Nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm và chế tạo Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng (Trypanosomiasis) ở đàn trâu tại tỉnh Tuyên Quang (LA tiến sĩ)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NCS. PHẠM THỊ TRANG
1

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH TỶ LỆ NHIỄM
VÀ CHẾ TẠO KIT CHẨN ĐOÁN BỆNH TIÊN MAO TRÙNG
(TRYPANOSOMIASIS) Ở ĐÀN TRÂU
TẠI TỈNH TUYÊN QUANG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ THÚ Y

THÁI NGUYÊN - NĂM 2017


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NCS. PHẠM THỊ TRANG

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH TỶ LỆ NHIỄM
VÀ CHẾ TẠO KIT CHẨN ĐOÁN BỆNH TIÊN MAO TRÙNG
(TRYPANOSOMIASIS) Ở ĐÀN TRÂU
TẠI TỈNH TUYÊN QUANG
Ngành: Ký sinh trùng và vi sinh vật học thú y
Mã số: 9640104

LUẬN ÁN TIẾN SĨ THÚ Y

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. GS. TS. Nguyễn Thị Kim Lan

2. PGS. TS. Phạm Công Hoạt

THÁI NGUYÊN - NĂM 2017


i

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của chúng tôi. Các kết quả
nghiên cứu trong luận án này là hoàn toàn trung thực và chưa được công bố trong
bất kỳ một luận án nào khác. Mọi thông tin trích dẫn trong luận án đều đã được chỉ
rõ nguồn gốc.
Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện đề tài nghiên cứu và
hoàn thành Luận án đều đã được cảm ơn.
TÁC GIẢ

Phạm Thị Trang


ii

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận án này, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới
GS. TS. Nguyễn Thị Kim Lan và PGS. TS. Phạm Công Hoạt - những Nhà khoa
học đã hướng dẫn, chỉ bảo tôi hết sức tận tình trong suốt quá trình nghiên cứu và
hoàn thành Luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện to lớn về cơ sở vật chất,
nhân lực, vật lực của Ban Giám đốc, Ban Đào tạo - Đại học Thái Nguyên; Đảng ủy,
Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo, Ban chủ nhiệm Khoa Chăn nuôi thú y, Bộ môn
Bệnh động vật, Bộ môn Dược lý & Vệ sinh an toàn thực phẩm Trường Đại học

Nông Lâm Thái Nguyên, tập thể cán bộ giảng dạy, các học viên cao học Trần Nhật
Thắng, Nguyễn Thị Thu Hiền, Hoàng Thị Hồng Hạnh và sinh viên các khóa 39, 40,
41, 42 Khoa Chăn nuôi Thú y - Trường Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên.
Đặc biệt, tôi xin trân trọng cảm ơn PGS. TS. Phạm Thị Tâm cùng các cán bộ giảng
viên, học viên và sinh viên Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở - Hà Nội đã
tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian triển khai đề tài.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Chi cục Thú y tỉnh Tuyên Quang, các Trạm Thú y và
cán bộ, nhân dân địa phương của các huyện Yên Sơn, Sơn Dương, Hàm Yên và Chiêm
Hóa - tỉnh Tuyên Quang đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Tôi vô cùng biết ơn các thành viên trong gia đình và bạn bè đã luôn ở bên tôi,
giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành
Luận án.
Thái nguyên, ngày

tháng

năm 2017

NGHIÊN CỨU SINH

Phạm Thị Trang


iii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .........................................................................................................i
MỤC LỤC .................................................................................................................. iii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT ...................................................................v
DANH MỤC CÁC BẢNG..........................................................................................vi

DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................................ viii
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
1. Tính cấp thiết của đề tài .......................................................................................1
2. Mục tiêu của đề tài ............................................................................................... 3
3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài ................................................3
4. Những đóng góp mới của đề tài ...........................................................................3
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................4
1.1. Cơ sở khoa học của đề tài .................................................................................4
1.1.1. Bệnh tiên mao trùng ở động vật ............................................................................. 4
1.1.2. Kỹ thuật sinh học phân tử trong sản xuất kháng nguyên của tiên mao trùng
T. evansi .......................................................................................................................... 12
1.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước .....................................................20
1.2.1. Tình hình nghiên cứu trong nước......................................................................... 20
1.2.2. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài ..................................................................... 24
1.3. Điều kiện tự nhiên, điều kiện kinh tế - xã hội của tỉnh Tuyên Quang ............35
1.3.1. Điều kiện tự nhiên ................................................................................................. 35
1.3.2. Điều kiện kinh tế - xã hội...................................................................................... 36
Chƣơng 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... 38
2.1. Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu .....................................................38
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................................... 38
2.1.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ....................................................................... 38
2.1.3. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................... 38
2.2. Nội dung nghiên cứu....................................................................................... 43
2.2.1. Nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng trên đàn trâu ở tỉnh Tuyên
Quang và áp dụng phác đồ điều trị................................................................................. 43


iv

2.2.2. Nghiên cứu chế tạo và thử nghiệm Kit CATT trong chẩn đoán bệnh tiên

mao trùng cho đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang ............................................................. 44
2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................45
2.3.1. Phương pháp xác định tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng trên đàn trâu của tỉnh
Tuyên Quang và áp dụng phác đồ điều trị ..................................................................... 45
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu chế tạo Kit chẩn đoán bệnh ....................................... 51
2.4. Phương pháp xử lý số liệu ..............................................................................64
Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ...................................65
3.1. Tình hình nhiễm tiên mao trùng trên đàn trâu ở 4 huyện thuộc tỉnh Tuyên
Quang và áp dụng phác đồ điều trị hiệu quả ......................................................... 65
3.1.1. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu tại 4 huyện thuộc tỉnh Tuyên Quang ................. 65
3.1.2. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng theo lứa tuổi trâu tại tỉnh Tuyên Quang ................ 67
3.1.3. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo tính biệt ................................................. 71
3.1.4. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo mùa vụ .................................................. 72
3.1.5. Kết quả xác định loài tiên mao trùng gây bệnh trên đàn trâu của tỉnh
Tuyên Quang .................................................................................................................. 75
3.1.6. Áp dụng phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng cho đàn trâu của tỉnh
Tuyên Quang .................................................................................................................. 80
3.2. Nghiên cứu chế tạo và thử nghiệm Kit CATT trong chẩn đoán bệnh tiên
mao trùng cho đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang......................................................83
3.2.1. Kết quả tách dòng và xác định trình tự gen mã hóa kháng nguyên bề mặt
RoTAT 1.2 của T. evansi ................................................................................................ 83
3.2.2. Kết quả biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của T. evansi .................. 95
3.2.3. Kết quả nghiên cứu chế tạo và thử nghiệm Kit CATT trong chẩn đoán bệnh
tiên mao trùng ................................................................................................................ 108
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................................131
1. Kết luận ............................................................................................................131
2. Đề nghị .............................................................................................................132
TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................................133
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI ................148

v

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
ADN: Acide Deoxyribo Nucleic
bp: base pair
CATT: Card Agglutination Test for Trypanosomiasis
CBB: Coomassie Brilliant Blue
DMSO: Di Methyl Sulfoxide
EDTA: Ethylene Diamine Tetra Acetic acid
IPTG: Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
ISG: Invanant Surface Glycoprotein
kb: kilobase
kDa: kiloDalton
LB: Luria Bertani
OD: Optical Density
PBS: Phosphat Buffered Saline
PCA: Plate Count Agar
PCR: Polymerase Chain Reaction
PMSF: Phenyl Methyl Sulfonyl Fluoride
PVDF: Poly Vinylidene Di Fluoride
RT - PCR: Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction
SDS: Sodium Dodecyl Sulfat
SDS - PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate Poly Acrylamide Gel Electrophoresis
spp.: Species pluralis
TEA: Tris - axit acetic - EDTA
TMB: Tetra Methyl Benzidine
VAT: Variable Antigen Type
VSG: Variant Surface Glycoprotein

vi

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Thành phần gel Tricine - SDS ...................................................................41
Bảng 2.2. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu .....................................................42
Bảng 2.3. Thành phần và chu trình nhiệt phản ứng PCR...........................................48
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen mã hóa kháng
nguyên RoTAT 1.2 .....................................................................................54
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng Klewnov cắt đầu bằng sản phẩm PCR ................54
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng lai tạo vector tái tổ hợp ..........................................55
Bảng 2.7. Thành phần phản ứng kiểm tra sự mang gen của vector tái tổ hợp
bằng phản ứng PCR với cặp mồi F1.2 và R1.2 ..........................................57
Bảng 2.8. Thành phần phản ứng ghép nối gen ngoại lai vào vector biểu hiện ..........58
Bảng 3.1. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu tại 4 huyện thuộc tỉnh Tuyên Quang ........65
Bảng 3.2. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng theo tuổi trâu .................................................68
Bảng 3.3. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo tính biệt .......................................71
Bảng 3.4. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo mùa trong năm ............................ 72
Bảng 3.5. Danh sách chuỗi gen 18S của Trypanosoma evansi sử dụng so sánh
và phân tích trong nghiên cứu ....................................................................78
Bảng 3.6. Kết quả áp dụng phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng trên diện hẹp ........80
Bảng 3.7. Thử nghiệm phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng trên diện rộng .............82
Bảng 3.8. Bảng tổng hợp kết quả so sánh trình tự xác định với các trình tự trên NCBI .......92
Bảng 3.9. Kết quả xác định mật độ hạt latex và nồng độ kháng nguyên để tạo
phức hợp kháng nguyên - hạt latex ...........................................................111
Bảng 3.10. Kết quả xác định nhiệt độ và thời gian để tạo phức hợp kháng
nguyên - hạt latex......................................................................................112
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của chất nhuộm màu đến khả năng ngưng kết kháng
nguyên - kháng thể....................................................................................113
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của nhiệt độ và chất ức chế phân giải protein đến kháng

nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 ...................................................................115
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của nhiệt độ và chất ổn định protein đến kháng nguyên
tái tổ hợp RoTAT 1.2 ................................................................................117


vii

Bảng 3.14. Ảnh hưởng của nhiệt độ và chất diệt khuẩn đến kháng nguyên tái tổ
hợp RoTAT 1.2 .........................................................................................118
Bảng 3.15. Xác định độ pha loãng kháng thể, thời gian và nhiệt độ phản ứng .......121
Bảng 3.16. Kết quả phản ứng sử dụng Kit CATT phát hiện kháng thể kháng ........125
Bảng 3.17. Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ bảo quản đến độ nhạy của
phản ứng khi sử dụng Kit CATT ..............................................................127
Bảng 3.18. Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ bảo quản đến độ đặc hiệu của
Kit CATT chế tạo .....................................................................................127
Bảng 3.19. So sánh kết quả chẩn đoán bệnh tiên mao trùng của Kit CATT với
kỹ thuật ELISA và phương pháp tiêm truyền chuột .................................128
Bảng 3.20. So sánh hiệu quả sử dụng Kit CATT với kỹ thuật ELISA và phương
pháp tiêm truyền chuột .............................................................................129


viii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc của tiên mao trùng T. evansi .........................................................4
Hình 1.2. Phương thức truyền lây tiên mao trùng T. evansi .......................................5
Hình 1.3. Sơ đồ vector pCR 2.1 ................................................................................17
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu tách dòng và biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên
bề mặt của T. evansi .................................................................................51
Hình 2.2. Sơ đồ nghiên cứu chế tạo và thử nghiệm Kit CATT từ kháng nguyên

tái tổ hợp của T. evansi ............................................................................52
Hình 3.1. Biểu đồ tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu tại 4 huyện thuộc tỉnh
Tuyên Quang ............................................................................................66
Hình 3.2. Đồ thị biến động nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo lứa tuổi .....................68
Hình 3.3. Biểu đồ tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo tính biệt ..........................71
Hình 3.4. Biểu đồ tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo mùa trong năm ...............73
Hình 3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen 18S của các mẫu Trypanosoma
spp. trên thạch agarose 1% ......................................................................75
Hình 3.6. Hình ảnh chuyển nạp sản phẩm PCR của mẫu Tev-CH-VN; TevHY-VN; Tev-SD-VN và Tev-YS-VN vào tế bào E. coli chủng
DH5α-T ....................................................................................................76
Hình 3.7. Điện di kiểm tra sản phẩm cắt ADN plasmid tái tổ hợp mang gen
18S bằng enzyme EcoRI ..........................................................................77
Hình 3.8. Cây phả hệ dựa trên trình tự nucleotide chuỗi gen 18S rRNA của các
mẫu Tev-CH-VN; Tev-HY-VN; Tev-SD-VN và Tev-YS-VN
nghiên cứu với các mẫu Trypanosoma evansi đã được đăng ký trong
Ngân hàng gen .........................................................................................79
Hình 3.9. Kết quả điện di ADN tổng số ....................................................................83
Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR của mẫu ADN tổng số ..........................84
Hình 3.11. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR ............................................................85
Hình 3.12. Sơ đồ thiết kế vector tái tổ hợp pJET1.2 - RoTAT 1.2 ...........................87


ix

Hình 3.13. Kết quả nuôi cấy vi khuẩn biến nạp trên môi trường LB có
ampicillin, chất chỉ thị màu X-gal, chất cảm ứng IPTG ..........................88
Hình 3.14. Kết quả tách chiết ADN plasmid pJET1.2 - RoTAT 1.2 ........................89
Hình 3.15. Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng phản ứng PCR .......................90
Hình 3.16. Kết quả kiểm tra pJET1.2 - RoTAT 1.2-1 bằng EcoRI và SalI ..............91
Hình 3.17. Trình tự nucleotide và axit amin suy diễn của đoạn gen đích

RoTAT 1.2 ...............................................................................................92
Hình 3.18. Kết quả tinh sạch sản phẩm cắt bằng hai enzyme EcoRI và SalI .......... 94
Hình 3.19. Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp pET22 - RoTAT 1.2 vào tế bào
vi khuẩn E. coli BL21 .............................................................................95
Hình 3.20. Kết quả tách chiết ADN plasmid pET22 - RoTAT 1.2...........................95
Hình 3.21. Sản phẩm PCR kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET22 - RoTAT 1.2 ..........96
Hình 3.22. Kết quả cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET22 - RoTAT 1.2.................97
Hình 3.23. Kết quả điện di Tricine-SDS PAGE các dòng plasmid tái tổ hợp ........99
Hình 3.24. Phản ứng western blot kiểm tra tính đặc hiệu của protein RoTAT 1.2 ........ 99
Hình 3.25. Mức độ biểu hiện kháng nguyên RoTAT 1.2 theo thời gian cảm ứng .......100
Hình 3.26. Mức độ biểu hiện kháng nguyên RoTAT 1.2 ở các nhiệt độ nuôi cấy .......101
Hình 3.27. Mức độ biểu hiện kháng nguyên RoTAT 1.2 ở các giá trị OD khác nhau ..102
Hình 3.28. Mức độ biểu hiện kháng nguyên RoTAT 1.2 ở các giá trị pH khác nhau .... 103
Hình 3.29. Mức độ biểu hiện kháng nguyên RoTAT 1.2 ở các nồng độ kháng
sinh ampicillin bổ sung khác nhau .........................................................104
Hình 3.30. Kết quả khảo sát nồng độ chất cảm ứng IPTG ở các nồng độ khác nhau ...105
Hình 3.31. Kết quả khảo sát thời gian cảm ứng ......................................................106
Hình 3.32. Kết quả khảo sát nhiệt độ cảm ứng ......................................................107
Hình 3.33. Quy trình sản xuất Kit CATT ..............................................................109
Hình 3.34. Đánh giá hiệu quả kết hợp kháng nguyên - kháng thể dựa trên
thang điểm từ âm tính (-), nghi ngờ (+/-) và dương tính (1+) - (4+) ....110
Hình 3.35. Quy trình chẩn đoán bệnh tiên mao trùng bằng Kit CATT và
phương pháp tiêm truyền chuột .............................................................129


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Bệnh tiên mao trùng là bệnh phổ biến ở nhiều loài gia súc như trâu, bò, dê,

ngựa, hươu, lạc đà… Elshafie E. I. và cs. (2013) [54], Kocher A. và cs. (2015) [66],
Tehseen S. và cs. (2015) [116] cho biết, bệnh do Trypanosoma evansi (T. evansi) ký sinh trùng đường máu, thuộc giới động vật nguyên sinh Protozoa, lớp trùng roi
Flagellata, giống Trypanosoma gây nên. Bệnh thấy ở hầu hết các nước châu Phi,
Nam Mỹ và châu Á. Ở Việt Nam, bệnh tiên mao trùng thấy phổ biến ở khắp các
vùng, miền.
Alves F. M. và cs. (2011) [35] cho biết, bệnh tiên mao trùng do đơn bào T.
evansi gây ra, nếu chẩn đoán và điều trị không kịp thời gia súc có thể chết, gây thiệt
hại lớn cho người chăn nuôi. Chính vì vậy, yêu cầu cấp thiết hiện nay là phải tìm ra
một phương pháp chẩn đoán bệnh nhanh, độ chính xác cao, chi phí thấp, dễ dàng áp
dụng trên phạm vi rộng để có thể điều trị kịp thời, giảm tỷ lệ chết do bệnh gây ra.
Hiện nay, nước ta đã sử dụng nhiều phương pháp chẩn đoán bệnh tiên mao
trùng như phương pháp phát hiện tiên mao trùng trực tiếp, phương pháp tập trung
tiên mao trùng, phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm, chẩn đoán huyết
thanh học, chẩn đoán sinh học phân tử. Trong đó, phương pháp soi tươi và phương
pháp nhuộm tiêu bản máu khô thường khó phát hiện tiên mao trùng; phương pháp
tiêm truyền chuột nhắt trắng cho kết quả chính xác, song cần nhiều thời gian mới có
kết quả; phương pháp sinh học phân tử có độ chính xác cao nhưng cần có trang thiết
bị hiện đại mới thực hiện được; phương pháp chẩn đoán huyết thanh học được
đánh giá là có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho kết quả nhanh và có khả năng
chẩn đoán với số lượng mẫu lớn trong thời gian ngắn.
Các phương pháp chẩn đoán huyết thanh học bệnh tiên mao trùng được thực
hiện dựa trên nguyên tắc dùng các phản ứng huyết thanh học đặc hiệu để phát hiện
kháng thể hoặc kháng nguyên tiên mao trùng. Tuy vậy, kháng nguyên bề mặt của
tiên mao trùng lại rất đa dạng với nhiều epitope biến đổi khác nhau. Việc lựa chọn
một epitope kháng nguyên có tính ổn định và tính đặc hiệu với nhiều serotype của


2

tiên mao trùng là công việc cần thiết để đảm bảo phương pháp chẩn đoán có độ

nhạy và đặc hiệu cao.
Theo nghiên cứu của Vương Thị Lan Phương (2004) [28], Abou El Naga T. và
cs. (2012) [33], kháng nguyên RoTAT 1.2 có mặt ở hầu hết các VAT (Variable
Antigen Type - kháng nguyên biến đổi) của T. evansi. Urakawa T. và cs. (2001)
[121], Phạm Thị Tâm và cs. (2013) [29] cho biết, Kit chẩn đoán chế tạo từ kháng
nguyên tái tổ hợp có độ nhạy, độ đặc hiệu cao hơn. Nguyễn Thị Kim Lan và cs.
(2015) [18] cho biết, kháng nguyên này được chế tạo bằng công nghệ gen cho khả
năng phát hiện đặc hiệu tiên mao trùng đạt trên 98%.
Tuyên Quang là một tỉnh miền núi phía Bắc có địa hình đồi núi, khí hậu nhiệt
đới gió mùa, thời tiết nóng ẩm, thích hợp cho ruồi trâu, mòng - vật môi giới phát triển,
hút máu và truyền bệnh tiên mao trùng từ trâu, bò bệnh sang trâu, bò khỏe. Đây là một
trong những tỉnh nằm trong vùng dịch tự nhiên, trâu, bò thường mắc ở thể mạn tính, có
biểu hiện lâm sàng không rõ rệt nên rất khó phát hiện và phòng chống bệnh. Hàng năm,
trâu, bò bị ốm và chết khá nhiều trong vụ Đông - Xuân, khi thời tiết giá lạnh và thức ăn
khan hiếm. Cơ sở hạ tầng phục vụ công tác chẩn đoán và điều trị bệnh cho đàn gia súc
tại địa phương vẫn còn nhiều hạn chế, dẫn tới hệ quả là bệnh tiên mao trùng trở nên
phổ biến hơn, nghiêm trọng hơn và gây thiệt hại lớn hơn.
Những phân tích ở trên đã cho thấy, mức độ phổ biến cũng như những tác
hại do bệnh tiên mao trùng gây ra trên đàn gia súc nói chung và đàn trâu nói riêng ở
nước ta, đặc biệt là ở các tỉnh trung du miền núi, trong đó, có tỉnh Tuyên Quang. Vì
vậy, việc nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm, chế tạo kit chẩn đoán và xác định phác
đồ điều trị hiệu quả bệnh tiên mao trùng cho đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang là hết
sức cần thiết.
Xuất phát từ yêu cầu cấp thiết của thực tiễn, để có cơ sở khoa học xây dựng
quy trình chẩn đoán, quy trình phòng trị bệnh tiên mao trùng hiệu quả cho đàn trâu
ở tỉnh Tuyên Quang, chúng tôi đã thực hiện đề tài: "Nghiên cứu xác định tỷ lệ
nhiễm và chế tạo Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng (Trypanosomiasis) ở đàn
trâu tại tỉnh Tuyên Quang".

3

2. Mục tiêu của đề tài
- Xác định được tỷ lệ nhiễm, định danh loài tiên mao trùng gây bệnh và áp
dụng phác đồ điều trị hiệu quả cho đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang.
- Chế tạo được Kit CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng có độ nhạy và độ
đặc hiệu cao.
3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả của đề tài là những thông tin khoa học về tỷ lệ nhiễm, nghiên cứu chế
tạo Kit chẩn đoán và biện pháp phòng chống bệnh tiên mao trùng hiệu quả trên đàn
trâu của tỉnh Tuyên Quang.
Sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp phục vụ chế tạo Kit chẩn đoán là hướng
nghiên cứu công nghệ cao khẳng định việc làm chủ công nghệ, sản phẩm của công
nghệ cao đã và đang được ứng dụng vào thực tiễn sản xuất tại Việt Nam.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Chế tạo được Kit từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 của loài T. evansi
phục vụ công tác chẩn đoán bệnh nhanh và kịp thời, áp dụng phác đồ điều trị bệnh
hiệu quả, từ đó góp phần nâng cao số lượng và chất lượng đàn trâu, cải thiện đời
sống cho người chăn nuôi.
4. Những đóng góp mới của đề tài
Chế tạo được các bộ Kit từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 của loài T.
evansi, Kit có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, có thể áp dụng chẩn đoán nhanh bệnh
tiên mao trùng ở các địa phương.


4

Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Cơ sở khoa học của đề tài
1.1.1. Bệnh tiên mao trùng ở động vật
1.1.1.1. Căn bệnh
Bệnh tiên mao trùng - Trypanosomiasis - là bệnh do ký sinh trùng đơn bào
Protozoa, lớp trùng roi Flagellata gây ra. Có nhiều loài thuộc giống Trypanosoma
như: Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Trypanosoma evansi, Trypanosoma
congolense, Trypanosoma gambiense, Trypanosoma vivax, Trypanosoma simiae…
có khả năng gây bệnh cho người và động vật (Kumar A. và cs., 1991 [69]). Ở Việt
Nam, bệnh tiên mao trùng do loài đơn bào Trypanosoma evansi (T. evansi) gây ra.
Tiên mao trùng T. evansi có hình thoi, dài 18 - 34 m. Giữa thân tiên mao
trùng có một nhân, phía cuối cơ thể có một roi, roi này chạy dọc theo thân và tạo
thành nhiều màng rung động, cuối cùng roi lơ lửng ở phần đầu và thành roi tự do
(Nguyễn Thị Kim Lan, 2011 [12]).
Kinetoplast
Màng rung
Nhân

Roi tự do

Hình 1.1. Cấu trúc của tiên mao trùng T. evansi
(Nguồn: Desquesnes M., 2004 [48])


5

1.1.1.2. Vật chủ và vật môi giới truyền bệnh tiên mao trùng
Trong tự nhiên, tiên mao trùng ký sinh ở hầu hết các loài thú nuôi và thú
hoang, thấy phổ biến hơn ở trâu, bò, ngựa, trâu bò rừng, hươu, nai, hổ, báo, sư tử, chó,
mèo, lạc đà, voi, thỏ, chuột cống, chuột lang, chuột bạch..., không ký sinh ở người
(Phạm Sỹ Lăng và cs., 2008 [22], Hasan M. U. và cs., 2006 [63], Youssif F. và cs.,

2008 [128]).
Sự lây truyền bệnh tiên mao trùng từ trâu, bò ốm sang trâu, bò khỏe là nhờ
các loài ruồi hút máu (thuộc họ phụ Stomoxydinae) và các loài mòng hút máu
(thuộc họ Tabanidae). Sự lây truyền này chỉ mang tính chất cơ học. Như vậy, ruồi
và mòng hút máu là những vật môi giới truyền bệnh tiên mao trùng quan trọng.
Đây là một trong những cơ sở khoa học để xây dựng biện pháp phòng và tránh lây
lan bệnh tiên mao trùng hiệu quả (Nguyễn Thị Kim Lan, 2012 [13]; Baldacchino
F. và cs., 2014 [36]).

Hình 1.2. Phƣơng thức truyền lây tiên mao trùng T. evansi
(Nguồn: Desquesnes M. và cs., 2004 [48])

1.1.1.3. Dịch tễ học bệnh tiên mao trùng
Bệnh tiên mao trùng phân bố rất rộng, từ phía Tây sang phía Đông bán cầu. Ở
châu Phi, T. evansi hiện diện tại tất cả các quốc gia có lạc đà, từ Senegal (15° Bắc)


6

đến Kenya (xích đạo), trên vành đai Glossina. T. evansi được tìm thấy không chỉ ở
Mauritania, Morocco, Algeria, Tunisia, Libya, Ai Cập, Sudan, Eritrea và Ethiopia,
mà còn ở khu vực phía bắc của Mali, Burkina Faso, Niger, Nigeria, Chad, Somalia,
Kenya. Ngày nay, phân bố địa lý của bệnh liên tục từ khu vực phía bắc của châu
Phi, qua Trung Đông đến khu vực Đông Nam Á. Bệnh phổ biến ở trâu, bò và ngựa
các nước nhiệt đới ở châu Phi, châu Á và Nam Mỹ (Haridy F. M. và cs., 2011 [62],
Sumbria D. và cs., 2014 [110]).
Ở Việt Nam, bệnh tiên mao trùng đã được phát hiện thấy phổ biến ở hầu hết
các vùng sinh thái khác nhau như miền núi, trung du, đồng bằng và ven biển (Phạm
Sỹ Lăng và cs., 2008 [22]).
Mùa phát bệnh có liên quan chặt chẽ với mùa côn trùng hoạt động, thường

vào khoảng từ tháng 5 đến tháng 9 hàng năm (Phan Địch Lân và cs., 2002 [23]).
1.1.1.4. Đặc điểm gây bệnh của T. evansi
Khi ruồi, mòng đốt, hút máu và truyền tiên mao trùng vào gia súc, tiên
mao trùng xâm nhập vào da, tạo nên các vết viêm trên mặt da.
Độc tố của tiên mao trùng tác động tới bộ máy tiêu hoá, gây rối loạn tiêu
hoá, làm con vật ỉa chảy. Hội chứng tiêu chảy thường xảy ra khi xuất hiện tiên mao
trùng trong máu con vật bệnh.
Khi sống trong huyết tương vật chủ, tiên mao trùng sử dụng protein huyết
tương, làm giảm áp lực keo trong máu, nước sẽ từ máu thẩm thấu qua thành mạch quản
vào gian bào của tổ chức gây hiện tượng thủy thũng. Ngoài ra, khi tiên mao trùng sinh
sản nhiều trong máu có thể làm tắc các mạch máu nhỏ và các mao mạch, làm tăng tính
thấm thành mạch, dần dần tạo ra các ổ thuỷ thũng chất keo vàng dưới da.
Sau khi xâm nhập vào máu ký chủ, tiên mao trùng sinh sản theo cấp số nhân.
Số lượng tiên mao trùng nhiều thì lượng độc tố cũng tăng lên, tác động vào trung
khu điều hòa nhiệt làm cho con vật sốt. Khi động vật sốt cao là lúc trong máu có
nhiều tiên mao trùng phát triển.
Theo Phạm Sỹ Lăng và cs. (2008) [22], trâu, bò bị bệnh tiên mao trùng thể
hiện các triệu chứng lâm sàng chủ yếu như: sốt cao và gián đoạn, có biểu hiện rối
loạn thần kinh, thủy thũng dưới da, gầy yếu, suy nhược, thiếu máu, viêm kết mạc và
giác mạc mắt. Một số trâu, bò bệnh bị ỉa chảy nặng, phân lỏng màu vàng, sau


7

chuyển màu xám, có lẫn bọt và chất nhầy. Các đợt ỉa chảy tiếp theo những cơn sốt
cách quãng.
Trâu, bò bị bệnh mạn tính thường kéo dài, cơ thể suy yếu, liệt hai chân sau,
nằm tư thế quỳ và không đi lại được. Mặc dù nằm liệt nhưng vẫn ăn và nhai lại cho
đến khi sắp chết. Triệu chứng viêm giác mạc và kết mạc mắt thấy ở hầu hết trâu, bò
mắc bệnh: mắt có dử trắng hay vàng, chảy liên tục, nếu nặng thì mắt sưng, đỏ ngầu.

Khi khỏi bệnh, mắt có màng trắng như cùi nhãn kéo che kín giác mạc.
Con vật mắc bệnh tiên mao trùng khi chết gầy xơ xác, mổ khám thấy có những
biến đổi bệnh tích đại thể rõ rệt ở hệ tuần hoàn và hô hấp: tim nhão, xoang bao tim tích
nước vàng; phổi sung huyết và tụ máu từng đám; gan sưng to, nhạt màu; lách sưng,
mềm nhũn và nhạt màu; hạch lâm ba sưng và tụ máu trong hạch; cơ nhão, màu nhợt
nhạt, nhát cắt rỉ nước; xoang ngực và xoang bụng tích dịch màu vàng nhạt.
1.1.1.5. Chẩn đoán bệnh tiên mao trùng
Việc chẩn đoán bệnh tiên mao trùng tương đối khó khăn vì căn bệnh có khi
có ở mạch máu ngoại vi, có khi không. Do đó, cần phải chẩn đoán bằng nhiều
phương pháp khác nhau:
* Phương pháp chẩn đoán lâm sàng
Biểu hiện lâm sàng của bệnh tiên mao trùng không phải lúc nào cũng phát
hiện được. Chính vì vậy, việc chẩn đoán qua triệu chứng lâm sàng ở trâu, bò có độ
chính xác không cao. Vì vậy, ngoài chẩn đoán qua các triệu chứng lâm sàng, cần
phải tiến hành các phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm để có kết quả chẩn
đoán chính xác.
* Phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm
Việc phát hiện tiên mao trùng được thực hiện trên các mẫu máu, có thể xét
nghiệm các mẫu máu này bằng hình thức soi tươi, cố định, nhuộm giemsa và một số
phương pháp huyết thanh học khác (Desquesnes M., 2004) [48]. Cụ thể như sau:
- Phương pháp phát hiện tiên mao trùng
Để phát hiện tiên mao trùng, có thể áp dụng phương pháp soi tươi máu
(Direct smear); phương pháp nhuộm giemsa tiêu bản máu khô (Romanovsky);
phương pháp tập trung tiên mao trùng.


8

- Phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm
Đây là phương pháp phổ biến, hiệu quả, chính xác và thường được ứng dụng

nhiều trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng. Ở phương pháp này, người ta tiêm
truyền máu của động vật cần chẩn đoán cho động vật thí nghiệm (thường dùng
chuột nhắt trắng). Sau đó, hàng ngày kiểm tra máu của động vật đã được tiêm
truyền để phát hiện tiên mao trùng. Nếu trong máu động vật này có tiên mao trùng
thì kết luận động vật cần chẩn đoán bị nhiễm bệnh và ngược lại.
Theo Lê Ngọc Mỹ (1994) [26], phương pháp tiêm truyền động vật thí
nghiệm là phương pháp chẩn đoán chính xác, nhưng nhược điểm của phương pháp
này là khi cần chẩn đoán nhanh, với số lượng mẫu nhiều trong khoảng thời gian
ngắn thì phương pháp này không thể đáp ứng được.
- Phương pháp chẩn đoán huyết thanh học
Khi tiên mao trùng ký sinh, cơ thể vật chủ sản sinh ra kháng thể đặc hiệu
chống lại tiên mao trùng. Những phương pháp sau cho phép phát hiện kháng thể
kháng tiên mao trùng trong máu vật chủ:
Phản ứng ngưng kết trên bản nhựa (CATT/T. evansi: Card Agglutination
Test for Trypanosomiasis)
Đây là phương pháp ngưng kết trực tiếp giữa kháng nguyên và kháng thể
trên bản nhựa, được dùng để phát hiện kháng thể trong máu động vật nhiễm bệnh.
Phương pháp CATT có ưu điểm cho kết quả nhanh chóng, dễ thực hiện,
đặc biệt có thể áp dụng trong điều kiện thực địa thiếu các dụng cụ chẩn đoán
chuyên biệt.
Nguyên lý của phương pháp: kháng nguyên tiên mao trùng đã được nhuộm
màu sẽ kết hợp với kháng thể có trong huyết thanh của động vật nhiễm bệnh, tạo
thành những đám kết tủa li ti màu xanh, đó là phản ứng dương tính. Nếu động vật
không nhiễm bệnh, trong máu không có kháng thể đặc hiệu, phản ứng kết hợp
kháng nguyên - kháng thể không xảy ra và không có các đám kết tủa, đó là phản
ứng âm tính.


9

Phương pháp ngưng kết trên phiến kính (SAT: Slide Agglutination Test)
Phương pháp ngưng kết trên phiến kính là phản ứng giữa kháng nguyên tiên
mao trùng sống có sẵn, với kháng thể có trong huyết thanh của động vật nghi
nhiễm. Phương pháp này đơn giản, dễ tiến hành và có thể áp dụng trên diện rộng.
Tuy nhiên phải thường xuyên lưu giữ giống tiên mao trùng để có tiên mao trùng
sống thực hiện phản ứng này.
Phương pháp LATEX (Latex Agglutination Test)
Phương pháp LATEX được dùng để phát hiện kháng thể có trong huyết
thanh của gia súc mắc bệnh tiên mao trùng.
Nguyên lý: Đây là phản ứng dùng kháng nguyên gắn hạt latex, khi gặp kháng
thể đặc hiệu, kháng nguyên và kháng thể sẽ kết hợp với nhau thành đám lớn mà mắt
thường có thể quan sát được. Khi cho kháng nguyên trộn với kháng thể đặc hiệu
tương ứng, phản ứng ngưng kết sẽ xảy ra. Kháng nguyên và kháng thể kết hợp với
nhau qua cầu nối kháng thể đặc hiệu. Do mỗi cầu nối với kháng nguyên dưới hình
thức mạng lưới nhiều chiều, tạo nên những đám ngưng kết biểu hiện bằng những
đám lấm tấm hoặc lổn nhổn như những hạt cát hoặc những cụm bông lơ lửng. Nhờ
có hạt latex gắn vào kháng nguyên, hiện tượng ngưng kết này trở nên dễ dàng quan
sát hơn.
Phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp IFAT (Indirect Fluorescent
Antibody Test)
Trong nhiều trường hợp, để phát hiện phức hợp kháng nguyên - kháng thể,
cần phải sử dụng một số kỹ thuật miễn dịch mới nhìn thấy được. Phương pháp
kháng thể huỳnh quang gián tiếp IFAT dùng kháng kháng thể đã được nhuộm chất
phát huỳnh quang để phát hiện kháng nguyên cần chẩn đoán. Trong phương pháp
này có ba thành phần tham gia là kháng nguyên cần chẩn đoán, kháng thể đặc hiệu
và kháng kháng thể đã gắn chất phát huỳnh quang. Do đó, phương pháp này còn
được gọi là phương pháp hai lớp.
Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
Phương pháp ELISA là một trong những phương pháp hiện đại được ứng
dụng để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng. Phương pháp này đang được sử dụng rộng

10

rãi ở các nước trên thế giới. Thuy N. T. và cs. (2012) [118] cho biết, sử dụng phản
ứng ELISA có khả năng phát hiện trâu nhiễm T. evansi với độ nhạy, độ đặc hiệu và
độ ổn định cao.
Nguyên lý: Trong phương pháp này, người ta dùng kháng thể hoặc kháng thể
kháng globulin (kháng kháng thể) có mang một enzyme (phosphatase hoặc
peroxydase) được gắn lên mảnh Fc, cho kết hợp trực tiếp hoặc gián tiếp với kháng
nguyên. Sau đó, cho cơ chất sinh màu vào, cơ chất sẽ kết hợp với enzyme và bị phân
hủy tạo nên màu. So sánh với màu của quang phổ kế sẽ định lượng được mức độ của
phản ứng.
- Phương pháp phát hiện ADN của tiên mao trùng bằng phản ứng PCR
(Polymerase Chain Reaction)
PCR được xem là phương pháp hiện đại nhất, được ứng dụng để chẩn
đoán bệnh tiên mao trùng trong những năm gần đây.
Nguyên lý: dựa vào phản ứng chuỗi polymerase để xác định sự có mặt ADN
của tiên mao trùng trong máu động vật nhiễm bệnh.
1.1.1.6. Phòng bệnh tiên mao trùng cho gia súc
Theo Tổ chức Thú y thế giới OIE (2012) [84], chưa có vắc xin đặc hiệu để
phòng bệnh tiên mao trùng cho gia súc. Vấn đề phòng bệnh tiên mao trùng thường
được thực hiện bằng các phương pháp sau đây:
* Biện pháp phòng đối với vật chủ
Để phòng bệnh tiên mao trùng, cần thực hiện các biện pháp tổng hợp. Ở
những vùng có bệnh, vào mùa ruồi trâu và mòng hoạt động, cần kiểm tra máu cho
toàn bộ gia súc. Nếu có bệnh hoặc nghi có bệnh thì cần cách ly và điều trị kịp thời.
Khi có bệnh xảy ra, phải báo cáo chính quyền và các cơ quan thú y để công bố dịch.
Có thể phòng bằng thuốc: dùng thuốc trypamidium, liều 0,5 mg/kgTT, pha thành
dung dịch 1 - 2%, tiêm bắp thịt làm nhiều điểm để phòng bệnh tiên mao trùng

(Nguyễn Thị Kim Lan, 2012 [13]).


11

Ngoài ra, để tránh lây lan bệnh, cần thường xuyên kiểm tra và kịp thời phát
hiện gia súc nhiễm tiên mao trùng. Ở vùng có động vật nhiễm bệnh và những vùng
lân cận, nên nuôi nhốt gia súc trong chuồng có lưới để ngăn côn trùng vào hút máu
và truyền bệnh cho những động vật khác (Barros A. T. M. và Foil L. D., 2007 [41]).
* Biện pháp diệt ruồi, mòng - vật môi giới truyền bệnh
Để bắt ruồi, mòng hút máu truyền bệnh, hiện nay người ta đã chế tạo được
một số loại bẫy bắt ruồi, mòng có hiệu quả, như bẫy Nzi, bẫy Vavoua, bẫy Malaise,
bẫy Manitoba. Các loại bẫy này thường được sử dụng với chất kích thích, thu hút
thị giác, khứu giác của ruồi, mòng như dioxid carbon, octenol, amoniac để dễ dàng
cho việc tiêu diệt chúng. Các loại bẫy này nên được để ở những nơi tập trung nhiều
ruồi, mòng như ở chuồng nhốt gia súc, nơi nước tù đọng (Hall M. J. và Wall R.,
2004 [61]).
Mặt khác, người ta có thể diệt ruồi, mòng bằng biện pháp sinh học. Các nhà
khoa học đã nghiên cứu sử dụng các loài ong và côn trùng ký sinh, có khả năng gây
hại, tiêu diệt ruồi, mòng; phân lập và sử dụng một số loài vi khuẩn gây bệnh trên
ruồi, mòng để tiêu diệt chúng; dùng tia phóng xạ nhằm gây đột biến gen ở ruồi,
mòng, làm mất khả năng sinh sản, ngăn chặn sự phát triển của chúng.
Ngoài ra, có thể dùng các hoá dược tiêu diệt ruồi, mòng bằng cách tắm hoặc
phun vào các vùng của cơ thể gia súc như chân trước, chân sau, đầu và bụng - là
những nơi ruồi, mòng tấn công gia súc nhiều nhất. Không nên sử dụng những thuốc
này cho gia súc vào mùa mưa, vì các thuốc này có thể bị nước mưa rửa trôi, làm
giảm tác dụng của thuốc.
Mặc dù vậy, các biện pháp trên mới chỉ hạn chế được một phần sự phát triển
của ruồi, mòng. Để đạt hiệu quả tốt hơn, cần tiến hành kết hợp đồng thời nhiều biện
pháp trên phạm vi rộng.

1.1.1.7. Điều trị bệnh
Nhiều loại hóa dược đã được sử dụng để điều trị bệnh tiên mao trùng cho gia
súc. Naganin, novarsenobenzol, trypamidium, berenil (azidin)... là những loại hóa
dược đã được sử dụng trong nhiều năm ở nước ta nhưng cho kết quả không ổn định.
Vì vậy, muốn nâng cao biện pháp điều trị bệnh tiên mao trùng cần điều trị bệnh


12

bằng biện pháp tổng hợp, vừa chú ý chăm sóc con vật ốm, vừa dùng một trong
những thuốc đặc hiệu mới thu được kết quả tốt (Nguyễn Thị Kim Lan, 2012 [13]).
1.1.2. Kỹ thuật sinh học phân tử trong sản xuất kháng nguyên của tiên mao
trùng T. evansi
1.1.2.1. Kháng nguyên của T. evansi
Kháng nguyên bề mặt của loài T. evansi gây bệnh tiên mao trùng có khả năng
biến dị cao. Chính vì vậy, việc chẩn đoán gia súc bị nhiễm bệnh bằng các phương
pháp truyền thống sẽ gặp nhiều khó khăn. Paim F. C. và cs. (2011) [86] cho biết,
kháng nguyên của T. evansi được chia làm hai loại: kháng nguyên biến đổi và kháng
nguyên không biến đổi.
* Kháng nguyên biến đổi
Mỗi T. evansi có một số lượng lớn gen mã hóa cho các protein bề mặt nên
khả năng biến đổi của chúng rất cao. Trong khi hệ thống miễn dịch của vật chủ
chưa kịp sản xuất ra kháng thể thì các thế hệ mới của T. evansi đã xuất hiện và hoàn
toàn có khả năng chống lại đáp ứng miễn dịch của vật chủ. Từ phát hiện này, người
ta đã tập trung nghiên cứu cơ chế phân tử về khả năng ức chế hay kích hoạt các gen
này để áp dụng cho công tác phòng chống bệnh tiên mao trùng hiệu quả.
Nghiên cứu về miễn dịch học, Pays E. và cs. (2006) [89], Paim F. C. và cs.
(2011) [86] có đồng quan điểm, tiên mao trùng có khả năng biến đổi kháng nguyên
bề mặt để né tránh đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của vật chủ. Tuy nhiên, sự biến đổi
này đã có ngay ở pha đầu tiên của quá trình nhiễm (trước khi xuất hiện đáp ứng

miễn dịch của cơ thể vật chủ). Chính vì thế, việc biến đổi này của tiên mao trùng
không gặp phải trở ngại do chưa có sự chống đỡ và bảo vệ của hệ thống miễn dịch
của vật chủ.
Tiên mao trùng tồn tại và nhân lên trong dịch ngoại bào của vật chủ, đặc biệt
là trong máu. Do đó, chúng phải đối mặt với hệ miễn dịch của vật chủ, áp lực chọn
lọc đã khiến chúng thiết lập cơ chế để chống lại sự tác động bởi hệ miễn dịch của
vật chủ.


13

Khi xâm nhập vào cơ thể vật chủ, tiên mao trùng sẽ phải chống lại kháng thể
đặc hiệu. Sau khi vào cơ thể vật chủ, không phải bao giờ tiên mao trùng cũng gây
rối loạn cho ký chủ. Trên quan điểm miễn dịch, tiên mao trùng chỉ gây bệnh được
nếu chúng hòa nhập với vật chủ đến mức không còn được xem là phần tử lạ. Tiên
mao trùng có thể sẽ bị tiêu diệt nếu phân tử kháng nguyên bề mặt VSG (Variant
Surface Glycoprotein - Glycoprotein bề mặt biến đổi) bị kết hợp bởi kháng thể đặc
hiệu. Điều này chính là nguyên nhân thúc đẩy tiên mao trùng hoạt hoá gen để biến
đổi kháng nguyên bề mặt, nhằm né tránh sự kết hợp của kháng thể đặc hiệu do cơ
thể vật chủ sản sinh ra.
Phạm Đức Chương và cs. (2007) [3] cho biết, phần lớn ký sinh trùng thuộc
động vật nguyên sinh đều có các cơ chế để tránh khỏi tác dụng đáp ứng miễn dịch
của cơ thể vật chủ. Các cơ chế này gồm: tác động ức chế đáp ứng miễn dịch của vật
chủ; thay đổi để trở thành không có tính kháng nguyên, làm cho cơ thể vật chủ
không sinh kháng thể chống lại ký sinh trùng khi chúng xâm nhập vào cơ thể; phát
triển khả năng biến đổi kháng nguyên bề mặt, vô hiệu hóa tác dụng của kháng thể
đặc hiệu. Tiên mao trùng có thể che giấu kháng nguyên của nó bằng cách náu mình
dưới các kháng nguyên của ký chủ (ví dụ, chúng được bao bọc bởi một lớp protein
huyết thanh của ký chủ). Vì vậy, khi vào cơ thể, chúng không bị cơ thể vật chủ xem
là phần tử lạ nên không có đáp ứng miễn dịch chống lại chúng.

Các VSG được mã hoá là nhờ tiên mao trùng có các gen chuyên biệt. Từ kho
chứa hàng nghìn gen khác nhau, một gen VSG được hoạt hoá một cách chọn lọc để
tổng hợp ra một loại kháng nguyên VSG mới. Khi các phân tử kháng nguyên VSG
được thay đổi hoàn toàn bằng các phân tử VSG mới thì kháng thể đặc hiệu lúc trước
đã không còn tác dụng đối với kháng nguyên mới này nữa, và nhờ đó tiên mao trùng
tiếp tục phát triển được trong cơ thể vật chủ. Đây cũng chính là nguyên nhân dẫn đến
việc tiên mao trùng có thể tồn tại trong máu ký chủ lâu dài và bệnh thường xảy ra ở
thể mãn tính (Urakawa T. và cs., 2001 [121], Nguyễn Thị Kim Lan và cs., 2008 [11],
Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương, 2009 [8]).
Kháng nguyên của tiên mao trùng có thể biến đổi theo hai cách. Cách thứ
nhất: sử dụng lần lượt các điểm biểu hiện (Expression Side - Điểm biểu hiện) khác
nhau. Trong bộ gen của tiên mao trùng tồn tại một số lớn gen VSG, các gen có các cơ


14

chế sắp xếp khác nhau. Do vậy, tiên mao trùng có nhiều VSG khác nhau. Các điểm
biểu hiện khác nhau sẽ mang các gen VSG khác nhau, sự luân phiên này dẫn đến sự
thay đổi các kiểu kháng nguyên. Cơ chế trên quan sát được chủ yếu ở giai đoạn đầu
của quá trình cảm nhiễm, do ở giai đoạn đầu này chưa có đáp ứng miễn dịch của vật
chủ đối với VSG. Cách thứ hai: tập hợp lại các đoạn ADN khác nhau để tái tổ hợp
gen hoặc chuyển đổi gen. Việc tái tổ hợp này cho phép thay thế hoàn toàn hoặc từng
phần gen. Như vậy, một gen hoạt hoá được thay thế bằng bản sao chép của một gen
khác đã biến đổi một phần hoặc hoàn toàn (Phạm Đức Chương và cs., 2007 [3],
Urakawa T. và cs., 2001 [121]).
* Kháng nguyên không biến đổi (kháng nguyên ổn định)
Ở màng nguyên sinh chất tế bào, tiên mao trùng T. evansi có ba loại kháng
nguyên không biến đổi: ISG 65, ISG 75 và ISG 100 (ISG: Invanant Surface
Glycoprotein). Các loại kháng nguyên này không kết hợp với kháng thể của vật chủ.
Trên bề mặt tế bào của tiên mao trùng có khoảng 30 loại kháng nguyên khác

nhau. Trong số tất cả các kháng nguyên bề mặt này, chỉ có kháng nguyên RoTAT
1.2 không bị biến đổi, độ ổn định cao. Kháng nguyên RoTAT 1.2 có mặt ở hầu hết
các VAT (Variable Antigen Type) của T. evansi. Kháng nguyên RoTAT 1.2 là
kháng nguyên bề mặt chính của T. evansi. Nó xuất hiện sớm, ngay sau khi ký
sinh trùng xuất hiện, đồng thời không gây phản ứng chéo với kháng thể đặc
hiệu của các loài ký sinh trùng khác (Abou El Naga T. và cs., 2012 [33]). Đây là
kháng nguyên có thể sử dụng để tạo kháng thể đặc hiệu, hoặc trực tiếp ứng dụng
trong các phương pháp chẩn đoán phát hiện kháng thể kháng tiên mao trùng T.
evansi. Để sản xuất kháng nguyên này, phải ứng dụng kỹ thuật gen, thực hiện qua
các bước tách dòng gen mã hóa kháng nguyên bề mặt và biểu hiện gen, tinh sạch
kháng nguyên.
1.1.2.2. Kỹ thuật tách dòng gen
Tách dòng gen còn được gọi với nhiều tên khác nhau: tạo dòng gen, nhân
dòng gen, phân lập gen…
Tách dòng gen là tập hợp các kỹ thuật nhằm phân lập và tách một gen, một
đoạn ADN cần thiết (ADN insert) để đưa vào tế bào chủ, tạo điều kiện thích hợp để