DSpace at VNU: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến việc xác định Asen trong nước bằng vi khuẩn chỉ thị

TAP CHÍ KHOA H O C ĐHQGHN. KHTN & CN. T.xx. sò 2PT.. 2004

N G H IÊ N C Ứ U Ả N H H Ư Ở N G C Ủ A M Ộ T s ố Y Ê U T ố
Đ Ế N V IỆ C X ÁC Đ ỊN H A S E N T R O N G N Ư Ớ C
BẰNG VI K H UẨN CHỈ THỊ
P h ạ m T h ị K im T ra n g , N g u y ề n V ă n M ùi
K hoa S in h học, Trường Đ ại học Khoa học T ự nhiên, Đ HQ GHN
P h ạ m T h ị D ậ u , P h ạ m H ù n g V iệt
T rung tâm N ghiên Cứu Công nghệ Môi trường và P hát triển Bển vững
Trường Đại học Khoa học T ự nhiên, Đ HQ GHN
M ic h a e l B e rg , J a n R. V a n D e r M ee r
Viện K hoa học và Công nghệ Môi trường, Liên bang T huỵ sĩ
1. Đ ặ t v â n đ ề

o
nhiễm asen (thạch tín) trong nưốc ngầm là một hiện tượng có nguồn gốc tự nh
xuất hiện ỏ nhiều quốc gia trê n th ế giối trong đó có Việt nam . Ở nhiều vùng nóng thôn Việt
Nam, nước ngầm là nguồn nưđc chủ yếu dùng cho ăn uốhg và sinh hoạt. Việc sử dụng
nguồn nước này trong thòi gian dài có th ể dẫn tói một sô' bệnh cho con ngiíời như các bệnh
ung Ihư da, ung thư phổi, rối loạn sắc tố da. Do vậy, việc khảo s á t xác định mức độ ô nhiễm
asen trong nước giếng khoan là vô cùng cần th iết [1,4]. Để phản ánh dũng hiện trạn g ô
nhiễm asen, ta cần phái phân tích tạ i từng giếng nên lượng m ẫu cần kiểm tra lốn, rấ t tôn
kém nếu sử dụng các phương pháp phân tích truyền thông trong phòng th i nghiệm như
khôi phổ cảm ứng plasm a (ICP-MS), quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS). Do dó cần có các
phương pháp phân tích hiện trường có chi phi tháp. Hiện nay, m ột sò* vi khuân chi thị
(Biosensor) dùng để xác định hàm lượng asen trong nước dà được các nhà khoa học trên th ế
giới nghiên cứu chế tạo. Ưu điểm của nó là dễ sử dụng, năng s u â t ph ân tích cao, giá thành
rẻ, cỏ đáp ứng dặc hiệu vói asen, độ nhạy và độ chính xác cao [3,5]. Vi khuẩn này khi tiếp
xúc với asen sẽ tạo ra enzym luciferaza, oxy hoá n-decanal th àn h ax it n-decanoic. Phản ứng
này phát ra ánh sáng ỏ bước sóng 490nm và dược đo bằng th iế t bị đo ánh sáng
(Luminometer). Vi khuẩn này có đáp ứng r ấ t tố t với asen trong các dung dịch chuẩn, nhưng

các mẫu nước ngầm thường có th àn h phần phức tạp và đặc biệt luôn chứa s ắ t với hàm lượng
cao có ảnh hưỏng xấu tới khả năng làm việc của chúng. Mục đích của bài báo này là nghiên
cửu ánh hường của m ột số yếu tô' đến việc xác định asen bằng chỉ th ị vi k h u ẩn (2,3,6].
2. Đ ố i tư ợ n g v à p h ư ơ n g p h á p n g h iê n c ứ u

2.1.

N h ả n g iô n g và bảo q u à n vi k h u ẩ n

Chung vi kh u ẩn E.coli DH5a (pJAMA-arsR) có khả nảng p h át hiện asen ở nồng độ
rấ t thấp O.OõụM (4jig/l) được tạo bởi các n h à khoa học thuộc nhóm sinh học phân từ của

Tiếnsĩ JanRoelofVanDerMeer, ViệnKHvàCNMôi trườngLiênbangThuỵsĩ. Giốngvi
khuẩn trên dược nuôi cấy trong môi trường Luria-Broth (LB) trên m áy lắc ôn nhiệt ở 37°c.
178


Nghiên CỨII ánh Imởng của mội số yếu lổ dến việc xác định ■

179

Dịch vi kh u ẩn thu được trộn lần vói glycerol 87%, chia đều vào các ô’ng Eppendorf vô trùng
(với th ể tích l,3m l) và bào quản trong tủ lạnh sâu -80"C [6],
2.2. Phép đo ho a t tín h đ á p ứ n g với asen củ a vỉ k h u ẩ n c h ỉ th ị
Ông giống được làm tan đá rồi trộn với 10ml môi trường lỏng LB. Đo hoạt tính của vi
khuẩn: trộn 500^1 m ẫu nước chứa asen với 500^1 dịch vi k h u ẩn lắc â 30"C, bổ xung dung
dịch n-decanal và đo cường độ ánh sáng trê n m áy J u n io r LB 9509 Lum inom eter. Các thí
nghiệm đểu lặp lại 3 lần, lấy tru n g bình. Đơn vị tín h là cường độ ánh sáng (RLƯ), m ẫu đối
chứng là m ẫu không chứa asen hoặc không bổ xung hoá chất.
2.3. T hí n g h iệm tối ưu thờ i g ia n tiếp xú c a sen và h à m lượ ng cơ ch ấ t

Khi vi khuẩn tiếp xúc với asen sẽ tạo ra enzym luciferaza xúc tác cho phản ỏng
chuyển hoá cơ chất (phản ứng p h á t quang), P hản ứng này phụ thuộc vào lượng enzym và cơ
chất, do đó cần phải tối ưu thời gian tạo enzym (thời gian vi khuẩn tiếp xúc vối asen từ 30 120 phút) và lượng cơ chất (n-decanal từ 0,125 - 2mM) nhằm tạo ra một đáp ứng lớn nhất
cho hệ thông.
2.4. T hi n ghiệm đ á n h g iá ả n h hưởng của s ắ t và chọn lự a hoá c h ấ t bảo q u ả n m ẫu
nước ngầm
Nước ngầm chứa nhiều asen thường có hàm lượng s ắ t cao từ 100-600 nM, hàm lượng
s ắ t cao nh ư vậy sẽ gây những ảnh hưởng không tố t cho phép đo. Để đánh giá ảnh hưởng của
s ắ t tới hoạt tính của vi kh uẩn chúng tôi đã tạo ra các m ẫu chứa asen có F e l+ thay dôi từ 0lOOOnM (FeCla.8H30 , analytical -Sigma) trong môi trường tru n g tín h và pH 2. Các axit
HC1, HNO;i, H.,SOj, H3PO., (Merck) được đùng để tạo pH 2. D ung dịch pyrophotphat 200mM
sẽ được bổ xung đế' tạo môi trường có pH 6,8 là điều kiện phù hợp cho enzym luciferaza có
hoạt tính cao nhất. Các chất tạo phức với s ắ t được dùng là muôi T ri N atri N itrilotriaxetat
m onohydrat (C6H6NN a30 6.H20-NTA-Fluka), D iN atri etylendiam in tetra a x e ta t dihydrat
(C10Hu N2Na2O8.2H2O-EDTA-Fluka), N atri pyro p hotphat (Na4P9O7.10H2O-Sigma) vối nồng
độ từ 0,1-1 raM,

3. Kết quả và bàn luận
3.1. Tối ưu h à m lượ ng cơ ch ấ t và thời g ia n tiếp xú c với asen
K ết quả th í nghiệm tối ưu thòi gian tiếp xúc với asen cho thấy cường độ ánh sáng
tăng lên khi ủ vi khuẩn trong mõi trường có chứa 0,65jxM ase n từ 30 ph ú t đến 120 ph ú t và
đ ạt cực đại ở khoảng 90 p h ú t sau đó có chiều hướng giảm (hình 1). N hư vậy, khi thòi gian
tiếp xúc vối asen ngắn, tế bào vi khuẩn chưa đủ thời gian để hồi phục sinh lý và thực hiện


Phạm Thị Kim Trang. Nguyôn Vãn MÙI..

các bước nhặn dạng asen [2]. Các tác giả của bài báo sô [6] đã dùng thời gian tiếp xúc là 60
phút và gợi ý có th ể kéo dài khoảng thòi gian này. Nhưng k ết quả th i nghiệm cho thấy nếu
kéo dài thời gian này hơn 90 ph ú t thì cường độ ánh sáng giảm, có th ể giải thích là sự tồn tại
quá lâu trong môi trường chứa ch ấ t độc asen của vi khuẩn làm x u ất hiện các ảnh hưởng bất

lợi đến sinh lý tế bào. N hư vậy, với k ết quả tìm được chúng tôi thấy thời gian tiếp xúc với
asen trong 90 ph ú t là tôi ưu.

Hình 1. Ảnh hưỏng của thời gian tiếp
xúc giũa asen và vi khuẩn chì thị E.cõli
DH5a (pJAMA-arsR).

Hình 2. Tối ưu nồng độ cơ chất ndecanal cho phản ửng xúc tác bâi
enzym luciferaza

Lượng cơ chất n-decanal cũng cần được tối ưu vì nếu thiếu th i độ nhậy của phép đo
sẽ không đ ạt gía trị tối ưu còn nếu cao quá thì sẽ thừa vì lượng enzym luciferaza sinh ra là
có hạn. Các tác già [6] đã sử dụng lượng n-decanal là 2mM nhưng khi th ử nghiệm các lượng
n d ec an a l từ 0,125-‘2 mM chúng tôi thấy giá trị bão hoà b ắ t đầu đ ạ t ỏ khoáng 1 mM (hình 2).
Các điều kiện th í nghiệm dã tối ưu sẽ được sử dụng cho các th í nghiệm tiếp theo.
3.2. Đ á n h g iá ả n h hư ởng của s ắ t và chọn lựa hoá c h ấ t bảo q u ả n m ẫ u nước ngầm
Khi phân tích asen trong nước ngầm có nhiều s ắ t có th ể có hai ản h hường làm giảm
khá năng phát hiện asen của vi khuẩn chỉ thị. Thứ nhất, khi s ắ t k ết tủ a tạo th àn h hydroxỵt
sắt (III) các phản tử asen sẽ bị hấp phụ lên đó nên hàm lượng asen hoà ta n trong dung dịch
và tiếp cận vâi vi k h u ẩn sẽ giảm đi. Ngoài ra, hàm lượng s ắ t quá cao cũng gây b ấ t lợi cho
hoạt động sinh lý bình thường của vi khuẩn.
Kết quả hình 3 cho thấy tác hại của s ắ t với hoạt tính p h át hiện ase n của vi khuan.
Cường độ ánh sáng giảm rấ t nhanh khi lượng sắt tăng từ 0-500 ỊiM. T ín hiệu giảm khoảng
50% khi s ắ t là 25 (iM và giám hoàn toàn khi hàm lượng s ấ t là 500 nM. H iện tượng này xảy
ra là do asen đã bị hấp thụ vào các h ạ t s ắ t k ết tủ a nên không còn đủ để gãy cảm ứng với vi
khuấn chi thị.


Hình 3: Ảnh hưởng cùa sắt tói hoạt
tinh đáp ừng với asen cùa

vi khuẩn chỉ thị

Hình 4: ành hưởng cùa việc axit hoá và tạo
phức tói đáp ửng với asen cùa vi khuẩn chi
thị (mẫu đôì chửng là mẫu không bổ xung
axit hoặc chất tạo phức)

Với mẫu nước có pH 2 đã ngăn cản sự k ết tủa của s ắ t tạo điều kiện cho asen tồn tại tự
do trong dung dịch và tiếp xúc vối vi khuẩn, thì đường biểu diễn cho thấy cường dộ ánh
sáng không giảm dột ngột m à khá ổn định cho tối khi hàm lượng s ắ t đ ạt 250nM, có thê cho
rằ n g hoạt tính của vi khuẩn chỉ thị asen đã bị ảnh hưởng xấu khi nồng độ s ắ t lốn hơn
250|jM. N hư vậy, so với trường hợp không axit hoá m ẫu ta có th ể sử dụng vi khuẩn chỉ thị
này để xác định hàm lượng asen trong một khoảng nồng độ s ắ t khá rộng (0-250^iM) mà
không gáy giảm nh iều hoạt tính của vi khuẩn.
Tuy nhiên, khi xét riêng vùng có hàm lượng s ắ t nhỏ (0-25|iM) ta thấy khả năng dáp
ứng của vi khuẩn chỉ thị giảm đi nhiều ở m ẫu đã axit hoá so với m ẫu tru n g tính. Như vậy,
môi trưòng axit và quá trìn h bổ xung pyrophotphat trung hoà lại có th ể gây h ạn chế cho
hoạt động của vi kh u ẩn chỉ thị, vấn đề này cần được tối ưu hơn nữa nhằm khai thác khả
năng p h át hiện asen vốn có cùa vi kh u ẩn chỉ thị.
Kết quả từ hình 4 cho thấy trong số các axit đã sử dụng để bảo quản m ẫu th ì HNO .1 là
có đáp ứng cao hơn rồi mối đến ax it HC1. Axit H3P 0 4 đã được coi là một chất bảo quản tốt
cho mầu chứa asen khi phân tích kiểu hoá học nhưng vâi trường hợp này nó có th ể gây nèn
những ức chẽ cho vi khuẩn do cấu trúc tương tự của p h otphat và a se n at [2,6]. Còn H2S 0 4
thể hiện ảnh hưởng kém hơn cả trong sô’ các axit đã sử dụng, điều này có th ể được giải
thích bởi tinh oxy hoá quá m ạnh của nó.
Trong thí nghiệm khảo s á t vai trò cùa các chất tạo phức với s ắ t với các nồng độ từ 0,1-1
mM chúng tôi thấy ở nồng độ 0,4 mM vi khuẩn chỉ thị có đáp ứ ng cao hơn với cả ba loại
muối nói trên và ỏ môi trường có bổ xung EDTA vi khuẩn có đáp ứng cao hơn so vói NTA và

Phạm Thị Kim Trang. Nguyền Vãn Mùi...

pyrophotphat nhưng vẫn không bằng ax it nitric. N hư vậy từ k ết quả th u được chúng tôi sẽ
sứ dụng ax it nitric đê làm hoá chất bảo qu ản cho m ẫu nước khi thử nghiệm với vi khuẩn chi
thị asen.
N hư vậy, s ắ t trong nước ngầm có ản h hường không tố t tới quá trìn h xác dính asen
băng vi k h u ẩn chỉ th ị E.coli D H 5a (pJAMA-arsR), nhược điểm này có th e khắc phục nhò
việc axit hoá m ẫu bằn g ax it nitric tới pH 2 và sau đó trung hoà lại bằng pyrophotphat. Phép
do hàm lượng asen có th ể được thực hiện sau khi nuôi vi kh u ẩn chi thị trong môi trường có
chứa asen 90 ph ú t và bô’ xung lượng cơ c h ấ t n-decanal với nồng dộ 1 mM. Sàn phẩm này cần
dược thử nghiệm trong thự c tiễn với các m ẫu nước ngầm thực có th àn h phần hoá học khác
nhau nhằm đánh giá tín h k h ả th i của phương pháp xác định hàm lượng asen trong nưóc
ngầm bằng vi kh u ẩn chỉ thị.
TÀ I L IỆ U THAM KHÀO
1.

Berg, M., T ran , H-, c ., N guyen, T., C-, Pham , H. V., Schertenleib, R., Giger, w , Arsenic
contam ination o f groundw ater a n d dringking water in Vietnam: A hum an health
threat. E nvironm ent Science Technology 13, 2001, pp. 2621-2626.

2.

D aunert, s ., B arrett, G., Feliciano, J ., s ., S hetty, R., s., S hrestha, s ., Sm ith-spencer,
w,

G enetically

E ngineered

Whole-Cell

Sensing

System s:

C oupling

Biological

Recognition w ith R eporter Genes, Chem , Rev, 100, 2000, pp. 2705-2738.
3.

Kinniburgh, D., G., Kosmus, w ., Arsenic contamination in groundwater:some analytical

4.

Phạm Thị Kim T rang, Nguyễn văn Đản, Phạm H ùng Việt, nnk, Bước đầu nghiên cứu

considerations. T a la n ta 58, 2002, pp. 165-180.

s ự ô nhiễm asen trong nước ngầm ngoại thành Hà nội, Tuyến tập báo cáo khoa học
Tiếu ban K H liên ngành K H C N m ôi trường, Trường Đại học K hoa học Tự nhiên,
ĐHQG H à Nội, 2002, tr. 65-71,
5.

R ahm an, M., M,, M urkherjee, D., Sengupta, e t al, Effectiveness a n d reliability o f
Arsenic field testing kits: are the m illion dollar screening projects effective or not?,
Environm ent Science Technology, 36, 2002, pp. 5385-5394.

Ổ.

Stocker, J .. B alluch, D., G sell, M., H arm s, H., Feliciano, J ., D aunert, s . Malik, K., A.,
van d er M eer, J., R, Development o f a set o f sim ple Bacterial Biosensor for quantitative
a n d rapid m easurem ents o f arsenite a n d arsenate in potable w ater, E nvironm ent
Science Technology 37, 2003, pp. 4743-4750.


Nghicn cihi ánl) hướng cùa mõi sò veil lố đến việc xác định..

183

VNU JOURNAL OF SCIENCE. Na!.. S c i. & Tech., T.xx. N02AP . 2004

S T U D Y IN G O F T H E E F F E C T S O F F A C T O R S O N T H E
D E T E R M IN A T IO N O F A R S E N I C I N W A T E R B Y B I O S E N S O R
T r a n g P h a m T h i K im , M u i N g u y e n V an
Departm ent o f Biology, College o f Science, VN U
D a u P h a m T h i, V iet P h a m H u n g
The Centre fo r Environm ental Technology a n d S ustainable Development,
Hanoi College o f Science, V N U ■Hanoi
M ic h a e l B erg, J a n R . V a n D e r M eer
Sw iss Federal Institute for E nvironm ental Science a n d Technology, Sw itze rla n d
Arsenic (As) contam inated groundw ater problem h as been found in m any countries in
the world-included V ietnam . It has requested developm ent of new, efficient and economic
quick test facilities beside expensive and sophisticated in stru m en t a s atom ic absorption
spectrom etry (AAS). Arsenic bacterial biosensors E.coli D H 5a (pJA M A arsR )
(nonpathogenic laboratory strain) can determ ine arsenic a t level o f 0.05
(4ppb).
Hydroxide iron (III) in th e groundw ater will precipitate and absorb arsen ic in th e presence
of oxygen. Experim ents checking the abilities ag a in st th is phenom ena by adding several

acids a s HC1, H N 0 3, H.,S04
H3P 0 4 an d chelators a s (CliH 6N N a 30(i.H 20-NTA),
(C|0H|,N-,Na.,08.2H^0- EDTA), (Na4P ,0 7.10H20 ) shows th a t HNOa h as b est effect.
Optimizing experim ents for th e testing procedure show th a t m axim um arsenic sensor
ability will be reached after 90 m inutes of incubation tim e w ith arsenic an d Im M su b strate
n-decanal is the best. T he arsenic biosensor E.coli DH5 (pJAM A-arsR) should be tested for
its reliability by using real groundw ater sam ples w ith different m atrix.