Nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm và chế tạo Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng (Trypanosomiasis) ở đàn trâu tại tỉnh Tuyên Quang (tt)

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

PHẠM THỊ TRANG

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH TỶ LỆ NHIỄM
VÀ CHẾ TẠO KIT CHẨN ĐOÁN BỆNH TIÊN MAO TRÙNG
(TRYPANOSOMIASIS) Ở ĐÀN TRÂU
TẠI TỈNH TUYÊN QUANG

Ngành: Ký sinh trùng và vi sinh vật học thú y
Mã số: 62.64.01.04

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ THÚ Y

Thái Nguyên, 2017


Luận án được hoàn thành tại:
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

Người hướng dẫn khoa học: 1. GS.TS. Nguyễn Thị Kim Lan
2. PGS. TS. Phạm Công Hoạt
Người phản biện 1: ...............................................................
Người phản biện 2:.................................................................
Người phản biện 3: ................................................................

Luận án được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Đại học
Họp tại: TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
Vào hồi ..... giờ, ngày ..... tháng ...... năm 2017

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Quốc gia
- Trung tâm học liệu Đại học Thái Nguyên
- Thư viện Trường Đại học Nông Lâm - ĐH Thái Nguyên


DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI
1. Nguyễn Thị Kim Lan, Nguyễn Văn Quang, Nguyễn Thị Ngân,
Lê Minh, Phan Thị Hồng Phúc, Phạm Diệu Thùy, Phạm Thị Trang,
Trần Nhật Thắng (2014), “Tình hình nhiễm Tiên mao trùng trên đàn
trâu của tỉnh Tuyên Quang và xác định phác đồ điều trị hiệu quả”,
Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, số tháng 6, tr. 91 - 95.
2. Nguyễn Thị Thu Hiền, Phạm Thị Tâm, Trương Quốc Phong,
Nguyễn Thị Kim Lan, Phạm Thị Trang (2014), “Nghiên cứu biểu
hiện gien mã hóa kháng nguyên bề mặt của tiên mao trùng gây bệnh
ở trâu, bò Việt Nam”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn,
chuyên đề Khoa học công nghệ Nông lâm nghiệp miền núi, số 24, tr.
90 - 95.
3. Nguyễn Mạnh Hùng, Phạm Thị Tâm, Phạm Thị Trang,
Nguyễn Thị Kim Lan (2015), “Nghiên cứu chế tạo sinh phẩm chẩn
đoán nhanh bệnh tiên mao trùng do Trypanosoma evansi gây cho
trâu, bò ở Việt Nam”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, Tập XXII,
số 7, tr. 48 - 59.
4. Phạm Thị Trang, Nguyễn Thị Kim Lan, Phạm Công Hoạt
(2017), “Thử nghiệm Kit CATT để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng
cho trâu tại tỉnh Tuyên Quang”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ
(Đại học Thái Nguyên), tập 168, số 08, tr. 125 - 130.


1

MỞ ĐẦU
Bệnh tiên mao trùng do đơn bào T. evansi gây ra, chẩn đoán và
điều trị không kịp thời gia súc có thể chết, gây thiệt hại lớn cho người
chăn nuôi. Chính vì vậy, yêu cầu cấp thiết hiện nay là phải tìm ra một
phương pháp chẩn đoán bệnh nhanh, độ chính xác cao, chi phí thấp,
dễ dàng áp dụng trên phạm vi rộng để có thể điều trị kịp thời, giảm tỷ
lệ chết do bệnh gây ra.
Tuyên Quang là một tỉnh miền núi phía Bắc có điều kiện thích hợp
cho bệnh tiên mao trùng phát triển. Cơ sở hạ tầng phục vụ công tác chẩn
đoán và điều trị bệnh cho đàn gia súc tại địa phương vẫn còn nhiều hạn
chế, dẫn tới hệ quả là bệnh tiên mao trùng trở nên phổ biến hơn, nghiêm
trọng hơn và gây thiệt hại lớn hơn.
Xuất phát từ yêu cầu cấp thiết của thực tiễn, để có cơ sở khoa
học xây dựng quy trình chẩn đoán, quy trình phòng trị bệnh tiên mao
trùng hiệu quả cho đàn trâu ở tỉnh Tuyên Quang, chúng tôi đã thực
hiện đề tài: "Nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm và chế tạo Kit chẩn
đoán bệnh tiên mao trùng (Trypanosomiasis) ở đàn trâu tại tỉnh
Tuyên Quang".
* Mục tiêu của đề tài
- Xác định được tỷ lệ nhiễm, định danh loài tiên mao trùng gây
bệnh và áp dụng phác đồ điều trị hiệu quả cho đàn trâu của tỉnh
Tuyên Quang.
- Chế tạo được Kit CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng có độ
nhạy và độ đặc hiệu cao.
* Ý nghĩa khoa học của đề tài
Kết quả của đề tài là những thông tin khoa học về tỷ lệ nhiễm,
nghiên cứu chế tạo Kit chẩn đoán và biện pháp phòng chống bệnh
tiên mao trùng hiệu quả trên đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang.

2
Sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp phục vụ chế tạo Kit chẩn đoán
là hướng nghiên cứu công nghệ cao khẳng định việc làm chủ công
nghệ, sản phẩm của công nghệ cao đã và đang được ứng dụng vào
thực tiễn sản xuất tại Việt Nam.
* Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
Chế tạo được Kit từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 của loài
T. evansi phục vụ công tác chẩn đoán bệnh nhanh và kịp thời, áp
dụng phác đồ điều trị bệnh hiệu quả, từ đó góp phần nâng cao số
lượng và chất lượng đàn trâu, cải thiện đời sống cho người chăn nuôi.
* Những đóng góp mới của đề tài
Chế tạo được Kit từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 của loài
T. evansi, Kit chế tạo có độ nhạy và độ đặc hiệu trên 97%, có thể áp
dụng chẩn đoán nhanh bệnh tiên mao trùng ở các địa phương.
* Bố cục của Luận án
Luận án gồm 147 trang được chia thành các chương, phần: mở
đầu 3 trang; chương 1: Tổng quan tài liệu 34 trang; chương 2: Vật
liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu 27 trang; chương 3: Kết
quả nghiên cứu và thảo luận: 66 trang; Kết luận và đề nghị: 2 trang;
Tài liệu tham khảo: 15 trang; Phụ lục: 14 trang. Luận án có 20 bảng,
40 hình (15 hình vẽ sơ đồ, đồ thị, biểu đồ; 25 hình ảnh kết quả phân
tích bằng kỹ thuật sinh học phân tử), 128 tài liệu tham khảo (32 tài
liệu tiếng việt, 96 tài liệu tiếng nước ngoài).


3
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Theo Phạm Sỹ Lăng và cs. (2008), Hasan M. U. và cs. (2006),
Youssif F. và cs. (2008), bệnh tiên mao trùng - Trypanosomiasis - là

bệnh do ký sinh trùng đơn bào Protozoa, lớp trùng roi Flagellata gây
ra. Trong tự nhiên, tiên mao trùng ký sinh ở hầu hết các loài thú nuôi
và thú hoang, thấy phổ biến hơn ở trâu, bò, ngựa, trâu bò rừng, hươu,
nai, hổ, báo, sư tử, chó, mèo, lạc đà, voi, thỏ, chuột cống, chuột lang,
chuột bạch..., không ký sinh ở người.
Haridy F. M. và cs. (2011), Sumbria D. và cs. (2014) cho biết,
phân bố địa lý của bệnh liên tục từ khu vực phía bắc của châu Phi,
qua Trung Đông đến khu vực Đông Nam Á. Bệnh phổ biến ở trâu,
bò, ngựa các nước nhiệt đới ở châu Phi, châu Á và Nam Mỹ.
Việc chẩn đoán bệnh tiên mao trùng tương đối khó khăn vì
căn bệnh có khi có ở mạch máu ngoại vi, có khi không. Biểu hiện
lâm sàng của bệnh tiên mao trùng không phải lúc nào cũng phát hiện
được. Chính vì vậy, việc chẩn đoán qua triệu chứng lâm sàng ở trâu,
bò có độ chính xác không cao. Do đó, ngoài chẩn đoán qua các triệu
chứng lâm sàng, cần phải tiến hành các phương pháp chẩn đoán
phòng thí nghiệm để có kết quả chẩn đoán chính xác.
Theo Tổ chức Thú y thế giới OIE (2012), chưa có vắc xin đặc
hiệu để phòng bệnh tiên mao trùng cho gia súc. Tuy nhiên, vẫn có thể
phòng bệnh tiên mao trùng bằng các biện pháp phòng bệnh tổng hợp.
Nhiều loại hóa dược đã được sử dụng để điều trị bệnh tiên mao
trùng cho gia súc. Naganin, novarsenobenzol, trypamidium, berenil
(azidin)... là những loại hóa dược đã được sử dụng trong nhiều năm ở
nước ta nhưng cho kết quả không ổn định. Vì vậy, muốn nâng cao biện
pháp điều trị bệnh tiên mao trùng thì cần điều trị bệnh bằng biện pháp
tổng hợp, vừa chú ý chăm sóc con vật ốm, vừa dùng một trong những
thuốc đặc hiệu mới thu được kết quả tốt (Nguyễn Thị Kim Lan, 2012).


4
CHƯƠNG 2

VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Bệnh tiên mao trùng do đơn bào T. evansi gây ra trên trâu ở 4
huyện của tỉnh Tuyên Quang: huyện Sơn Dương, Yên Sơn, Hàm Yên
và Chiêm Hóa.
- Kháng nguyên RoTAT 1.2 của T. evansi.
- Kit CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng.
2.1.2. Địa điểm nghiên cứu
2.1.2.1. Địa điểm triển khai: tại tỉnh Thái Nguyên và Bắc Giang
2.1.2.2. Địa điểm xét nghiệm mẫu
- Đề tài được thực hiện tại các nông hộ ở 4 huyện của tỉnh Tuyên
Quang: huyện Sơn Dương, Yên Sơn, Hàm Yên và Chiêm Hóa.
- Địa điểm xét nghiệm mẫu:
+ Phòng thí nghiệm Khoa Chăn nuôi thú y, Trường Đại học Nông Lâm
Thái Nguyên.
+ Trung tâm Chẩn đoán thú y Trung ương.
+ Khoa Công nghệ sinh học - Viện đại học mở Hà Nội.
2.1.3. Thời gian nghiên cứu: Từ năm 2013 - 2017
2.2. Vật liệu nghiên cứu
* Các loại mẫu nghiên cứu: Mẫu máu trâu thu thập tại 4 huyện
thuộc tỉnh Tuyên Quang; Đơn bào T. evansi: phân lập từ máu trâu
mắc bệnh tiên mao trùng tại tỉnh Tuyên Quang.
* Thiết bị và dụng cụ: Tủ ấm ổn nhiệt; Lò vi sóng: Sanyo
(Nhật). Máy PCR (Gen Amp PCR system 9700); Máy phân tích trình


5
tự ADN ABI 3100 - Avant: Applied BioSiences (Mỹ). Máy PCR
(Thermo cycle): Bio - Rad (Pháp). Máy ly tâm lạnh (Biofuge Primo

R): Heraeus (Mỹ). Máy đo pH (Digital pH Meter Delta 320):
Thommas Scientific (Mỹ). Máy chụp ảnh Gel - Doc: Dolphin (Mỹ),
Tủ lạnh - 20oC, - 80oC; Tủ an toàn sinh học cấp II: Nuaire (Mỹ), xi
lanh, kim tiêm, lam kính và lamen...
* Hóa chất: Các loại hóa chất do hãng Fementas, Sigma,
BioLabs và Applied BioSiences (Mỹ) sản xuất bao gồm: acrylamide,
Bis-acrylamide, Tris-HCl, Tris base, Tricine, glycerol, sucrose,
ethylene glycol, benzamidine, xanh methylene, X - gal, agarose,
peptone, yeast extract, EDTA, PMSF, SDS, APS, TEMED, Tween 20,
TMB, IPTG, NaHPO4, NaCl, NaH2PO4, K2HPO4, KH2PO4, NaOH,
MgSO4, MgCl2, CaCl2,...
* Thuốc điều trị tiên mao trùng: azidin, trypamidium samorin,
trypanosoma, cafein natri benzoat 20%, nước sinh lý mặn, vitamin
C 5%, vitamin B1 2,5%.
2.3. Nội dung nghiên cứu
2.3.1. Nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng trên đàn
trâu ở tỉnh Tuyên Quang và áp dụng phác đồ điều trị
- Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu tại tỉnh Tuyên Quang.
- Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo lứa tuổi.
- Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo tính biệt.
- Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo mùa vụ.
- Xác định loài tiên mao trùng gây bệnh trên đàn trâu ở tỉnh
Tuyên Quang.
- Áp dụng phác đồ hiệu quả điều trị bệnh tiên mao trùng cho
trâu ở tỉnh Tuyên Quang.


6
2.3.2. Nghiên cứu chế tạo và thử nghiệm Kit CATT trong chẩn
đoán bệnh tiên mao trùng cho đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang

2.3.2.1. Nghiên cứu các điều kiện tách dòng và xác định
trình tự gen mã hóa kháng nguyên bề mặt RoTAT 1.2 của
loài tiên mao trùng T. evansi
- Tách ADN tổng số từ tiên mao trùng T. evansi.
- Khuếch đại gen RoTAT 1.2 bằng kỹ thuật PCR
- Tách dòng và xác định trình tự gen mã hóa kháng nguyên bề
mặt của T. evansi.
2.3.2.2. Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của
T. evansi
- Tạo dòng vector biểu hiện pET22b (+) mang gen đích RoTAT 1.2.
- Chọn dòng mang cấu trúc biểu hiện pET22 - RoTAT 1.2 tái tổ hợp.
- Biểu hiện protein RoTAT 1.2 tái tổ hợp.
- Xác định các điều kiện biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên
RoTAT 1.2 trong vi khuẩn E. coli.
2.3.2.3. Nghiên cứu chế tạo và thử nghiệm Kit CATT trong chẩn
đoán bệnh tiên mao trùng
- Nghiên cứu xác định các điều kiện gắn kháng nguyên lên hạt latex.
- Đánh giá ảnh hưởng của chất nhuộm màu kháng nguyên
đến mức độ ngưng kết.
- Xác định các điều kiện bảo quản kháng nguyên tái tổ hợp.
- Xây dựng quy trình sử dụng Kit CATT chế tạo.
- Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của Kit CATT chế tạo để chẩn
đoán bệnh tiên mao trùng.
- Xác định các điều kiện bảo quản Kit CATT.


7
- Thử nghiệm Kit CATT chế tạo từ kháng nguyên tái tổ hợp
RoTAT 1.2 để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng.
2.4. Phương pháp nghiên cứu

2.4.1. Phương pháp xác định tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng trên đàn
trâu của tỉnh Tuyên Quang và áp dụng phác đồ điều trị
- Thu thập mẫu máu trâu ở 4 huyện của tỉnh Tuyên Quang theo
phương pháp lấy mẫu chùm nhiều bậc. Mẫu được thu thập ngẫu
nhiên ở các hộ nuôi trâu.
- Xét nghiệm mẫu bằng các phương pháp sau: xem tươi, tiêm
truyền chuột nhắt trắng.
- Định danh tiên mao trùng bằng kỹ thuật sinh học phân tử, giải
trình tự gen 18S của tiên mao trùng, đối chiếu hình ảnh bản BLAST
với Ngân hàng gen thế giới (genBank) để có kết quả về mức độ
tương đồng gen, từ đó xác định được đó là loài tiên mao trùng nào.
- Áp dụng 3 phác đồ điều trị trên diện hẹp, mỗi phác đồ điều trị
cho 3 trâu. Sau đó, áp dụng 3 phác đồ này trên diện rộng cho trâu
nhiễm tiên mao trùng của tỉnh Tuyên Quang để đánh giá hiệu quả.
2.4.2. Phương pháp nghiên cứu chế tạo và thử
nghiệm Kit CATT trong chẩn đoán bệnh tiên mao
trùng cho đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang
2.4.2.1. Phương pháp nghiên cứu tách dòng gen mã hóa kháng
nguyên bề mặt của tiên mao trùng T. evansi
Từ mẫu máu chuột có chứa T. evansi được phân lập từ trâu bị
mắc bệnh tiên mao trùng tại tỉnh Tuyên Quang, chúng tôi đã tiến
hành tách ADN tổng số. Kết quả tách ADN tổng số được kiểm tra và
đánh giá bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%.
Gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 của tiên mao trùng được
khuếch đại bởi cặp mồi gồm mồi xuôi RoTAT 1.2F: 5’-ATA GAA TTC
AGG GGT GTT TAA AGC AA-3’ và mồi ngược RoTAT 1.2R: 5’-AAT


8
GTC GAC TAG TGC GTG TGT TCG-3’. Phản ứng PCR thực hiện

với 35 chu kỳ theo các chu trình nhiệt: 95ºC/5 phút, 95ºC/30 giây,
57ºC/30 giây, 72ºC/30 giây. Sau đó phản ứng tiếp tục ở 72ºC/5 phút.
Sản phẩm PCR được gắn vào vector biểu hiện vector pET22b (+) tại
2 vị trí của enzyme giới hạn EcoRI và SalI để tạo vector tái tổ hợp
pET22/RoTAT 1.2.
2.4.2.2. Phương pháp nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa kháng
nguyên bề mặt của tiên mao trùng T. evansi
Hai dòng E. coli BL21 (DE3) mang vector tái tổ hợp pET22 RoTAT 1.2 được nuôi cấy lắc trong môi trường LB lỏng có chứa
kháng sinh ampicillin nồng độ 100 µg/ml, ở 37°C trong 12 giờ. Từ
dịch nuôi cấy, chúng tôi tiếp tục cấy chuyển sang môi trường LB lỏng
có bổ sung ampicillin 100 µg/ml, nuôi cấy lắc trong 4 giờ. Sau 4 giờ
bổ sung chất cảm ứng IPTG để đạt đến nồng độ cuối cùng là 1 mM.
Tiến hành nuôi cấy với tốc độ 115 vòng/phút trong 4 giờ, thu sinh
khối, xử lý. Kết quả được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel
polyacrylamide có SDS, Tricine và phương pháp lai Western blot với
kháng thể đặc hiệu kháng RoTAT 1.2.
Với mục đích thu được lượng lớn protein tái tổ hợp RoTAT 1.2,
chủng E. coli chứa plasmid tái tổ hợp được nuôi cấy trong các điều
kiện (pH môi trường, nồng độ kháng sinh, thời gian và nhiệt độ nuôi
cấy, nồng độ IPTG và thời gian, nhiệt độ cảm ứng) khác nhau để lựa
chọn được điều kiện nuôi cấy thích hợp nhất. Sau đó, mẫu được chạy
điện di trên gel polyacrylamide để kiểm tra kết quả. Mỗi giếng chạy
10 l mẫu để so sánh sự biểu hiện của gen mã hóa kháng nguyên
RoTAT 1.2 trong các điều kiện khác nhau.
2.4.2.3. Phương pháp nghiên cứu chế tạo Kit chẩn đoán bệnh từ
kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2


9
* Phương pháp tạo phức hợp kháng nguyên - hạt latex để phát

bệnh tiên mao trùng
Kháng nguyên và hạt latex có bản chất rất khác nhau. Chính vì
vậy, để chế tạo được Kit, tiến hành kết hợp thử nghiệm kháng nguyên
và hạt latex với các nồng độ và tỷ lệ khác nhau, ở điều kiện khác nhau.
Từ đó, đánh giá và xác định được lượng kháng nguyên - hạt latex và
điều kiện phản ứng phù hợp để tạo được phức hợp bền vững nhất.
* Phương pháp xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của Kit CATT
Gây nhiễm tiên mao trùng T. evansi cho trâu. Kiểm tra bằng
phương pháp tiêm truyền chuột để khẳng định trâu nhiễm (+) và
không nhiễm (-) tiên mao trùng. Lấy mẫu huyết thanh trâu (+) và (-)
để sử dụng Kit, xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của Kit.
* Phương pháp nghiên cứu điều kiện bảo quản Kit
Tiến hành bổ sung lần lượt các chất ức chế phân giải protein, chất
ổn định protein và chất diệt khuẩn và bảo quản Kit ở các điều kiện
nhiệt độ khác nhau. Sau đó, xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của
phản ứng khi sử dụng Kit tại các thời điểm khác nhau. Từ đó, xác
định điều kiện phù hợp để bảo quản Kit.
2.4.2.4. Phương pháp thử nghiệm Kit CATT chế tạo từ kháng nguyên
tái tổ hợp RoTAT 1.2 để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng
Thử nghiệm Kit CATT để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng trên
550 trâu ở các địa phương, sau đó so sánh hiệu quả chẩn đoán của Kit
CATT, kỹ thuật ELISA với phương pháp tiêm truyền chuột. Bằng
phương pháp tiêm truyền chuột, chúng tôi đã xác định được chính
xác trong 550 trâu này có 66 con dương tính, 484 con âm tính với T.
evansi. Từ đó, xác định được độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị dự báo âm
tính và giá trị dự báo dương tính; so sánh hiệu quả chẩn đoán của các
phương pháp trên với phương pháp tiêm truyền chuột.
2.5. Phương pháp xử lý số liệu

10
Số liệu được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh vật học theo
tài liệu của Nguyễn Văn Thiện (2008), trên phần mềm Microsoft
Excel 2007 và phần mềm Minitab 14.0, các phần mềm tin - sinh học
gồm các chương trình ChromasLite, SeqEd1.3, MacVector8.2,
GeneDoc2.7 và MEGA6.06.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tình hình nhiễm tiên mao trùng trên đàn trâu ở 4 huyện
thuộc tỉnh Tuyên Quang và áp dụng phác đồ điều trị hiệu quả
3.1.1. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu tại 4 huyện thuộc tỉnh
Tuyên Quang
Bằng phương pháp tiêm truyền chuột nhắt trắng, chúng tôi đã xác
định được tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu tại Tuyên Quang.
Kết quả được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu tại 4 huyện
thuộc tỉnh Tuyên Quang
Địa
phương
(Huyện)

Số trâu
kiểm tra
(con)

Số trâu
nhiễm
(con)

Tỷ lệ

nhiễm
(%)

Yên Sơn

257

28

10,89

Hàm Yên

264

35

13,26

Chiêm Hóa

252

41

16,27

So sánh tỷ lệ nhiễm
giữa các huyện
χ2Yên Sơn, Hàm Yên = 0,684

P = 0,408
2
χ Hàm Yên, Chiêm Hóa = 0,931
P = 0,334
χ2 Chiêm Hóa, Sơn Dương = 1,674
P = 0,196
χ2 Yên Sơn, Sơn Dương = 0,019


11

Sơn Dương

132

15

11,36

P = 0,889
χ Hàm Yên, Sơn Dương = 0,286
P = 0,593
χ2tính chung = 3,664
P = 0,300
2

Tính
chung

905

119

13,15

Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy:
Trong tổng số 905 trâu kiểm tra tại 4 huyện thuộc tỉnh Tuyên
Quang có 13,15% số trâu nhiễm tiên mao trùng. Mặc dù tỷ lệ này
không cao, song do tính chất nguy hiểm của bệnh tiên mao trùng nên
tỷ lệ nhiễm này rất có ý nghĩa trong dịch tễ học của bệnh.
3.1.2. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng theo lứa tuổi
trâu tại tỉnh Tuyên Quang
Kết quả về tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng theo tuổi của trâu trình bày
đồ thị hình 3.2.

Hình 3.2. Đồ thị biến động nhiễm tiên mao trùng ở trâu
theo lứa tuổi


12
Hình 3.2 cho thấy: Tỷ lệ nhiễm ở trâu tăng dần theo tuổi. Trâu
dưới 2 năm tuổi nhiễm với tỷ lệ thấp nhất (6,40%), tiếp đến là trâu 2 5 năm tuổi (10,34%), trâu 5 - 8 năm tuổi nhiễm với tỷ lệ cao hơn
(14,29%), đặc biệt là những trâu trên 8 tuổi tỷ lệ nhiễm rất cao
(26,36%). Theo kết quả xử lý thống kê, tỷ lệ nhiễm giữa các lứa tuổi
của trâu sai khác rất rõ rệt.
3.1.3. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo tính biệt
Kết quả về tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo tính biệt được
trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo tính

biệt
Tính biệt
Đực
Cái
Tính chung

Số trâu
kiểm tra
(con)
536
369

Số trâu
nhiễm
(con)
69
50

Tỷ lệ
nhiễm
(%)
12,87
13,55

So sánh tỷ lệ
nhiễm giữa trâu
đực và trâu cái
χ2đực, cái = 0,088
P = 0,767

905
119
13,15
Qua kết quả bảng 3.3 cho thấy: Kiểm tra 536 trâu đực có 69 trâu
nhiễm tiên mao trùng; trong 369 trâu cái được kiểm tra có 50 trâu bị
nhiễm tiên mao trùng. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu đực là
12,87%, tỷ lệ nhiễm ở trâu cái là 13,55%. Theo đó, tỷ lệ nhiễm tiên
mao trùng ở trâu cái cao hơn so với trâu đực. Tuy nhiên, qua xử lý
thống kê cho thấy sự sai khác này không rõ rệt (P > 0,05).
3.1.4. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo mùa vụ
Kết quả về tỷ lệ nhiễm theo mùa được trình bày ở biểu đồ hình 3.4.


13

Hình 3.4. Biểu đồ tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo mùa
trong năm
Biểu đồ hình 3.4 cho thấy, trâu bị nhiễm tiên mao trùng ở cả 4
mùa điều tra và có sự khác nhau giữa các mùa. Mùa xuân, trâu có tỷ
lệ nhiễm thấp nhất (8,21%). Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng tăng dần từ
mùa xuân đến hè, thu và cao nhất vào mùa đông (17,21%).
3.1.5. Kết quả xác định loài tiên mao trùng gây bệnh trên đàn trâu
của tỉnh Tuyên Quang
Sau khi phân lập được các chủng tiên mao trùng ký sinh ở trâu nuôi
tại 13 xã thuộc 4 huyện của tỉnh Tuyên Quang, bằng kỹ thuật sinh học
phân tử, chúng tôi đã định danh được loài tiên mao trùng gây bệnh.
Trên cơ sở các dữ liệu đã thu nhận được, chúng tôi đã xây dựng cây
phả hệ dựa trên trình tự nucleotide chuỗi gen 18S của 19 mẫu (bao gồm cả
bốn mẫu trong nghiên cứu). Kết quả xây dựng mối quan hệ phả hệ được
trình bày ở hình 3.8.

14

Hình 3.8. Cây phả hệ dựa trên trình tự nucleotide gen 18S của
Tev-CH-VN; Tev-HY-VN; Tev-SD-VN và Tev-YS-VN với các mẫu
Trypanosoma evansi đã được đăng ký trong Ngân hàng gen
Ghi chú: Ký hiệu (♦) là các mẫu trong nghiên cứu này
Hình 3.8 cho thấy: Các mẫu Tev-CH-VN; Tev-HY-VN; TevSD-VN và Tev-YS-VN đã được định danh chính xác là tiên mao
trùng Trypanosoma evansi.
3.1.6. Áp dụng phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng cho đàn
trâu của tỉnh Tuyên Quang
3.1.6.1. Áp dụng phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng trên diện hẹp
Để có cơ sở cho việc chọn lựa phác đồ điều trị bệnh tiên mao
trùng đạt hiệu quả cao và an toàn, chúng tôi tiến hành điều trị trên
diện hẹp cho 9 trâu thí nghiệm. Kết quả được tổng hợp và trình bày
tại bảng 3.6.


15

Bảng 3.6. Kết quả áp dụng phác đồ điều trị bệnh tiên
mao trùng trên diện hẹp
Phác
đồ

I
II
III

Số
TT
trâu
1
2
3
1
2
3
1
2
3

Sau 1 - 3
ngày dùng
thuốc
+
+
+
-

Kết quả (-)/(+)
Sau 4 - 15
Sau 16 - 25
ngày dùng ngày dùng
thuốc
thuốc
-

Sau 26 - 35

ngày dùng
thuốc
-

Kết quả bảng 3.6 cho thấy: Cả 3 phác đồ đều có hiệu lực diệt tiên
mao trùng, trong đó, phác đồ II có tác dụng trị tiên mao trùng nhanh
và triệt để nhất. Từ sau ngày thứ 4 đến ngày thứ 35 sau điều trị, kiểm
tra thấy cả 9 trâu đều sạch tiên mao trùng, không thấy trâu nào có
phản ứng cục bộ hoặc toàn thân.
3.1.6.2. Áp dụng phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng trên diện rộng
Từ kết quả áp dụng trên diện hẹp, chúng tôi tiến hành áp dụng 3
phác đồ trên diện rộng cho số trâu bị nhiễm tiên mao trùng ở 4 huyện
của tỉnh Tuyên Quang. Kết quả được trình bày ở bảng 3.7.

Bảng 3.7. Thử nghiệm phác đồ điều trị bệnh tiên mao
trùng trên diện rộng
Phác đồ
I
II
III
Tính chung

Số trâu điều
trị (con)
38
42
39
119

Số trâu (-) sau điều

trị (con)*
36
42
38
116

Tỷ lệ
(%)
94,74
100
97,44
97,48


16
Ghi chú: * Kiểm tra không còn tiên mao trùng trong vòng 30 ngày
sau điều trị
Kết quả bảng 3.7 cho thấy: Thuốc azidin điều trị cho 38 trâu bị
nhiễm tiên mao trùng. Sau 30 ngày dùng thuốc, kiểm tra mẫu máu
thấy 36/38 trâu không còn tiên mao trùng, hiệu lực đạt 94,74%.
Thuốc trypanosoma điều trị 39 trâu bị nhiễm tiên mao trùng có 38/39
trâu sạch tiên mao trùng, hiệu lực điều trị đạt 97,44%. Thuốc
trypamidium samorin điều trị cho 42 trâu bị nhiễm tiên mao trùng,
hiệu lực điều trị đạt 100%.
3.2. Nghiên cứu chế tạo và thử nghiệm Kit CATT trong chẩn
đoán bệnh tiên mao trùng cho đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang
3.2.1. Kết quả tách dòng và xác định trình tự gen mã hóa kháng
nguyên bề mặt RoTAT 1.2 của T. evansi
3.2.1.1. Kết quả tách ADN tổng số của T. evansi
Từ mẫu máu chuột có chứa T. evansi được phân lập từ trâu bị

mắc bệnh tiên mao trùng tại tỉnh Tuyên Quang, chúng tôi đã tiến
hành tách ADN tổng số. Kết quả tách ADN tổng số được kiểm tra và
đánh giá bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% và được ghi
lại ở hình 3.9.

Hình 3.9. Kết quả điện di ADN tổng số
Ghi chú: (Giếng 1: ADN tổng số tách được;
Giếng 2: Marker)


17
Hình 3.9 cho thấy, hình ảnh điện di trên gel agarose 1% của ADN
tổng số được tách chiết đảm bảo đủ điều kiện để thực hiện các thí
nghiệm tiếp theo trong nghiên cứu.
3.2.1.2. Kết quả khuếch đại gen RoTAT 1.2 bằng kỹ thuật PCR
Chúng tôi tiến hành khuếch đại gen mã hóa kháng nguyên
RoTAT 1.2 phục vụ cho việc tách dòng và biểu hiện gen này trong tế
bào vi khuẩn E. coli.

Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm
PCR của mẫu ADN tổng số
Ghi chú: (Giếng 1: marker; Giếng 2, 3: sản
phẩm PCR của mẫu ADN tổng số)

Kết quả điện di đồ ở hình 3.10 cho thấy, sản phẩm PCR của mẫu
ADN tổng số tách được từ tiên mao trùng đã phân lập có kích thước
khoảng 205 bp. Kích thước này là phù hợp với kích thước lý thuyết
của đoạn gen RoTAT 1.2.
3.2.1.3. Tách dòng và xác định trình tự gen mã hóa kháng nguyên bề mặt
của T. evansi

Tách dòng gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 được thực hiện
bằng cách gắn trực tiếp sản phẩm PCR đã được xử lý cắt đầu bằng vào
vector tách dòng pJET1.2/blunt của hãng Fermentas.
- Giải trình tự đoạn gen RoTAT 1.2 đã tạo dòng
Plasmid pJET1.2 - RoTAT 1.2-1 được gửi đi xác định trình tự đoạn
gen đích tại công ty Macrogen (Hàn Quốc). Trình tự đoạn gen trên


18
được so sánh với các trình tự đã được công bố trên Ngân hàng gen
Quốc tế bằng phần mềm BLAST. Kết quả so sánh cho thấy, trình tự
xác định được có độ tương đồng 100% so với các trình tự gen mã hóa
kháng nguyên bề mặt T. evansi đã được công bố trên Ngân hàng gen
Quốc tế. Kết quả này khẳng định rằng đoạn gen được gắn vào vector
tách dòng pJET1.2/blunt chính là đoạn gen đích RoTAT 1.2. Điều này
chứng tỏ chúng tôi đã tách dòng thành công gen RoTAT 1.2 mã hóa
kháng nguyên bề mặt của tiên mao trùng T. evansi.
3.2.2. Kết quả biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của
T. evansi
Vector được lựa chọn để biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề
mặt của tiên mao trùng T. evansi là vector pET22b (+) của hãng
Novagen, có chiều dài 5.493 bp. Sản phẩm cắt enzyme của gen
RoTAT 1.2 và vector pET22b (+) xuất hiện một băng duy nhất, có
kích thước 205 bp và 5,5 kb, tương tự như kích thước lý thuyết của
gen RoTAT 1.2 và vector pET22b (+). Kết quả này chứng tỏ, sản
phẩm PCR sau khi cắt bằng hai enzyme giới hạn EcoRI và SalI có
chất lượng tốt và cho phép chúng tôi tiến hành việc nối đoạn gen
RoTAT 1.2 vào vector biểu hiện pET22b (+).
Sự biểu hiện protein của gen RoTAT 1.2 được khẳng định bằng
phương pháp lai Western blot với kháng thể đặc hiệu kháng RoTAT

1.2. Kết quả lai Western blot được thể hiện ở hình 3.24.


19

10 kDa

8 kDa

Hình 3.24. Phản ứng western blot kiểm tra
tính đặc hiệu của protein RoTAT 1.2
Ghi chú: M: Thang protein chuẩn;
1: Kháng nguyên hòa tan của T. evansi với
kháng thể đặc hiệu;
2: Protein RoTAT 1.2 với kháng thể đặc hiệu
của T. evansi;
3: Đối chứng âm

Kết quả phản ứng western blot ở hình 3.24 cho thấy: Protein này
được nhận biết đặc hiệu bởi kháng thể kháng T. evansi, vạch phản
ứng của protein RoTAT 1.2 với kháng thể đặc hiệu với T. evansi
tương đương với vạch phản ứng của kháng nguyên hòa tan của T.
evansi với kháng thể đặc hiệu. Kết quả này cho phép kết luận rằng,
kháng nguyên RoTAT 1.2 đã được chế tạo thành công bằng công
nghệ tái tổ hợp gen.
* Nghiên cứu xác định các điều kiện biểu hiện gen mã hóa kháng
nguyên RoTAT 1.2 trong vi khuẩn E. coli
Từ các kết quả thử nghiệm các điều kiện biểu hiện gen mã hóa
kháng nguyên RoTAT 1.2 trong vi khuẩn E. coli, chúng tôi rút ra kết
luận: Điều kiện biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 trong

vi khuẩn E. coli là ở 37°C trong thời gian 4 giờ, pH môi trường là 7,
vi khuẩn có mật độ OD600 = 0,8; nồng độ kháng sinh ampicillin là 100
g/ml. Điều kiện cảm ứng IPTG thích hợp để biểu hiện kháng
nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 là: nồng độ 0,1 mM, thời gian 5 giờ,
nhiệt độ 30°C.
3.2.3. Kết quả nghiên cứu chế tạo và thử nghiệm Kit CATT trong
chẩn đoán bệnh tiên mao trùng


20
3.2.3.1. Kết quả xác định các điều kiện gắn kháng
nguyên lên hạt latex
Chúng tôi đã làm thí nghiệm với các yếu tố sau: Mật độ hạt latex:
sử dụng 5 mật độ 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 và 0,5. Nồng độ kháng nguyên tái
tổ hợp RoTAT 1.2: 200, 250, 300, 350, 400, 450 và 500 µg/ml. Huyết
thanh dương tính chuẩn được lấy từ trâu gây nhiễm T. evansi, pha
loãng trong dung dịch PBS theo tỷ lệ 1: 16. Huyết thanh âm tính
chuẩn được sử dụng là huyết thanh bào thai bê pha loãng theo tỷ lệ 1:
16. Chúng tôi đã thực hiện các thí nghiệm gắn kháng nguyên RoTAT 1.2
lên hạt latex ở điều kiện nhiệt độ 37ºC trong 2 giờ và điều kiện nhiệt độ
37ºC trong 30 phút rồi tiếp tục lắc ở 4ºC trong 24 giờ.
Kết quả nghiên cứu cho thấy: Hàm lượng kháng nguyên tái tổ
hợp RoTAT 1.2 tối ưu trong quá trình tạo Kit CATT chẩn đoán bệnh
tiên mao trùng là nồng độ 300 µg/ml và mật độ hạt latex: OD 600= 0,3.
Kháng nguyên RoTAT 1.2 gắn lên hạt latex tốt nhất ở điều kiện lắc ở
37ºC trong 30 phút rồi tiếp tục lắc ở 4ºC trong thời gian 24 giờ.
3.2.3.2. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của chất nhuộm màu kháng
nguyên đến mức độ ngưng kết
Việc lựa chọn chất nhuộm màu phản ứng là một trong những
bước quan trọng để kết quả phản ứng dễ dàng quan sát được. Các

chất nhuộm màu kháng nguyên dùng trong nghiên cứu là xanh
methylene, xanh malachite và safranin 0,5%.
Kết quả thí nghiệm cho thấy, chất tạo màu phản ứng xanh
methylene cho hiệu quả quan sát tốt nhất và là lựa chọn tối ưu để sử
dụng cho bộ Kit CATT chẩn đoán tiên mao trùng.
3.2.3.3. Kết quả xác định các điều kiện bảo quản kháng
nguyên tái tổ hợp
Kháng nguyên tái tổ hợp có bản chất là protein. Vì vậy, để bảo
quản kháng nguyên này cần phải xác định các điều kiện bảo quản
protein, nhằm đảm bảo chất lượng kháng nguyên.


21
Kết quả thử nghiệm lựa chọn các chất ức chế phân giải, chất ổn
định protein và chất diệt khuẩn ở các nhiệt độ - 20 oC, 4oC, nhiệt độ
phòng cho phép chúng tôi nhận xét: Điều kiện bảo quản kháng
nguyên tái tổ hợp là: bổ sung EDTA, glycerol, sodium azide 0,02%
và bảo quản trong 12 tháng ở - 20oC, hoặc trong 6 tháng ở 4oC.
3.2.3.4. Xây dựng quy trình sử dụng Kit CATT chế tạo
Chúng tôi đã nghiên cứu và đã xây dựng được quy trình sử dụng
Kit CATT gồm 6 bước sau: Chuyển Kit về nhiệt độ phòng trước khi sử
dụng; Sử dụng pipette, lấy 0,5 ml dung dịch pha loãng huyết thanh vào
ống eppendorf; Lấy 0,1 ml huyết thanh cần chẩn đoán trộn đều vào
ống eppendorf có chứa dung dịch pha loãng huyết thanh, pha loãng
theo tỷ lệ 1/32; Nhỏ lên các vòng tròn trên card phản ứng, mỗi vòng
tròn 20 µl dung dịch kháng nguyên gắn lên hạt latex; Nhỏ các mẫu
huyết thanh cần chẩn đoán, huyết thanh dương tính chuẩn, huyết thanh
âm tính chuẩn lần lượt vào các vòng tròn đã chứa kháng nguyên. Mỗi
vòng tròn nhỏ 20 µl dung dịch huyết thanh (huyết thanh cần chẩn
đoán, hoặc huyết thanh dương tính chuẩn, hoặc huyết thanh âm tính

chuẩn); Dùng que trộn, trộn đều các giọt kháng nguyên và huyết thanh.
Giữ card phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 10 phút rồi đọc kết quả dựa
trên sự hình thành các đám ngưng kết.
3.2.3.5. Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của phản ứng khi sử dụng
Kit CATT chế tạo trên trâu thí nghiệm
Ngay sau khi chế tạo Kit, để đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của
phản ứng CATT trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng trên trâu. Kết
quả phản ứng khi sử dụng Kit CATT với các mẫu huyết thanh nói trên
được thể hiện ở bảng 3.16.


22
Bảng 3.16. Kết quả phản ứng sử dụng Kit CATT phát hiện kháng
thể kháng T. evansi trong huyết thanh trâu

Xét nghiệm (+)

Mẫu huyết
thanh trâu
nhiễm T. evansi
49

Các mẫu huyết
thanh trâu không
nhiễm T. evansi
1

Xét nghiệm (-)

0

75

75

Tổng số

49

76

125

Các xét nghiệm

Tổng
số
50

Kết quả bảng 3.16 cho thấy: Trong các mẫu huyết thanh trâu
nhiễm T. evansi, Kit CATT đã phát hiện được cả 49 mẫu (số mẫu
dương tính thật là 49), không có mẫu nào có kết quả âm tính giả. Trong
số 76 mẫu huyết thanh của trâu không nhiễm T. evansi, có 75 âm tính
thật khi phát hiện bằng Kit CATT, có 1 mẫu dương tính giả. Từ kết quả
trên, độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng như sau: Độ nhạy của phản
ứng (Se) là 100%. Độ đặc hiệu của phản ứng (Sp) là 98,68%.
3.2.3.6. Kết quả xác định các điều kiện bảo quản Kit CATT
Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu về điều kiện nhiệt độ và thời
gian bảo quản Kit. Chúng tôi đã bố trí thí nghiệm đánh giá Kit khi
bảo quản ở 4ºC và nhiệt độ phòng. Định kỳ hàng tháng kiểm tra lại

độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng khi sử dụng Kit.
Kết quả theo dõi ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian bảo quản
đến độ nhạy, độ đặc hiệu của phản ứng khi sử dụng Kit CATT trong
chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho thấy: Sau 6 tháng bảo quản, độ
nhạy của phản ứng giảm từ 98% xuống còn 90% ở 4ºC và 62% ở
nhiệt độ phòng, độ đặc hiệu của Kit giảm từ 98% còn 92% ở 4ºC và
giảm còn 58% ở nhiệt độ phòng.
Qua kết quả trên có thể kết luận: Kit CATT có thể bảo quản ở 4 oC
trong 6 tháng, hoặc ở nhiệt độ phòng trong 1 tháng.