Nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh trưởng, sinh lý, hóa sinh và khả năng tích lũy asen của cây thuốc lá chuyển gen arsc trong môi trường nuôi cấy invitro

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI
KHOA SINH HỌC
----------------

HÀ THỊ NGỌC ANH

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH TRƯỞNG,
SINH LÝ – HÓA SINH VÀ KHẢ NĂNG TÍCH LŨY ASEN
(As)
CỦA CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN NUÔI CẤY IN VITRO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

HÀ NỘI - 2017

1


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI
KHOA SINH HỌC
----------------

HÀ THỊ NGỌC ANH

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH TRƯỞNG,
SINH LÝ – HÓA SINH VÀ KHẢ NĂNG TÍCH LŨY ASEN
(As)
CỦA CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN NUÔI CẤY IN VITRO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Chuyên ngành

: Sinh học thực nghiệm

Hướng dẫn khoa học : TS. Lê Thị Bích Thủy
TS. Lê Thị Thủy

HÀ NỘI – 2017


LỜI CẢM ƠN
Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến TS. Lê Thị
Bích Thủy – Phòng Di truyền tế bào thực vật – Viện Công nghệ Sinh học và cô giáoTS. Lê Thị Thủy, Khoa Sinh học, Trường ĐH Sư phạm Hà Nội đã hướng dẫn và tận
tình chỉ bảo, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu vừa qua.
Em xin gửi lời cảm ơn tới ThS. Hồ Thị Hương và tập thể cán bộ phòng Di
truyền tế bào thực vật – Viện Công nghệ Sinh học đã giúp đỡ em nhiệt tình và tạo mọi
điều kiện tốt nhất trong quá trình em học tập tại đây.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô Bộ môn Sinh lý học thực vật và Ứng
dụng, cùng các thầy cô Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội đã dạy bảo
và giúp đỡ em trong thời gian học tập và nghiên cứu tại trường.
Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đinh, người thân và bạn bè đã luôn động viên và
giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn.

Hà Nội, ngày 29 tháng 4 năm 2017
Sinh viên
Hà Thị Ngọc Anh


MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
As
DNA
KLN

Asen
Deoxyribonucleic acid
Kim loại nặng

PCR

Phản ứng khuếch đại gen


DANH MỤC BẢNG


DANH MỤC HÌNH


PHẦN I: MỞ ĐẦU
1.1.

Lý do chọn đề tài
Môi trường bị ô nhiễm do các hoạt động khai khoáng và tuyển quặng đã được
nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu. Trong đó kim loại nặng KLN là chất gây
ô nhiễm hàng đầu vì chúng không dễ dàng bị vi sinh vật (VSV) phân giải. Một số
KLN là các nguyên tố vi lượng không thể thiếu cho sự sinh trưởng và phát triển của
sinh vật như Fe, Zn, Cu, Mn, Mo, As, Cd,… tuy nhiên với nồng độ cao, đây lại là
những chất rất độc đối với cơ thể sinh vật và con người. Đặc biệt hàm lượng As trong

đất và nước ngầm đang ở mức đáng lo ngại ở nhiều vùng khai thác khoáng sản trên thế
giới và Việt Nam.
Tùy thuộc vào đặc điểm tính chất của từng loại đất mà lựa chọn phương pháp xử
lý KLN phù hợp như: cơ học, vật lý, hóa học, sinh học... Trong đó xử lý đất chứa KLN
bằng biện pháp sinh học đang trở thành một hướng đi đầy triển vọng do giá thành thấp,
vận hành đơn giản và thân thiện với môi trường,…. Việc phát hiện ra một số loại cây
có khả năng hấp thụ, tích lũy và chuyển hóa các KLN đặc biệt là As đã mở ra khả năng
sử dụng thực vật để cải tạo ô nhiễm môi trường. Các nhà khoa học đã tìm ra trên 450
loài thực vật có khả năng hấp thụ cao kim loại nặng như cỏ mần trầu (Eleusine indica
L), cỏ Vetiver (Vetiveria zizanioides L) và dương xỉ (Pteris vittata L), cải xanh
(Brassica juncea), nghé nước (Polygonum hydropiper),… Trong đó dương xỉ được chú
ý bởi khả năng chống chịu và tích lũy đồng thời nhiều KLN và khả năng hấp thu, tích
lũy As cao. Nhiều nhà khoa học đã chứng minh được loài dương xỉ (Pteris vittata) là
loài siêu tích lũy As.
Ở Việt Nam đã tìm ra loài dương xỉ (Microsorum pteropus) có khả năng sinh
trưởng tốt trong vùng đất mỏ bị ô nhiễm As ở Thái Nguyên. Gen arcC tách được từ
loài này đã được so sánh với gen arsC tách được từ loài dương xỉ (Arabidopsis) đột
biến (đã được chứng minh có khả năng tích lũy As). Đánh giá phân tử cho thấy sản
phẩm của 2 gen này có thành phần amino acid giống nhau 100%.
Việc nghiên cứu phát triển một số loài thực vật hấp thụ kim loại nặng phải đáp
ứng được yêu cầu là giống dễ trồng, có khả năng vận chuyển KLN từ đất lên nhanh,
chịu được nồng độ ô nhiễm cao, phát triển nhanh. Nhưng trong thực tế, cây tích lũy
KLN thường phát triển chậm, những loài phát triển nhanh lại mẫn cảm với hàm
8


lượng KLN cao. Một vấn đề khác là nếu dùng cây xuất xứ nơi khác với các cây nơi
cải tạo đất sẽ làm ảnh hưởng đến đa dạng sinh học của các cây địa phương. Vì vậy,
cách tốt nhất là tạo các cây địa phương có khả năng cải tạo đất.
Đề tài Nafosted (cơ quan chủ trì: Viện Công nghệ Sinh học) là đề tài đầu tiên sử

dụng thuốc lá làm cây mô hình nghiên cứu sự chuyển gen liên quan đến khả năng tích
luỹ kim loại nặng, cụ thể là gen arsC liên quan đến việc hấp thu và tích lũy As. Đề tài
đã thực hiện xong các nội dung: tách thành công gen arsC từ cây dương xỉ
(Microsorum pteropus) có khả năng tích lũy As cao đang sinh trưởng ở vùng đất mỏ bị
ô nhiễm và đã chuyển gen arsC vào cây thuốc lá K326.
Để tiếp tục hướng nghiên cứu trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu một
số chỉ tiêu sinh trưởng, sinh lý - hóa sinh và khả năng tích lũy asen (As) của các
dòng thuốc lá chuyển gen arsC ở giai đoạn in vitro” nhằm đánh giá một số chỉ tiêu
sinh trưởng sinh lý-hóa sinh của cây thuốc lá chuyển gen arsC nuôi cấy in vitro, phục
vụ cho các nội dung nghiên cứu tiếp theo trên con đường sử dụng thực vật chuyển gen
xử lý đất ô nhiễm As.
1.2.
-

Mục đích nghiên cứu
Tìm ra các dòng thuốc lá chuyển gen có chứa gen arsC.
Đánh giá một số chỉ tiêu sinh trưởng, sinh lý-hóa sinh của các dòng thuốc lá chuyển
gen nuôi cấy in vitro.

1.3.

Nội dung nghiên cứu

-

Kiểm tra sự có mặt của gen arsC trong cây thuốc lá chuyển gen.
Đánh giá một số chỉ tiêu sinh trưởng của cây thuốc lá chuyển gen trong môi trường

-

nuôi cấy in vitro có bổ sung As.
Đánh giá một số chỉ tiêu sinh lý-hóa sinh của cây thuốc lá chuyển gen trong môi
trường nuôi cấy in vitro có bổ sung As.

1.4.

Tổng quan tài liệu

1.4.1. Sơ lược về nguyên tố asen và ảnh hưởng của asen tới sức khỏe con người
1.4.1.1.

Sơ lược về nguyên tố asen
Asen (còn gọi là thạch tín, có ký hiệu hóa học là As) là một nguyên tố hóa
học có số nguyên tử 33. As lần đầu tiên được Albertus Magnus (Đức) đề cập đến vào
năm 1250. Khối lượng nguyên tử của nó bằng 74,92. As là một á kim gây ngộ độc và
có nhiều dạng thù hình: màu vàng (phân tử phi kim) và một vài dạng màu đen và xám
9


(á kim). Ba dạng có tính kim loại của As với cấu trúc tinh thể khác nhau cũng được tìm
thấy trong tự nhiên (khoáng vật asen sensu stricto và hiếm hơn là asenolamprit và
parasenolamprit), nhưng nói chung nó hay tồn tại dưới dạng các hợp chất asenua và
asenat. As và các hợp chất của nó được sử dụng như là thuốc trừ dịch hại, thuốc trừ
cỏ, thuốc trừ sâu và trong một loạt các hợp kim. Tính chất hóa học của As rất giống
với nguyên tố đứng trên nó là phốtpho. Sự tương tự lớn đến mức As sẽ thay thế phần
nào cho phốtpho trong các phản ứng hóa sinh học và vì thế nó gây ra ngộ độc. Tuy
nhiên, ở các liều thấp hơn mức gây ngộ độc thì các hợp chất As hòa tan lại đóng vai trò
của các chất kích thích trong một số loại thuốc chữa bệnh cho con người vào giữa thế
kỷ 18.

Hình 1.1.Mẫu As trong ống nghiệm
Nguồn: />
As đã được biết đến và sử dụng tại Ba Tư từ thời cổ đại. Do triệu chứng ngộ độc
As không rõ ràng nên nó thường được sử dụng làm chất giết người cho đến khi phát
hiện ra thử nghiệm Marsh, một thử nghiệm rất nhạy để phát hiện ra sự tồn tại của nó.
Trong thời kì đồ đồng, As được sử dụng trong các hợp kim, làm cho đồng trở nên cứng
hơn. Albertus Magnus (1193-1280) được coi là người đầu tiên cô lập được As nguyên
tố vào năm 1250. Năm 1649, Johann Schoder công bố 2 cách điều chế As. Các dạng
As vô cơ và hợp chất của nó khi đi vào chuỗi thức ăn, được trao đổi tích cực thành
dạng ít độc hơn thông qua quá trình metyl hóa [4].
As là nguyên tố đặc biệt cần thiết khi ở hàm lượng rất thấp và là chất độc cực
mạnh khi ở hàm lượng đủ lớn. Hàm lượng As trong đất, nước, …cao có thể do các quá
trình tự nhiên và do hoạt động của con người đặc biệt là quá trình khai thác khoáng
sản. As có nhiều trong mỏ khoáng suphit, vì vậy nó có thể phát tán vào không khí hay

10


nguồn nước từ các lò luyện kim. Than đá cũng chứa một lượng lớn đáng kể As, quá
trình đốt than đã phát tán tới hơn 20% lượng chất này vào khí quyển.
Khi ở trạng thái rắn As là chất bột màu trắng. As tan trong nước tạo thành dung
dịch không màu, không mùi, không vị ngay cả khi hàm lượng As trong dung dịch cao
nên phát hiện nó bằng trực giác rất khó.
As (và một số hợp chất của As) thăng hoa khi bị nung nóng ở áp suất tiêu chuẩn,
chuyển hóa trực tiếp thành dạng khí mà không chuyển qua trạng thái lỏng. Đó là lý do
vì sao nhiệt độ sôi của As lại thấp hơn nhiệt độ nóng chảy. Nhiệt độ sôi của As là
887oC, trong khi nhiệt độ nóng chảy là 817oC.
1.4.1.2.

Ảnh hưởng của asen tới sức khỏe con người

Sự nhiễm độc asen được gọi là arsenicosis. Đó là một tai họa đối với sức khỏe
con người. As có thể gây 19 loại bệnh khác nhau như: sừng hóa da, hắc tố da và mất
sắc tố da, bệnh Bowen, bệnh đen và rụng móng chân, bệnh về tim mạch, tiểu đường và
thiếu máu,….. ảnh hưởng đến sinh sản và miễn dịch. Trong nước ngầm ở điều kiện
thiếu O2, As được giải phóng ra từ trầm tích của lớp đất gần bề mặt và tồn tại ở 2 dạng
chủ yếu là asenit (As3+) và asenate (As5+). Ngoài việc nhiễm độc cấp tính, As còn gây
độc mãn tính do tích lũy trong gan với các mức độ khác nhau. Liều gây tử vong là 0,1g
(tính theo As2O3) [2].
Các hợp chất As vô cơ được xếp vào nhóm A các chất gây ung thư ở người và
ung thư da, phổi, gan, phá hủy hệ thống thần kinh. Nếu bị nhiễm độc As dù với lượng
rất nhỏ nhưng tích tụ trong thời gian dài, sau 5-10 năm sẽ gây các triệu chứng: mệt
mỏi, hồng cầu và bạch cầu giảm, mạch máu bị tổn thương, rụng tóc, giảm trí nhớ, sừng
hóa da. Nguồn nước bị ô nhiễm As dù với một lượng nhỏ cũng ảnh hưởng đến sức
khỏe các bà mẹ mang thai, làm động thai, ảnh hưởng đến thai nhi, gây bệnh phổi ác
tính, ảnh hưởn xấu đến sự phát triển thể chất và trí tuệ của thai nhi. Hiện tại trên thế
giới chưa có phương pháp hữu hiệu chưa bệnh nhiễm độc As.
Đối với thực vật, As gây ảnh hưởng như một chất ngăn cản quá trình trao đổi
chất, làm giảm năng suất cây trồng.
Tổ chức y tế thế giới đã hạ thấp nồng độ giới hạn cho phép của As trong nước
uống trực tiếp xuống 10 µg/l. Cơ quan bảo vệ môi trường Hoa Kỳ (USEPA) và cộng
đồng châu Âu cũng đã đề xuất hướng tới tiêu chuẩn As trong nước cấp uống trực tiếp
11


là 2-20 µg/l, ở Đức là 10 µg/l.
As xâm nhập vào cơ thể người chủ yếu qua đường thức ăn và nước uống, ngoài
ra còn một lượng nhỏ trong không khí ở vùng ô nhiễm và do tiếp xúc nhiều với không
khí hay nguồn nước ô nhiễm. Vào trong cơ thể người As tích tụ chủ yếu ở gan, thận,
hồng cầu, và đặc biệt tập trung ở não, các mô da, móng tay, tóc, răng, xương, phổi và
các bộ phận giàu biểu mô như niêm mạc gây nhiễm độc cấp tính.

Cơ chế gây độc của As là tấn công vào các nhóm sulfuahydryl của enzyme làm
cản trở hoạt động của các enzyme, gây đông tụ các protein do chúng tấn công vào liên
kết có nhóm sunfua và phá hủy quá trình photphat hóa tạo ra ATP [7].
Hàm lượng As trong cơ thể người khoảng 0,008-0,2 ppm, tổng lượng As có
trong người bình thường khoảng 1,4 mg. Trong nhóm dân cư khu vực nông thôn trung
bình là 0,4 - 1,7 ppm, khu vực thành phố công nghiệp 0,4 - 2,1 ppm còn khu vực ô
nhiễm nặng là 0,6 - 4,9 ppm [11].
Ở động vật có vú, tế bào có cơ chế giảm độc As nhờ sự metyl hóa arsenate. Quá
trình này có sự tham gia tích cực của các chất nhường gốc metyl.
As (V)

2GSH
GSSG

As (III)
Methyltransferase

S-adenosylhomocystein
CH3As (V)
2GSH
GSSG
CH3As(III)

SAM
Methyltransferase
S-adenosylhomocystein
Hình 1.2. Sự methyl hóa asenate bởi tế bào
động vật có vú
(CH3)2As(V)
Nguồn: />

1.4.2. Thực trạng ô nhiễm asen trong và ngoài nước
1.4.2.1.

Trên thế giới
Hoạt động khai thác khoáng sản đã phát triển mạnh từ thập kỷ trước ở nhiều quốc
gia giàu tài nguyên như Nga Mỹ, Campuchia, Indonesia,… nhằm đáp ứng nhu cầu
ngày càng gia tăng nguyên liệu khoáng của thế giới. Đây là một trong những nguyên
12


nhân gây suy thoái tài nguyên đất, tài nguyên rừng, tài nguyên nước,… Tổ chức bảo vệ
môi trường Green Blacksmith của Mỹ đã công bố kết quả nghiên cứu và đưa ra 10
nguyên nhân ô nhiễm môi trường gây tác động nghiêm trọng nhất trên thế giới, trong
đó có 2 nguyên nhân gây suy thoái đất là khai thác vàng thủ công và khai khoáng công
nghiệp. Khó khăn lớn nhất của 2 hoạt động này là xử lý chất thải dưới dạng đất đá và
bùn. Các chất thải này thường chứa các kim loại nặng, gây hại cho ruộng đồng và
nguồn nước ngầm. Ở Mỹ, hiện có trên 43.000 vùng công nghiệp trọng điểm đang
trong tình trạng ô nhiễm, trong đó trên 40% là ô nhiễm KLN như: chì (Pb), cadimi
(Cd), crôm (Cr), asen (As). Theo số liệu của tổ chức y tế thế giới về ô nhiễm As trong
nguồn nước, nồng độ As trong khu vực nam Iowa và tây Missouri của Mỹ dao động từ
0,034 - 0,49 mg/l. Mexico từ 0,008 – 0,624 mg/l, có tới 50% số mẫu có nồng độ As >
0,05 mg/l. Mỗi năm ngân sách nước Mỹ phải tốn 1,5 tỷ USD cho việc xử lý và ngăn
chặn ô nhiễm.Trong năm 2005, ước tính lượng nước thải của Trung Quốc lên tới 31 tỷ
tấn, KLN lên tới 15 triệu tấn, khoảng 20% đất nông nghiệp của Trung Quốc bị nhiễm
KLN làm mất 10 triệu tấn hoa màu mỗi năm. Viện Hàn lâm khoa học Trung Quốc, đã
phát hiện đất ở nhiều khu vực có chứa As ở mức cao.
Các nhà khoa học đã tìm ra trên 450 loài thực vật có khả năng hấp thụ cao kim
loại đã được công bố như cỏ mần trầu (Eleusine indica L.), cỏ Vetiver (Vetiveria
zizanioides L.) và dương xỉ (Pteris vittata L.), cải xanh (Brassica juncea), nghé nước
(Polygonum hydropiper),…Một số nước trên thế giới cũng sử dụng cỏ Vetiver nhằm

mục đích chống xói mòn, cải tạo thảm thực vật và đặc biệt là khả năng xử lý ô nhiễm
KLN trong đất ở các vùng mỏ và hạ du [5].
1.4.2.2.

Ở Việt Nam
Theo tác giả Đỗ Văn Ái và cộng sự, ở Việt Nam có 3 vùng ô nhiễm As là: vùng
núi với các biến đổi đá nhiệt dịch, quặng vàng, đá kim, sunfua và vỏ phong hóa cũng
như đất phát triển trên chúng; vùng đồng bằng với nguồn ô nhiễm As tự nhiên (oxi hóa
khoáng vật sunfua và khoáng vật chứa As trong trầm tích, khử các hydroxit sắt chứa
As) và hoạt động của con người; đới duyên hải (trầm tích ven bờ một số vùng ở Quảng
Ngãi, Phú Yên) ô nhiễm do sử dụng thuốc trừ sâu, diệt cỏ và vũ khí hóa học của con
người [1]. Kết quả phân tích đất trồng ở khu vực mỏ thiếc Sơn Dương, Tuyên quang

13


có hàm lượng As là 642 mg/kg trong khi tiêu chuẩn đặt ra là 12 mg/kg (QCVN
03:2008/BTNMT) [2].
Bảng 1.1. Quy chuẩn quốc gia về giới hạn cho phép của As trong đất
trong một số loại đất
Đơn vị tính: mg/kg đất khô
Thông số

Đất nông

Đất lâm

Đất dân

Đất thương

Đất công

nghiệp

nghiệp

sinh

mại

nghiệp

15

20

15

25

20

Asen (As)

Nguồn: QCVN 03 : 2008/BTNMT, Quyết định số /2008/QĐ-BTNMT

Trong hơn năm (2003-2005), chính phủ Việt Nam và Quỹ Nhi đồng Liên Hợp
Quốc (UNICEF) đã tiến hành khảo sát nồng độ As trong nước của hơn 71.000 giếng
khoan thuộc 17 tỉnh đồng bằng miền Bắc, Trung, Nam. Kết quả phân tích cho thấy

nguồn nước giếng khoan ở các tỉnh lưu vực sông Hồng như: Hà Nam, Nam Định, Hà
Tây, Hưng Yên, và các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long như An Giang, Đồng Tháp đều
bị nhiễm As rất cao. Tỉ lệ các giếng có nồng độ As từ 0,1 mg/l đến > 0,5 mg/l (cao hơn
mức tiêu chuẩn cho phép của Việt Nam và tổ chức Y tế thế giới 10-50 lần) của các xã
dao động từ 59.6-80%. Ở Hà Nội 40% giếng khoan có hàm lượng As lớn hơn mức an
toàn nhiều lần [9].
Bảng 1.2. Giá trị cho phép của nồng độ các chất ô nhiễm trong nguồn nước
Đơn vị tính: mg/l
Tiêu chuẩn chất lượng nước
Thông số
Asen (As)

mặt
Giới hạn A
Giới hạn B
0,05
0,1

Tiêu chuẩn nước
ngầm
0,05

Đơn vị
mg/l

Nguồn: TCVN 5942-1995; TCVN 5944-1995

1.4.3. Các phương pháp xử lý asen trong đất và nước
1.4.3.1. Phương pháp truyền thống
Việc xử lý đất chứa KLN nói chung và As nói riêng là hết sức phức tạp và

thường không triệt để. Có nhiều phương pháp xử lý đất như: cơ học, vật lý, hóa học,
sinh học… Tùy thuộc và đặc điểm tính chất của từng loại đất mà chọn phương pháp
cho phù hợp như: rửa đất, bê tông hóa, đào đất bị ô nhiễm chuyển đến nơi chôn lấp
14


thích hợp, kết tủa hóa học, oxy hóa khử, phản hấp phụ ở nhiệt độ thấp, xử lý nhiệt, trao
đổi ion, bốc hơi, cố định các chất ô nhiễm…
Đối với nước nhiễm As, biện pháp xử lý phổ biến là công nghệ xử lý bằng dàn
mưa, bể lắng hoặc bể lọc. Xử lý giàn mưa làm tăng quá trình oxy hóa sẽ làm giảm
lượng As có trong nước. Tuy biện pháp này chỉ có thể làm giảm một lượng nhỏ As,
không có tác dụng xử lý As nhưng đây là khâu rất quan trong quá tình xử lý nước
nhiễm As. Biện pháp bể lắng sử dụng ánh sáng mặt trời và oxy để lắng và loại bỏ As ra
khỏi nước nhưng hiệu quả rất thấp.
Muốn xử lý As một cách hiệu quả cần có những vật liệu xử lý có thành phần
mangan chiếm 40 - 50%. Tuy nhiên các loại vật liệu này rất đắt như Filox, BRIL nhập
khẩu từ USA hoặc vật liệu tổng hợp với thành phần quặng mangan rất cao.
Nhìn chung, các phương pháp truyền thống trên có hiệu quả xử lý không cao và
chi phí đầu tư lớn. Đất và nước sau xử lý vẫn còn một lượng KLN nhất định và có thể
ảnh hưởng đến môi trường. Hơn nữa những phương pháp này còn kém hiệu quả khi
nồng độ kim loại trong đất và nước thấp và mức độ phân tán của kim loại lớn.
Trong đó, hầu hết các phương pháp hóa học hay vật lý đều rất tốn kém về kinh
phí, bị giới hạn về kỹ thuật và hạn chế về diện tích và hiệu quả không cao.
1.4.3.2. Phương pháp sinh học
Trong quá trình nghiên cứu kĩ thuật xử lý ô nhiễm bằng thực vật, các nhà khoa
học đã khám phá ra rất nhiều loài thực vật có khả năng hút As từ đất. Ví dụ, cỏ
Agrostis capillaris, cỏ Agrostis tenerrima Trin, dương xỉ Pteris vittata và cây gỗ nhỏ
Sarcosphaera coronaria có khả năng tích lũy As tương ứng là 100, 1000, 27000 và
7000 mg/kg sinh khối khô [1] [3] [5] [6] [8]. Hiện nay người ta cũng đã tìm thấy rất
nhiều loài VSV có khả năng tích lũy một lượng lớn KLN trong tế bào của chúng ví dụ

như: Vi khuẩn Bacillus CH34 được sử dụng để xử lý chất ô nhiễm Cd, Zn, Pb. Do đó,
xử lý đất và nước chứa KLN bằng biện pháp sinh học đang trở thành một hướng đi
đầy triển vọng. Một số biện pháp xử lý KLN nhờ thực vật đang được áp dụng như:
Xử lý bằng vùng rễ: như cỏ có rễ sợi (cỏ đuôi trâu), cây sản xuất ra các hợp chất
phenol (dâu tằm, táo), thực vật thủy sinh. Các loài này tiết ra các chất để kích thích các
vi sinh vật vùng rễ như nấm men, nấm, vi khuẩn phát triển và phân giải các chất ô
nhiễm qua quá trình trao đổi chất của chúng.
15


Cố định các chất ô nhiễm: các loài có rễ sợi, ưa nước ngầm hấp thụ hay hấp phụ
các chất ô nhiễm vào rễ làm giảm khả năng di động của chúng trong môi trường.
Chiết suất bằng thực vật: là quá trình sử dụng thực vật để hấp thụ các KLN ở đất
vào trong rễ và vận chuyển chúng lên các bộ phận khác của cây. Tại đó, KLN được
tích lũy và có thể được thu hồi lại sau khi xử lý sinh khối.
Công nghệ lọc bằng rễ : Quá trình này dựa trên khả năng hút và giữ các chất ô
nhiễm bởi hệ rễ của các thực vật thủy sinh để xử lý nước thải có chứa KLN, chất
phóng xạ, hợp chất hữu cơ kị nước và chất nổ.
Không giống như các phương pháp truyền thống, các phương pháp sinh học không
tạo ra các chất thải hóa học giàu As khó xử lý. Thay vào đó, chất nhựa được tách ra từ cây
dương xỉ có khoảng ¾ là asen, có thể chiết suất và sử dụng trong công nghiệp.

1.4.4. Tình hình nghiên cứu xử lý ô nhiễm asen trong và ngoài nước
1.4.4.1.

Trên thế giới
Trong những năm gần đây, Trung quốc đã tiến hành một dự án thử nghiệm trồng
cây để thu gom As độc hại trong đất. Theo Chen Toongbin thuộc viện Khoa học địa lý
và tài nguyên thì dự án trên được thực hiện tại 3 tỉnh Hồ Nam, Triết Giang, Quảng
Đông. Mỗi địa điểm thử nghiệm có diện tích 1ha với 30 tấn hạt Pteris vittata. Các nhà

khoa học Trung Quốc đã dần hoàn thiện kỹ thuật trồng cây dương xỉ, mở ra hy vọng
giải quyết cơ bản vấn đề ô nhiễm KLN ở vùng hạ du [18]. Một số loài có khả năng hấp
thu KLN như cỏ vetiver cũng đã được sử dụng rất thành công trong phục hồi và cải tạo
đất ở vùng đất mỏ như: mỏ than, vàng, boxit ở Australia, mỏ vàng, kim cương ở Nam
Phi, mỏ chì ở Thái Lan, mỏ đồng ở Chi Lê,…
Mark Elless cùng các cộng sự đã phân tích và thử nghiệm công dụng của loại
dương xỉ Pteris vittata bằng cách đo đạc thời gian và lượng As mà chúng hút được.
Kết quả là sau 24 giờ, loại cây này đã làm giảm được tới 200 µg As trong mỗi lít nước.
Một số nghiên cứu về gen liên quan đến việc hấp thu KLN cũng đã được công bố
như: Hàn quốc, các nhà khoa học đã thành công trong việc chuyển rất nhiều gen có
khả năng hấp thụ KLN tập trung vào một dòng cây Dương (Poplar) có khả năng sinh
trưởng nhanh, sinh khối lớn. Dòng Dương này không có hoa và hiện đang trong quá
trình thử nghiệm trong nhà kính và trên đồng ruộng [16].
16


Đã có một số gen liên quan đến việc hấp thu As được tìm ra. Trong đó có gen
arsC, mã hóa cho enzyme arsenate reductase tham gia vào chuyển hóa As ở dạng
arsenate thành arsenit đã được tách từ dòng Arabidopsis đột biến. Việc chuyển gen arsC
với gen khởi động rubisco từ đậu tương (SRS1p) và gen γ-ECS với gen khởi động actin
của nấm men (ACT2p) vào Arabidopsis đã tạo được cây chuyển gen kháng As hơn cây
đối chứng [18]. Một gen khác mã hóa cho enzyme arsenate reductase là PvGRX5 đã
tách được từ cây dương xỉ Trung Quốc Pteris vittata, chuyển vào hai dòng Arabidopsis.
So sánh cho thấy các dòng Arabidopsis chuyển gen có khả năng chống chịu As cao hơn
đáng kể so với với dòng đối chứng trong môi trường thử nghiệm [12] [13] [14].
Từ những công trình nêu trên cho thấy, nghiên cứu sử dụng thực vật cho cải tạo
môi trường đang là hướng đi được nhiều nhà khoa học quan tâm. Công nghệ xử lý môi
trường nhờ thực vật này được gọi là phytoremediation. Cho đến nay, Phytoremediation
đã phát triển thành một hướng cải tạo môi trường hiệu quả, an toàn và tiết kiệm. Tuy
nhiên, những công trình đã nghiên cứu mới sử dụng các gen có nguồn gốc từ vi khuẩn

và mới bước đầu sử dụng gen từ thực vật để đưa vào một số cây mô hình như
Arabidopsis, cải dầu…..
1.4.4.2.

Ở Việt Nam
Ở Việt Nam vấn đề nghiên cứu về ô nhiễm KLN cũng đã được chú ý đến trong
những năm gần đây. Viện Công nghệ môi trường - Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam,
và một số cơ sở nghiên cứu của các trường đại học như Khoa Môi trường, Đại học
Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, Viện Tài nguyên môi trường, Đại học
Quốc gia TP Hồ Chí Minh đã bước đầu điều tra và nghiên cứu xử lý ô nhiễm KLN.
Các nghiên cứu tập trung vào thống kê mức độ ô nhiễm KLN và khả năng hấp thu
KLN ở một số cây như dương xỉ, bèo tây, ngổ, cỏ Vetiver …
Nghiên cứu của Bùi Cách Tuyến và cộng sự đã chỉ ra: loài cỏ Vetiver hay còn gọi là
cỏ Hương Bài có khả năng hút các kim loại như Cu, Zn, Pb, Cd, As. Sinh trưởng của loại cỏ
này tăng khi trên đất trồng có nồng độ 1055,15 ppm Pb và hàm lượng tích lũy các kim loại
này tỉ lệ thuận với nồng độ các kim loại trong đất và thời gian trồng cỏ [6].
Nghiên cứu của Bùi Thị Kim Anh và cộng sự (2011) cho thấy, loài dương xỉ
Pteris vittata có khả năng chống chịu khá tốt trong đất có hàm lượng As linh động
tương ứng lên tới 1500mg/kg và trong đất thải của quặng có chứa 15.146 ppm As tổng
17


số. Trong khoảng nồng độ mà cây chống chịu được, Pteris vittata tích lũy lượng As từ
307 – 6042 ppm trong thân, 131-3756 ở rễ. Ngoài ra, loài này còn có thể sử dụng cho
xử lý Pb và Zn nếu cùng tồn tại trong đất với hàm lượng thấp [1].
Đề tài Nafosted (cơ quan chủ trì: Viện Công nghệ sinh học) đã thực hiện tách
dòng thành công gen arsC từ cây dương xỉ (Microsorum pteropus). So sánh trình tự
gen arsC nghiên cứu với trình tự gen gốc mang mã số X80057.1 trên Genebank cho
thấy trình tự của của gen này giống đến 99%. So sánh sản phẩm của gen nàyvới sản
phẩm của gen arsC tách được từ loài dương xỉ (Arabidopsis đột biến: đã được chứng

minh có khả năng hấp thu và tích lũy As) cho thấy thành phần amino acid của chúng
giống nhau 100%. Gen này đã được chuyển vào giống thuốc lá K326, thuốc lá được
xem như là cây mô hình để đánh giá hiệu quả của gen arsC.
Trong đề tài này chúng tôi tiếp tục thực hiện giai đoạn sau của đề tài: cây thuốc
lá chuyển gen arsC do Viện Công nghệ sinh học –Viện Hàn lâm và Khoa học Việt
Nam cung cấp nhằm đánh giá mức độ hoạt động của gen arsC. Kết quả của nghiên
cứu sẽ có thể góp phần vào việc ứng dụng thực vật chuyển gen để xử lý ô nhiễm As, từ
đó sẽ tạo điều kiện thuận tiện cho việc ứng dụng quy trình này để tạo các loại cây
chuyển gen, có khả năng tích lũy loại KLN phù hợp với từng vùng bị ô nhiễm cụ thể.

18


PHẦN II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.

Vật liệu, thời gian và địa điểm nghiên cứu

2.1.1. Vật liệu thực vật
Dòng thuốc lá K326-WT làm đối chứng và 24 dòng thuốc lá đã được chuyển gen
arsC tách từ cây dương xỉ (Microsorum pteropus) do Phòng Di truyền tế bào thực vật,
Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cung cấp.

2.1.2. Vật liệu sinh học phân tử
Cặp mồi đặc hiệu (bảng 2.1) để nhân gen arsC (dựa vào trình tự gen arsC phụ lục 1
để thiết kế) do phòng Di truyền Tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học cung cấp.
Bảng 2.1.Trình tự cặp mồi đặc hiệu nhân gen arsC
Tên mồi

Trình tự nucleotide

arsCTACCATGGACTGATATGAGCAAC ATTACC
Ncol/F
arsCTACACGTGTTA TTT CAG GCG CTT ACC
Eco72l/R

%GC

Tm
(oC)

Kích thước
(nucleotide)

31,8

58,5

21

44,4

57,8

18

2.1.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
2.1.3.1.

Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 6 năm 2016 đến tháng 4 năm 2017.

2.1.3.2.

Địa điểm nghiên cứu
Phòng Di truyền tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam
Phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh lý thực vật Ứng dụng, Khoa Sinh học, Trường
Đại học sư phạm Hà Nội.

2.1.3.3.

Bố trí thí nghiệm
Thiết lập 5 công thức nồng độ As là 0, 200, 400, 600, 800 ppm được thực hiện
trên 3 dòng chuyển gen và 1 dòng đối chứng (không chuyển gen).
10 cây (1 dòng)/công thức, mỗi công thức được lặp lại 3 lần và được đặt trong điều
kiện phòng thí nghiệm, với cường độ chiếu sáng và nhiệt độ là 2000 lux, 25oC.

19


2.2.

Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Tách chiết DNA tổng số từ thuốc lá theo phương pháp của Saghai
Maroof[17].
Mẫu được nghiền trong nitơ lỏng, thu lấy bột rồi cho vào ống eppendorf. Thêm
750 μl đệm CTAB đã làm ấm ở 65oC trong 10 phút. Ủ trong bể ổn nhiệt 65 oC trong 30

phút, lắc nhẹ nhàng 5 phút/lần. Sau đó chuyển hỗn hợp ra để ở nhiệt độ phòng trong 5
phút. Thêm 750 μl dung dịch chloroform : Isoamyl alcohol 24 : 1 lắc nhẹ trong 10 phút.
Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút. Tủa DNA bằngisopropanol tỉ lệ 1 : 1, xoay nhẹ
nhàng vài phút rồi giữ ở - 20 oC trong 1giờ. Ly tâm 10.000 vòng/ phút, trong 10 phút,
loại bỏ dịch và thu tủa. Hòa tan tủa trong 0.5 ml TE pH= 8 để ở tủ 4oC qua đêm.
Thêm 15 µl RNase, ủ ở 37oC trong 90 - 120 phút để loại bỏ hoàn toàn Rnase.
Thêm dung dịch Phenol : Chloroform : Isoamyl Alcohol 25 : 24 : 1, lắc nhẹ trong 15
phút, ly tâm 10.000 vòng/phút, 10 phút. Hút dịch sang ống effendorf mới sau đó thêm
Chloroform: Isoamyl alcohol 24 : 1 tỷ lệ 1 : 1, lắc nhẹ trong 15 phút. Ly tâm 10.000
vòng/phút, 10 phút. Hút dịch nổi sang ống eppendorf mới và tủa trong isopropanol tỉ lệ
1 : 1, để hỗn hợp ở -20oC trong 1 giờ. Ly tâm 10.000 vòng/phút , 7 phút. Loại bỏ dịch
nổi phía trên, thu tủa và rửa bằng cồn 70% lạnh. Thổi khô trong 20 phút ở trong box
cấy. Hòa tan tủa bằng TE và giữ trong tủ -20oC. Điện di sản phẩm trên gel agarose 1%.
2.2.2. Phương pháp nhân gen đích bằng kỹ thuật PCR
Phản ứng PCR sử dụng nhân gen arsC được thực hiện với hỗn hợp phản ứng
gồm 1 µl DNA tổng số (25 ng/µl); 13,4 µl H2O; 2,0 µl Buffer 10xPCR; 2,5 µl dNTP (1
mM); 0,5 µl mồi F (50 ng/μl); 0,5 µl mồi R (50 ng/μl); 0,1 µl enzyme Taq polymerase
(5 U/μl). Phản ứng PCR được tiến hành với chu kì nhiệt: 94oC trong 5 phút; 35 chu kỳ
của 94oC 50 giây; 50oC (tùy thuộc Tm của mồi) 50 giây; 72oC 1 phút 30 giây và bước
cuối cùng 72oC trong 5 phút sau đó điện di trên gel agarose 1%.
2.2.3. Phương pháp xác định các chỉ tiêu sinh trưởng
Các chỉ tiêu nghiên cứu được xác định tại thời điểm 6 tuần nuôi cấy, tương ứng
với 6 tuần bổ sung As vào môi trường.
2.2.3.1. Tỉ lệ sống sót
Tỉ lệ sống sót được tính bằng số mẫu sống trên tổng số số mẫu cấy ban đầu.

20


2.2.3.2. Thời gian ra rễ

Thời gian ra rễ được tính từ khi cấy cây vào môi trường đến khi cây bắt đầu ra rễ.
2.3.3.3. Chiều cao cây
Được tính từ bề mặt môi trường nuôi cấy đến chóp lá dài nhất. Chiều cao cây
được đo vào các thời điểm 6 tuần sau khi cấy chuyển cây.
2.3.3.4. Diện tích lá trung bình
Diện tích lá được xác định bằng cách: vẽ lại đường viền của lá cây trên một
mảnh giấy đồng nhất rồi đem cắt ra theo đường viền. Mặt khác, cắt mảnh giấy có kích
thước 100cm2, cân trên cân điện tử được a (g). Đem cân tấm giấy có hình chiếc lá
được b (g). Diện tích lá được tính theo công thức:
Diện tích lá x 100 (cm2)
2.3.4. Các chỉ tiêu sinh lý – hóa sinh
2.3.4.1. Xác định hàm lượng diệp lục trong lá cây
Các mẫu lá lấy cùng vị trí, mỗi công thức lấy 3 mẫu. Cân chính xác 1g lá tươi,
cho vào cối sứ và 1ml acetone 100%, nghiền nhỏ, thêm 5ml acetone tiếp tục nghiền.
Chú ý nghiền trong điều kiện tối hay ánh sáng yếu, diệp lục có thể bị phân hủy bởi ánh
sáng mạnh. Chuyển hỗn hợp vào ống fancol, ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút thu
được dịch chiết, định mức dịch chiết đến 10ml. So màu trên máy quang phổ ở bước
sóng 644nm và 662nm.
Nồng độ diệp lục được tính theo công thức Wettstein, 1957:
Hàm lượng dla: Ca (mg/l) = 0.784E662 – 0.990E644
Hàm lượng dlb: Cb (mg/l) = 21.426E662 – 4.65E644
Hàm lượng dba+b: Ca+b (mg/l) = 5.134E662 + 20.436E644
Hàm lượng diệp lục trong 1g lá tươi được tính theo công thức:
(mg.g chất tươi)
Trong đó: E644, E662 là mật độ quang đo ở bước sóng 644nm và 662nm
Ca, Cb, Ca+b là hàm lượng diệp lục a, b và tổng số
A: Hàm lượng diệp lục trong 1g lá tươi
P: Khối lượng mẫu
C: Nồng độ diệp lục trong dịch chiết
N: Số lần pha loãng

V: Thể tích dịch chiết
1000: Hệ số chuyển ml ra l
2.3.4.4. Xác định hàm lượng đường khử trong lá bằng phương pháp DNS
Pha 1ml đường glucose chuẩn. Tiến hành pha dãy glucose chuẩn theo các mức
nồng độ lần lượt là: 0; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0 (mg/ml). Cân 1g nguyên liệu tươi, nghiền
nhỏ bằng cối sứ trong 2 ml nước cất, tráng lại chày cối và dẫn lên 5 ml. Đem ly tâm
21


5000 vòng/phút trong 5 phút.Lấy 250 μl dung dịch glucose chuẩn ở các mức nồng độ
cho lần lượt vào các ống eppendorf sau đó thêm 250 μl dung dịch thuốc thử DNS, trộn
đều. Tiến hành tương tự với dung dịch mẫu nghiên cứu.Đun cách thủy các ống
eppendorf trong 5 phút. Nạp mẫu và dung dịch đường chuẩn vào bản nhựa 96 giếng
sau đó đo ở bước sóng 540 nm.
Hàm lượng đường khử được tính theo công thức: A =
Trong đó:
A: Hàm lượng đường khử trong lá (mg/g)
X: Mật độ quang của mẫu
n: Hệ số pha loãng của mẫu
V: Thể tích dịch đường gốc (ml)
m: Khối lượng mẫu cân (g)
2.3. 4.2. Xác định hàm lượng vitamin C theo phương pháp chuẩn độ bằng iot
Cân 0,5g mẫu tươi, nghiền nhuyễn với 5ml HCl 5%, cho vào ống đong dẫn đến
50ml bằng nước cất. Khuấy đều, lấy 20 ml dịch nghiền cho vào bình nón dung tích
100ml, nhỏ thêm 10 giọt tinh bột rồi tiến hành chuẩn độ bằng dung dịch I 2 cho đến khi
có màu xanh lam nhạt.
Hàm lượng vitamin C được tính theo công thức:
Trong đó:
V – Số ml dung dịch iod 0,01 dùng chuẩn độ
V1 – Thể tích mẫu thí nghiệm (50ml)

V2 – Thể tích dung dịch lấy mẫu để xác định (20ml)
W – thể trọng lượng mẫu (o,5g)
0,00088 – số g vtamin C tương ứng với 1ml dung dịch iod 0,01N

2.3.4.3. Xác định hoạt tính của enzyme catalase theo phương pháp của Bergmeyer
(1983).
Chuẩn bị đệm phosphat 100mM (pH=7): 39ml dd NaH 2PO4 0.2M 61ml dung dịch
NaHPO4 0.2M +100ml H2O được 200 ml đệm phosphat (chuẩn pH=7). Bổ sung 1g
PVP 1%; 0,37g Na=EDTA 1mM; 0,29g NaCl 0,5M trong 100 ml đệm phosphate được
22


dung dịch thuốc thử. Cân 0,5g lá, cắt nhỏ cho vào cối sứ nghiền trong 4ml dung dịch
thuốc thử. Ly tâm ở 5000 vòng/ phút trong 25 phút ta được dịch chiết chứa enzyme. Lấy
vào ống fancol lần lượt 2,9 ml thuốc thử + 50μl dịch chiết + 50μl H 2O2 3%. Ống đối
chứng: 3 ml đệm phosphate. Đo độ hấp thụ của mẫu ở bước sóng 240 nm.
Độ hoạt tính của catalase được tính theo công thức sau:
Hoạt độ của catalase (U/ml) =
Trong đó:
∆AS: Độ hấp thụ của dung dịch mẫu ở bước sóng 240 nm.
∆A0: Độ hấp thụ của dung dịch trắng (đệm phosphate) ở bước sóng 240 nm.
df: Hệ số pha loãng (nếu có).34,4: tương ứng 3,45 μmol H 2O2 bị thủy phân trong 3
ml hỗn hợp phản ứng.
2.3.4.5. Xác định hàm lượng asen tích lũy trong lá
Xác định hàm lượng asen trong lá sử dụng 0,5 g mẫu lá nghiền trong 10 ml nước
cất, xử lý phá mẫu bằng lò vi sóng Microway với HNO3 sau đó đo ICP/MS bằng máy
AGILNT (Nhật Bản), tại phòng Phân tích mẫu - Viện Địa lý - Viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam..
2.3. Phương pháp xử lý số liệu
Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê sinh học Microsoft Excel, SPSS phiên

bản 16,0. Sự sai khác giữa các giá trị bằng One way – ANOVA (Turkey’s – b) ở mức ý
nghĩa α = 0,05.

23


PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kiểm tra sự có mặt của gen arsC trong cây thuốc lá chuyển gen arsC bằng kĩ
thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu arsC- R/F
Sau 4 tuần nuôi cấy cây thuốc lá (trong điều kiện chiếu sáng với cường độ 2000
lux ở 25oC) những mảnh lá bánh tẻ của 24 dòng thuốc lá chuyển gen khỏe mạnh được
lựa chọn để tách chiết DNA tổng số phục vụ cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu
arsC-R/F nhân gen arsC.
Kết quả điện di DNA tổng số của 24 dòng thuốc lá chuyển gen được thể hiện trên
hình 3.1.

Hình 3.1.Kết quả điện di DNA tổng số của 24 dòng thuốc lá chuyển gen.
1- 24: dòng thuốc lá chuyển gen từ 1 – 24. M: marker Fermentas 1kb
Kết quả điện di thể hiện trên hình 3.1 cho thấy các băng đều và rõ nét, như vậy
ADN tổng số của các mẫu thuốc lá đã được tách chiết thành công. Sự có mặt của gen
đích được kiểm tra bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu để nhân gen arsC và sử
dụng DNA tổng số của 24 dòng thuốc lá chuyển gen làm khuôn mẫu. Kết quả điện di
sản phẩm PCR thể hiện trên hình 3.2.

24


Hình 3.2.Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen arsC bằng cặp mồi đặc hiệu
arsC-R/F của 24 dòng thuốc lá chuyển gen.

1 – 24: Sản phẩm PCR của dòng thuốc lá chuyển gen 1-24.
M: Marker 100 bp DNA Ladder

Kết quả trên hình 3.2 cho thấy: trong số 24 dòng thuốc lá chuyển gen arsC sau 4
tuần nuôi cấy trong ống nghiệm được kiểm tra bằng phản ứng PCR, có 12 dòng thuốc
lá chuyển gen đều nhân được một băng có kích thước khoảng 500 bp, phù hợp với
kích thước lý thuyết của gen arsC. Như vậy gen arsC đã được chuyển thành công vào
12/24 dòng thuốc lá trên (đạt tỷ lệ 50%). Tác giả Nguyễn Thu Trang đã kiểm tra được
sự có mặt của gen GSHI góp phần nâng cao khả năng vận chuyển và tích lũy As ở 18
cây chuyển gen bằng phản ứng PCR cho thấy có 8/18 dòng cây cho kết quả dương tính
(chiếm tỷ lệ 44,4%).
3.2. Ảnh hưởng của nồng độ asen đến các chỉ tiêu sinh trưởng của các dòng thuốc
lá
3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ As đến tỉ lệ sống của các dòng thuốc lá thí nghiệm
Sau khi kiểm tra sự có mặt của gen arsC, các dòng thuốc lá được nuôi cấy trong
môi trường có bổ sung As nhằm đánh giá tỉ lệ sống của cây. Kết quả đánh giá sau 6
tuần bổ sung As được thể hiện trong bảng 3.1.

25