DSpace at VNU: Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật Polymerase Chain Reaction trong chẩn đoán viêm âm đạo- cổ tử cung do Chlamydia trachomatis tại bệnh viện Đại học Y Thái Bình

Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật Polymerase
Chain Reaction trong chẩn đoán viêm âm
đạo- cổ tử cung do Chlamydia trachomatis tại
bệnh viện Đại học Y Thái Bình
Trần Thị Hòa
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên; Khoa Sinh học
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30
Người hướng dẫn: GS. TS Lương Xuân Hiến
Năm bảo vệ: 2011
Abstract: Tổng quan về vi khuẩn Chlamydia trachomatis: Vi khuẩn Chlamydia
trachomatis; Các xét nghiệm chẩn đoán vi khuẩn Chlamydia trachomatis; Các
nghiên cứu về Chlamydia trachomatis trên thế giới và trong nước . Trình bày các
phương pháp nghiên cứu: Phương pháp chọn mẫu và cỡ mẫu ; Kỹ thuật xét nghiệm;
Xử lý số liê ̣u . Trình bày kết quả và thảo luận : Tố i ưu hóa phản ứng PCR phát hiê ̣n
Chlamydia trachomatis; Độ nhạy của kỹ thuật PCR; Độ đặc hiệu của kỹ thuật PCR;
Kết quả xét nghiệm bằng kỹ thuật PCR.
Keyword: Sinh học thực nghiệm; Phụ khoa; Viêm âm đạo; Viêm tử cung;
Chlamydia trachomatis

Content:
Viêm đường sinh dục do Chlamydia trachomatis được coi là bệnh lây truyền
qua đường tình dục xếp thứ nhất trên thế giới. Nhiễm C.trachomatis thường gây
viêm niệu đạo , viêm cổ tử cung . Tuy nhiên nế u không điề u tri ̣có thể dẫn đế n các
biế n chứng như viêm phần phụ, đau vùng chậu mãn tính, thai ngoài tử cung, vô sinh
do tổn thương ống dẫn trứng, viêm mào tinh đòi hỏi phải chăm sóc y tế với phí tổn
cao. Tổ chức Y tế thế giới ước tính hàng năm có khoảng 90 triệu ca nhiễm
C.trachomatis được phát hiện mới. Bệnh do C.trachomatis hay gặp ở những người
trẻ tuổi, trong độ tuổi sinh đẻ. Nguy hiểm nhất của nhiễm C.trachomatis qua đường
sinh dục là có tới 75% nữ giới và 50% nam giới mắc bệnh mà không có triệu chứng,
người bệnh hoàn toàn không biết mình mắc bệnh.
Khuếch đại acid nucleic (nucleic acid amplification tests – NAATs) là kỹ thuật

sinh học phân tử đã được ứng dụng rộng rãi trong y học để phát hiện sự tồn tại của
các vi sinh vật trong các mẫu bệnh phẩm. Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase
Chain Reaction – PCR) là một NAATs có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao, nhiều
nghiên cứu đã xem PCR là một tiêu chuẩn vàng để khảo sát giá trị của các xét
nghiệm chẩn đoán khác. Đối với bệnh nhiễm C.trachomatis, xét nghiệm này cho
phép xác định sự tồn tại của vi khuẩn trong dịch âm đạo, tử cung của bệnh nhân.
Đề tài thực hiện với mục tiêu:


- Chuẩn hóa quy trình kỹ thuật thực hiện phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn
Chlamydia trachomatis trên máy Master Cycler C 1000 BioRad tại Lab sinh học
phân tử - Trung tâm KHKT Y Dược - Đại học Y Thái Bình.
- Bước đầu xác đi ̣nh tỷ lê ̣ nhiễm Chlamydia trachoma tis ở bệnh nhân viêm
âm đạo , cổ tử cung đến khám tại bệnh viện Đại học Y Thái Bình từ tháng
4 đến
tháng 10 năm 2011 bằng kỹ thuật PCR.
Đối tượng nghiên cứu:
- Mẫu DNA vi khuẩn C.trachomatis do Viện Công nghệ sinh học- Viện
Khoa học Việt Nam cung cấp.
- Các bệnh nhân nữ trong độ tuổi sinh sản (15-49 tuổ i) có biểu hiện viêm âm
đạo, cổ tử cung đế n khám ta ̣i phòng khám Sản phu ̣ khoa
- Bê ̣nh viê ̣n Đa ̣i ho ̣c Y
Thái Bình trong thời gian từ 01/04/2011 đến 10/2011.
Địa điểm nghiên cứu:
Lấy mẫu dịch quết cổ tử cung tại phòng khám Sản phu ̣ khoa - Bê ̣nh viê ̣n Đa ̣i
học Y Thái Bình. Chuẩn quy trình kỹ thuật , xử lý mẫu, tách chiết DNA và thực hiện
phản ứng PCR tại Lab sinh học phân tử - Trung tâm KHKT Y Dươ ̣c - Đa ̣i ho ̣c Y
Thái Bình.
Cỡ mẫu: Với p = 17% (theo nghiên cứu của Farhad B . Hashemi và cô ̣ng sự )
và lựa chọn giá trị độ sai số m = 0.05 thì cỡ mẫu tối thiểu là 217 bê ̣nh nhân.

Tách chiết DNA theo phương pháp Boom, chuẩn hóa quy trình kỹ thuật thực
hiện phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn C.trachomatis trên máy Master Cycler
C1000 BioRad. Các bước chuẩn hoá bao gồm: thực hiện phản ứng PCR trong các
nồng độ mồi khác nhau, nhiệt độ và thời gian gắn mồi, nồng độ MgCl2, số chu kỳ
thích hợp trong mỗi phản ứng.
Xác định độ nhạy của phản ứng: mẫu plasmid tái tổ hợp có mang đoạn
DNA của vi khuẩn C.trachomatis được pha loãng thành các dung dịch có các nồng
độ từ 1010, 109, 108, 107,... đến 101 bản sao plasmid/µl và sử du ̣ng làm mẫu chuẩ n để
đánh giá đô ̣ nha ̣y của phản ưng.
́ Xác định độ đặc hiệu của phản ứng bằng thử nghiệm
PCR với các loài Chlamydia khác và các mẫu DNA khác. Xác đinh
̣ tỷ lê ̣ nhiễm
C.trachomatis ở bệnh nhân viêm âm đạo , cổ tử cung đến khám tại bệnh viện Đại
học Y Thái Bình từ tháng 4 đến tháng 10 năm 2011: Các mẫu bệnh phẩm thu thập
đúng tiêu chuẩn chọn lựa sẽ được tiến hành bằng phản ứng PCR theo quy trinh
chuẩn ở trên.
Kết quả: Quy trình đã được chuẩn hóa: Phản ứng PCR đầu tiên có MgCl2
nồng độ 2.1 mM, 0.4 pmol mỗi loại mồi KL-5, KL-6, 0.05 U UNG, nước đến 25 µl.
Phản ứng Nested PCR chứa MgCl2 nồng độ 1,5 mM, 0,4 pmol mỗi loại mồi KL-1,
KL-2, 1 µl phản ứng PCR lần đầu, nước đủ 25 µl. Độ nhạy: phát hiện được 10 bản
sao plasmid. Độ đặc hiệu 100%.
Trong số 217 bệnh nhân có biểu hiện viêm âm đạo, cổ tử cung đến khám tại
bệnh viện Đại học Y Thái Bình từ tháng 4 đến tháng 10 năm 2011 có 80 người có
kết quả dương tính với C.trachomatis chiếm tỷ lệ 36.9%. Kết quả xét nghiệm trên
chưa phản ánh được toàn bộ quần thể vì còn có những đối tượng nhiễm bệnh nhưng
không có biểu hiện viêm nhiễm nên không đi khám, và xét nghiệm này lần đầu tiên
được áp dụng tại Thái Bình. Trong số bệnh nhân dương tính, nhóm dưới 25 tuổi có
tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C.trachomatis cao nhất, chiếm 40.6%. Đồng thời tỷ lệ nhiễm
vi khuẩn C.trachomatis trong nghiên cứu tại Thái Bình ở nông thôn cao hơn ở thành
phố. Tỷ lệ bệnh nhân dương tính tại khu vực nông thôn là 37.8%.

References:
Tiếng Việt

1. Phạm Đông An (1996). Viêm nhiễm cổ tử cung do Chlamydia trachomatis ở
phụ nữ mang thai, Luận văn tốt nghiệp bác sỹ y khoa, Trung tâm đào tạo và
bồi dưỡng cán bộ y tế.
2. Bộ Y Tế (2007), “Vi sinh vật Y học”, Nhà xuất bản Y học.
3. Lê Hồng Cẩm (2002). Nghiên cứu tỷ lệ viêm cổ tử cung do Chlamydia
trachomatis và một số yếu tố kết hợp ở phụ nữ trong lứa tuổi sinh đẻ tại huyện
Hóc Môn, Luận án tiến sỹ y học, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh.
4. Phạm Văn Đức (2007). “ Tỷ lệ nhiễm Chlamydia trachomatic ở phụ nữ hút
thai ba tháng đầu thai kỳ và các yếu tố liên quan”, Tạp chí y học TP Hồ Chí
Minh, tập 13 (1), trang 17-22.
5. Nguyễn Phúc Như Hà, “Ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đoán
bệnh phong và các bệnh lây truyền qua đường tình dục tại bệnh viện phong- da
liễu Trung ương Quy Hòa”. Bệnh viện phong- da liễu Trung ương Quy Hòa.
6. Nguyễn Thanh Hùng, Nguyễn Trọng Hào, Nguyễn Ngọc Bá, “Giá trị chẩn
đoán của test nhanh (quick test-USA) so với PCR (công ty Nam Khoa- Việt
Nam) trong chẩn đoán nhiễm Chlamydia trachomatis ở bệnh nhân đến khám
tại bệnh viện Da liễu thành phố Hồ Chí Minh”. Bệnh viện Da liễu thành phố
Hồ Chí Minh.
7. Trần Hậu Khang, Phạm Đăng Bảng, Lê Huyền My, viện Da liễu Quốc gia
(2009), “Áp dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán nhiễm Chlamydia
trachomatis đường sinh dục tiết niệu”, Tạp chí y học thực hành, 1, trang 641642.
8. Trần Thị Lợi (2000). “Sơ bộ khảo sát tình hành nhiễm Chlamydia trachomatis
trong viêm sinh dục “ Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh, Tập 4 (1): trang 14-18
9. Đặng Chi Mai (2003). “ Chlamydiae”. Vi khuẩn học. Đại học Y dược TP Hồ
Chí Minh, trang 176-176.

10. Nguyễn Văn Thục, “Dịch tễ học bệnh lây truyền qua đường tình dục và nhiễm
HIV ở khu vực phía Nam Việt Nam: Một số vấn đề nổi cộm”. Viện Pasteur
thành phố Hồ Chí Minh.
Tiếng Anh

11. Achchhe L Patel, Divya Sachdev, Poonam Nagpal, Uma Chaudhry, Subash C
Sonkar, Suman L Mendiratta and Daman Saluja (2010), “Prevalence of
Chlamydia infection among women visiting a gynaecology outpatient
department: evaluation of an in-house PCR assay for detection of Chlamydia
trachomatis”, Annals of clinical microbiology and antimicrobials, 9 (24),
12. Anahita Jenab, Naser Golbang, Pouran Golbang, Leili Chamani-Tabriz,
M.PH, Rasoul Roghanian (2009), “Diagnostic Value of PCR and ELISA for
Chlamydia trachomatis in a Group of Asymptomatic and Symptomatic
Women in Isfahan, Iran”, Royan Institue International Journal of Fertility and
Sterility Vol 2, (4), pp. 193-198.
13. Bass CA, Jungkind DL, Silverman NS (1993), “Clinical evaluation of a new
polymerase chain reaction assay for detection of Chlamydia trachomatis in
endocervical specimens”. J Clin Microbiol; 31, pp. 2648-2653.
14. Boom R. et al., (1990), “Rapic and simple method for purification of nucleic
acids”, J. Clin. Microbiol., vol. 28 no. 3, pp. 495-503.


15. European Centre for Disease prevention and Control (2008), Technical report
review of Chlamydia control activities in EU countries, Stockholm.
16. Farhad B. Hashemi, BabakPourakbari, and JavadZaeimiYazdi (2007),
“Frequency of Chlamydia trachomatis in Women with Cervicitis inTehran,
Iran”, Infectious Diseases in Obstetrics and Gynecology Vol 2007, 4 pp
17. Frost EH, Deslandes S, Bourgaux-Ramoisy D (1993), “Sensitive detection and
typing of Chlamydia trachomatis using nested polymerase chain reaction”.
Genitour in Med, 69, pp 290-294.

18. James B. Mahony, Kathleen E Luinstra, John W. Sellors, Dan Jang, and Max
A. Chernesky (1992), “Confirmatory Polymerase Chain Reaction Testing for
Chlamydia trachomatis in First-Void Urine from Asymptomatic and
Symptomatic Men”, Journal of clinical microbiology, pp. 2241-2245.
19. Joanne Rampersad, Xiaohui Wang, Helen Gayadeen, Samuel Ramsewak, and
David Ammons (2007), “In-house polymerase chain reaction for affordable
and sustainable Chlamydia trachomatis detection in Trinidad and Tobago”,
Ammons Rev Panam Salud Publica, 22(5), pp. 317- 322.
20. J.S Wilson, E.Honey, A. Templeton, J.Paavonen, P.A. Mardh, A.Stary and
B.Stray- Pedesen (2002), “A systematic review of the prevalence of
Chlamydia trachomatis among European women”, Human Reproduction
update, Vol 8, (4), pp. 385-394.
21. Loeffelholz MJ, Lewinski CA, Silver SR, (1992), “Detection of Chlamydia
trachomatis in endocervical specimens by polymerase chain reaction”. J. Clin
Microbiol, 30, pp. 2847-2851.
22. Pamela Cribb, Juan Pablo Scapini, Esteban Serra (2002), “One-tube nested
Polymerase Chain Reaction for detection of Chlamydia trachomatis”, Mem
Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Vol. 97(6), pp. 897-900.
23. Saiki RK et al., (1985), “Enzymatic amplification of beta-globin genomic
sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia”,
Science, 230, pp. 1350-1354.
24. Nguyen Thi Thanh Thuy, Vo Tuyet Nhung, Nguyen Van Thuc, Truong Xuan
Lien and Ha Ba Khiem (1998), “HIV infection and risk factors among female
sex workers in southern Vietnam”, AIDS, 12, pp. 425-432.
25. Huynh Thi Trong, Nguyen Quoc Chinh and Nguyen Van Tu (2002),
Prevalence of lower reproductive tract infections among married childbearingage women in Ho Chi minh City.
26. Vietnam Commission for Population, Family and Children – Ministry of
Health AIDS Division and Pasteur Institute Ho Chi Minh City. STI/HIV
survey among female sex workers in 5 border provinces, Vietnam, 2002.
Medical Publishing House, 2003.

Tài liệu tham khảo khác
27. www.cfsh.ca/files/PDF/chlamydia in canada.pdf
28. www.pasteur-hcm.org.vn/anpham/anpham.htm
29. www.pasteur-hcm.org.vn/anpham/dichtehoc_blqdtd.htm
30. www.quyhoandh.org.vn
31. www.hosrem.org.vn/index.php?...chlamydia...nhan
32. www.cicatelli.org/.../CHLAMYDIATESTINGTECHNOLOGIES012007.pdf
33. www.advms.pl/?q=system/files/30_52Bulhak-Koziol.pdf
34. />

35. www.vsmmb.com/data/upload_file/File/.../PCR_basic.pdf