Tiểu luận Các bước tạo GMO, GMF

Thực phẩm biến đổi gen

Đề tài 4: Các bước tạo GMO, GMF
Sinh viên thực hiện
(Nhóm 4)

Hà Thị Ngọc Anh
Nguyễn Thị Vân Cúc
Hồ Thị Lan
Lê Thị Uyên Phương
Hoàng Thị Huyền Trinh
Lê Thị Vân

GV hướng dẫn

PGS.TS Khuất Hữu Thanh


CÁC BƯỚC CƠ BẢN


1. Chuẩn bị gen mục tiêu
Gen mục tiêu có thể là:
– DNA lấy từ vi sinh vật (gen kháng sâu từ vi
khuẩn BT);
– RNAm lấy từ thực vật, động vật (gen chịu
hạn từ cỏ ba lá)…

Các bước tiến hành:

1. Chuẩn bị gen mục tiêu
Các
Tách chiết
bước
Mục đích Lấy đoạn gen mục tiêu ra
khỏi tế bào sinh vật (tách
lấy DNA, RNA)
Nguyên
tắc

- Phương pháp vật lý (đồng
hóa, đun nóng, ly tâm, siêu
âm…)
- Phương pháp hóa học
(phá vỡ màng tế bào)
Cách tiến Sử dụng các phương pháp
hành
tách chiết khác nhau, phụ
thuộc vào:
- Loại gen (DNA tổng? DNA
plasmid? RNA…)
- Sinh vật (vi khuẩn? Sinh
vật bậc cao?)

Tinh sạch
Loại bỏ các thành phần
khác để có DNA hoặc
RNAm tinh khiết

Tách dòng

Cắt lấy đoạn gen mục tiêu,
tạo dòng tế bào mang gen
đích mới  lưu trữ
- Dùng hỗn hợp hóa chất, Sử dụng enzym cắt đặc
tách lớp, gạn lấy phần có hiệugắn vào vector tách
gen mục tiêu.
dòng phù hợp. Có sự khác
- Rửa và ly tâm lấy kết tủa eukaryote và prokaryote
(DNA, RNA)
- cắt đoạn gen
- Rửa bằng cồn tuyệt
đối lạnh và dung dịch - gắn vào vector tách dòng
muối
phù hợp
- Ly tâm ở tốc độ cao để - Chuyển vào tế bào khả
DNA và RNA lắng
biến
xuống đáy, gạn nước
- Tạo dòng mang gen đích
thu kết tủa
mới  lưu trữ


1. Chuẩn bị gen mục tiêu
 Cấu trúc vector tách dòng:
-

Phân tử DNA mạch kép, dạng vòng

-

Kích thước nhỏ dễ vào tế bào

-

Có các điểm cắt đặc hiệu của RE

-

Cho phép cài các đoạn DNA lạ

-

Có trình tự tái bản ori

-

Có gen chỉ thị (kháng sinh, màu)

 Tiến hành tách dòng gen mục tiêu:
prokaryote

eukaryote
Vi khuẩn
Thực vật, động vật
Chỉ cần tách đoạn gen mục tiêu từ DNA Có thể phải lấy RNA
Chỉ cần sao chép đoạn gen mục tiêu, cắt Cần phải cắt bỏ intron sau đó thực hiện
nhờ các enzyme
phiên mã ngược

2. Tạo vector tái tổ hợp
- Vector là các đoạn DNA có kích thước nhỏ cho phép cài (gắn)
các đoạn DNA cần thiết, có khả năng tái bản không phụ thuộc
vào sự phân chia của tế bào, tồn tại độc lập trong tế bào chủ
qua nhiều thế hệ mà không gây biến đổi hệ gen của tế bào chủ.
- Vetor tái tổ hợp là vector được tạo thành khi gắn gene cần
chuyển vào vector biểu hiện sẵn có bởi các loại enzyme cắt, nối.
- Vector chuyển gene: Là phân tử ADN có khả năng mang được
gen cần thiết, thường có dạng vòng và có một số đặc tính:
• Có điểm khởi đầu sao chép (origin of replication) để tự sao chép mà tồn tại độc lập
trong tế bào.
• Có các đoạn trình tự nhận biết cho enzyme giới hạn để tạo nơi lắp ráp cho các đoạn
gen lạ.
• Có trình tự khởi điểm (promoter).
• Có dấu chuẩn chọn lọc cho phép dễ dàng phát hiện nhận biết chúng trong tế bào
chủ nhận


 Một số plasmid


 Enzyme cắt giới hạn:
Dựa vào khả năng nhận biết và cắt, chia làm 3 nhóm:
+ Nhóm 1: Enzym nhận biết vị trí đặc hiệu, cắt phân tử DNA ở cách
vị trí nhận biết khoảng 1000 bp
+ Nhóm 2: Enzym nhận biết vị trí đặc hiệu, cắt phân tử DNA tại vị trí
nhận biết
+ Nhóm 3: Enzym nhận biết vị trí đặc hiệu, cắt phân tử DNA ở cách

vị trí nhận biết khoảng 20 bp
 Chỉ có các RE nhóm 2 được thương mại hóa, sử dụng trong kỹ thuật
gen

 Enzyme ghép nối
– Sử dụng enzyme có tên là ligase: tạo liên kết este giữa đầu 5’P
và đầu 3’OH
– Có thể ghép nối đầu 2 đầu bằng hoặc đầu lệch
– Uphổ biến là enzyme T4 DNA ligase: từ thực khuẩn thể T4.
– Thường có sản phẩm thương mạ i
– Điều kiện cho phản ứng ghép nối: nhiệt độ phòng (25oC), thời
gian ngắn (5 -10 phút), hoặc nhiệt độ thấp 4oC, thời gian dài
(qua đêm)


Sự hình thành vector tái tổ hợp

Gen gắn vào
giữa
promotor và
terminator
nhờ đoạn
tương đồng


3. Thực hiện chuyển gen
Chuyển gen là tập hợp nhiều kỹ thuật
khác nhau nhằm gắn một gen mới
(một đoạn DNA) vào bộ gen của một
tế bào hoặc một cá thể sinh vật

4. Sàng lọc tế bào chuyển gen
Nguyên
tắc

Ưu
Nhược
điểm

Dựa vào chỉ thị kháng sinh
Dựa vào gen chỉ thị màu
- Gen kháng chất kháng
- Gen chỉ thị (Reporter
sinh có trong vecto tái
genes) là các gen có trách
tổ hợp, MT dinh dưỡng
nhiệm thông báo là gen
bổ sung các chất kháng
cần biến nạp đã gắn vào
sinh tương ứng để nuôi
hệ gen của sinh vật và bắt
cấy tế bào
đầu hoạt động hay chưa.
- tế bào chứa vecto tái tổ - Gen chỉ thị thường dùng:
hợp tồn tại và phát
ß-galactosidase,
triển được; tế bào
luciferase, Alkaline
không có vecto tái tổ

Phosphatase, GUS, NPT,
hợp không phát triển
CAT, GFP, FRET,…
được.
đơn giản, dễ sử dụng
Độ chính xác ở mức độ
tương đối

phương pháp lai phân tử
- Tiến hành phản ứng lai
phân tử:
Nuôi cấy  để khuẩn lạc in
dấu trên màng lai  lai
phân tử giữa màng lai với
mẫu dò đánh dấu phóng
xạ (mẫu dò có trình tự
tương ứng với đoạn đặc
hiệu gen tái tổ hợp)  rửa
để loại bỏ các mẫu không
được lai)
- thực hiện phóng xạ tự
ghi để lấy kết quả
đơn giản, dễ sử dụng
độ chính xác cao
Độ chính xác ở mức độ tương kỹ thuật tương đối phức
đối
tạp, tốn kém và đòi hỏi
các thiết bị chuyên dụng

Chọn lọc các tế bào đã được chuyển gen bằng chỉ thị kháng sinh

Sàng lọc gen biến nạp ở
Ngô
Ví dụ: Sàng lọc gen biến nạp ở Ngô


Chọn lọc các tế bào đã được chuyển gen bằng gen chỉ thị


5. Kiểm tra hoạt tính gen mới
Phương pháp phát hiện
DNA
PCR
Giải trình tự gen

Phương pháp
phát hiện
protein

Chọn lọc cá
thể mang
gen chuyển

Chạy PCR với cặp
mồi đặc hiệu cho
gen đã đưa vào.
Phát hiện sản phẩm
PCR bằng điện di.

Giải trình tự khu
vực mang đoạn
chèn xem có thay
đổi về cấu trúc,
trình tự gen không.

Gen đưa vào sẽ tạo
protein mới, cần xác
định sự có mặt của
protein mới và hàm
lượng của nó

Nuôi cấy trong môi
trường chọn lọc về
tính trạng đưa vào
thể chuyển gen

Nếu có sản phẩm
PCR đúng kích
thước  có đoạn
gen đã đưa vào
Không có sản phẩm
PCR  không có
đoạn gen đưa vào
hoặc bị biến đổi

Trình tự gen giải ra
ở thể chuyển gen
phải giống với trình
tự gen mục tiêu

đưa vào.

Định tính và định
lượng protein đó để
xác định hoạt tính
gen mới của thể
chuyển gen.

Chọn các cá thể có
biểu hiện đặc tính
cao nhất để tiếp
tục lai và tạo thành
sản phẩm thương
mại


6. Thử nghiệm, đánh giá an toàn
a) Thử nghiệm:
• Là quá trình theo dõi,đánh giá ảnh hưởng của sinh vật biến đổi
gen với môi trường và đa dạng sinh học của Việt Nam.
• Khi phát hiện sinh vật biến đổi gen gây rủi ro, và không kiểm soát
được cần dừng khảo nghiệm và tiêu hủy.
• Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn công nhận hoặc thu hồi
quyết định công nhận cơ sở khảo nghiệm và giấy phép khảo
nghiệm. Điều kiện công nhận: đủ cơ sở vật chất, có đủ cán bộ
chuyên môn, quy trình đảm bảo.

b) Đánh giá an toàn
• Sinh vật biến đổi gen được cấp chứng nhận an toàn sinh học khi:
kết quả khảo nghiệm đạt yêu cầu và Hội đồng an toàn sinh học

kết luận là an toàn đối với môi trường và đa dạng sinh học
• Bộ Tài nguyên và Môi trường cấp, thu hồi Giấy chứng nhận an
toàn sinh học.


7. Sản xuất, dán nhãn, lưu thông
 Tổ chức, cá nhân sản xuất, kinh doanh sinh vật biến đổi gen,
sản phẩm của sinh vật biến đổi gen sử dụng làm thực phẩm
phải tuân thủ các điều kiện sau đây:
- Sinh vật biến đổi gen hoặc sản phẩm của sinh vật biến đổi gen
•
•

được cấp Giấy xác nhận đủ điều kiện sử dụng làm thực phẩm;

•

trừ trường hợp quy định tại Điều 29 của Nghị định 69/2010/NĐ-CP

có tên trong Danh mục sinh vật biến đổi gen được cấp Giấy xác nhận đủ
điều kiện sử dụng làm thực phẩm;

- Tuân thủ các quy định của pháp luật về sản xuất, kinh doanh thực
phẩm
 Xin cấp Giấy xác nhận sinh vật biến đổi gen đủ điều kiện sử
dụng làm thực phẩm
 Dãn nhãn theo quy định đối với thực phẩm biến đổi gen
Thể hiện các thông tin liên quan đến sinh vật biến đổi gen trên nhãn hàng hóa

Hướng dẫn ghi nhãn đối với thực phẩm biến đổi gen bao gói sẵn
Cách thức ghi nhãn
-

-

Miễn ghi nhãn bắt buộc đối với
một số thực phẩm

Ghi bằng tiếng Việt cụm từ “biến đổi gen” bên cạnh tên
của thành phần nguyên liệu
biến đổi gen kèm theo hàm
lượng trên nhãn sản phẩm.
Đối với những sản phẩm có
diện tích để ghi nhãn nhỏ hơn
10cm2 thì trên nhãn bắt buộc
phải có tên hàng hóa và cụm từ
“biến đổi gen”; những nội dung
bắt buộc còn lại không thể hiện
trên nhãn thì phải được ghi
trong tài liệu kèm theo hàng hóa.

Khắc phục, sửa chữa nhãn

Thực phẩm mang theo người nhập cảnh để tiêu dùng cá
nhân trong định mức được
miễn thuế nhập khẩu; thực phẩm trong túi ngoại giao, túi
lãnh sự; thực phẩm tạm nhập
tái xuất, thực phẩm quá cảnh,
chuyển khẩu; thực phẩm gửi

kho ngoại quan; thực phẩm là
mẫu thử nghiệm hoặc nghiên cứu; là mẫu trưng bày hội chợ,
triển lãm;
Nguyên liệu, phụ gia thực
phẩm, chất hỗ trợ chế biến
thực phẩm, bao bì chứa đựng
thực phẩm, nhập khẩu về để
sản xuất nội bộ không bán ra
thị trường, chỉ vận chuyển nội
bộ giữa các kho từ tỉnh này qua
tỉnh khác thuộc cùng một hệ
thống trong doanh nghiệp.

Tổ chức, cá nhân sản xuất, kinh
doanh, nhập khẩu phải tự thực
hiện việc khắc phục, sửa chữa.
Bổ sung cụm từ “biến đổi gen”
theo quy định tại Thông tư liên
tịch này nhưng không được che
lấp những thông tin bắt buộc
theo quy định của pháp luật về
ghi nhãn thực phẩm.
Việc khắc phục, sửa chữa nội
dung không phù hợp, ghi thiếu
trên nhãn thực phẩm phải bảo
đảm không phục hồi lại được
như trước


GIỐNG NGÔ BIẾN ĐỔI GEN GA21

KHÁNG THUỐC TRỪ CỎ

Mô tả sơ bộ quy trình


Thông tin gen chuyển
• Trình tự chuỗi axit amin của protein mEPSPS giống đến 99,3%
so với protein EPSPS là enzyme quan trọng trong con đường
axit shikimic và enzyme này được tìm thấy trong tự nhiên ở
tất cả thực vật, nấm, vi khuẩn.
• So sánh trình tự chuỗi axit amin của protein mEPSPS với trình
tự của các protein độc tố trong ngân hàng dữ liệu thông tin
cho thấy mEPSPS không tương đồng với bất kỳ độc tố đã biết
nào.


Cấu trúc gen chuyển


Primer and probe


Vector sử dụng



Các thành phần trong vùng backbone của
vecto

Kích thước và chức năng của mỗi vùng trong
đoạn T-DNA