Nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh lý, hóa sinh của vi tảo biển dunaliella salina phân lập từ ruộng muối giao thủy nam định

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2

TRỊNH MINH THU

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH LÝ, HÓA SINH
CỦA VI TẢO BIỂN Dunaliella salina PHÂN LẬP TỪ
RUỘNG MUỐI GIAO THỦY - NAM ĐỊNH
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. TRẦN ĐĂNG KHOA

Hà Nội, 2017


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Trần Đăng Khoa đã tận tình giúp đỡ,
chỉ bảo và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn
này.
Tôi chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Thị Hoài Hà đã chỉ bảo và tạo mọi điều
kiện giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các Thầy Cô trường ĐHSP Hà N i 2 và cán
b Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học ĐHQGHN đã cung cấp những kiến
thức nền tảng cơ bản hỗ trợ cho quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Cuối cùng, Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình người thân, bạn bè đã
luôn đ ng viên giúp đỡ trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2017

Học viên

T ịnh Minh Thu


ỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan kết quả nghiên cứu, số liệu trình bày trong luận văn là
trung thực và không tr ng l p với c c đề tài kh c
Tôi cũng xin cam đoan r ng c c thông tin tr ch dẫn trong luận văn đã được
chỉ r ngu n gốc
Hà Nội, tháng

năm 2017

Học viên

Trịnh Minh Thu


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 4
1.1. Giới thiệu về Dunaliella ................................................................................... 4
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu ..................................................................................... 4
1.1.2. Vị trí phân loại của Dunaliella ................................................................... 4
1 1 3 Đ c điểm sinh học của Dunaliella ............................................................. 5

1.1.4. Sinh sản ...................................................................................................... 6
1.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng ................................................................................. 7
1.2. Carotenoid ....................................................................................................... 11
1.2.1. Caroten ..................................................................................................... 13
1.2.2. Xanthophyll .............................................................................................. 15
1.3. Tình hình nghiên cứu Dunaliella trong và ngoài nước .................................. 16
1.3.1. Tình hình nghiên cứu Dunaliella trong nước ........................................... 16
1.3.2. Tình hình nghiên cứu Dunaliella ngoài nước .......................................... 16
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 18
2 1 Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................... 18
2 1 1 Đối tượng .................................................................................................. 18
2 1 2 Địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 18
2 1 3 Môi trường ................................................................................................ 18
2.1.4. Thiết bị ..................................................................................................... 19
2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 19
2.2.1. Phân lập vi tảo .......................................................................................... 19
2 2 2 X c định khả năng sinh trưởng ................................................................ 20
2 2 3 Phương ph p phân loại ............................................................................. 20
2.2.4. Nghiên cứu điều kiện ảnh hưởng đến sinh trưởng và tổng hợp βcaroten của vi tảo Dunaliella.............................................................................. 21
2 2 5 Phương ph p t ch chiết carotenoid .......................................................... 21


2 2 6 Phương ph p phân t ch sắc ký bản mỏng (TLC)...................................... 22
2.2.7. Phương ph p phân t ch sắc ký lỏng cao áp (HPLC) ................................ 22
2.2.8. Các phân tích thống kê ............................................................................. 23
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 24
3.1. Phân lập và sàng lọc vi tảo Dunaliella ........................................................... 24
3 2 Đ c điểm hình th i học và hình thức sinh sản của Dunaliella DUN23.......... 25
3 3 Phân t ch giải trình tự 18S rDNA ................................................................... 27
3.4. Ảnh hưởng của c c điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng và t ch lũy caroten của vi tảo Dunaliella salina DUN23 ........................................................ 31

3.4.1. Ảnh hưởng của n ng đ NaCl đến sinh trưởng và t ch lũy -caroten
của vi tảo Dunaliella salina DUN23 .................................................................. 31
3.4.2. Ảnh hưởng của cường đ chiếu s ng đến sinh trưởng và t ch lũy caroten của vi tảo Dunaliella salina DUN23 ..................................................... 33
3.5. Lựa chọn phương ph p và dung môi th ch hợp cho tách chiết carotenoid ..... 35
3.6. Phân tích carotenoid b ng sắc ký bản mỏng TLC .......................................... 37
3.7. Phân tách carotenoid b ng phương ph p HPLC ............................................. 39
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 43


ANH MỤC CÁC CH
Chữ viết tắt

VIẾT TẮT

Chữ viết đầy đủ

EDTA

Ethylene DiamineTetraacetic Acid

Môi trường J

Môi trường Johnsons

HPLC

High Performance Liquid Chromatography - Sắc ký lỏng cao áp

Tb

Tế bào

TLC

Thin Layer Chromatography - Sắc ký bản mỏng

TLK

Trọng lượng khô

VTB

Vi tảo biển


DANH MỤC ẢNG
Bảng 2.1. Môi trường Johnsons (J) ........................................................................... 18
Bảng 2.2. Vị trí thu mẫu của 5 chủng Dunaliella ..................................................... 19
Bảng 3.1. Khả năng sinh trưởng và t ch lũy carotenoid của 5 chủng Dunaliella
sau 16 ngày ................................................................................................ 24
Bảng 3.2. Các ký hiệu chi và mã GenBank 18S rDNA và ITS của các vi tảo
tham khảo ................................................................................................... 29


ANH MỤC H NH
Hình 1.1. Cấu tạo tế bào Dunaliella ........................................................................... 5
Hình 1.2. Hợp nhất dạng đỏ và xanh của D. salina và sự hình thành giao tử ............ 7
Hình 1.3. Mô hình cấu trúc hóa học chung của m t số carotenoid........................... 12
Hình 1.4. Mô hình cấu trúc hai đ ng phân của -caroten ......................................... 14

Hình 3.1. Hình dạng tế bào sinh dưỡng Dunaliella DUN23 (thanh k ch thước
5µm) ........................................................................................................... 25
Hình 3.2. Thể giao tử Dunaliella DUN23 (thanh k ch thước 5µm) ......................... 25
Hình 3.3. Sinh sản hữu tính của Dunaliella DUN23 ................................................ 26
Hình 3.4. Sinh sản vô tính của Dunaliella DUN23 .................................................. 27
Hình 3.5. Cây phả hệ dựa trên phân tích giải trình tự18S rDNA của Dunaliella
DUN23 và các chủng có quan hệ họ hàng gần .......................................... 28
Hình 3.6. Cây phân phả hệ dựa trên phân tích giải trình tự ITS của Dunaliella
DUN23 và các chủng có quan hệ họ hàng gần .......................................... 29
Hình 3.7. Ảnh hưởng của n ng đ NaCl đến sinh trưởng và hàm lượng caroten của vi tảo Dunaliella salina DUN23 ............................................ 32
Hình 3.8. Ảnh hưởng của cường đ chiếu s ng đến sinh trưởng và t ch lũycaroten của vi tảo Dunaliella salina DUN23 ............................................ 34
Hình 3 9 Hàm lượng carotenoid tách chiết b ng phương ph p (a) vortex (b)
sonic, (c) hỗn hợp dung môi ...................................................................... 36
Hình 3.10. Sắc ký đ TLC carotenoid của vi tảo Dunaliella salina DUN23 ........... 38
Hình 3.11. Sắc ký đ chuẩn của Lutein 9.814; Astaxanthin 12.985; -caroten
14.299......................................................................................................... 39
Hình 3.12. Sắc ký đ HPLC của Dunaliella salina DUN23 (Thời gian lưu:
Lutein 9.784; Astaxanthin 12.986; -caroten 14.298) ............................... 40


1

MỞ ĐẦU
1.

do chọn đ tài
Vi tảo là m t cấu thành quan trọng của sinh vật ph du đóng vai trò quan

trọng trong việc duy trì và phát triển hệ sinh th i dưới nước. Chúng có giá trị dinh
dưỡng cao và phạm vi ứng dụng r ng rãi như m t số loài vi tảo Chlorella,

Dunaliella, Spirulina đã được nuôi cấy để sản xuất protein β-caroten, glycerol,
nhiên liệu sinh học, các dạng dược phẩm…
Vi tảo lục-cam Dunaliella (ngành tảo lục) là các loài có hình dạng khác nhau
từ hình que tới dạng trứng đơn bào di đ ng (9 tới 11 µm), xuất hiện trong nhiều
v ng nước m n như đại dương c c h nước m n c c đầm lầy, b n chứa và các
mương ngập m n gần biển, chiếm ưu thế trong các thủy vực có chứa hàm lượng
muối n ng đ 2M. M t vài loài vi tảo có thể t n tại trong c c điều kiện đ muối cao
như c c ao bay hơi muối Để t n tại, những vi tảo này t ch lũy c c β-carotene và
glycerol với n ng đ cao để bảo vệ chúng trước các yếu tố cường đ ánh sáng và áp
suất khí quyển. Loài Dunaliella cũng được nghiên cứu nhiều do chúng có hoạt tính
chống oxy hóa cao, chúng có khả năng t ch lũy lượng lớn các carotenoid. Chi
Dunaliella có 22 loài và m t số dạng biến thể, các dạng sinh sống ở biển và các loài
ưa m n, những vi tảo này được nuôi cấy tương đối đơn giản và không kết thành
đ m hay c c dạng chuỗi Loài được biết tới nhiều nhất là Dunaliella salina ưa m n.
Dunaliella là ngu n ch nh t ch lũy m t lượng carotenoid lớn trong tự
nhiên[34] Trong môi trường nước m n, Dunaliella salina có màu lam. Tuy nhiên,
trong c c điều kiện đ muối và cường đ ánh sáng cao, vi tảo này lại biến thành
màu đỏ do sự sinh t ch lũy các carotenoid có chức năng bảo vệ tế bào.
Công nghệ sinh học tảo có những ưu điểm lớn trong hàng thập kỷ qua và
những kết quả nghiên cứu đã mang lại những giá trị to lớn cho con người. Hiện nay,
carotenoid đang được quan tâm nhiều trên thị trường, chúng sử dụng như c c chất
tạo màu trong các loại thực phẩm dinh dưỡng dược phẩm, mỹ phẩm. Những hợp
chất này có c c đ c tính chống oxy hóa và thu hút được nhiều sự chú ý bởi c c đ c
tính tiềm ẩn của chúng trong qu trình ngăn ngừa ung thư[28]. Trong số khoảng


2

1000 c c carotenoid được tìm thấy trong tự nhiên, chỉ m t vài trong số chúng có
chứa β-carotene (cà rốt), lycopene (cà chua) và lutein (sau bina). M c dù m t số loại

carotenoid, ví dụ β-carotene và zeaxanthin có thể được tổng hợp nhân tạo, ngu n
carotenoid từ vi tảo tự nhiên cũng như từ vi khuẩn và nấm men được sử dụng như
các chất bổ sung vẫn tạo được sự chú ý lớn của c ng đ ng thế giới. Ngày nay, vi tảo
Dunaliella đang thu hút được nhiều sự chú ý do khả năng t ch lũy β-carotene của
nó. M t phân tử β-carotene có thể trung hòa tới hơn 1000 phân tử oxy gốc tự do.
Nam Định là vựa muối lớn nhất của miền Bắc với 870 ha có thể sử dụng cho
sản xuất muối. Giao Thuỷ là huyện ven biển, ở cực nam đ ng b ng châu thổ sông
H ng ph a Nam và Đông Nam tiếp giáp với biển Đông Việt Nam, tiếp giáp các
huyện Xuân Trường, Hải Hậu (Nam Định) và Kiến Xương Tiền Hải (Thái
Bình). Hai xã Giao Phong và Bạch Long thu c huyện Giao Thủy là hai trong những
xã có sản lượng muối cao của tỉnh. Ru ng muối thu c xã Giao Phong n m sát phía
trong đê trung ương gi p thị trấn Quất Lâm. Từ 250 ha ru ng muối, mỗi năm xã
Bạch Long đóng góp khoảng 40000 tấn muối. Gần đây do sự gia tăng nhiệt đ , quá
trình bay hơi nước trực tiếp đ muối tăng lên; quần thể Artemia (loài giáp xác)
giảm và do đó sự đa dạng về mật đ Dunaliella ở ru ng muối của hai xã tăng lên
màu đỏ của ru ng muối cũng từ đó mà hình thành
Vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh lý, hóa
sinh của vi tảo biển Dunaliella salina phân lập từ ruộng muối Giao Thủy-Nam
Định” nh m tạo cơ sở cho việc đưa chủng vi tảo Dunaliella salina vào nhân nuôi
trên quy mô công nghiệp, nh m đạt hiệu quả cao trong việc khai thác giá trị kinh tế
to lớn của chủng vi tảo này.
2. Mục đ ch nghiên cứu
X c định m t số chỉ tiêu sinh lý hóa sinh của vi tảo biển Dunaliella salina.
Tuyển chọn được vi tảo biển Dunaliella tiềm năng sinh tổng hợp carotenoid.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
Phân lập x c định chỉ tiêu sinh lý hóa sinh vi tảo biển Dunaliella salina.


3

Nghiên cứu c c yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và t ch lũy β-caroten
của vi tảo Dunaliella salina.
T ch chiết carotenoid từ vi tảo Dunaliella salina.
4. Điểm mới của luận văn
Cung cấp m t số dẫn liệu cập nhật về ngu n gen vi tảo biển Dunaliella ở các
đ ng muối tại khu vực nghiên cứu.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
5.1. Ý nghĩa khoa học
Góp phần bổ sung vốn kiến thức cho chuyên ngành sinh học thực nghiệm
sinh thái học và là cơ sở khoa học cho những nghiên cứu về ngu n gen vi tảo biển đa
dạng sinh học và nuôi tr ng thủy sản.
5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả của đề tài phục vụ trực tiếp việc bảo t n ngu n gen vi tảo trong c c
đ ng muối Nam Định, tuyển chọn được vi tảo biển Dunaliella đưa vào khai th c
nhân nuôi trên quy mô công nghiệp.


4

CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU
1.1. Giới thiệu v Dunaliella
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu
Năm 1838, Dunal mô tả đầu tiên về loài vi tảo đỏ đơn bào hai roi, sống trong
nước biển cô đ c. Ông đã công bố sự có m t của m t nhóm sinh vật trong các ru ng
muối ở Montpellier thu c bờ biển Mediterranean nước Ph p mà ngày nay được biết
đến là Dunaliella salina [26].
Trong suốt thế kỷ 19, các nhà sinh học cũng quan sát thấy vi tảo đỏ có roi
của Dunal trong các h nước m n và tại các khu vực có đ m n cao ở Crimea,
Algeria, Lorraine, Pháp và Romania [7].

Năm 1905, Teodoresco (Bucharest) và Clara Hamburger (Heidelberg) công
bố hai bài báo mô tả chi tiết thêm về Dunaliella như là m t chi mới. Teodoresco đã
nghiên cứu mẫu thu thập từ ru ng muối ở Romani, trong khi Hamburger nghiên cứu
trên các mẫu vật được gửi tới từ các ru ng muối ở Cagliari, Sardinia. Cả hai tác giả
đều trình bày bản vẽ chi tiết của sinh vật về hình thái, cấu trúc, sinh sản, tập tính và
sinh thái học. Trong phân loại, chi Dunaliella được đ t tên Dunal vì sự kính trọng
đối với ông người đầu tiên quan sát thấy sinh vật này trong các ru ng muối ở Pháp
c ch đây gần 70 năm với hai loài đầu tiên trong chi này đã được công bố năm 1906
là Dunaliella salina và Dunaliella viridis [26].
1.1.2. Vị trí phân loại của Dunaliella
Theo Avron và Ben-Amotz, phân loại khoa học của Dunaliella như sau [6]:
Ngành: Chlorophyta
Lớp: Chlorophyceae
B : Volvocales
Họ: Dunaliellaceae
Chi: Dunaliella


5

1.1.3. Đặc điểm sinh học của Dunaliella
Dunaliella là vi tảo đơn bào sống đơn lẻ có hai roi. Tế bào không có lớp
màng polysaccharide cứng, được bao bọc bởi màng đàn h i mỏng và phủ m t lớp
áo là màng nhầy nguyên sinh chất. Việc thiếu m t polysaccharide cứng giúp tế bào
nhanh thay đổi về khối lượng để đ p ứng áp lực thẩm thấu trong tế bào b ng c ch
loại bỏ glycerol qu trình chấm dứt khi thể t ch trở về với gi trị ban đầu [10]. Tế
bào Dunaliella có hình dạng khác nhau: hình trứng, hình cầu, hình quả lê ho c hình
elip với c c k ch thước: chiều dài 5-25µm, chiều r ng 3-13µm [20]. Tế bào của m t
loài nhất định có thể thay đổi hình dạng khi c c điều kiện sống thay đổi trong điều
kiện không thuận lợi tế bào thường có dạng hình cầu K ch thước tế bào cũng có thể

thay đổi khi điều kiện sinh trưởng và cường đ

nh s ng thay đổi [33].
Hạt nhân thường bị
che khuất bởi m t số hạt
nhỏ, nó chiếm hầu hết diện
tích phần trước của tế bào
và thường được bao quanh
bởi th y trước lục lạp [33].
Những tế bào di đ ng này
chuyển đ ng nhờ hai roi,
trong đó m t roi n m ở
điểm cuối ph a trước của
tế bào, chiều dài của roi
phụ thu c vào loài.

Hình 1.1. Cấu tạo tế bào Dunaliella [10]
Tế bào chứa duy nhất m t lục lạp đơn hình chén lục lạp này bao g m m t
hạt tinh b t ở trung tâm được bao quanh bởi tinh b t. Lục lạp chiếm hầu hết diện
t ch cơ thể. Thể lục lạp khắc thành nhiều thùy, các màng thylakoid trong lục lạp xếp
ch ng lên nhau dày đ c. Lục lạp có thể t ch lũy m t lượng lớn β-caroten làm cho
các tế bào có màu cam ho c đỏ thay vì màu xanh lá cây. Khi nuôi cấy ở n ng đ


6

muối thấp tế bào có thể bị mất màu cam. Nghiên cứu siêu cấu trúc cho thấy tế bào
có m t màng xốp được bao quanh bởi chất dị nhiễm sắc kết tụ. Ty thể có thể n m
trong các b phận khác nhau của tế bào ở phần mỏng. Số lượng và k ch thước của
ty thể khác nhau giữa các tế bào và ở giai đoạn phát triển khác nhau. Số lượng b

máy golgi trong tế bào có thể có từ 2 đến 4, g m 10-15 túi màng dẹt xếp ch ng
nhau Điểm mắt n m ở ngoại vi của lục lạp.
Các loài trong chi Dunaliella được phân lập từ môi trường nước m n như
biển và các h muối với m t dải r ng các thành phần hóa học và n ng đ muối dao
đ ng từ 0,5% đến bão hòa khoảng 35%. Cơ chế thích nghi với dải n ng đ muối
r ng ở Dunaliella dựa trên khả năng thay đổi n ng đ glycerol trong tế bào. Khi
Dunaliella được nuôi cấy ở đ m n cao thì n ng đ glycerol n i bào vượt quá 50%.
Trong điều kiện này glycerol đóng vai trò như m t “chất tan tương th ch” bảo vệ
chống lại cả hai enzyme bất hoạt và ức chế. Cũng thấy r ng dưới ánh sáng ho c
trong tối tổng hợp glycerol trong điều kiện ưu trương và loại bỏ trong điều kiện
nhược trương đ c lập với tổng hợp protein [10]. M t khác, những nghiên cứu gần
đây cho r ng Dunaliella có m t khả năng đ c biệt trong việc loại bỏ các ion Na+
trong môi trường m n cao b ng cách sử dụng m t kênh bơm natri theo hướng oxy
hóa khử mới [22]. Các kết quả nghiên cứu proteomic cũng chỉ thêm r ng ngoài các
phương ph p trên, Dunaliella đ p ứng với thay đổi đ m n cao b ng cách tăng
cường quang tổng hợp để đ ng hóa CO2 [26]. Ngoài sự thích nghi với điều kiện môi
trường n ng đ muối cao của hầu hết các loài Dunaliella thì Dunaliella acidophila
có thể phát triển trong môi trường axit (pH 0-1), Dunaliella antarctica phát triển
mạnh ở nhiệt đ thấp và m t số chủng D. salina có thể chịu được cường đ ánh
sáng cao. Dunaliella là sinh vật có khả năng th ch nghi được với nhiều điều kiện
môi trường sống khắc nghiệt nhất.
1.1.4. Sinh sản
Dunaliella có m t chu trình sinh trưởng phức tạp bao g m cả sinh sản hữu
tính và vô tính. Sự hợp nhất của hai đ ng giao tử thành m t hợp tử đã được chứng
minh trong nhiều nghiên cứu trước đây Các nghiên cứu của Lerche đã chỉ ra


7

phương thức sinh sản hữu tính của Dunaliella, sự hình thành hợp tử hữu tính của 5

trong số 6 loài được nghiên cứu bao g m D. salina, D. parva, D. peircei, D.
euchlora, D. minuta. Sự hình thành hợp tử ở D. salina được hoạt hoá bởi sự giảm
n ng đ muối từ 10 đến 3%. Bắt đầu quá trình, các roi tiếp xúc với nhau, tiếp sau đó
các giao tử tạo nên m t cầu sinh chất và hợp nhất. Hợp tử có lớp phía ngoài dày,
chúng có thể chịu được môi trường nước ngọt và cũng có thể kéo dài được sự sống
trong điều kiện khô hạn. Những hợp tử này nảy mầm b ng cách phóng thích lên tới
32 tế bào con khi phá vỡ bào nang Tuy nhiên trong trường hợp này, tế bào hình
thành vỏ dày và tròn đã diễn ra vào thời điểm đ m n của nước tăng lên Sinh sản
hữu tính ở Dunaliella là phổ biến hơn sinh sản vô tính [26].
Sinh sản vô tính b ng cách phân chia theo chiều dọc tế bào thành nhiều đ ng
bào tử. G p điều kiến bất lợi Dunaliella hình thành bào tử nghỉ (dạng cyst) có vách
dày chống chịu được với điều kiện khắc nghiệt. Khi g p điều kiện thuận lợi chúng
phát triển thành cơ thể mới.

Hình 1.2. Hợp nhất dạng đỏ và xanh của D. salina và
sự hình thành giao tử [26]
1.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng
Dunaliella có thể sinh trưởng trong môi trường có n ng đ NaCl cao. N ng
đ NaCl có ảnh hưởng cao đến sinh trưởng và phát triển của Dunaliella. Ngoài ra


8

các yếu tố kh c như dinh dưỡng, nhiệt đ , pH, ánh sáng cũng ảnh hưởng đến sinh
trưởng của Dunaliella.
1.1.5.1. Ánh sáng
Dunaliella là sinh vật quang tự dưỡng bắt bu c, ánh sáng là ngu n năng
lượng duy nhất cho sự trao đổi chất của Dunaliella [12]. Trong hệ thống ao mở,
ngu n ánh sáng là ánh sáng m t trời trong khi đó ở các bể phản ứng quang sinh ánh
sáng có thể được cung cấp b ng cách sử dụng m t trong hai: đèn huỳnh quang trắng

hay ánh sáng m t trời. Sự sinh trưởng và tổng hợp carotenoid khác nhau với các
dạng ánh sáng khác nhau. Cảm ứng carotenoid không phụ thu c bước sóng mà phụ
thu c nhiều vào cường đ ánh sáng [9]. Jahnkecho cho r ng không giống như UVB, UV-A bức xạ tạo ra sự t ch lũy lớn carotenoid của D. bardawil mà không làm
chậm quá trình sinh trưởng [21].
1.1.5.2. Nhiệt độ
Dunaliella có khả năng sinh trưởng trong m t dải nhiệt đ từ dưới 0 đến
450C.Trong phòng thí nghiệm, nhiệt đ tối ưu cho sự sinh trưởng của Dunaliella là
320C và thích hợp ở dải nhiệt đ 25 - 350C. Nhiệt đ thấp làm giảm tốc đ sinh
trưởng dẫn đến giảm số lượng tế bào. M t khác, nhiệt đ ở 40oC sẽ thúc đẩy cảm
ứng carotenoid nhưng đ ng thời cũng làm chậm tỷ lệ sinh trưởng [12]. Ngoài ra,
nhiệt đ cao hơn 40oC vi tảo Dunaliella sinh glycerol nhiều vào môi trường, đây là
m t ngu n cacbon hữu cơ là điều kiện tốt cho vi khuẩn và nấm sợi phát triển dẫn
đến cạnh tranh với vi tảo [20].
1.1.5.3. pH
Dunaliella có khả năng chịu pH từ 011 nhưng pH tối ưu cho D.salina n m
trong khoảng 9  11. Trong nuôi cấy vi tảo tự dưỡng, pH tăng lên do vi khuẩn
quang hợp cố định CO2 với NO3- góp phần làm tăng n ng đ OH- [9]. Khi pH môi
trường cao sẽ có nguy cơ kết tủa m t số các muối canxi và keo tụ sinh khối vi tảo.
Điều này dẫn đến giảm sinh trưởng của vi tảo bởi vậy trong nuôi cấy cần tr nh tăng
pH lên trên 8 [9]. Trong hệ thống ao mở được vận hành pH thường được duy trì ở
mức 7,5 ± 0,2 b ng điều khiển kép (CO2 và HCl) tại đầu vào của hệ thống nuôi cấy.


9

Đ ng thời trong quá trình nuôi cấy, bổ sung CO2 và HCl. Trong m t số ao mở và
các bể phản ứng quang sinh, ngu n cung cấp chính cacbon vô cơ là ion HCO3-, pH
được điều khiển b ng cách cho thêm HCl.
1.1.5.4. Nhu cầu dinh dưỡng
Dunaliella là sinh vật quang tự dưỡng, sử dụng CO2 và HCO3- như ngu n

cacbon vô cơ Việc thiếu m t ngu n cacbon vô cơ th ch hợp là yếu tố hạn chế sinh
trưởng dưới c c điều kiện trong nuôi cấy D. salina như đ m n cao, pH cao và nhiệt
đ cao [12]. Các thiết bị sục khí, bơm CO2 được sử dụng trong hệ thống nuôi cấy
nh m cung cấp đủ lượng CO2 cần cho sinh trưởng. Ngoài ra, bổ sung vào môi
trường nuôi cấy 10 mmol/l NaHCO3 là cần thiết cho sinh trưởng tối ưu
Ngu n nitơ tốt nhất cho D. salina là nitrate. Trong thực tế, bổ sung vào môi
trường 5 mmol/lNaNO3 ho c KNO3 sẽ cho vi tảo sinh trưởng tốt. M t khác, thiếu
hụt nitrate là m t trong những cách phổ biến nhất để giảm tốc đ sinh trưởng đ ng
thời sẽ kích hoạt cảm ứng sản xuất carotenoid. Tuy nhiên, kéo dài thiếu hụt nitơ
trong nuôi cấy, có thể dẫn đến tỷ lệ tử vong cao của các tế bào cũng như gây giảm
nghiêm trọng hàm lượng carotenoid trong mỗi thể tích nuôi cấy. Ngu n nitơ kh c
như muối amoni và urê là không thích hợp vì chúng có thể gây chết vi tảo dưới điều
kiện nhất định. Nghiên cứu cũng chỉ ra r ng việc sử dụng NH4NO3 hay (NH4)2CO3
như ngu n nitơ sẽ gây đ c hại đối với sự phát triển của D. salina [13]. Phốt pho
trong KH2PO4 ho c NaH2PO4 cho kết quả tốt nhất. Yêu cầu hàm lượng photphat tối
ưu cho sự phát triển là khoảng 0,2 mg/l KH2PO4. Trong ao mở, n ng đ cao hơn có
thể ức chế sự sinh trưởng vì sự có m t đ ng thời của photphat và canxi đ c biệt là ở
pH cao hơn 8 có thể dẫn đến kết tủa Ca3PO4 và keo tụ vi tảo [18].
Dunaliella cũng cần n ng đ sunphat cao (khoảng 2 mmol/l) để phát triển tối
ưu nhưng sunphat rất ít khi phải thêm vào trong môi trường ao thương mại vì
ngu n nước tự nhiên như nước biển ho c nước máy chứa hàm lượng sunphat cao
(khoảng 30 mmol/l) [9].
Các yếu tố khác cũng cần cho sinh trưởng của D.salina bao g m: K+, Ca2+,
Mg2+, Cl-, Na+, sắt chelated và m t số yếu tố khác. Các chỉ số của Mg2+/Ca2+ và Cl-


10

/SO42- trong môi trường cũng ảnh hưởng đến tốc đ

sinh trưởng và tổng hợp

caroten. Dunaliella có thể chịu được phạm vi r ng của tỷ lệ Mg2+/Ca2+ từ 0,8 – 2,0.
Tỷ lệ Cl-/SO42- tốt nhất cho sinh trưởng tối ưu của D. salina được nghiên cứu là 3,2,
trong khi đó tỷ lệ tối ưu cho t ch lũy carotenoid là khoảng 8,6. Fe3+ thường được
thêm vào nuôi cấy dưới hình thức bổ sung FeCl3-EDTA ho c bổ sung sắt dạng
phức-EDTA. Nghiên cứu của Borowitzka và Borowitzka cho thấy, so với bổ sung
sắt dạng phức thì bổ sung FeCl3 dẫn đến tốc đ sinh trưởng tăng nhanh hơn so với
sinh trưởng ban đầu của D. Salina[13]. Tuy nhiên, khi bổ sung sắt dạng phức thì
cho số lượng tế bào cao hơn so với FeCl3. Bốn nguyên tố vi lượng, bao g m cả
mangan, kẽm coban và đ ng cũng cần thiết cho sự sinh trưởng tối ưu của
Dunaliella. Tuy nhiên, không cần phải thêm các yếu tố đó vào môi trường nếu môi
trường đó bao g m các muối công nghiệp ho c nước biển [9].
1.1.5.5. Hệ thống nuôi cấy
Nuôi cấy đại trà vi tảo đã được phát triển trong các hệ thống nuôi cấy bao g m
ao mở ao tròn ao mương túi lớn, bể chứa, thùng lên men dị dưỡng và m t số loại bể
phản ứng quang sinh k n C c đ c điểm sinh học của vi tảo là m t trong những yếu tố
quan trọng nhất để xem xét cho lựa chọn m t hệ thống nuôi cấy thực tế.
 Hệ thống ao mở
Ngày nay, các hệ thống thương mại phổ biến nhất cho nuôi sinh khối của
Dunaliella là ao mở ngoài trời. Nhà máy sản xuất Dunaliella n m trong khu vực có
khí hậu nóng và khô với đ che phủ thấp và thường n m ở ngu n nước muối ho c
gần ngu n nước muối. Để kiểm so t đ m n thì nước biển với n ng đ muối thấp
được bơm từ c c đầm phá vào các h nước sau đó bổ sung các chất dinh dưỡng
thích hợp. Sau khi các tế bào vi tảo trong ao đạt n ng đ -caroten thích hợp, sẽ
được chuyển sang các nhà máy thu hoạch trên bờ và môi trường còn lại được bơm
lại vào các ao [33].
Ngoài ra, ở m t số nơi sử dụng cánh khuấy nhỏ để tr n đều chất dinh dưỡng,
CO2 và tế bào vi tảo. Cung cấp khí CO2 với vai trò là ngu n cacbon vô cơ đ ng thời
nh m kiểm soát pH. Nuôi cấy ngoài trời có thể được vận hành theo mẻ ho c bán

11

liên tục. Sự pha tr n của các hình thức nuôi cấy có nhiều ưu điểm: có hiệu quả ngăn
ch n các tế bào sa lắng, phân tầng nhiệt, hỗ trợ chất dinh dưỡng, phân phối khí và
loại bỏ oxy dư thừa [33].
Các thông số ảnh hưởng đến năng suất của vi tảo trong ao như: tỷ lệ tr n đ
sâu của hệ thống nuôi cấy k ch thước của các chủng… cần được tối ưu hóa trong
bất kỳ trường hợp nghiên cứu nào vì kết quả có thể thay đổi từ m t điều kiện thử
nghiệm khác.
 Hệ thống khép kín
Bể phản ứng quang sinh công nghiệp là hệ thống tuyệt vời cho việc kiểm
soát nhiều thông số nuôi cấy và do đó được sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật quang
hợp như vi tảo và tế bào thực vật. Sinh khối vi tảo thu được xử lý để sản xuất các
sản phẩm dinh dưỡng, tổng hợp các thành phần có giá trị như axit béo bão hòa và
carotenoid, làm thức ăn trong c c ngành công nghiệp nuôi tr ng thủy sản. Bể phản
ứng được thiết kế để phân phối ánh sáng và chất dinh dưỡng đều và tăng cường trao
đổi khí. Trong sản xuất Dunaliella thì các thông số như: nhiệt đ , pH, chất dinh
dưỡng luôn được theo dõi và kiểm soát ch t chẽ.
Tuy hệ thống khép kín đạt n ng đ sinh khối cao và kiểm soát các thông số
môi trường và các thông số kỹ thuật khác là tốt hơn như giảm nguy cơ ô nhiễm,
giảm thiếu hụt CO2 và có điều kiện tái canh tác sản xuất Nhưng gần đây c c số liệu
đã chỉ ra r ng: năng suất trên m t đơn vị thể tích và chi phí sản xuất trong hệ thống
này không tốt hơn so với ao mở [24]. So với ao mở, thiết kế của bể phản ứng quang
sinh là phức tạp hơn tốn kém và khó áp dụng với quy mô r ng Tuy nhiên đối với
các ứng dụng trong tương lai sử dụng bể phản ứng quang sinh có tiềm năng trong
sản xuất hơn sử dụng hệ thống ao mở.
1.2. Carotenoid
Carotenoid là m t họ của các hợp chất có sắc tố được tổng hợp từ thực vật,

vi sinh vật và đ ng vật. Trong thực vật, chúng tham gia vào b máy quang hợp và
bảo vệ thực vật chống lại bức xạ m t trời. Trái cây và rau quả tạo thành các ngu n
chính của carotenoid trong chế đ ăn uống của người. Carotenoid có tác dụng ngăn


12

ngừa các bệnh như bệnh tim mạch ung thư và c c bệnh mãn tính khác. Chúng cũng
là tiền chất của vitamin A.

Hình 1.3. Mô hình cấu trúc hóa học chung của một số carotenoid [23]
Trong những năm gần đây c c đ c tính chống oxy hóa của carotenoid đã
được quan tâm nghiên cứu [25] Cho đến nay có đến hơn 600 carotenoid được xác
định trong tự nhiên. Tuy nhiên, chỉ có khoảng 40 có m t trong m t chế đ ăn uống
phổ biến của con người. Trong số 40 carotenoid này thì có khoảng 20 carotenoid
được tìm thấy trong máu và các mô của người. Gần 90% carotenoid trong chế đ ăn
uống và cơ thể người được đại diện bởi -caroten, -caroten, lycopen, lutein và
cryptoxanthin [17].
Carotenoid có cấu trúc polyisoprenoid g m 40 nguyên tử cacbon, là m t
chuỗi dài liên hợp của liên kết đôi Được cấu tạo bởi 8 đơn vị isoprence liên tiếp
nhau ở trung tâm phân tử tạo nên cấu trúc đối xứng. Có vài carotenoid mạch thẳng,
nhưng đa số là những hợp chất có vòng 6 cạnh (ho c vòng 5 cạnh) ở m t đầu hay cả
hai đầu của phân tử. Những carotenoid khác nhau bởi tận cùng chứa các nhóm chức
kh c nhau nhưng đều có cấu trúc phân tử trung tâm giống nhau.
Theo cấu trúc hóa học carotenoid được chia thành 2 loại là: caroten và
xanthophyll.


13

1.2.1. Caroten
Caroten - m t loại hydratcacbon chưa bão hòa có CTHH là C40H56, không
tan trong nước, chỉ tan trong lipid và các dung môi hữu cơ Phần trung tâm phân tử
g m 18 nguyên tử cacbon hình thành m t hệ thống các liên kết đơn đôi xen kẽ, có
4 nhóm CH3 mạch nhánh. Có 4 loại caroten quan trọng là α-caroten β-caroten, caroten và lycopen.
Trong số c c đ ng phân của carotenoid thì α-caroten và β-caroten là 2 loại
phổ biến nhất của caroten.-caroten g m 2 dạng -caroten tự nhiên và -caroten
tổng hợp nhân tạo. -caroten từ thiên nhiên t n tại 2 dạng cis và trans, còn caroten tổng hợp chủ yếu chỉ t n tại m t dạng trans.
Hai dạng cis và trans là hai hợp chất khác nhau về tính chất vật lý và hóa
học. Ngoài ra, có sự khác biệt cả trong việc được cơ thể hấp thu trong ru t trong
quá trình tiêu hóa. M t nghiên cứu thực tế trên gà và chu t cho thấy -caroten tự
nhiên được hấp thu tốt hơn 10 lần so với -caroten tổng hợp, sử dụng carotenoid tự
nhiên khiến nguy cơ mắc ung thư thấp hơn -caroten tự nhiên không chứa thành
phần nhân tạo hay chất bảo quản, còn -caroten tổng hợp có chứa các chất bảo quản
và t n đọng hóa chất d ng để tổng hợp trong quá trình tinh chế Đây là lý do tại sao
c c cơ quan ch nh phủ như Viện Y tế Quốc tế và Viện Ung thư Quốc tế khuyến cáo
nên sử dụng -caroten từ thực phẩm thiên nhiên [25]. -caroten tự nhiên thường
thấy trong các loại trái cây và rau quả như cải xoăn c c rau có màu xanh đậm, bông
cải xanh b đỏ, cà rốt b đu đủ dưa đỏ, các loại trái cây màu vàng, màu da cam...
Bên cạnh đó vi tảo Dunaliella cũng là m t ngu n cung cấp -caroten d i dào. Theo
nghiên cứu của Ben-Amotz, ở đ m n trên 27% NaCl D.salina có thể t ch lũy được
lượng carotenoid lên tới trên 14% khối lượng khô[11]. Vì vậy Dunaliella là ngu n
khai thác -caroten tiềm năng


14

Hình 1.4. Mô hình cấu trúc hai đồng phân của -caroten [23]
-caroten có hàng loạt tác dụng có lợi cho sức khỏe. Lợi ch đ ng kể nhất là
tăng cường khả năng miễn dịch và đ c biệt ở những người dương t nh với HIV. Có

nghiên cứu chỉ ra r ng m t số carotenoid thực sự ảnh hưởng đến con đường truyền
tín hiệu giữa các tế bào của chúng ta. Ví dụ, các dòng tế bào ung thư thường không
thể nhận được các tín hiệu hóa học kiểm so t sinh trưởng từ các tế bào khác. caroten giúp mở các kênh truyền tín hiệu trên màng các tế bào ung thư và tiền ung
thư cho phép cơ thể truyền tín hiệu ngừng phân chia ở dòng tế bào ung thư Do đó
các loại thực phẩm giàu carotenoid, cụ thể trong trường hợp này là -caroten có thể
không chỉ ngăn cản mà còn đảo ngược bệnh ung thư [25].
-caroten được chứng minh là tiền vitamin A Cơ thể chuyển hóa -caroten
thành vitamin A nhưng sẽ không gây ra đ c tố của vitamin A vì cơ thể chỉ chuyển
đổi vừa đủ lượng -caroten sang vitamin A mà cơ thể cần. Khi sử dụng vitamin A
trong thời gian dài sẽ gây phát ban, rụng tóc đau đầu, tổn thương gan không thể h i
phục Nhưng khi d ng với liều lượng lớn -caroten cũng không gây đ c tố hay tác
dụng phụ cho cơ thể Lượng -caroten dư thừa sẽ di chuyển trong máu và tích trữ
trong các mô mỡ, nếu tích trữ với lượng lớn dưới da thì da sẽ có màu vàng cam đ c
biệt là trong lòng bàn tay [25].


15
Tuy nhiên, m t số nhà khoa học học đưa ra giả thuyết r ng -caroten kết
hợp với vitamin C có thể làm giảm năng lượng của các gốc tự do. Khi không có m t
vitamin C, -caroten có thể tạo thành dạng pro-oxy hóa (ức chế chống oxy hóa) dẫn
đến làm gia tăng tổn thương c c tế bào, mô. Những người hút thuốc, có hàm lượng
cao các gốc tự do trong phổi nên dẫn tới thiếu vitamin C điều này cho thấy với
những người bị nghiện thuốc lá nếu bổ sung -caroten có thể gây tăng nhẹ nguy cơ
ung thư [25]. Vì vậy để phát huy tốt nhất lợi ích của -caroten đối với sức khỏe, cần
bổ sung m t cách hợp lý để tránh những tác dụng không mong muốn.
1.2.2. Xanthophyll
Xanthophyll là những dẫn xuất oxy hóa của caroten, có CTHH là C40H56O2,
chứa nhóm hydroxyl. Xanthophyll được tìm thấy chủ yếu g m: lutein, zeaxanthin và
cryptoxanthin. Lutein là m t loại xanthophyll tìm thấy trong lá cây và rau quả. Ngoài
ra cũng ph t hiện thấy lutein trong lòng đỏ trứng. Lutein là hợp chất tan tốt trong

chất béo và rất ổn định trong nhũ tương Đ ng vật không thể tự tổng hợp xanthophyll,
nên bổ sung vào cơ thể b ng c ch ăn c c thực phẩm giàu xanthophyll [23].
Xanthophyll là m t chất chống oxy hóa quan trọng vì 2 lý do: Thứ nhất đây là
m t trong số ít các chất chống oxy hóa có thể vượt qua hàng rào máu não mang lại sự
bảo vệ chống oxy hóa cho đôi mắt, não và hệ thần kinh trung ương Thứ hai nó cũng
là m t trong số ít các chất chống oxy hóa không bao giờ trở thành pro-oxy hóa.
Lutein và zeaxanthin là những carotenoid duy nhất được tìm thấy trong điểm
vàng và thủy tinh thể của mắt người, có chức năng kép giúp chống oxy hóa mạnh và
nâng cao khả năng lọc ánh sáng màu xanh. Ngoài vai trò quan trọng trong việc bảo
vệ mắt lutein và zeaxanthin còn đóng vai trò quan trọng giúp ngăn ngừa bệnh tim
mạch đ t quỵ và ung thư phổi. Bên cạnh đó chúng cũng giúp bảo vệ da khỏi sự tác
đ ng của tia cực tím (UV) khi tiếp xúc quá nhiều với ánh nắng. M t số quan sát từ
các nghiên cứu kh c cũng cho thấy các xanthophyll có thể giảm nguy cơ mắc m t
số bệnh ung thư đ c biệt là ung thư vú và ung thư phổi [30].


16

1.3. Tình hình nghiên cứu Dunaliella t ong và ngoài nƣớc
1.3.1. Tình hình nghiên cứu Dunaliella trong nước
Dunaliella là m t ngu n cung carotenoid tự nhiên tiềm năng với nhiều ứng
dụng khác nhau. M c dù vậy, Việt Nam vẫn chưa sản xuất được carotenoid tự nhiên
từ Dunaliella ở quy mô công nghiệp. Các nghiên cứu chỉ dừng ở quy mô phòng thí
nghiệm Đã có c c đề tài nghiên cứu về Dunaliella như nghiên cứu của Huỳnh Hiệp
Hùng và c ng sự, tìm ra được n ng đ NaCl và n ng đ KNO3 tối ưu cho sinh
trưởng và tối ưu cho t ch lũy -caroten đối với chủng Dunaliella sp. phân lập được
từ ru ng muối ở Khánh Hòa [1]. Cũng có nghiên cứu khác của Hoàng Thị Kim
Thoa về ứng dụng Dunaliella trong nuôi tr ng thủy sản[2]. Các nghiên cứu vẫn
dừng ở việc tìm hiểu sơ b chưa đào sâu tìm hiểu c c cơ chế điều hòa áp suất thẩm
thấu, tìm ra các gen chịu m n… Đ ng thời cũng nghiên cứu theo phương ph p

truyền thống chưa ứng dụng được công nghệ gen vào trong nghiên cứu.
1.3.2. Tình hình nghiên cứu Dunaliella ngoài nước
Carotenoid tự nhiên có nhu cầu cao trên thị trường toàn cầu nhờ vào ứng
dụng của chúng trong c c lĩnh vực: y học, mỹ phẩm, thực phẩm. M t số chủng
Dunaliella có khả năng t ch lũy lượng lớn -caroten. Thấy được tầm quan trọng đó
nhiều quốc gia trên thế giới đã đi sâu vào nghiên cứu c c đ c điểm sinh học điều
kiện cho sinh trưởng tối ưu và c c yếu tố ảnh hưởng đến qu trình t ch lũy -caroten
của vi tảo Dunaliella. Các thí nghiệm đầu tiên nh m đ nh gi ảnh hưởng của đ
m n đến tốc đ sinh trưởng của các loài Dunaliella kh c nhau đã được công bố vào
những năm 1930 Baas-Becking đã quan s t thấy r ng D. viridis phát triển mạnh
như nhau trong khoảng 1–4 M NaCl (6–23%) và pH trong khoảng 6–9 Ông đã ph t
hiện ra r ng n ng đ cao của ion Ca và Mangan sẽ trở thành nhân tố ức chế. Nhiều
thí nghiệm sâu và r ng, sử dụng nhiều chủng loài đã được công bố bởi Lerche. Bà
nhận thấy r ng hầu hết các chủng sinh trưởng tối ưu ở n ng đ muối từ 2-8%, và rất
chậm nếu trên 15%. Tốc đ sinh trưởng hàng ngày 0,47-1,22 đã ghi nhận được dưới
c c điều kiện tối ưu Song song với nghiên cứu về sinh trưởng, thì nghiên cứu về
khả năng t ch lũy -caroten cũng được đ c biệt quan tâm. Các nghiên cứu đã chứng


17
minh được khả năng t ch lũy -caroten của vi tảo Dunaliella phụ thu c vào nhiều
yếu tố như: n ng đ NaCl dinh dưỡng cường đ chiếu s ng pH… Các nghiên cứu
của Lerch chứng minh được r ng hàm lượng carotenid cao có thể được kích thích
bởi việc giới hạn dinh dưỡng cũng như b ng cường đ ánh sáng mạnh. Cùng với
khoa học hiện đại, ngoài những phương ph p nghiên cứu truyền thống thì các
phương ph p ứng dụng công nghệ gen trong việc kích hoạt t ch lũy carotenoid trong
Dunaliella và đã đạt hiệu quả. Tiềm năng công nghệ sinh học của Dunaliella làm
ngu n cung cấp ß-caroten đã được nghiên cứu từ khá sớm. Tổ chức tiên phong
trong việc nuôi tr ng Dunaliella để sản xuất ß-caroten đã được thành lập ở Liên
bang Xô Viết năm 1966 Hiện nay trên thế giới, việc sản xuất Dunaliella quy mô

lớn để thu ß-caroten là m t trong những thành công về công nghệ sinh học ở thực
vật ưa m n. Các công nghệ kh c nhau được sử dụng, từ nuôi quảng canh tự nhiên
đến hình thức nuôi tr ng tập trung mật đ cao với c c điều kiện giám sát ng t
nghèo. Các nghiên cứu đã đạt được những kết quả to lớn, nhờ đó có thể ứng dụng
vào sản xuất Dunaliella đại trà. Và hứa hẹn m t hướng đi đầy tiềm năng về sản xuất
ß-caroten tự nhiên từ vi tảo Dunaliella.