân tích.
Có ba kiểu hình thành ion ứng dụng cho nguồn API trong LC/MS:
* Ion hóa tia điện (electrospray ionization - ESI).
* Ion hóa hóa học tại áp suất khí quyển (atmospheric pressure chemical
ionization - APCI).
* Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure
Photoionization - APPI).
Trong đó, hai kỹ thuật APCI và ESI , đă ̣c biê ̣t là ESI đƣợc sử dụng
nhiều hơn cả.
***Các loại đầu dò khố i phổ
Có các loại tổng quát sau:
* Sự uấn cong nhờ từ trƣờng (Magnetic field deflection).
12
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




- Máy khối phổ đơn giản sử dụng từ trƣờng (a single focussing
magnetic sector mass spectrometer): máy có độ phân giải thấp.
- Máy khối phổ nhị tiêu (double focussing mass spectrometer): sự uốn
cong nhờ từ trƣờng và điện trƣờng, máy có độ phân giải cao.

* Máy khối phổ tứ cực (quadrupole mass spectrometer)
- Máy khối phổ tứ cực (quadrupole mass filter).
- Bẫy ion (quadrupole ion storage; ion trap).
* Máy khối phổ sử dụng kỹ thuật thời gian bay (time of flight mass
spectrometry).
* Máy khối phổ cộng hƣởng cyclotron-ion, sử dụng phép biến đổi Fourier
(Fourier transform-ion cyclotron resonance mass spectrometry: FTMS).
Trong đó , Máy khối phổ tứ cực; máy khối phổ sử dụng kỹ thuật thời
gian bay; máy khối phổ cộng hƣởng cyclotron-ion, sử dụng phép biến đổi
Fourierđƣợc sử dụng nhiều hơn cả.
1.3. Khái quát về bệnh tiểu đƣờng
1.3.1. Phân loại bệnh tiểu đường
Bệnh tiểu đƣờng đƣợc chia thành hai loại nhƣ sau:
Tiểu đƣờng tuýp 1: Tiểu đƣờng typ 1 là một bệnh tự miễn trong đó hệ
thống miễn dịch của cơ thể phản ứng lại và phá huỷ tế bào  sản xuất insulin
của đảo tuỵ. Sự thiếu hụt insulin dẫn đến tăng glucose máu và thƣờng dẫn
đến các biến chứng mãn tính.
Tiểu đƣờng typ 2: Bệnh tiểu đƣờng typ 2 đƣợc đặc trƣng bởi kháng
insulin và giảm tiết chế insulin dẫn đến mất khả năng duy trì mức glucose
máu bình thƣờng.
Các typ tăng đƣờng huyết đặc hiệu khác:
- Đái tháo đƣờng thai kỳ.
- Thiếu hụt di truyền chức năng tế bào .
- Thiếu hụt di truyền về tác động của insulin.
13
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

- Bệnh tuyến tụy ngoại tiết ....
1.3.2. Các thuốc điều trị bệnh tăng đường huyết
Dựa vào tác dụng và cơ chế tác dụng, các thuốc điều trị bệnh tiểu đƣờng
đƣợc chia thành 3 nhóm chính nhƣ sau:
- Insulin và các thuốc kích thích bài tiết insulin.
- Các thuốc làm tăng nhạy cảm insulin.
- Các thuốc chống tăng đƣờng huyết sau bữa ăn.
a) Insulin và các thuốc kích thích bài tiết insulin:
+ Insulin:
Insulin là hormon do tế bào  của tuyến tuỵ tiết xuất, đóng vai trò chủ
yếu trong cơ chế điều hoà đƣờng huyết của cơ thể. Insulin là một trong những
hormon quan trọng của cơ thể, không chỉ tác dụng trên chuyển hoá năng
lƣợng và phát triển cơ thể, mà còn là chất cần thiết cho sự sống. Tác dụng của
insulin bao gồm các đáp ứng phức tạp mà ảnh hƣởng cuối cùng là trên chuyển
hoá glucid, lipid và protid.
+ Thuốc kích thích bài tiết insulin.
Các sulfonylurea.
Năm 1942, Janbon đã tình cờ phát hiện tác dụng hạ đƣờng huyết của dẫn
suất sulfonamid (1154RP) ở những bệnh nhân điều trị sốt thƣơng hàn. Từ
phát hiện này, nhiều nghiên cứu về tác dụng hạ đƣờng huyết của các
sulfonylurea đã đƣợc tiến hành. Các nghiên cứu ngày càng làm sáng tỏ cơ chế
tác dụng của thuốc. Nhiều thuốc thuộc nhóm sulfonylurea đã ra đời, bao gồm
các thuốc thế hệ I (tolbutamide, chlorpropamide) và các thuốc thế hệ II
(Glyburide, Glypizide). Các thuốc này đang đƣợc sử dụng rộng rãi trên lâm
sàng, đem lại nhiều kết quả khả quan cho ngƣời bệnh.
b) Các thuốc làm tăng nhạy cảm insulin.
Các biguanide:
14
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

Năm 1926, Frank và cộng sự đã tổng hợp synthalin từ nhân guanidin.
Chính các synthalin là tiền thân của các biguanid sau này.
Công thức chung:
R-NH-C-NH-C-NH2
NH

NH

(4)
Các thuốc thuộc nhóm biguanide bao gồm: metformin, phenformin và
buformin. Hiện nay metformin là thuốc đang đƣợc sử dụng phổ biến nhất, vì
ít gây tăng axit lactic trong máu hơn. Các biguanide là thuốc chống tăng
đƣờng huyết, không gây hạ đƣờng huyết. Thuốc tác dụng chủ yếu ngoài tuỵ,
không có tác dụng kích thích tế bào  tuyến tuỵ bài tiết insulin.
c) Thuốc chống tăng đƣờng huyết sau ăn (thuốc ức chế enzym glucosidase).
Acarbose:
Acarbose là thuốc ức chế enzym glucosidase của tế bào niêm mạc ruột.
Do tác dụng ức chế enzym này, thuốc làm giảm hoặc chậm quá trình hấp thụ
tinh bột, dextran và các disaccharide ở ruột non, tránh đƣợc tình trạng tăng
đƣờng huyết sau ăn. Thuốc có tác dụng tốt cho cả 2 typ bệnh.
1.3.3. Quan niệm của y học cổ truyền về bệnh tiểu đường
Theo quan niệm của Đông y, bệnh thuộc phạm vi chứng tiêu khát với ba
triệu chứng chủ yếu là ăn nhiều, uống nhiều và tiểu nhiều.
1.3.4. Các thuốc Đông y điều trị bệnh tiểu đường
Các thuốc Đông y điều trị bệnh tiểu đƣờng chủ yếu là các thuốc có
nguồn gốc từ dƣợc liệu nhƣ sinh địa (Rehmania glutinosa Libosch,
Scrophulariaceae), cỏ ngọt (Stevia rebaudiana, Asteraceae), mƣớp đắng

(Momordica

charantia

L.Cucurbitaceae),

hoàng

kỳ

(Astragalus

membranaceus, Fabaceae), Huyền sâm (Scrophularia ningpoensis Hemsl,
Scrophulariaceae)...
15
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




1.4. Thuốc chữa bệnh tiểu đƣờng metformine hydrochloride
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
Cho đến nay, ở trong nƣớc có duy nhất một công trình nghiên cứu tổng
hợp metformin từ CaO, ure và dimethylamin. Quá trình tổng hợp đƣợc đƣợc
tiến hành qua 3 bƣớc [5]:
* Bƣớc 1: Tổng hợp calci cyanamide:

Sơ đồ 1.1: Quá trình tổng hợp calci cyanamid.
Calci cyanamide đƣợc tạo thành phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ
phản ứng. Theo tác giả Ngô Quốc Huy, quá trình phản ứng thực hiện theo

2 giai đoạn:
- Giai đoạn 1: Nung CaO và ure ở nhiệt độ 180-300oC.
- Giai đoạn 2: Tiếp tục nung hỗn hợp trên ở nhiệt độ 750oC.
*Bƣớc 2: Tổng hợp 1-cyanoguanidine:
Từ calci cyanamide đã đƣợc tổng hợp trong bƣớc 1, đem đun nóng trong
dung môi H2O nhận đƣợc 1-cyanoguanidin đƣợc mô tả trong sơ đồ sau:

1-cyanoguanidine.
Sơ đồ 1.2: Quá trình tổng hợp 1-cyanoguanidine.
Điều kiện phản ứng thích hợp tổng hợp 1-cyanoguanidine là ở nhiệt độ
70 oC trong khoảng thời gian 30 phút. Phản ứng rất dễ bị polyme hóa nên khó
16
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN