Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinh tổng hợp amylase ngoại bào của chủng nấm mốc phân lập từ quy trình sản xuất rượu gạo truyền thống

ĐẶT VẤN ĐỀ
Amylase là hệ các enzyme thủy phân tinh bột và các polysaccharid đơn
chất tương tự như: dextrin, glicogen Hệ enzyme amylase là một trong số các
hệ enzyme được sử dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp, y học và nhiều lĩnh
vực kinh tế quốc dân khác. Trong Công Nghệ Thực Phẩm amylase được ứng
dụng: trong sản xuất bánh mì có tác dụng tăng độ ngọt và mùi vị của sản
phẩm, trong sản xuất cồn để đường hóa tinh bột, chế biến dextrin với dịch
đường để sản xuất thức ăn cho người già và trẻ con, dùng trong sản xuất mật
ngô Amylase chiếm khoảng 25% thị trường enzyme, đã thay thế hầu như
hoàn toàn việc thủy phân tinh bột bằng hóa chất trong các ngành công nghiệp.
Amylase được phân bố rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật
(nấm mốc, nấm men, vi khuẩn) đến thực vật (đại mạch, khoai lang ) và động
vật (gan, ruột, tụy ). Trong đó amylase thu nhận từ vi sinh vật có nhiều tính
ưu việt do chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn, thành phần môi trường
nuôi cấy dễ kiếm và rẻ tiền. Đồng thời, chúng ta có thể dễ dàng điều khiển các
điều kiện tối ưu của quá trình nuôi cấy. Điều đó cho phép thu được các
enzyme theo mong muốn với hoạt tính cao.
Rượu là sản phẩm đã được sản xuất từ rất lâu trong các hộ gia đình với
nguyên liệu để nấu rượu thường là gạo, nếp Mỗi loại nguyên liệu tạo thành
một hương vị đặc trưng của rượu. Để sản xuất rượu thì người ta thường sử
dụng hỗn hợp vi sinh vật làm nhiệm vụ chuyển hoá tinh bột thành đường (nấm mốc) nhờ hệ enzyme amylase, sau đó
chuyển đường thành rượu (nấm men) và còn có một số vi khuẩn tạo hương cho sản phẩm.
Dựa trên cơ sở này chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ảnh
hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinh tổng hợp amylase ngoại bào
của chủng nấm mốc phân lập từ quy trình sản xuất rượu gạo truyền thống”
Nội dung của đề tài này là:
+ Phân lập, tuyển chọn chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp
amylase ngoại bào cao từ quy trình sản xuất rượu gạo truyền thống.
1
+ Khảo sát một số yếu tố nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng
hợp amylase ngoại bào.

+ Khảo sát tính chất của chế phẩm enzyme thu được nhằm cung cấp
những thông số kỹ thuật để áp dụng vào thực tế sản xuất hoặc để thực hiện
những nghiên cứu tiếp theo.
2
PHẦN 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.Tổng quan về rượu gạo lên men truyền thống
Rượu được làm từ nguyên liệu gạo là sản phẩm đã xuất hiện từ rất lâu
không chỉ ở nước ta mà còn ở một số nước Châu Á khác như: Trung Quốc,
Hàn Quốc, Nhật Bản Mỗi nước có một phương thức sản xuất khác nhau tạo
nên các sản phẩm truyền thống có mùi vị đặc trưng riêng.
Ở nước ta rượu gạo được sản xuất ra theo nhiều phương pháp khác
nhau, trong đó phương pháp lên men rượu truyền thống bằng bánh men hiện
nay vẫn được dân gian sử dụng nhiều. Phương pháp này có những đặc điểm
khác với những phương pháp khác như:
- Nấm mốc và nấm men được nuôi cấy và phát triển cùng một lúc trên
môi trường tinh bột sống và có thêm những vị thuốc bắc.
- Nguyên liệu tinh bột không nhất thiết phải hồ hóa thành dung dịch mà
chỉ cần làm chín.
- Quá trình đường hóa và rượu hóa tiến hành cùng một lúc.
Phần lớn các vùng miền cả nước hiện nay vẫn thường gọi tên rượu đơn
thuần gắn với tên của địa phương sản xuất rượu (như rượu làng Vân, rượu Bầu
Đá, rượu Mẫu Sơn, rượu Xuân Thạnh, rượu Phú Lộc, rượu đế Gò Đen v.v ). Tất
cả các sản phẩm này có chất lượng khác nhau phụ thuộc nhiều vào nguồn
nguyên liệu và nguồn bánh men ở địa phương nhưng nhìn chung đều có sơ đồ
sản xuất như hình 1.1.
3
Hình 1.1: Quy trình sản xuất rượu gạo truyền thống
 Thuyết minh quy trình
- Hiện nay, có hai phương pháp sản xuất rượu:

+ Có qua chưng cất (rượu trắng): nguyên liệu thường là gạo tẻ.
+ Không qua chưng cất (rượu vang gạo): nguyên liệu thường là gạo nếp.
• Nguyên liệu
 Nguyên liệu gạo
Thường sử dụng các loại gạo có hàm lượng tinh bột cao thông dụng
như gạo tẻ, gạo nếp
+ Thành phần dinh dưỡng của hạt gạo [6]:
Gạo nếp: Nước 14%, Glucid 79.4%, Lipid 1.5% và protein 8.2% trong
đó Protein của gạo nếp chủ yếu là glutein (oryzaine) và glubuline ngoài ra
còn một ít lẫn Cozine và Prolamin. Glucid của gạo nếp chủ yếu là tinh bột,
4
Nấu chín
Để nguội
Trộn bánh men
Lên men
Chưng cất
Rượu trắng
Lọc
Bánh men
Rượu vang
gạo
Nguyên liệu gạo
đường, cellulose và hemicellulose.Trong tinh bột chủ yếu là amylopectin.
Ngoài ra còn chứa một số vitamin như B
1
, B
2
, B
6
, PP và E.

Gạo tẻ: Nước 13.84%, Glucid 77.55%, Protein 7.35%, Lipid 0.52%,
cellulose 0.18% và muối khoáng 0.54%.
 Bánh men
Bánh men rượu được chế từ nhiều loại thảo dược (thuốc Nam, thuốc
Bắc) như cam thảo, quế chi, gừng, hồi, thạch xương bồ, bạch chỉ, xuyên
khung, rễ ớt Nhào trộn hỗn hợp với bột gạo, thậm chí cả bồ hóng và ủ ở
30
0
C trong khoảng 1 tuần. Trong suốt thời gian này sẽ có một số vi sinh vật
phát triển ở trong bánh men.
Cho đến nay đã có nhiều nghiên cứu về hệ vi sinh vật có trong bánh
men thuốc bắc: N.T.P. Dung và cộng sự (2005) [22] đã phân lập được từ bánh
men 119 chủng vi sinh vật bao gồm: 53 chủng mốc, 51 chủng men và 15
chủng vi khuẩn. Các chủng nấm mốc phân lập có nhiều tính chất tốt như
Amylomyces rouxii, Amylomyces aff. Rouxii (một hình thức không điển hình
của Amylomyces rouxii), Rhizopus oligosporus và Rhizopus oryzae. Các
chủng nấm men phân lập được có đặc tính lên men tốt như Saccharomyces
cerevisiae. Từ 52 mẫu bánh men ban đầu bằng phương pháp PCR Vũ Nguyên
Thanh và cộng sự (2008) [29] đã phân lập và định danh được 13 loài nấm
mốc và nấm men, 23 loài vi khuẩn, bao gồm vi sinh vật sản xuất amylase (chủ
yếu là các loài nấm mốc Rhizopus oryzae, R.microsporus ngoài ra còn có các
loài vi sinh vật khác như Absidiacorymbifera, Amylomyces sp.,
Saccharomycopsis fibuligera), vi sinh vật sản xuất ethanol (Saccharomyces
cerevisiae, Issatchenkia sp., Pichia anomala, Candida tropicalis,
P.ranongensis, Clavispora lusitaniae), một số vi khuẩn sản sinh acid lactic
(Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus plantarum, L.brevis, Weissella
confuse và W.paramesenteroides), các vi khuẩn sản sinh acid acetic
(Acetobacter orientalis, A.pasteurianus) và một vài loài Bacillus sản xuất
amylase (Bacillus subtilis, B.circulans, B.amyloliquefaciens,
B.sporothermodurans).

•Nấu chín: Gạo nguyên liệu được ngâm nhằm rửa sạch chất bẩn bám bên
ngoài hạt, đồng thời làm cho hạt gạo mềm, trương nở giúp dễ dàng cho quá
5
trình nấu. Sau khi để ráo, gạo được cho vào nồi, thêm nước và nấu chín. Tỉ lệ
gạo: nước khoảng 1: 1 theo thể tích.
• Làm nguội: Cơm sau khi nấu chín được trải đều trên một bề mặt
phẳng để làm nguội xuống nhiệt độ thích hợp cho việc trộn bánh men rượu.
Bánh men rượu được trộn vào bằng cách bóp nhỏ, rắc đều lên bề mặt lớp cơm
với tỷ lệ thích hợp tùy theo hướng dẫn trên từng loại men. Sau đó cho tất cả
vào khạp lớn, đậy nắp để bắt đầu quá trình lên men rượu.
• Lên men: Quá trình lên men diễn ra ở nhiệt độ thường (khoảng 28 -
32
o
C). Sau 2 ngày đầu lên men, có thể bổ sung nước vào khối lên men với tỷ
lệ nước: cơm khoảng 3: 1, sau đó đậy nắp và tiếp tục lên men thêm khoảng 1
ngày nữa.
•Chưng cất: Khi quá trình lên men kết thúc, ta tiến hành chưng cất để
thu được rượu thành phẩm. Tùy theo yêu cầu của khách hàng mà ta có thể
tiến hành pha trộn các loại rượu thu được ở các khoảng thời gian chưng cất
khác nhau để tạo ra rượu có nồng độ cao thấp khác nhau.
1.2.Tổng quan về amylase
1.2.1. Giới thiệu về amylase
Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật. Các
enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân. Amylase thủy phân các phân tử
tinh bột để cho ra nhiều sản phẩm khác nhau bao gồm những dextrin và các
polyme kích thước nhỏ hơn được tạo thành từ các đơn vị glucose [30].
1.2.2. Phân loại amylase
Theo tính chất và cách thức tác dụng lên tinh bột, người ta phân chia
amylase làm 3 loại: α-amylase, β-amylase và γ-amylase (hay còn gọi
glucoamylase).

1.2.2.1. α-amylase
α-amylase (endo-1,4-α-D-glucan glucohydrolase, E.C.3.2.1.1) là một
trong những enzym thương mại quan trọng nhất. α-amylase xúc tác liên kết
thủy phân liên kết α-1,4 glucoside nội mạch ở bất kỳ vị trí nào trong phân tử
tinh bột. Với cơ chất là amylose, α-amylase cho sản phẩm thủy phân chủ yếu
6
là maltose (khoảng 87%) và một ít glucose (13%). Với cơ chất là
amylopectin, α-amylase chỉ thủy phân liên kết 1,4 chứ không thủy phân liên
kết 1,6 glucoside, sản phẩm tạo thành là các dextrin phân tử thấp không cho
phản ứng màu với iod, maltose, glucose và izomaltose.
α-amylase hầu như không tác dụng lên tinh bột nguyên thể mà chỉ tác
dụng mạnh lên tinh bột đã hồ hóa. Quá trình thủy phân xảy ra qua nhiều giai
đoạn:
- Giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa) chỉ một số liên kết trong phân
tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng dextrin, độ nhớt của hồ tinh bột
giảm nhanh.
- Giai đoạn hai (giai đoạn đường hóa): các dextrin vừa được tạo thành
bị thủy phân, tiếp tục tạo thành các dextrin có phân tử thấp hơn, maltose,
izomaltose và glucose.
Tuy nhiên thông thường trong một thời gian ngắn (30 - 60 phút), α-
amylase chỉ thủy phân tinh bột chủ yếu thành dextrin phân tử thấp và một ít
đường maltose. Khả năng dextrin hóa cao của α-amylase là tính chất đặc
trưng của nó.
α-amylase tương đối bền với tác dụng nhiệt.
α-amylase của nấm mốc có thể xúc tác thủy phân tinh bột ở 50 - 52
0
C.
α-amylase của mầm hạt hoạt động tốt ở nhiệt độ 58 - 60
0
C. α-amylase

của vi khuẩn có tính bền nhiệt cao, có thể giữ được hoạt tính ở 70 - 90
0
C.
Tính bền nhiệt của α-amylase là do sự có mặt của canxi trong phân tử enzym,
ở đây canxi giữ vai trò ổn định cấu trúc bậc ba của phân tử enzym.
α-amylase thường thể hiện hoạt tính trong vùng axit yếu, α-amylase của
nấm mốc hoạt động mạnh ở pH 4.5 - 4.9; của vi khuẩn ở pH 5.9 - 6.1. Nếu
pH< 3, đa số α-amylase bị vô hoạt hoàn toàn, trừ α-amylase của Asperillus
niger có thể chịu được pH 2.5 - 3.8.
Những chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp α-amylase có ý nghĩa
công nghiệp: Bacillus subtilis, Bacillus lichenifomis, Asperillus oryzae [1].
7
1.2.2.2. β-amylase
β-amylase (α-1,4-glucan maltosehydrolase, EC 3.2.1.2) là một enzyme
xúc tác sự thủy phân liên kết α–1,4 glucoside của phân tử tinh bột và các
polisaccarit tương tự.
β-amylase không tác dụng lên tinh bột nguyên thể, chỉ tác dụng lên tinh
bột đã hồ hóa. Khác với α-amylase, β-amylase vẫn giữ được hoạt tính khi
không có canxi.
β-amylase kém bền dưới tác dụng của nhiệt độ cao, β-amylase bị vô
hoạt hoàn toàn ở nhiệt độ 70
0
C, song trong dịch nấu nhiệt độ tối thích lại là 60
- 65
0
C.
β-amylase khá bền trong môi trường axit, ngay ở pH 3 - 4. Đa số β-
amylase hoạt động mạnh hơn trong môi trường có pH 4.5 - 5 [1].
1.2.2.3. Glucoamylase
Glucoamylase (α-1,4-glucan glucohydrolase, E.C.3.2.1.3) là enzym

thủy phân liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside của phân tử tinh bột và các
polysaccarit khác tương tự.
Đa số glucoamylase đã biết đều thể hiện hoạt tính tối đa ở vùng pH 3.5
– 5.5. Nhiệt độ hoạt động tối thích của glucoamylase 50 - 60
0
C. Hầu hết các
glucoamylase bị mất hoạt tính khi đun nóng trên 70
0
C. Những chủng vi sinh
vật có khả năng sinh tổng hợp glucoamylase có ý nghĩa công nghiệp [1]:
+ Nấm mốc: Aspergillus (Asp. Awamori, Asp. Niger), Rhizopus.
+ Nấm men: Endomycopsis.
1.2.3. Nguồn thu nhận amylase
Trong thiên nhiên enzyme có ở hầu hết ở mọi thực vật, động vật và vi
sinh vật. Song chỉ có một số hạt thực vật và một số loài vi sinh vật mới là
những đối tượng có thể dùng làm nguồn thu các chế phẩm enzyme amylase,
do chúng có khả năng tích lũy một lượng lớn các enzyme này trong những
điều kiện xác định.
8
1.2.3.1. Nguồn thực vật
Ở thực vật, amylase thường tìm thấy nhiều ở các cơ quan dự trữ. Người
ta thu nhận α-amylase từ các hạt hòa thảo nảy mầm như thóc hoặc đại mạch,
β-amylase từ củ khoai lang [1]. Amylase thu được từ nước chiết của một số
đối tượng thực vật khi sử dụng trong sản xuất làm cho sản phẩm có mùi vị
đặc trưng riêng. Do vậy, được sử dụng rộng rãi trong một số ngành công
nghiệp, đặc biệt là công nghiệp thực phẩm [10]. Vào năm 1999, tác giả Cao
Văn Nguyên và Nguyễn Quốc Khang đã tách chiết thành công amylase từ hạt
cây Quina [7].
.2.3.2. Nguồn động vật
Ở các loài động vật, phần lớn amylase được tiết ra từ tuyến nước bọt và

tuyến tụy. Amylase cũng có trong các tụy tạng như gan, ruột. Ngoài ra,
amylase còn có trong huyết thanh.
1.2.3.3. Nguồn vi sinh vật
Enzym vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vượt xa enzym từ các nguồn
khác. Amylase thu nhận từ vi sinh vật chủ yếu là từ nấm mốc, giá nấm men và
vi khuẩn, còn xạ khuẩn thì ít hơn.
Amylase từ nấm mốc
Để thu amylase người ta thường dùng các giống nấm mốc Aspergillus,
Rhizopus. Nhiều loại thuộc các giống này (Asp. Oryzae, Asp.niger, Asp.
usamii, Asp. awamori, Asp. batalae, Rhizopus delemar, Rh. tonnesis, Rh.
neveus, Rh. japonicum, Rh. fonkinensis, Rh. topninensis) và một số loài của
Neurospora và Mucor sinh tổng hợp rất mạnh mẽ không những chỉ α-
amylase mà cả glucoamylase [9].
 Amylase từ nấm men và giả nấm men
Amylase cũng được thu nhận từ nấm men và giả nấm men thuộc các
giống Saccharomyces, Endomycopsis, Endomyces (Ikuo Matsui và cộng sự
(1990) [19], Helena Ebertová (1964) [18], Dr. Y. Hattori (1961) [14]).
9
 Amylase từ vi khuẩn
Amylase có thể được thu nhận từ nhiều loài vi khuẩn khác nhau.
Collins BS, Kelly CT cùng cộng sự (1993) [12] phân lập chủng
Thermomonospora curvata NCIB 10081, Chung Yc và Kobayashi T (1995)
[13] cũng tìm được chủng T. profundus DT 5432 đều có khả năng sinh α-
amylase ngoại bào cao.
1.2.4. Sản xuất chế phẩm amylase từ vi sinh vật [1]
1.2.4.1. Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống
Chọn chủng thích hợp là bước đầu tiên khi muốn sản xuất enzym từ vi
sinh vật. Sau khi sàng lọc từ hàng trăm chủng và loài vi sinh vật khác nhau,
chủng có hiệu suất sinh enzym cao, không lây bệnh, không sinh độc tố, thể
hiện khả năng ổn định sinh học cao sẽ được lựa chọn.

Người ta có thể tiến hành phân lập từ môi trường tự nhiên hoặc có thể
dùng các tác nhân gây đột biến tác động lên bộ máy di truyền hoặc làm thay
đổi đặc tính di truyền của vi sinh vật tạo thành các dạng biến chủng có khả
năng tổng hợp đặc biệt cao một loại enzyme nào đó. Bằng nhiều phương pháp
khác nhau hiện nay trên thế giới người ta đã tạo và đưa vào sản xuất hàng loạt
biến chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp enzyme cao hơn hẳn chủng gốc
ban đầu như: phương pháp gây đột biến, biến nạp, tiếp hợp gen, tải nạp
Khi sử dụng vi sinh vật để sản xuất enzyme cần chọn giống thuần khiết,
đã được kiểm tra đầy đủ về đặc tính sinh hóa và cần đặc biệt lưu ý đến điều
kiện bảo quản giống. Sỡ dĩ phải bảo quản giống vì trong quá trình giữ giống
có thể giống sẽ bị thoái hóa do bị biến dị ngẫu nhiên hoặc do giống vẫn tiếp
tục phát triển nên môi trường nuôi cấy tích tụ các sản phẩm trao đổi chất có
thể có ảnh hưởng không tốt đến những đặc tính của giống. Một số phương
pháp bảo quản giống thông thường là: phương pháp cấy truyền, phương pháp
làm khô, phương pháp đông khô, phương pháp làm lạnh đông trong nitơ lỏng.
1.2.4.2. Lựa chọn môi trường nuôi vấy vi sinh vật tổng hợp amylase
Thành phần môi trường thích hợp cho một chủng vi sinh vật sinh
amylase trước hết phải đáp ứng sự tăng tưởng của chủng đó. Tuy nhiên,
10
không phải lúc nào sự phát triển tốt của vi sinh vật cũng đảm bảo hiệu suất
sinh enzyme tốt. Thông thường, hiệu suất sinh enzyme tốt nhất trong môi
trường mà vi sinh vật phát triển một cách vừa phải.
Thành phần môi trường bao gồm:
- Nguồn cacbon (tinh bột, glucose, rỉ đường, siro ngô, cám mỳ ),
- Nguồn nitơ (protein thủy phân, gelatin, casein, các nuối amoni ),
- Các chất kích thích sinh trưởng (cao nấm, nước chiết ngô )
- Và muối khoáng.
Nguồn cacbon thường là carbonhydrat. Tùy vào chủng vi sinh vật mà
các nguồn carbonhydrat khác nhau có khả năng kích thích hoặc ức chế quá
trình sinh tổng hợp amylase.

Nguồn nitơ có thể là các hợp chất vô cơ hoặc hữu cơ. Nguồn nitơ hữu
cơ cũng có thể là các nguyên liệu giàu protein như cao ngô, bột đậu tương,
khô đậu, khô lạc Ngoài ra một số acid amin, các bazơ nitơ cũng được bổ
sung vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật.
Ngoài nguồn cacbon và nitơ, các nguyên tố khoáng cũng ảnh hưởng rõ
rệt đến đến quá trình sinh tổng hợp enzyme. Các nguyên tố này bao gồm
nguyên tố vi lượng (Fe, Cu, Zn, Co ) và nguyên tố đa lượng. Chúng thường
có trong nước hoặc trong thành phần hữu cơ khác của môi trường nên không
cần bổ sung hoặc chỉ bổ sung ở dạng vết.
1.2.4.3. Phương pháp nuôi cấy thu nhận enzym từ vinh vật
Để thu được enzyme có hai phương pháp nuôi cấy vi sinh vật khác
nhau về nguyên tắc. Phương pháp bề mặt và phương pháp nuôi bề sâu hay
còn gọi là phương pháp chìm, trong môi trường chìm có thể có phương pháp
nuôi chìm hai bước:
+ Nuôi cấy trên bề mặt ( môi trường cám gạo)
+ Nuôi cấy chìm (môi trường dung dịch lỏng )
+ Nuôi cấy chìm hai bước
11
 Phương pháp nuôi bề mặt
Trong phương pháp nuôi bề mặt vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi
trường dinh dưỡng ở thể rắn đã được làm ẩm và vô trùng. Các chất dinh
dưỡng này thường là các nguyên liệu tự nhiên như cám, các chất thải bỏ của
công nghệ thực phẩm hoặc hỗn hợp của nhiều chất. Trong môi trường dinh
dưỡng người ta thường cho thêm các chất cảm ứng cần thiết cho sự sinh tổng
hợp enzyme nào đó hoặc một số chất dinh dưỡng bổ sung nguồn nitơ,
photpho như nước chiết ngô, khoai tây, dịch tự phân nấm men Để đảm bảo
độ xốp của môi trường cần có các chất làm xốp như trấu với tỷ lệ 10 - 20%.
Trước khi gieo cấy vi sinh vật, môi trường cần được thanh trùng để đảm bảo
không bị nhiễm vi sinh vật lạ trong khi nuôi.
Phương pháp nuôi bề mặt thường thích hợp để nuôi các loại nấm mốc

vì khả năng phát triển nhanh, mạnh nên ít bị tạp nhiễm.
 Phương pháp nuôi chìm
Trong phương pháp nuôi chìm vi sinh vật phát triển trong môi trường
lỏng có sục khí và khuấy đảo liên tục, nguồn cacbon thường dùng trong
phương pháp này là tinh bột, các chất thải bỏ có đường như rỉ đường và các
vật liệu khác. Còn nguồn nitơ người ta hay dùng các nguồn nitơ hữu cơ như
cao ngô, dịch men bia thủy phân, khô lạc Ngoài ra trong thành phần môi
trường cũng cần được bổ sung thêm các chất khoáng. Môi trường nuôi cấy
chìm cần được thanh trùng sau đó làm nguội rồi mới nhân giống. Phương
pháp nuôi cấy chìm được sử dụng phổ biến trong sản xuất men bánh mì,
protein đơn bào từ nấm men, các enzyme, các acid amin
 Phương pháp nuôi chìm hai bước
Theo phương pháp này các tế bào vi sinh vật được nuôi trong thiết bị
để phát triển tối đa, sau đó được chuyển tới thiết bị lên men sinh tổng hợp
enzyme, trong đó thành phần môi trường khác với điều kiện phát triển của vi
sinh vật. Phương pháp này có nhiều thuận lợi trong việc kiểm tra và tạo điều
kiện tốt cho các pha riêng biệt đó là pha sinh trưởng (trophophase) và pha chế
tạo enzyme (idiophase), vì vậy hiệu suất cao.
12
1.2.4.4. Nguyên tắc tách và tinh chế enzyme
Các chế phẩm enzym được sử dụng trong công nghiệp dưới nhiều dạng
khác nhau:
- Canh trường nuôi cấy vi sinh vật trong đó có enzyme được sử dụng
trực tiếp dưới dạng thô. Không cần tách tạp chất nếu các tạp chất đó không
gây hại đáng kể đến sản phẩm và kỹ thuật sản xuất.
- Trường hợp cần sử dụng enzyme tinh khiết, người ta sẽ tinh chế các
chế phẩm enzyme thô với nhiều mức độ khác nhau tùy theo yêu cầu sử dụng.
Enzyme dễ dàng bị giảm hoạt tính dưới tác dụng của nhiều tác nhân.
Do đó, để tránh làm biến tính protein trong quá trình tinh chế enzyme, cần
tiến hành nhanh trong điều kiện nhiệt độ thấp, thời gian ngắn và môi trường

có pH thích hợp.
Không có quy trình chung nào để chiết xuất và tinh chế nhiều loại
enzyme khác nhau. Tuy nhiên, quá trình tách và tinh chế enzyme thường tuân
theo các bước sau:
- Phá vỡ tế bào và chiết enzyme bằng các dung môi thích hợp đối với
enzyme nội bào hoặc ly tâm tách sinh khối đối với enzym ngoại bào.
- Dịch enzyme thu được có thể chứa nhiều loại enzyme, protein không
hoạt động và các tạp chất. Vì vậy, để thu được một loại enzyme nào đó ở
dạng tinh khiết có thể tiến hành theo nhiều phương pháp như sau:
+ Tách enzym nhờ kết tủa bằng dung môi hữu cơ như aceton, rượu
etylic hoặc các dung dịch muối trung tính như (NH
4
)
2
SO
4
, NaCl.
+ Sắc ký lọc gel hoặc trao đổi ion: kết quả của phương pháp này là các
protein khác nhau sẽ được tách ra khỏi cột theo từng phần chiết khác nhau,
trong đó phần chiết chứa enzyme cần thu có nồng độ cao nhất.
Sau khi làm sạch cần sấy khô enzyme để bảo quản lâu dài. Phương
pháp sấy thường được dùng để sấy enzyme là sấy thăng hoa hoặc sấy chân
không. Các chế phẩm thương mại có thể ở dạng dung dịch bổ sung thêm chất
bảo quản, chất này thường là NaCl.
13
1.2.5. Ứng dụng của amylase
1.2.5.1.Trong sản xuất rượu
Đối với công nghiệp rượu cồn, các enzyme đường hóa có một vai trò
quan trọng. Chế phẩm enzyme dùng trong sản xuất rượu thường ở dạng thô,
không cần thiết phải tinh chế.

Nguồn enzyme thường là Aspergillus oryzae, Aspergillus usami,
Aspergillus awamori.
Aspergillus awamori tạo được nhiều glucoamilase hoạt động nhưng lại
có lượng amylase kém hơn Aspergillus oryzae 3 - 4 lần. Nhờ có glucoamylase
hoạt động cao mà lượng chế phẩm từ Aspergillus awamori cần thiết để dùng
đường hóa giảm bớt đi 2 – 2.5 lần. Thường, người ta dùng hỗn hợp 4 phần
canh trường bề mặt của Aspergillus awamori và 1 phần canh trường bề mặt
của Aspergillus oryzae để bổ sung lẫn nhau.
Để đường hóa tinh bột có trong nguyên liệu, lượng chế phẩm enzyme
phải chiếm khoảng 6 – 6.5% lượng tinh bột.
Ở các nhà máy rượu Việt Nam thường dùng chế phẩm enzyme từ
Aspergillus usami vì trong chúng thường chứa nhiều glucoamylase hoạt động.
Trong sản xuất rượu, vai trò của glucoamylase rất quan trọng, vì
glucoamylase có thể đường hóa tinh bột đến cùng.
Hiện nay các chế phẩm amylase của nấm mốc đã thay thế hoàn toàn
malt trong công nghiệp rượu.
1.2.5.2. Trong sản xuất bia
Trong công nghiệp bia, do ngoài yêu cầu đường hóa sản phẩm còn cần
nhiều yêu cầu khác nữa như vị của dịch lên men, khả năng tạo bọt, giữ bọt, do
đó sự đường hóa chỉ cần tiến hành đến mức vừa phải.
Trước đây, người ta dùng malt làm nguyên liệu hạt chủ yếu. Hiện nay,
người ta đã thay từ 20 - 50% malt bằng các nguyên liệu không phải malt như
đại mạch chưa nảy mầm hoặc tinh bột ngô đã khử chất béo và dùng các chế
phẩm amylase của vi sinh vật, có trường hợp người ta đã thay thế tới 80 -
90% malt bằng các nguyên liệu không phải malt.
14
Để đạt được mục đích này, người ta dùng chế phẩm Aspergillus oryzae.
Khi dùng 50% nguyên liệu phi malt thì phải cho khoảng 1% canh trường
Aspergillus oryzae khô và một ít acid lactic để tạo pH cần thiết cho enzyme
hoạt động.

Việc sử dụng các chế phẩm amylase vi sinh vật thay cho malt trong sản
xuất bia có nhiều ưu điểm như:
+ Tiết kiệm nguyên liệu hạt cao cấp để sản xuất malt, rút ngắn thời gian
sản xuất, giảm diện tích sản xuất.
+ Giảm chi phí về năng lượng và lao động.
+ Tăng hiệu suất do mức độ thủy phân tinh bột sâu sắc hơn.
1.2.5.3. Trong công nghiệp sản xuất glucose và mật tinh bột
Chúng ta đều biết từ tinh bột có thể thu được các phẩm vật đường khác nhau.
Khi thủy phân tinh bột bằng acid cũng như bằng enzyme của malt sẽ
thu được mật glucose hay mật maltose. Mật thu được bằng phương pháp
enzyme (mật maltose) thường chứa nhiều dextrin. Mật maltose thường được
dùng trong sản xuất bánh kẹo và trong sản xuất sản phẩm ăn kiêng cho trẻ con
và người bệnh.
Trong sản xuất glucose và mật tinh bột, amylase được ứng dụng rộng
rãi và chiếm vị trí quan trọng. Với chế phẩm amylase từ vi sinh vật, ngoài mật
maltose, người ta còn có thể thu được glucose tinh khiết.
Việc sử dụng amylase để thủy phân tinh bột trong sản xuất các loại mật
và đường glucose có những ưu điểm cao hơn hẳn phương pháp thủy phân bằng
acid vì enzyme có tính đặc hiệu cao có thể cho sản phẩm thuần khiết. Hơn nữa,
quá trình sản xuất lại đơn giản, dễ điều khiển và cho hiệu suất cao hơn.
Hiện nay, ở nhiều nước (Nhật, Mỹ, Canda) người ta đã sử dụng các chế
phẩm glucoamylase để sản xuất đường glucose và đã giải quyết được hàng
chục vạn tấn glucose hàng năm.
Các chế phẩm enzyme glucoamylase dùng để sản xuất glucose không
cần chứa enzyme glucosiltransferase (là enzyme thường có mặt với
glucoamylase trong canh trường) vì các enzyme này sẽ gây nên sự tạo thành
15
các oligosaccharid có liên kết 4 - 6 làm giảm hiệu suất đường glucose và làm
cho sản phẩm có vị đắng, do đó cần chọn các chủng vi sinh vật tổng hợp
mạnh glucoamylase nhưng lại không tổng hợp glucosiltransferase. Người ta

cũng có thể làm vô hoạt glucosiltransferase có trong các chế phẩm
glucoamylase chịu acid bằng cách acid hóa.
Những nấm mốc chứa nhiều glucoamylase là Aspergillus awamori, Rhizopus.
Ngoài ra, amylase còn được dùng trong công nghiệp bánh mỳ [17] và
công nghiệp giấy [11].
1.3. Tổng quan nấm mốc và đặc tính amylase của nấm mốc
1.3.1. Đặc điểm hình thái và sinh sản của nấm mốc [2]
Nấm mốc là tên chung chỉ các loài nấm hiển vi có cấu tạo sợi, chúng thuộc
loại thực vật hạ đẳng có bào tử, không có diệp lục, không có khả năng tổng hợp
chất hữu cơ từ khí cacbonic mà sử dụng chất hữu cơ có sẵn để sinh sống.
Nấm mốc chỉ mọc tốt trong môi trường có nhiều không khí. Vì vậy,
chúng thường phát triển trên bề mặt của cơ chất dưới dạng lún phún hình sợi,
lớp màng nhện hay khối sợi bông.
Nhiều nấm có giá trị lớn trong công nghiệp, chúng được sử dùng trong
việc sản xuất axit hữu cơ, men, chất kháng sinh, vitamin thực phẩm. Trái lại,
nhiều loại nấm cũng gây nhiều thiệt hại trong việc bảo quản thực phẩm và
hàng công nghiệp khác.
 Cấu tạo của nấm
- Đa số nấm có hình sợi phân nhánh, đan kết lại với nhau thành một khối
sợi, từng sợi riêng lẻ gọi là sợi nấm và cả toàn bộ các sợi gọi là hệ sợi nấm.
- Có hai loại sợi nấm: Sợi nấm có màng ngăn ngang và sợi nấm không
có màng ngăn ngang, trong trường hợp sau toàn bộ hệ sợi nấm chỉ là một tế
bào phân nhánh phức tạp.
Sợi nấm có màng ngăn Sợi nấm không có màng ngăn
16
- Một số sợi nấm sinh trưởng bằng cách đâm sâu vào cơ chất và hút các
chất dinh dưỡng từ trong đó (khuẩn ty cơ chất), trong khi đó một phần hệ sợi
nấm phát triển trên bề mặt của cơ chất (khuẩn ty ký sinh). Ở nhiều loài, các
sợi của hệ sợi nấm nằm bên ngoài cơ chất là cơ quan sinh sản. Ở một số nấm
khác sợi nấm đan kết lại dày đặc với nhau tạo thành quả thể.

- Cấu tạo tế bào nấm không khác với cấu tạo tế bào của các vi sinh vật
khác. Màng tế bào cấu tạo bởi cellulose hay các chất gần giống với cellulose,
ở nhiều loại nấm trong màng tế bào có chứa chitin. Trong tế bào chất có
không bào và các chất khác. Các chất dự trữ thường gặp ở nấm là glicogen,
hạt volutin và các giọt mỡ. Tế bào nấm có 1, 2 hoặc nhiều hạch (nhân). Ở
nấm hiện tượng nhiều hạch là rất phổ biến.

Hình 1.2: Khuẩn lạc của Aspergillus awamori và Mucor miehei
 Sinh sản của nấm mốc
Một số đặc điểm nổi bật của nấm là có nhiều hình thức sinh sản và
nhiều loại cơ quan sinh sản. Nấm sinh sản chủ yếu bằng bào tử, bào tử mọc ra
sợi nấm và sau đó là hệ sợi nấm. Mặc dù vậy, bất cứ một đoạn sợi nấm hoặc
một mảnh nào của hệ sợi nấm cũng có thể dùng để sinh sản được. Các đoạn
này khi rơi trên môi trường dinh dưỡng thì phát triển và tạo thành một hệ sợi
nấm mới. (Hình 1.3)
17
Hình 1.3: Hình dạng bào tử của một số chủng nấm mốc
1.3.2. Khả năng sinh tổng hợp amylase ngoại bào
Đa số các chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp amylase ngoại
bào, điển hình là:
+ Aspergillus oryzae: là mốc có màu vàng, bào tử hở, được sử dụng
rộng rãi trong sản xuất tương và nước chấm. Đặc điểm của nó là có hệ
enzyme amylase và protease.
18
+ Aspergillus awamori: là mốc màu xám đen giàu hệ enzyme amylase
và được ứng dụng rộng rãi trong công nhgiệp sản xuất rượu.
+ Aspergillus usamii: là mốc màu xám trắng, rất giàu enzyme amylase.
Hiện nay được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất rượu.
Ngoài ra, vẫn còn có một số chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp
amylase ngoại bào cao như: Aspergillus niger, Mucor rouxii [8].

Cho đến nay đã có nhiều nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp enzyme
amylase từ nấm mốc. H. Pedersen và J. Nielsen (1999) [16] đã nghiên cứu
“Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến việc sản xuất a amylase của Aspergillus
oryzae trong điều kiện nuôi dưỡng liên tục”, Febe Francisvà cộng sự (2002)
[15] “Sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng để đánh giá thông số trong quy
trình sản xuất α-amylase bởi Aspergillus oryzae”. Trong khi đó Morten
Carlsenvà cộng sự (1996) [21] đã ngiên cứu “Sự phát triển và sản xuất α-
amylase từ Aspergillus oryzae trong quá trình lên men liên tục ”.
1.3.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi vi sinh vật đến quá trình sinh tổng
hợp amylase của nấm mốc [9]
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng lên quá trình sinh tổng hợp amylase ngoại
bào của nấm mốc như độ ẩm môi trường, thời gian, không khí, nhiệt độ, pH
 Ảnh hưởng của độ ẩm(w) môi trường
Tốt nhất cho sự hình thành enzym của nấm mốc Asp.oryzae là 58 -
60%. Độ ẩm môi trường thích hợp cho sự hình thành bào tử là khoảng 45%
nên cần giữ cho độ ẩm môi trường không bị giảm trong quá trình phát triển.
Điều này thật sự cần thiết phải giữ ẩm cho môi trường ở mức độ tối thích.
Cần thông khí liên tục trong suốt thời kỳ sinh trưởng của nấm mốc và còn phụ
thuộc vào kích thước, chiều dày của lớp môi trường nuôi.
 Ảnh hưởng độ ẩm tương đối của không khí
Độ ẩm cho phép từ 80% trở lên đến mức bão hoà tức là 100%W đều
thích hợp cho nấm mốc phát triển. Trong phòng nuôi cần giữ cho độ ẩm
không khí bão hoà để tránh cho môi trường khỏi bị khô.
19
 Ảnh hưởng của không khí
Trong quá trình sinh trưởng của mình vi sinh vật tiêu thụ 25 - 35% chất
dinh dưỡng của môi trường và thải ra một lượng lớn nhiệt sinh lý và CO
2
. Vì
vậy, cần phải tải nhiệt này bằng thông gió với thông khí vô trùng có độ ẩm

tương đối khoảng 100%. Chế độ thông khí có thể liên tục, gián đoạn tùy thuộc
vào chiều dày môi trường nuôi.
 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình sản xuất amylase là liên quan
đến sự phát triển của vi sinh vật. Với nấm mốc, hầu hết những nghiên cứu sản
xuất amylase cho thấy nhiệt độ nằm trong vùng giới hạn từ 25 - 37
0
C. Lượng
amylase tối thích là đạt được ở 30 - 37
0
C đối với Aspergillus oryzae [27] [20].
Ảnh hưởng của thời gian nuôi nấm mốc
Thời gian nuôi để có lượng amylase cực lớn thường được xác định
bằng thực nghiệm. Tùy thuộc vào tính chất sinh lý của chủng sinh vật và sự
ngừng tổng hợp enzyme mà có thể làm ngừng sinh trưởng của nấm mốc vào
bất kỳ lúc nào cần thiết. Sự tạo bào tử là hiện tượng không mong muốn vì
thường làm giảm hoạt lực của enzyme. Hầu hết các chủng nấm mốc
Aspergillus oryzae có hoạt động cực đại của amylase ở khoảng giờ thứ 24 -
36.
Ảnh hưởng của pH
pH thích hợp cho nấm mốc là môi trường acid yếu khoảng 5.5 - 6.5.
Các môi trường tự nhiên từ cám, ngô thường có sẵn pH ở khoảng này nên
không cần điều chỉnh. Đôi khi khả năng sinh bào tử của nấm mốc bị yếu hoặc
mất hẳn. Để khôi phục khả năng này có thể nuôi nấm mốc trong ánh sáng
khuếch tán trong một vài thế hệ.
1.3.4. Đặc tính amylase của nấm mốc [9]
α-amylase của nấm mốc hầu như chỉ tấn công những hạt tinh bột bị
thương tổn. Sản phẩm cuối cùng của sự thủy phân amylase là glucose và
maltose.
20

α-amylase của nấm mốc không tấn công liên kết α-1,6 glucoside của
amylopectin, nên khi thủy phân nó sẽ tạo thành các dextrin tới hạn phân nhánh.
Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường
không giống nhau. pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ nấm mốc là
4.0 - 4.8 (có thể hoạt động tốt trong vùng pH từ 4.5 - 5.8).
Amylase của nấm mốc khá bền với acid so với amylase từ các nguồn
khác. α-amylase của Aspergillus oryzae bền vững đối với acid tốt hơn là α-
amylase của malt và vi khuẩn Bac.subtilis. Ở pH 3.6 và 0
0
C, α-amylase của
malt bị vô hoạt hoàn toàn sau 15 - 30 phút, α-amylase vi khuẩn bị bất hoạt
đến 50%, trong khi đó hoạt lực của α-amylase của nấm sợi hình như không
giảm nhiều. Trong dung dịch, α-amylase nấm sợi bảo quản tốt ở pH 5.0 - 5.5,
α-amylase dextrin hóa của nấm sợi đen có thể chịu được pH 2.5 -2.8.Ở 0
o
C và
pH 2.5, nó chỉ bị bất hoạt hoàn toàn sau 1 giờ.
Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α-amylase từ các nguồn
khác nhau cũng không đồng nhất, α-amylase của nấm sợi rất nhạy cảm đối
với tác động nhiệt. Nhiệt độ tối thích của amylase nấm mốc thường là 50
0
C và
bị vô hoạt ở 70
0
C .
21
PHẦN 2
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Mẫu cơm sau khi ủ bánh men được lấy theo từng giai đoạn ở các cơ sở

sản xuất ở tỉnh Thừa Thiên Huế:
Giai đoạn 1: cơm sau khi ủ bánh men 1 ngày
Giai đoạn 2: cơm sau khi ủ bánh men 2 ngày
Giai đoạn 3: cơm sau khi ủ bánh men 3 ngày
2.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu
2.2.1. Hóa chất
- Hóa chất vô cơ: HCl, KCl, NaNO
3
, MgSO
4
.7H
2
O, Na
2
HPO
4
,
NaH
2
PO
4
.
- Hóa chất hữu cơ: Tinh bột hòa tan, glycerol, focmol, saccharose.
2.2.2. Thiết bị nghiên cứu
- Máy ly tâm lạnh Centrifuge 5417 – Nhật.
- Bể điều nhiệt kèm máy lắc Grant – Nhật.
- Tủ ấm Incubator MiR.262 – Nhật.
- Tủ lạnh Sanyo medicool – Nhật.
- Máy so màu Biowate – Nhật.
- Tủ cấy Labgard – Nhật.

- Máy đo pH Hanna – Ý.
- Cân phân tích của hang Sartorius – Đức.
- Pipetman: Germany.
22
2.3. Nội dung phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp phân tích hóa sinh
2.3.1.1. Phương pháp xác định hoạt độ amylase
- Xác định hoạt độ amylase theo phương pháp tạo màu với dung dịch Iod [25].
• Nguyên tắc :
Dùng tinh bột làm cơ chất. Xác định hoạt độ phân giải tinh bột của
enzyme trên cơ sở định lượng tinh bột còn sót lại trong phản ứng màu với
thuốc thử Iod bằng cách xác định độ hấp thụ ánh sáng (OD) được đo trên máy
quang phổ, bước sóng 660nm.
• Cách tiến hành :
Thực hiện song song 2 mẫu: 1 mẫu phản ứng (PƯ) và 1 mẫu kiểm tra (KT).
Mẫu phản ứng:

23
Tạo màu với 100µl dung dịch Iod 0.02N
100µl dịch enzyme
Ủ ổn nhiệt (50
0
C, 10 phút)
Trộn với 100µl tinh bột 2% (50
0
C)
Phản ứng (t
0
: 50
0

C, 10 phút)
Ngưng phản ứng bởi 2ml HCl 0.01M
Đo OD
PƯ
ở bước sóng 660nm
Mẫu kiểm tra:
• Định nghĩa hoạt độ :
Một đơn vị hoạt độ amylase được định nghĩa là lượng enzyme có tác dụng
làm giảm 1% màu xanh (được biểu thị bởi mật độ quang) của dung dịch tinh
bột 2% ở 50
0
C, trong 10 phút.
• Tính kết quả :
Trong đó:
OD
KT
: Mật độ quang của mẫu KT
OD
PƯ
: Mật độ quang của mẫu PƯ
10: thời gian phản ứng (phút)
2.3.1.2. Xác định khả năng sinh tổng hợp Enzyme ngoại bào (Amylase)
bằng phương pháp đục lỗ đĩa thạch
• Nguyên tắc:
Enzyme khuyếch tán từ lỗ đục vào thạch làm thủy phân cơ chất là tinh
bột, tạo vòng thủy phân không bắt màu với thuốc nhuộm Lugol.
24
100µl dịch enzyme
Ủ ổn nhiệt (50
0

C, 10 phút)
Bất hoạt enzyme bởi 2ml HCl 0.01M
Enzyme đã bất hoạt 100µl dung dịch tinh bột 2%
Tạo màu với 100µl dung dịch Iod 0.02N
Đo OD
KT
ở bước sóng 660nm
• Tiến hành:
Đổ 18ml dung dịch có chứa 0.2% tinh bột và 2% agar. Đục lỗ sau khi
thạch đông và cho vào đó 0.1 ml dung dịch enzyme, giữ ở 50
0
C. Sau 2 - 3 giờ
đem nhuộm với Lugol rồi quan sát đường kính phần môi trường trong suốt ở
chỗ enzyme tác dụng [3].
2.3.2. Phương pháp vi sinh vật [2]
2.3.2.1. Phân lập một số chủng nấm mốc
Quá trình phân lập giống được tiến hành theo sơ đồ sau:
Nguyên liệu đem phân lập là mẫu rượu được lấy ở từng giai đoạn sau
khi ử bánh men tại các cơ sở sản xuất hộ gia đình, mẫu vật được hòa loãng
bằng nước muối sinh lý vô trùng, lắc đều. Lấy 20µl dịch nước muối có chứa
vi sinh vật dàn đều trên môi trường Czapek (NaNO
3
0.35%, KH
2
PO
4
0.15%,
MgSO
4
.7H

2
O 0.05%, KCl 0.05%, FeSO
4
0.01%, saccaroza 3%, agar 2%). Sau
khi nuôi ở 35
0
C trong 24 đến 48 giờ, trên đĩa thạch đã xuất hiện các khuẩn lạc
vi sinh vật khác nhau. Tiến hành quan sát các khuẩn lạc này và dùng que cấy
lấy cẩn thận từng khuẩn lạc khác nhau cấy sang đĩa thạch khác. Tiến hành
phân lập nhiều lần để tách riêng từng khuẩn lạc.
2.3.2.2. Xác định hình thái, cấu tạo khuẩn lạc, tế bào của nấm mốc
Sử dụng phương pháp nuôi cấy nấm ở trên phiến kính để xác định hình
thái, cấu tạo khuẩn lạc, tế bào của nấm mốc.
• Chuẩn bị :
- Phiến kính dùng để nuôi cấy nấm phải thật trong, sạch.
25
Nguồn phân lập
Xử lý mẫu
Pha loãng
Môi trường phân lập
Nuôi trong tủ ấm
Khảo sát các đặc
điểm khuẩn lạc
Tuyển chọn và thu nhận các
chủng VSV làm đối tượng
nghiên cứu