PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG HISTAMINE TRONG CÁ BẰNG PHƯƠNG PHÁP sắc KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

BÀI BÁO CÁO
Môn học: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG ĐỘC TỐ
TRONG SẢN PHẨM NÔNG NGHIỆP

Đề tài: PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG HISTAMINE
TRONG CÁ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ
LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
GVHD: ThS. Phùng Võ Cẩm Hồng

1


I. Đặt

vấn đê

Hiện nay ngộ độc Histamine đang là một
trong những mối nguy phổ biến đối với sức khỏe
của người tiêu dùng. Ngộ độc Histamine xảy ra
sau khi ăn phải một số hải sản có chứa hàm
lượng cao histamine thường gặp ở các loại cá
thu, cá ngừ, cá nục và một số loài cá thuộc họ
Scombroidiae. Các loại cá này có chứa hàm
lượng cao histidine tự do trong mô của chúng.
Và khi điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của
vi khuẩn (ví dụ khi cá được bảo quản trong nhiệt
độ không thích hợp), enzyme decarboxylase do

vi khuẩn sinh ra sẽ chuyển hóa histidine thành
histamine.
-

2


1. Histamine là gì?
Histamine là một amin sinh học có công thức hóa học là
C5H9N3, được tạo thành trong quá trình chuyển hóa
axit amin histidine dưới sự xúc tác của enzyme L histidine decarboxylase.

Hình 2.2. sự chuyển hóa từ histidine thành
histamine bởi histidine decarboxylase.
3


Histamine có đặc tính chịu nhiệt, thậm chí khi được
nấu chín histamine vẫn không bị phá hủy. Khi hàm
lượng histamine trong thức ăn quá cao hoặc enzym
phân hủy histamine (acetaldehyde dehydrogenase hay
histamine - N - methyltransferase và diamine oxidase)
trong cơ thể bị ức chế thì histamine sẽ gây độc cho cơ
thể.

4


2. Ngộ độc histamine
Ngộ độc histamine thường xảy ra nhanh từ một đến vài

giờ sau khi ăn. Thường với lượng ăn vào từ 8 mg - 40 mg
histamine, người nhạy cảm sẽ bị chảy nước mắt, nước
bọt, buồn nôn…; từ 1.500 mg - 4.000 mg, người ăn có
biểu hiện như nhức đầu, đau bụng, tiêu chảy, mạch
nhanh, khó thở, co thắt khí quản, nổi ban mạch nhanh, hạ
huyết áp do giãn mạch...

Hình 1.2b Các triệu chứng lâm sàn
khi ngộ độc

5


3. Qui định hàm lượng histamine cho phép
Hàm lượng histamine cho phép la khoảng 100 mg/kg
Trích thông tư 29/2010/TT-BNNPTNN ngày 6/5/2010

6


4. Nguồn histamine
Thực phẩm tươi hầu như không có hoặc có chứa rất ít
histamine. Vì histamine được tạo thành từ axit amin histidine
nên thực phẩm chứa nhiều đạm được bảo quản càng lâu thì
lượng histamine càng tăng. Thịt, cá đặc biệt là các loại cá
biển như cá ngừ, cá nục, cá thu… bị ôi, ươn có hàm lượng
histamine cao.

7

II. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
1. Ðối tượng và phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định hàm lượng
histamin trong sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng hiệu
năng cao (sau đây gọi tắt là HPLC). Giới hạn phát hiện của
phương pháp là 5 mg/kg.

8


2. Phương pháp tham chiếu
Tiêu chuẩn này được xây dựng dựa theo Tiêu chuẩn NMKL số 99
- 1981(Nordic committee on food analysis No 99 -1981).
3. Nguyên tắc
Histamin có trong mẫu thủy sản được tách chiết bằng
metanol. Dịch chiết được làm sạch trên cột trao đổi anion;
sau đó, được tạo dẫn xuất huỳnh quang với o-Phthal alđehyt
(OPT). Hàm lượng dẫn xuất histamin được định lượng trên
hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang theo phương pháp
ngoại chuẩn.

Hình 2.3a Hệ thống
HPLC

9


 4. Phương pháp tiến hành
Qui trình trích ly xử lý mẫu

- Cắt toàn bộ mẫu thành những miếng nhỏ và nghiền cơ
học. Hỗn hợp khối lượng được và nặng 10g mẫu vào
100ml cốc và thêm 20 ml dung dịch 10% axit tri-chloro
acetic (TCA) và 20 ml nước cất mẫu đồng nhất trong 2
phút sử dụng đồng hóa và chuyển giao mẫu vào 100 ml
bình định mức, thêm nước cất và đợi 10 phút. Sau đó,
mẫu được lọc qua giấy lọc Whatman số 1 và pipetted ra
10 ml dịch lọc vào cốc thủy 50ml và điều chỉnh pH đến
4,6 và đi qua các cột pha đảo Amberlite CG-50 nhựa. 8
mL mẫu tách rửa được đưa vào 25 ml cốc thủy tinh và
điều chỉnh pH=7 và thực hiện lên đến 10 ml bằng nước
cất.
10


 Qui trình phân tích
- Histamine phản ứng chậm với hệ thống dò tìm bởi dễ bay
hơi và thiếu sắc thể, không có tính hấp thụ huỳnh quang
chuyên biệt. Do đó chất dẫn xuất được dùng để làm tăng
độ nhạy như o-phthalaldehyde (OPA) và Dansyl
chloride.
- Dùng pipetted lấy ra 5,0 mL rửa giải pháp sắc ký cột
vào một bình định mức 10,0 ml và thêm 1,00 ml NaOH
1,0 M . Sau đó, thêm 0,50 ml OPT 0.1% ,thêm 1.50 mL
H2SO4 1M sau 4 phút và được hỗn hợp. thêm nước cất
đến vạch định mức.
- Chuẩn bị 100 và 10mg/l chuẩn trung gian.
- Chuẩn làm việc 0.5;1.0;1.5;2.0 và 3.0mg/l

11

5. Kết quả thí nghiệm

12


6. Kết luận
Sự tích lũy histamine là kết quả của sự lạm dụng thời gian/
nhiệt độ trong quá trình chế biến và bảo quản dẫn đến hư hỏng
thực phẩm. Để giảm thiểu nguy cơ này tổ chức FDA (2001) đề
xuất các loại cá sao khi đánh bắt cần được bảo quản dưới
4oC.Thời gian từ lúc cá chết đến lúc cá được bảo quản không
được quá 6 giờ.
Cơ quan FDA đã thiết lập tiêu chuẩn cho hàm lượng histamine
trong cá ăn được là MRL(giới hạn nồng độ cho
phép)=50mg/kg (FDA, 2005) và các loại cá có hàm lượng
histamine cao hơn qui định sẽ bị cấm bán cho người tiêu
dùng. Tại Australia thì MRL=200mg/kg và tại Nam Phi thì
MRL=100mg/kg (Auerwald et al.,2006).

13


Tài liệu tham khảo
An, H., & Ben-Gigirey, B. (1998). Scombrotoxin poisoning. In I. Millar,
D. Gray, & N.
Strachan (Eds.), Microbiology of seafoods (pp. 68–69). London:
Chapman & Hall
Ltd.

Chen, H. C., Kung, H. F., Chen, W. C., Lin, W. F., Hwang, D. F., Lee,
Y. C., et al. (2008).
Determination of histamine and histamine-forming bacteria in tuna
dumpling
implicated in a food-borne poisoning. Food Chemistry, 106, 612–618.
Eerola, S., Hinkkanen, R., Lindfors, E., & Hirvi, T. (1993). Liquid
chromatographic
determination of biogenic amines in dry sausages. Journal of AOAC
international,
76, 575–577.

14