Phân lập tuyển chọn và nghiên cứu một số đặc tính của chủng nấm đảm thu thập từ vườn quốc gia bidoup núi bà

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Trần Thị Thu Hiền

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

TRẦN THỊ THU HIỀN

PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC
TÍNH CỦA CHỦNG NẤM ĐẢM THU THẬP TỪ VƢỜN QUỐC
GIA BIDOUP- NÚI BÀ

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội tháng 12 năm 2015

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Trần Thị Thu Hiền

Lời Cảm Ơn
Trước hết, tôi xin bày tỏ sự biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS. Đặng Thị
Cẩm Hà đã tận tình chỉ bảo, quan tâm hướng dẫn và dìu dắt tôi trong suốt quá trình
học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, giúp tôi có thêm nhiều kiến thức và kinh

nghiệm quý báu trong nghiên cứu khoa học.
Xin cám ơn Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hỗ trợ kinh phí
từ đề tài: “Phân lập và chọn lọc vi sinh vật sinh enzyme ngoại bào ở vườn Quốc gia
Bidoup- Núi Bà để tạo nguồn nguyên liệu cho phát triển các chế phẩm ứng dụng trong
nông nghiệp, lâm nghiệp” để tôi hoàn thành công trình này. Tôi cũng xin cám ơn chủ
nhiệm đề tài và các thành viên tham gia đã tạo điều kiện giúp tôi thu thập số liệu.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS. Đinh Thị Thu Hằng, Th.S Đào Thị Ngọc Ánh,
Th.S. Nguyễn Thị Lan Anh, Th.S Phạm Quang Huy, Th.S Ngô Thị Huyền Trang, KS.
Nguyễn Hải Vân, KS. Nguyễn Đăng Thắng, KS. Hoàng Thị Nhung, CN. Nguyễn Văn
Huynh phòng Công nghệ sinh học tái tạo môi trường, Viện Công nghệ sinh học, Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện cho
tôi trong quá trình làm khóa luận tốt nghiệp.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đối với thầy cô viện Sinh thái và Tài nguyên
sinh vật, viện Công nghệ sinh học đã tận tình dạy dỗ và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn
thành khóa học và thực hiện luận văn này.
Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn bố mẹ, chồng và những người thân yêu nhất đã tạo
điều kiện động viên giúp đỡ tôi cả về vật chất và tinh thần để tôi có thể hoàn thành
khóa luận này.
Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Trần Thị Thu Hiền

Trần Thị Thu Hiền

Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan đã trực tiếp thực hiện các nghiên cứu trong luận văn này. Mọi
kết quả thu được không sao chép từ các nghiên cứu khác. Các số liệu, sơ đồ kết quả
của luận văn này chưa từng được công bố.
Mọi dữ liệu hình ảnh, biểu đồ và trích dẫn tham khảo trong luận văn đều được
thu thập và sử dụng từ nguồn dữ liệu mở hoặc với sự đồng ý của tác giả.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên!
Tác giả

Trần Thị Thu Hiền

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Trần Thị Thu Hiền

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
MỞ ĐẦU .................................................................................................................................... 1
CHƢƠNG I : TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................. 3

1.1. Đặc điểm tự nhiên của Vƣờn Quốc gia Bidoup – Núi Bà ........................................... 3
1.2. Enzyme laccase ............................................................................................................... 4
1.2.1. Giới thiệu về laccase ................................................................................................ 4
1.2.2. Cấu trúc của phân tử laccase .................................................................................. 5
1.2.3. Cơ chế xúc tác của laccase ...................................................................................... 7
1.2.4.Chất gắn kết .............................................................................................................. 8
1.2.5. Tính chất của laccase .............................................................................................. 8
1.2.5.1. pH tối ưu và độ bền pH ...................................................................................... 8
1.2.5.2. Nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt .......................................................................... 9
1.2.5.3. Hằng số động học của phản ứng laccase .......................................................... 9
1.2.5.4. Chất ức chế laccase .......................................................................................... 9
1.2.6. Sự phân bố của laccase và vi sinh vật sinh enzyme laccase ................................ 10
1.2.7. Gene mã hóa enzyme laccase ................................................................................ 12
1.2.8. Ứng dụng của laccase ............................................................................................ 13
1.2.8.1. Xử lý rác thải và loại màu thuốc nhuộm .......................................................... 13
1.2.8.2. Ứng dụng xử lý khí độc môi trường ô nhiễm và chuyển hóa polymer mạch dài
...................................................................................................................................... 14
1.2.8.3. Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm ............................................................ 15
1.2.8.4. Ứng dụng trong công nghệ dược phẩm và công nghệ nano ............................ 15
1.2.8.5. Các ứng dụng khác của laccase ...................................................................... 16
1.2.9. Chi Polyporus và những đặc tính của nó ............................................................. 17
1.3. Thuốc nhuộm và các đặc tính cơ bản của chúng ...................................................... 20
1.3.1 Khái quát và phân loại về thuốc nhuộm ................................................................ 20
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Trần Thị Thu Hiền

1.3.2. Khả năng phân hủy, loại màu thuốc nhuộm bởi vi sinh vật sinh laccase........... 23
1.3.3. Ô nhiễm nước thải dệt nhuộm và tác hại ............................................................. 26
1.3.3.1. Ô nhiễm nước thải dệt nhuộm do thuốc nhuộm .............................................. 26
1.3.3.2. Tác hại của ô nhiễm thuốc nhuộm .................................................................. 26
CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ................................................................. 28
2.1 Vật liệu và phƣơng pháp .............................................................................................. 28
2.1.1. Vật liệu ................................................................................................................... 28
2.1.2 Hóa chất .................................................................................................................. 28
2.1.3 Thiết bị ..................................................................................................................... 28
2.1.4 Các môi trường nuôi cấy ........................................................................................ 28
2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................................ 29
2.2.1. Phân lập các chủng nấm sinh enzyme ngoại bào ................................................ 29
2.2.2. Sàng lọc các chủng nấm sinh enzyme ngoại bào ................................................. 29
2.2.3. Phương pháp thu dịch laccase trên môi trường lên men lỏng để xác định hoạt
tính .................................................................................................................................... 29
2.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính laccase ............................................................ 30
2.2.5. Phân loại chủng nấm............................................................................................ 30
2.2.5.1. Phân loại theo phương pháp truyền thống ...................................................... 30
2.2.5.2 Phân loại bằng phương pháp xác định và so sánh trình tự vùng ITS ............. 31
2.2.5.3. Phương pháp xác định trình tự vùng ITS......................................................... 31
2.2.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh tổng
hợp laccase ....................................................................................................................... 31
2.2.6.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy ............................................................... 32
2.2.6.2. Ảnh hưởng của các chất cảm ứng .................................................................... 32
2.2.6.3. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy ........................................................ 32
2.2.6.4. Ảnh hưởng của nguồn cacbon ......................................................................... 32
2.2.6.5. Ảnh hưởng của nguồn nitơ vô cơ ..................................................................... 32
2.2.6.6. Ảnh hưởng của nguồn nitơ hữu cơ .................................................................. 32

2.2.7. Đánh giá hiệu quả loại màu thuốc nhuộm hoạt tính bằng laccase thô từ chủng
nấm FBD154 .................................................................................................................... 33
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……………………………………………..34
3.1. Phân lập các chủng nấm sinh enzyme ngoại bào ...................................................... 34
3.2. Sàng lọc các chủng nấm sinh enzyme ngoại bào ....................................................... 35
3.3. Đặc điểm hình thái, phân loại và định danh chủng nấm FBD154........................... 38
3.3.1. Đặc điểm hình thái................................................................................................. 38
3.3.2. Phân loại chủng FBD154 ...................................................................................... 39
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Trần Thị Thu Hiền

3.3.2.1. Phân loại theo phương pháp truyền thống ..................................................... 39
3.3.2.2. Phân loại bằng phương pháp xác định và so sánh trình tự vùng ITS (ITS1 - 5,8
S - ITS2) ........................................................................................................................ 39
3.4. Chọn lọc môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy ............................................................... 41
3.4.1. Ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp laccase
của chủng Polyporus sp. FBD154................................................................................... 41
3.4.2. Ảnh hưởng của pH môi trường lên khả năng sinh tổng hợp laccase của chủng
Polyporus sp. FBD154 ..................................................................................................... 43
3.4.3. Ảnh hưởng của các chất cảm ứng lên khả năng sinh tổng hợp laccase của
chủng Polyporus sp. FBD154.......................................................................................... 44
3.4.4. Ảnh hưởng nồng độ CuSO4 môi trường lên khả năng sinh laccase của chủng
Polyporus sp. FBD154 ..................................................................................................... 46
3.4.5. Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh tổng hợp laccase của chủng

Polyporus sp. FBD154 ..................................................................................................... 47
3.4.6. Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh tổng hợp laccase của chủng
Polyporus sp. FBD154 ..................................................................................................... 48
3.4.6.1. Ảnh hưởng của nguồn nitơ vô cơ ..................................................................... 48
3.4.6.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ hữu cơ .................................................................. 50
3.5. Khả năng loại màu thuốc nhuộm bằng enzyme thô sinh tổng hợp từ chủng nấm
Polyporussp. FBD154 .......................................................................................................... 51
3.5.1. Khả năng loại màu nhóm anthraquinone (RBBR, NY5) bởi laccase thô từ chủng
Polyporus sp. FBD154 ..................................................................................................... 52
3.5.2. Khả năng loại màu azo (NY1, NY7) bởi laccase thô từ chủng Polyporus sp.
FBD154 ............................................................................................................................ 54
3.5.3. Khả năng loại màu thương mại (CLS và LF-2B) bởi laccase thô của chủng
Polyporus sp. FBD154 ..................................................................................................... 55
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................................ 60
Kết luận ................................................................................................................................ 60
Kiến nghị .............................................................................................................................. 60
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................................... 62
Tiếng Việt............................................................................................................................. 62
Tiếng Anh ............................................................................................................................ 62
PHỤ LỤC................................................................................................................................. 74

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Trần Thị Thu Hiền

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ABTS

2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid

Ace

Acetosyringone

bp

Base pair

CLS

Dimaren Black CLS

CGK

Chất gắn kết

DDT

Dichloro - Trichloroethane Diphenyl

DNA

Deoxyribonucleic acid

Đtg

Đồng tác giả

HCH

Hexachlorocyclohexane

HBT

Hydroxybenzotriazole

ITS

Internal transcribed spacer

Lac

Laccase

LF-2B

Everzol Red

LiP

Lignin peroxidase

MnP

Manganese peroxidase

NY1

Acid red 299

NY5

Acid blue 281

NY7

Acid red 266

PCR

Polymerase Chain Reaction

RBBR

Remazol brilliant blue R

Si

Sinapic acid

Sy

Syringaldehyde

VIO

Violuric acid

VSV

Vi sinh vật

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Trần Thị Thu Hiền

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Một số vi sinh vật có khả năng sinh laccase .................................................. 11
Bảng 1.2. Một số loại thuốc nhuộm hoạt tính ................................................................ 23
Bảng 3.1. Các chủng nấm sinh enzym ngoại bào .......................................................... 35
Bảng 3.2. Hoạt tính laccase và hình ảnh khuẩn lạc của 7 chủng nấm trên môi trường
PDA …………………………………………………………………………………..36
Bảng 3.3. Hiệu suất loại màu của thuốc nhuộm hoạt tính bằng laccase của FBD154 khi
có mặt các chất gắn kết khác nhau ................................................................................. 58
Bảng 3.4. So sánh hiệu suất loại màu bởi laccase của chủng nấm FBD154 so với
laccase thu được của các chủng nấm khác ..................................................................... 59

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Trần Thị Thu Hiền

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Hình ảnh không gian ba chiều của laccase từ M. albomyces .......................... 6
Hình 1.2. Trung tâm hoạt động của laccase ..................................................................... 6
Hình 1.3. Cơ chế xúc tác của laccase [40] ....................................................................... 7
Hình 3.1. Hoạt tính tự nhiên của các mẫu nấm từ Bidoup ............................................. 34
Hình 3.2. Hoạt tính laccase của 7 chủng nấm phân lập từ Bidoup – Núi Bà................ 38
Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc của chủng nấm FBD154 ................................................ 38
Hình 3.4. Hệ sợi nấm dưới kính hiển vi quang học ...................................................... 39
Hình 3.5. Cây phát sinh chủng loài của chủng FBD154 ................................................ 40
Hình 3.6. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh laccase ở chủng
Polyporus sp. FBD154 ................................................................................................... 42
Hình 3.7. Ảnh hưởng pH môi trường lên khả năng sinh laccase của chủng Polyporus
sp.FBD154 ..................................................................................................................... 43
Hình 3.8. Ảnh hưởng của chất cảm ứng lên khả năng sinh laccase của chủng Polyporus
sp. FBD154 .................................................................................................................... 45
Hình 3.9. Ảnh hưởng nồng độ CuSO4 môi trường lên khả năng sinh laccase của chủng
Polyporus sp. FBD154 ................................................................................................... 46
Hình 3.10. Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh laccase của chủng .......... 47
Hình 3.11. Ảnh hưởng của nguồn nitơ vô cơ lên khả năng sinh laccase của chủng
Polyporus sp.FBD154 .................................................................................................... 49
Hình 3.12. Ảnh hưởng của nguồn nitơ hữu cơ lên khả năng sinh laccase của chủng
Polyporus sp.FBD154 .................................................................................................... 50
Hình 3.13. Khả năng loại màu thuốc nhuộm RBBR (A); NY5 (B) của dịch enzyme thô
của chủng Polyporus sp. FBD154 khi có và không cómặt các chất gắn kết ................. 52

Hình 3.14. Sự thay đổi màu RBBR bởi laccase thô từ chủng Polyporus sp.FBD154 khi
có và không có mặt các chất gắn kết .............................................................................. 52
Hình 3.15. Sự thay đổi màu NY5 bởi laccase thô từ chủng Polyporus sp.FBD154 khi
có và không có mặt các chất gắn kết .............................................................................. 52
Hình 3.16. Khả năng loại màu thuốc nhuộm NY1 (A); NY7 (B) của enzyme thô của
chủng Polyporus sp. FBD154 khi có và không có mặt các chất gắn kết ....................... 54

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Trần Thị Thu Hiền

Hình 3.17. Sự thay đổi màu NY1 bởi laccase thô từ chủng Polyporus sp. FBD154 khi
có và không có mặt các chất gắn kết .............................................................................. 54
Hình 3.18. Sự thay đổi màu NY7 bởi laccase thô từ chủng Polyporus sp. FBD154 khi
có và không có mặt các chất gắn kết .............................................................................. 54
Hình 3.19. Khả năng loại màu thuốc nhuộm CLS (A); LF-2B (B) của dịch enzyme thô
của chủng Polyporus sp. FBD154 khi có và không có mặt các chất gắn kết ................ 55
Hình 3.20. Sự thay đổi màu CLS bởi laccase thô từ chủng Polyporus sp. FBD154 khi
có và không có mặt các chất gắn kết .............................................................................. 56
Hình 3.21. Sự thay đổi màu LF-2B bởi laccase thô từ chủng Polyporus sp. FBD154 khi
có và không có mặt các chất gắn kết .............................................................................. 56

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Trần Thị Thu Hiền
MỞ ĐẦU

Hiện nay, ô nhiễm môi trường ngày càng trở nên nghiêm trọng và đang là một
vấn đề cấp thiết được toàn thế giới quan tâm. Sự ô nhiễm ngày càng gia tăng do tác
động của thiên tai và do các hoạt động của con người. Việt Nam cũng là một trong
những nước mà tình trạng ô nhiễm môi trường đang trở nên báo động, trong đó có tình
trạng ô nhiễm bởi nguồn thuốc nhuộm không được xử lý. Cùng với sự phát triển của
nhiều ngành công nghiệp khác nhau sử dụng màu tổng hợp như giấy in, photo màu hay
được thêm vào các sản phẩm dầu mỏ, đặc biệt là ngành công nghiệp dệt nhuộm thì một
lượng lớn nước thải màu cũng được thải ra môi trường. Thông thường, các chất có
trong thuốc nhuộm không bám hết vào sợi vải trong quá trình nhuộm mà bao giờ cũng
còn lại một lượng dư nhất định tồn tại trong nước thải. Đây chính là nguyên nhân làm
cho nước thải dệt nhuộm có độ màu cao và nồng độ chất ô nhiễm lớn, nếu không được
xử lý triệt để chúng sẽ gây ô nhiễm nguồn nước mặt và nước ngầm.Cụ thể là thuốc
nhuộm gây nên rất nhiều bệnh hiểm nghèo đặc biệt là bệnh ung thư và gây nên đột
biến.
Do những ảnh hưởng xấu đến môi trường nên xử lý thuốc nhuộm đang là vấn đề
được toàn xã hội rất quan tâm. Một số phương pháp xử lý nước thải từ các nhà máy dệt
nhuộm được sử dụng hiện nay là phương pháp vật lý và hóa học thường không triệt để.
Loại màu và phân hủy thuốc nhuộm bằng con đường sinh học đang được quan tâm
trong những năm gần đây vì công nghệ sinh học vừa mang lại hiệu quả kinh tế và rất
thân thiện với môi trường. Trong các phương pháp xử lý màu thuốc nhuộm bằng vi
sinh vật thì sử dụng hệ enzyme ngoại bào từ đại diện của hai ngành Basidomycota và
Ascomycotanhư laccase, manganese peroxidase (MnP), lingnin peroxidase (LiP) đang
được quan tâm bởi hiệu quả về cả kinh tế và môi trường.

Những năm gần đây việc nghiên cứu sàng lọc để tiến tới sản xuất enzyme ngoại
bào từ nấm đảm đã và đang được các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu
và giành được sự quan tâm đăc biệt là laccase. Các nguyên cứu tìm kiếm và khai thác

1


Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Trần Thị Thu Hiền

enzyme ngoại bào thuộc nhóm oxidoredase và peroxidase từ nấm đảm đã đạt được
thành tựu cao. Đã phát hiện trên 100 loại laccase có trọng lượng phân tử khác nhau với
hoạt tính và tính chất khác nhau. Chúng có khả năng phá vỡ các liên kết trong các hợp
chất hữu cơ hoặc xúc tác chuyển hóa chúng thành các chất ít độc hơn và các dạng dễ
phân hủy hơn để tiến tới khoáng hóa hoàn toàn chất ô nhiễm. Laccase xuất hiện ở các
loại thực vật bậc cao và nhiều nhất ở nấm lớn, có dải pH tối thích rộng và cũng có loại
laccase có khả năng chịu nhiệt cao. Chúng có khả năng phân hủy phenol và các hợp
chất của phenol. Ngoài ra, laccase còn được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như khử
độc và loại màu thuốc nhuộm và các màu khác do các ngành công nghiệp thải ra, xử lý
nước thải, làm trắng giấy và có ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, mỹ phẩm, công
nghệ nano, dược phẩm v.v.
Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đó, đề tài “Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu
một số đặc tính của chủng nấm đảm thu thập từ vƣờn quốc gia Bidoup - Núi Bà”
đã được tiến hành. Luận văn bao gồm những nội dung chủ yếu sau:
- Phân lập và sàng lọc các chủng nấm đảm có khả năng sinh laccase cao từ
vườn quốc gia Bidoup- Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng;
- Phân loại chủng nấm đã được chọn lọc có hoạt tính cao nhất bằng phương
pháp truyền thống và xác định trình tự vùng ITS;
- Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy phù hợp để chủng đã được chọn sinh tổng

hợp laccase với hoạt tính cao;
- Đánh giá khả năng loại màu một số thuốc nhuộm hoạt tính (tổng hợp và
thương mại)bởi laccase thô thu được từ chủng nghiên cứu có và không có chất gắn kết.

2


Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Trần Thị Thu Hiền

CHƢƠNG I : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc điểm tự nhiên của Vƣờn Quốc gia Bidoup – Núi Bà
Vườn Quốc gia Bidoup – Núi Bà là một trong hai mươi tám vườn quốc gia nằm
trong hệ thống các khu rừng đặc dụng Việt Nam. Khu vực Bidoup – Núi Bà thuộc địa
giới hành chính Huyện Lạc Dương Tỉnh Lâm Đồng chiếm gần trọn cao nguyên
Langbiang (còn gọi là cao nguyên Lâm Viên), cách thành phố Đà Lạt 50 km theo tỉnh
lộ 273. Vườn Quốc gia Bidoup – Núi Bà nằm trong tọa độ địa lý Từ 12 độ 00' 00” đến
12 độ 52' 00” vĩ độ Bắc và từ 108 độ 17'00” đến 108 độ 42' 00” kinh độ Đông.
Địa hình núi trung bình và núi cao, chia cắt mạnh, độ cao phổ biến từ 1.500m 1.800m. Ðịa hình thấp dần theo hướng Nam Bắc. Nhiệt độ trung bình năm là 18 0C.
Lượng mưa trung bình 1.755 mm/năm, mùa khô lượng mưa chiếm khoảng 20%, mùa
mưa lượng mưa chiếm khoảng 80%; số ngày mưa trung bình 170 ngày/năm. Số ngày
có sương mù khoảng 80 ngày/năm, tập trung vào các tháng 2, 3, 4, 5. Khu vực Vườn
quốc gia Bidoup-Núi Bà là thượng nguồn của các hệ sông Krông-Knô, sông Ða Nhim,
duy trì nguồn nước cho một loạt hồ của Ðà Lạt như: hồ Ðan Kia, hồ Ða Thiện, hồ Than
Thở, hồ Xuân Hương.
Vườn quốc gia Bidoup-Núi Bà là một mẫu chuẩn hệ sinh thái rừng kín thường
xanh mưa ẩm á nhiệt đới của Việt Nam đặc trưng cho vùng cao nguyên, là một địa
điểm lý tưởng trong nghiên cứu khoa học, bảo tồn và đa dạng sinh học.
Đa dạng sinh học về loài thực vật: với khoảng 1.468 loài bao gồm họ Lan 250 loài; họ

Cúc 78 loài; họ Ðậu 65 loài; họ Cỏ 58 loài; họ Cà phê 45 loài; họ Dẻ 41 loài; họ Thầu
dầu 35 loài; họ Cói 33 loài; họ Hoa hồng 33 loài; họ Long não 29 loài; họ Dâu tằm 28
loài; họ Ðơn nem 25 loài; họ Bạc hà 22 loài; họ Ðỗ quyên 21 loài; họ Chè 21 loài…
Đa dạng về nguồn gene: có nhiều nguồn gene quý hiếm và đặc hữu; riêng về đặc hữu
hẹp đã thống kê được 91 loài: Thông tre, Thông đỏ, Du sam, Pơ mu Bách xanh, Thông
hai lá dẹt, Thông 5 lá Ðà Lạt, Ðỉnh tùng, Hoàng đàn giả. Côm Bidoup, Chè gò đồng
Bidoup, Lan Hoàng Thảo Ðà Lạt, Lan Hoàng thảo Lang Biang, Trà hoa Langbiang,

3


Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Trần Thị Thu Hiền

Chân chim Langbian, Cung nữ Langbian, 250 loài phong lan, cho hoa đẹp và quý, 9
loài Ðỗ quyên, 5 loài Thu hải đường, 6 loài Thích là các nguồn gen quý.
Đa dạng về loài động vật: Về thú: Bao gồm các họ: họ Cầy, họ Chuột, họ Khỉ, họ Mèo,
họ Sóc cây, họ Chồn, họ Hươu nai, họ Gấu, họ Trâu bò, họ Nhím, họ Chuột chù, Chồn
bay, họ Dơi quả, họ Cu li, họ Vươn, họ Chó, họ Lợn, họ Cheo cheo, họ Tê tê, họ Sóc
bay, họ Dúi. Về Chim: họ Khướu, họ Trĩ , họ Cu cu, họ Chào mào, họ chim chích; đặc
biệt có những loài đặc hữu hẹp như: Mi Langbian, Khướu đầu đen, Khướu má xám, Sẻ
thông họng vàng. Về Bò sát: họ Rắn nước, họ Nhông, họ Rắn hổ, họ Tắc kè, họ Kỳ đà,
họ Rùa núi, họ Thằn lằn bóng, họ Trăn, họ Rắn mống, họ Rắn lục, họ Ba ba. Về Ếch
Nhái: có các họ: họ Ếch nhái, họ Nhái bầu, họ Cóc nhà, họ Ếch cây; … vv.
Tuy nhiên cho đến nay, các nghiên cứu về hệ nấm tại vườn quốc gia Bidoup –
Núi Bà còn ít, mới chỉ có đề tài điều tra, đánh giá, phân loại các loài nấm dưới tán rừng
thông tập trung vào điều tra các loài nấm cộng sinh ngoại bào của ThS Tôn Thất Minh,
còn hệ nấm ngoại sinh và các nhóm vi sinh khác chưa có một nghiên cứu cụ thể. Đặc
biệt, với đặc điểm rừng cây tán lá rộng, độ che phủ cao, ẩm quanh năm thì hệ vi sinh

vật nơi đây được kỳ vọng là khá đa dạng, cần được nghiên cứu và khai thác bền vững.
Vì vậy đề tài mở ra một hướng nghiên cứu mới, vừa góp phần xây dựng cơ sở dữ liệu
đa dạng sinh học cho Vườn quốc gia Bidoup – Núi Bà, vừa đưa ra hướng khai thác
hiệu quả hệ sinh thái rừng phục vụ cho việc phát triển kinh tế và môi trường bền vững.
1.2. Enzyme laccase
1.2.1. Giới thiệu về laccase
Laccase (p–benzenediol: oxygen oxidoreductase, E.C.1.10.3.2 ) thuộc nhóm
enzyme oxy hóa khử. Trong phân tử có chứa 4 nguyên tử đồng có khả năng oxy hóa cơ
chất sử dụng phân tử oxy làm chất nhận điện tử. Khác với phần lớn các enzyme khác,
laccase có phổ cơ chất rất đa dạng, bao gồm diphenol, polyphenol, các dẫn xuất
phenol, diamine, amine thơm, benzenethiol, PCB, dioxin và cả các hợp chất vô cơ như
iot. Các loại laccase tách chiết từ các nguồn khác nhau thì khác nhau về khối lượng

4


Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Trần Thị Thu Hiền

phân tử, tính chất glycosyl hóa và tính chất động học.
Trong những năm gần đây, laccase đặc biệt được quan tâm bởi các enzyme này
có những ứng dụng hữu ích trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau trong xử lý khử
độc bằng công nghệ phân hủy sinh học, dệt nhuộm, tổng hợp hữu cơ, thực phẩm, dược
phẩm v.v.
1.2.2. Cấu trúc của phân tử laccase
Một loài sinh vật có thể có nhiều dạng isozyme của laccase, các dạng isozyme
này khác nhau về trình tự axit amin và một số tính chất về động học xúc tác. Nấm có
thể tạo ra nhiều dạng isozyme laccase khác nhau cả về mức độ glycosyl hóa và cả
thành phần các gốc cacbonhydrat. Loài nấm Trametes versicolor có 5 dạng isozyme

chỉ khác nhau về thành phần cacbonhydrat, thành phần cacbonhydrat của chúng thay
đổi từ 10-45% so với khối lượng của thành phần protein. Phân tử laccase thường là
monomeric protein, chỉ một số là oligomeric protein, có khối lượng phân tử dao động
trong khoảng 60-90 kDal. Phần lớn laccase của nấm có bản chất là glycoprotein với
hàm lượng cacbonhydrat chiếm khoảng 10-25% [35]. Ngoài ra còn có nhiều loại
enzyme giống laccase (laccase-like).
Tuy vậy, tất cả laccase đều giống nhau về cấu trúc trung tâm xúc tác với 4
nguyên tử đồng. Những nguyên tử đồng này được chia thành ba nhóm: Loại 1 (T1),
loại 2 (T2) và loại 3 (T3), chúng khác nhau về tính chất hấp thụ ánh sáng và thế điện
tử. Các nguyên tử đồng T1 và T2 có tính chất hấp thụ điện tử và tạo thành phổ điện tử
mạnh, trong khi cặp nguyên tử đồng T3 không tạo phổ điện tử hấp thụ điện tử và có thể
được hoạt hóa khi liên kết với anion mạnh.

5


Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Trần Thị Thu Hiền

Hình 1.1. Hình ảnh không gian ba
chiều của laccase từ M. albomyces
Tiểu phần A, B, C được kí hiệu đỏ,
xanh lam và xanh lá cây

Phân tử laccase thông thường bao gồm 3 tiểu phần chính (vùng) A, B, C có khối
lượng tương đối bằng nhau, cả ba phần đều có vai trò trong quá trình xúc tác của
laccase. Vị trí liên kết với cơ chất nằm ở khe giữa vùng B và vùng C, trung tâm một
nguyên tử đồng nằm ở vùng C và trung tâm ba nguyên tử đồng nằm ở bề mặt chung
của vùng A và vùng C. Trung tâm đồng một nguyên tử chỉ chứa một nguyên tử

đồng T1, liên kết với một đoạn peptit có hai gốc histidin và một gốc cystein. Liên kết
giữa nguyên tử đồng T1 với nguyên tử lưu huỳnh của cystein là liên kết đồng hóa trị
bền và hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 600 nm, tạo cho laccase có màu xanh nước biển
đặc trưng. Trung tâm đồng ba nguyên tử có nguyên tử đồng T2 và cặp nguyên tử đồng
T3. Nguyên tử đồng T2 liên kết với hai gốc histidin bảo thủ trong khi các nguyên tử
đồng T3 thì tạo liên kết với 6 gốc histidin bảo thủ (Hình 1.2).

Hình 1.2. Trung tâm hoạt động của laccase

6


Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Trần Thị Thu Hiền

1.2.3. Cơ chế xúc tác của laccase
Laccase là enzyme oxy hóa khử có khả năng oxy hóa diphenol và các hợp chất
có liên quan, sử dụng oxy phân tử làm chất nhận điện tử. Khác với phần lớn các loại
enzyme khác, laccase có phổ cơ chất rộng. Sự phù hợp của các cơ chất đối với laccase
quyết định bởi hai nhân tố chính. Thứ nhất là sự phù hợp giữa cơ chất và nguyên tử
đồng T1, thứ hai là sự phụ thuộc vào sự chênh lệch giữa thế oxy-hóa khử giữa cơ chất
và enzyme. Các đại lượng này phụ thuộc vào cấu trúc hóa học của cơ chất. Thế oxy
hóa khử của laccase dao động trong khoảng 0,4 đến 0,8 V [43]. Cơ chất khử bị mất một
điện tử nhờ xúc tác laccase thường tạo thành một gốc tự do, gốc tự do không bền này
tiếp tục bị oxy hóa nhờ xúc tác bởi chính laccase đó hoặc tiếp tục các phản ứng không
cần xúc tác enzyme như hydrat hóa, phân ly hoặc polymer hóa.
Trung tâm nguyên tử đồng một nguyên tử (T1) là nơi diễn ra phản ứng oxy hóa
cơ chất. Cơ chất chuyển một điện tử cho nguyên tử đồng T1, biến nguyên tử đồng T1
(Cu2+) trở thành dạng Cu+, hình thành phân tử laccase có cả 4 nguyên tử đồng đều ở

trạng thái khử (Cu+). Một chu kỳ xúc tác liên quan đến sự vận chuyển đồng thời 4
electron từ nguyên tử đồng T1 sang cụm nguyên tử đồng T2/T3 qua cầu tripeptit bảo
thủ His-Cys-His. Phân tử oxy sau đó oxy hóa laccase dạng khử, tạo thành hợp chất
trung gian peroxy, và cuối cùng bị khử thành nước (Hình 1.3)

Hình 1.3. Cơ chế xúc tác của laccase [40]
7


Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Trần Thị Thu Hiền

Ngoài ra, cơ chế xúc tác có thể xảy ra theo một trong các cơ chế sau. Cơ chế
đơn giản nhất có thể diễn ra khi các cơ chất bị oxy hóa trực tiếp bởi trung tâm hoạt
động do 4 nguyên tử đồng đảm nhiệm. Tuy nhiên, các phần tử cơ chất thường có cấu
tạo cồng kềnh hoặc có thế khử quá lớn, vì vậy chúng không thể tiếp cận được trung
tâm phản ứng của laccase. Trong trường hợp này cần một hợp chất hóa học trung gian
đó là chất gắn kết (CGK). Hợp chất hóa học này có thể tiếp xúc với trung tâm phản
ứng của laccase và bị laccase oxy hóa thành dạng gốc tự do [77]. Sự tham gia của các
chất trung gian đã làm tăng phổ cơ chất xúc tác và tính không đặc hiệu cơ chất của
laccase.
1.2.4.Chất gắn kết
Như đã trình bày ở trên, laccase có khả năng loại và khử độc nhiều màu trong
công nghiệp [45]. Tuy nhiên, một số màu không thể bị oxy hóa, hoặc chỉ bị oxy hóa
một phần bởi laccase. Bởi vì các phần tử cơ chất thường có cấu tạo cồng kềnh hoặc có
thế oxi hóa khử quá lớn, vì vậy chúng không thể tiếp cận được trung tâm phản ứng của
laccase. Trong trường hợp này cần một chất gắn kết (mediator) có vai trò quan trọng để
có thể tiếp xúc với trung tâm phản ứng của laccase và bị laccase oxy hóa thành dạng
gốc tự do [77]. Sau đó CGK ở dạng oxy hóa nhận một điện tử của cơ chất và trở thành

dạng khử, tiếp tục tham gia vào chu kỳ xúc tác. Ngược lại, laccase sau khi cho CGK
một điện tử thì trở thành dạng khử, sau đó bị oxy hóa thành dạng oxy hóa và tiếp tục
tham gia vào chu kỳ tiếp theo. Do đó, các CGK có vai trò quan trọng đối với các phản
ứng enzyme trong những trường hợp này. Hơn 100 loại CGK được biết đến nhưng các
CGK thường được sử dụng nhiều nhất là HBT,VIO, ABTS, Ace, Si, Sy. Những CGK
này đã được chứng minh là có hiệu quả trong việc oxy hóa các loại màu khác nhau
[45].
1.2.5. Tính chất của laccase
1.2.5.1. pH tối ưu và độ bền pH
Laccase hoạt động tối thích trong khoảng pH 4-6 đối với cơ chất phenolic. Khi

8


Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Trần Thị Thu Hiền

tăng pH sang vùng trung tính hoặc vùng kiềm thì hoạt tính của laccase bị giảm, nguyên
nhân do anion nhỏ là ion hydroxyt đã ức chế laccase. Mặt khác, tăng pH còn làm giảm
thế oxy hóa khử của các cơ chất phenolic do đó cơ chất phenolic dễ bị oxy hóa bởi
laccase hơn. Do vậy, hoạt tính laccase ở các pH khác nhau là kết quả của hai tác dụng
đối lập của pH là sự tăng chênh lệch thế oxy hóa khử laccase-cơ chất và tác dụng ức
chế trung tâm đồng ba nguyên tử của ion hydroxit. Đối với các cơ chất không phải
phenolic như ABTS thì phản ứng oxy hóa không liên quan đến sự vận chuyển ion và
do đó pH tối thích nằm trong khoảng 2-3. Ngược lại, tính bền của laccase cao nhất
trong khoảng pH kiềm nằm trong khoảng 8-9.
1.2.5.2. Nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt
Nhiệt độ bền của laccase dao động đáng kể, phụ thuộc vào nguồn gốc của VSV.
Nhìn chung, laccase bền ở 30-50oC và nhanh chóng mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 60oC.

Laccase bền nhiệt nhất được phân lập chủ yếu từ các loài thuộc sinh vật nhân sơ. Ví dụ
thời gian bán hủy của laccase của Streptomyces lavendulae là 100 phút ở 70oC và của
protein cotA từ loài Bacillus subtilis là 112 phút ở 80oC. Thời gian bán hủy của laccase
có nguồn gốc từ nấm thường dưới 1 giờ ở 70oC và dưới 10 phút ở 80oC [43].
1.2.5.3. Hằng số động học của phản ứng laccase
Hoạt tính xúc tác của enzyme được đặc trưng bởi hằng số Michaelis-Menten
(Km). Hằng số này của laccase dao động trong một giới hạn khá rộng, trong khoảng 2500 µM phụ thuộc vào nguồn enzyme và cơ chất. Giá trị Km thấp nhất đối với cơ chất
là syringaldazine. Ái lực đối với oxy ít phụ thuộc vào enzyme hơn và chỉ dao động
trong khoảng 20-50µM.
1.2.5.4. Chất ức chế laccase
Các chất ức chế của laccase thường là các ion nhỏ như azit, cyanit, fluorit. Các
ion này sẽ liên kết vào trung tâm đồng 3 nguyên và cản trở các dòng điện tử đi đến các
nguyên tử này. Các chất ức chế laccase khác là ethylenediaminetetraaxetic axit, axit
béo, tropolon và axit coumaric nhưng chúng chỉ có tác dụng ức chế ở nồng độ cao hơn.

9


Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Trần Thị Thu Hiền

Các hợp chất chứa sulfhydryl như L-cystein, dithiothreitol và thioglycolic axit cũng
được coi là các chất ức chế laccase.
1.2.6. Sự phân bố của laccase và vi sinh vật sinh enzyme laccase
Laccase là enzyme rất phổ biến trong tự nhiên, chúng được tìm thấy ở thực vật,
nấm, một số vi khuẩn và côn trùng. Laccase lần đầu tiên được phát hiện ở cây Rhus
vernicifera. Nghiên cứu laccase trên đối tượng đầu tiên là thực vật và nấm đảm là các
cơ thể sinh tổng hợp laccase rất phổ biến. Laccase từ nấm được nghiên cứu và khảo sát
rất kỹ đặc biệt là laccase từ nấm đảm thuộc chi Basidiomyces. Ngoài ra, laccase còn

được phát hiện trong các loài nấm của các chi Ascomyces,Deuteromyces và các loài
nấm có khả năng phân hủy lignocellulose như Agaricus bisidomyces, Botrytis cinerea,
Chaetomiumthemophilum, Coprius cinereus, Neurospora crassa, Phlebia radiate,
Pleurotusostreatus, Pycnoporus cinnabarius, Trametes versicolor v.v. Tuy nhiên, các
nghiên cứu về laccase trên các đối tượng nấm sợi, xạ khuẩn và vi khuẩn lại không
nhiều. Một số VSV có khả năng tạo laccase được trình bày ở bảng 1.1.

10


Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Trần Thị Thu Hiền

Bảng 1.1. Một số vi sinh vật có khả năng sinh laccase
VSV

Nấm đảm

Nấm sợi

Xạ khuẩn

Vi khuẩn

Tên chủng

Tài liệu tham khảo

Phanerochaete chrysosporium

Viswanath et al., 2008 [96]

Pycnoporus coccineus

Jaouani et al. 2005 [33]

Pycnoporus sanguineus

Pointing et al. 2000 [67]

Pycnoporus cinnabarinus

Recordet al. 202 [74]

Cerrena unicolor

Michniewicz A et al., 2005 [53]

Trametes versicolor

Moldes et al., 2012 [54]

Pleurotus ostreatus

Hou Het al., 2004 [30]

Pleurotus florida

Sathishkumaret al., 2010 [81]

Polyporus pseudobetulinus

Songserm et al., 2012 [89]

Polyporus arcularius

Jegatheesan, Eyini, 2014 [34]

Coriolopsis polyzona

Cui et al., 2009 [18]

Aspergillus ochraceus

Saratale et al., 2006 [64]

Trichoderma harzianum

Sadhasivam S et al., 2008 [63]

Aspergillus niger

Téllez-Juradoet al., 2006 [94]

Penicillium simplicissimum

Zenget al., 2006 [67]

Penicillium pinophilum

Dhakar et al.,2014 [21]

Myrothecium verrucaria 24G-4

Sulistyaningdyahet al.,2003 [92]

Streptomyces lavendulae

Suzuki et al., 2003 [93]

Streptomyces psammoticus

Niladeviet al., 2009 [56]

Streptomyces lydicus

Mahmoud et al., 2013 [50]

Streptomyces coelicolor

Machczynski et al., 2004 [49]

Bacillus halodurans

Ruissenaars, Hartmans, 2004[78]

Bacillus subtilis

Wang et al., 2011 [99]

Stenotrophomonas maltophilia

Galai, Marzouki, 2009 [24]

Azospirillum lipoferum

Givaudan et al., 1993 [26]

11


Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Trần Thị Thu Hiền

1.2.7. Gene mã hóa enzyme laccase
Trong vài thập kỷ gần đây, gene mã hóa laccase đã bắt đầu được nghiên cứu.
Cho đến nay đã có hơn 100 gene mã hóa laccase được đánh giá và so sánh, các nghiên
cứu chủ yếu tập trung trên đối tượng VSV. Năm 1998 gene mã hóa laccase đầu tiên
được phân lập và xác định trình tự từ nấm đảm Neurospora crassa và nấm sợi
Aspergillus nidulans. Tuy nhiên các gene tương ứng với các laccase hoàn chỉnh mới
chỉ có khoảng 20 gen, phần lớn trong số đó là nấm đảm. Gene mã hóa cho laccase cũng
đã được xác định từ vi khuẩn cổ [1].
Đối với nấm đảm và thực vật bậc cao, các gene mã hóa laccase thường có nhiều
intron. Số lượng intron trong mỗi gene thường từ 8-13 đoạn, mỗi đoạn có kích thước
khoảng 50-90 nucleotit. Ngoài ra cũng có những gene laccase chỉ có một intron như
Neurospora crassai, ngược lại Pleurotus ostreatus lại có đến 19 đoạn intron. Các gene
điển hình mã hóa protein laccase thường có kích thước khoảng 500-600 axit amin [1].
Ở nhiều chủng nấm trong bộ gene chứa nhiều gene mã hóa sinh tổng hợp

laccase. Trametes villosa chứa ít nhất 5 gene mã hóa cho laccase, Coprinus cinereus
chứa ít nhất 8 gene và Rhizoctonia solani, Pleurotus sajor-caju chứa ít nhất là 4 gene
mã hóa laccase. Tuy nhiên, các gene này nằm ở các allen khác nhau trên nhiễm sắc thể
và các trình tự bảo thủ liên quan đến vị trí liên kết với các nguyên tử đồng lại đồng thời
cũng có mặt trong các gene mã hóa các enzyme oxidase chứa nhiều nguyên tử đồng
khác, chính những đặc điểm này đã gây khó khăn trong việc phân lập và xác định
chính xác số gene mã hóa cho laccase.
Sự biểu hiện của gene sinh tổng hợp laccase phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện
môi trường. Với mỗi chủng khác nhau thì đòi hỏi điều kiện môi trường thích hợp cho
sinh tổng hợp laccase khác nhau. Môi trường giàu nitơ làm tăng quá trình sinh tổng
hợp laccase ở chủng Pleurotus sajor-caju PI27 nhưng chủng Lentinula edodes UFV52
lại có khả năng sinh tổng hợp laccase tốt hơn trên môi trường có hàm lượng nitơ thấp.

12


Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Trần Thị Thu Hiền

Đồng và các ion kim loại khác như Hg2+, Mg2+, Cd2+ và một số hợp chất vòng thơm
được xem là những nhân tố hoạt hóa mạnh quá trình sinh tổng hợp laccase. Quá trình
hoạt hóa gene sinh tổng hợp bởi các ion kim loại hoặc các hợp chất chứng minh là
được điều khiển bởi một trình tự điều hòa của vùng promoter của gen [1].
Trình tự gene mã hóa laccase có thể chia thành ba nhóm chính và nằm trong
Ascomycete, Basidomycete và thực vật bậc cao. Tuy nhiên các nghiên cứu về gene mã
hóa laccase ở vi sinh vật nhân sơ đang được quan tâm. Các nhà khoa học tìm kiếm
gene laccase mới và các đặc tính của các enzyme laccase nhằm ứng dụng trong phát
triển kinh tế cũng như trong xử lý môi trường.
1.2.8. Ứng dụng của laccase

1.2.8.1. Xử lý rác thải và loại màu thuốc nhuộm
Laccase được quan tâm nhiều hơn cả do có tiềm năng ứng dụng cao cho nhiều
ngành công nghiệp và xử ý ô nhiễm môi trường và họ ligninase có tiềm năng to lớn
trong tiền xử lý lignocellulose [66]. Với tốc độ tăng dân số nhanh và đời sống con
người ngày càng được nâng cao thì lượng rác thải sinh hoạt cũng tăng nhanh chóng.
Xử lý rác thải sinh hoạt là một trong những vấn đề rất được chú ý và quan tâm ở nhiều
nước trên thế giới. Rác thải sinh hoạt đa phần có nguồn gốc hữu cơ, chủ yếu là
lignocellulose, tinh bột, chất béo, ngoài ra còn có kim loại nặng, dầu mỡ, PAH và các
loại vi sinh vật gây bệnh. Do lignocellulose chứa lượng lignin nhất định nên tương đối
khó bị phân huỷ, lượng lignin này có thể liên kết với các polysacarit tạo nên hàng rào
vững chắc ngăn chặn sự tấn công của các enzyme từ vi sinh vật. Vì vậy, khi sử dụng hệ
enzyme phân huỷ lignin trong xử lý rác thải sẽ tạo tiền đề cho các vi sinh vật khác mà
đặc biệt là hệ vi sinh vật phân huỷ cellulose, hemicellulose lên men ưa nhiệt và chịu
nhiệt để tạo ra các đường đơn giản làm nguyên liệu cho các ngành công nghiệp khác
cũng như làm phân bón hữu cơ hay thức ăn cho động vật [34].
Theo thống kê, khoảng 90% chất màu từ cơ sở dệt nhuộm không bị phân huỷ
sau quá trình xử lý nước thải bằng biện pháp lý – hoá học. Nhiều chất ngoài tác động

13


Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Trần Thị Thu Hiền

về mặt màu sắc còn là tác nhân gây đột biến hoặc ung thư và gây độc cho đa số vi sinh
vật. Loại bỏ những hợp chất này luôn là vấn đề cần quan tâm, đặc biệt là về việc tìm
kiếm những phương pháp cũng như các tác nhân xử lý thích hợp. Hiện nay đã có nhiều
công trình nghiên cứu của các nhà khoa học cho thấy hệ enzyme phân huỷ lignin có
khả năng phân huỷ các loại thuốc nhuộm [62]. Các enzyme laccase và MnP từ vi sinh

vật đã được ứng dụng trong các nghiên cứu loại màu thuốc nhuộm công nghiệp như
RBBR, Poly –R, Poly-B, có hiệu quả rất cao. Laccase còn được sử dụng để tẩy trắng
giấy trong công nghiệp chế biến giấy, tẩy màu vải sợi trong công nghiệp dệt nhuộm
[28, 54]. Việc sử dụng các enzyme thay thế làm giảm đi một lượng lớn hóa chất cũng
như lượng thải các chất hữu cơ khó phân hủy là sản phẩm của các biến đổi hóa học từ
các nhà máy sản xuất các sản phẩm giấy và dệt may [28].
1.2.8.2. Ứng dụng xử lý khí độc môi trường ô nhiễm và chuyển hóa polymer mạch dài
Những enzyme peroxidase và laccase từ các chủng nấm đảm cũng được nghiên
cứu khả năng phân hủy các hợp chất có trong thuốc diệt cỏ như dioxin, 2,4,5-T;
2,3,7,8-TCDD; PCDDs v.v. thu được hiệu quả cao. Nấm P. chrysosporium có khả năng
khoáng hóa 2,2% 2,3,7,8-TCDD thành CO2 sau 30 ngày. Cajthaml và đtg [61] đã sử
dụng enzyme thô để nghiên cứu khả năng phân hủy một vài PAH như anthracene,
phenanthrene, pyrene, fluoranthene. Sau 50 ngày ủ với dịch môi trường nuôi cấy chứa
enzyme thì anthracene còn lại 1%, phenanthrene 5%, fluorathene 32% và pyrene 7%.
Đã không tìm thấy chất chuyển hóa trung gian nào có độc tính được tích tụ trong dịch
sau xử lý. Levin và đtg [46] nghiên cứu khả năng phân hủy nitrobenzene và anthracene
khi sử dụng chủng nấm đảm Trametes trogii. Chủng này chịu được 2 chất ô nhiễm này
với nồng độ cao từ 250 – 500 mg/l và chuyển hóa được 90 – 97% trong quá trình sinh
trưởng và phân hủy hoàn toàn sau khi chuyển sang giai đoạn cân bằng. Trong môi
trường nuôi cấy xác định được laccase và MnP trong suốt quá trình sinh trưởng của
chủng nấm. Ngoài ra rất nhiều chất ô nhiễm bền vững khác cũng được chứng minh là
bị phân hủy bởi 3 enzyme ngoại bào này. Như vậy 3 enzyme laccase, MnP và LiP đóng

14


Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Trần Thị Thu Hiền

vai trò rất quan trọng trong phân hủy sinh học và phục hồi sinh học các vị trí bị ô
nhiễm trong môi trường tự nhiên. Đặc biệt sẽ có hiệu quả cao hơn nếu nhân rộng và
thúc đẩy sự phát triển mạnh của tập đoàn vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp 3
enzyme này một cách mạnh hơn.
1.2.8.3. Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm
Laccase còn có khả năng oxy hóa các hợp chất phenol và không thuộc phenol
mà không phụ thuộc vào các yếu tố đồng trao đổi chất đắt tiền. Chính vì tính không đặc
hiệu và có tới hơn 100 loại laccase khác nhau nên chúng đã được sử dụng trong công
nghiệp thực phẩm. Hiệu quả rõ ràng nhất là sử dụng laccase để làm trong nước hoa quả
ép, rượu vang, bia. Đặc biệt là tăng chất lượng tinh bột và các vật liệu tương tự cho
công nghiệp thực phẩm.Gần đây các nghiên cứu cho thấy laccase còn một khả năng
nữa đó là khử được các hormone và các chất làm giảm miễn dịch trong thực phẩm và
nước.
1.2.8.4. Ứng dụng trong công nghệ dược phẩm và công nghệ nano
Laccase đã được ứng dụng có hiệu quả trong sinh tổng hợp các chất trong công
nghiệp dược phẩm [7, 11, 64]. Ngày nay, laccase đã được sử dụng nhiều hơn trong
chẩn đoán bệnh. Đặc biệt, enzyme này không thể thiếu trong quá trình sản xuất các loại
thuốc chống ung thư và ức chế các loại virus, đặc biệt là HIV. Laccase có thể được sử
dụng trong sản xuất các dược phẩm mới khác nữa như chất kháng sinh, kháng virus,
chống viêm và chống ô xy hóa. Thường laccase loại này được sản xuất và thu nhận từ
nấm thuốc như Clitocybe maxima, Hericium erinaceum, Pleurotus eryngii, Tricholoma
giganteum, Lentinus tigrinus, Agrocybe cylindracea[31, 97,100]. Laccse còn là thành
phần tạo nên mỹ phẩm và lọc nước để tạo ra hệ nước sạch bởi tính xúc tác của enzyme.
Đặc biệt laccase có tiềm năng rất cao trong công nghệ nano sinh học. Nhờ sử dụng các
bề mặt có kích thước nano để cố định laccase nên người ta đã tạo ra các sensor sinh
học đa chức năng và có độ chính xác cao, sử dụng để phát hiện các chất như
catecholamine, dopamine dẫn truyền xung thần kinh, epinephrine và norepinephrin v.v.

15