Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán viêm âm đạo, cổ tử cung do chlamydia trachomatis tại bệnh viện đại học y thái bình (luận văn thạc sĩ)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------

TRẦN THỊ HÒA

NGHIÊN C U NG DỤNG KỸ THUẬT PCR TRONG CHẨN
ĐOÁN VIÊM ÂM ĐẠO, CỔ TỬ CUNG DO CHLAMYDIA
TRACHOMATIS TẠI BỆNH VIỆN ĐẠI HỌC Y THÁI BÌNH

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2015

1


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ......................................................................................... 9
1.1. Vi khuẩn Chlamydia trachomatis. .........................................................................9
1.2. Các xét nghiệm chẩn đoán vi khuẩn Chlamydia trachomatis ............................. 12
1.2.1. Nuôi cấy .........................................................................................................12
1.2.2. Kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme (enzyme immunoassays – EIAs) ...............13
1.2.3. Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang trực tiếp (direct fluorescent antibody - DFA) 14
1.2.4. Kỹ thuật khuếch đại acid nucleic (nucleic acid amplification tests – NAATs). . 14

1.3. Các nghiên cứu về Chlamydia trachomatis trên thế giới và trong nước .............16
1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới ..........................................................................16
1.3.2. Các nghiên cứu trong nước ............................................................................24
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN C U ....................... 29

2.1. ĐỐI T

NG NGHI N CỨU .............................................................................29

2.1.1. Đối tư ng nghiên cứu ....................................................................................29
2.1.2. Thời gian nghiên cứu. ....................................................................................29
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu ...................................................................................... 29
2.2. PH

NG PH P NGHI N CỨU .......................................................................29

2.2.1. Phư ng pháp chọn m u và c m u ................................................................ 29
2.2.2. Kỹ thuật xét nghiệm ....................................................................................... 30
2.2.2.1. Phư ng pháp lấy m u ...............................................................................30
2.2.2.2. Xử lý m u .................................................................................................30
2.2.2.3. Tách chiết ADN ....................................................................................... 31
2.2.2.4. Tối ưu hóa phản ứng PCR ........................................................................31
2.2.2.5. Xác định độ nhạy của phản ứng PCR ...................................................... 35
2.2.2.6. Đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng ......................................................... 36
2.2.2.7. Xác định t lệ nhiễm Chlamydia trachomatis ở bệnh nh n viêm m đạo,
c tử cung đến khám tại bệnh viện Đại học Y Thái

nh từ tháng 4 đến tháng 10

năm 2011 ...............................................................................................................37
2.2.2.8. Điện di, ph n t ch kết quả ........................................................................37
2.2.3. Xử lý số liệu ...................................................................................................38
2

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN.................................................................39
3.1. Tối ưu hóa phản ứng PCR phát hiện Chlamydia trachomatis ............................. 39
3.1.1. Nồng độ MgCl2 .............................................................................................. 39
3.1.2. Nồng độ mồi ..................................................................................................41
3.1.3. Thời gian và nhiệt độ gắn mồi .......................................................................43
3.1.4. Số chu kỳ........................................................................................................40
3.2. Độ nhạy của kỹ thuật PCR...................................................................................49
3.3. Độ đặc hiệu của kỹ thuật PCR .............................................................................50
3.4. Kết quả xét nghiệm bằng kỹ thuật PCR .............................................................. 50
KẾT LUẬN ..................................................................................................................55
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 50

3


DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ
Hình 1.1. Cấu trúc hệ gen của vi khuẩn Chlamydia trachomatis……………………...3
Hình 1.2. Chu kỳ vòng đời của vi khuẩn C.trachomatis………………………………..4
Hình 1.3. T lệ nhiễm C.trachomatis ở một số nước Ch u Âu……………………10
H nh 3.1. Ảnh điện di kết quả tối ưu nồng độ MgCl2 với cặp mồi KL1/KL2…….34
Hình 3.2. Ảnh điện di kết quả tối ưu nồng độ MgCl2 với cặp mồi KL5/KL6…….35
Hình 3.3. Ảnh điện di kết quả tối ưu nồng độ mồi KL5/KL6……………………..36
H nh 3.4. Ảnh điện di kết quả tối ưu nồng độ mồi KL1/KL2……………………..36
H nh 3.5. Ảnh diện di kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi KL1/KL2………………...38
H nh 3.6. Ảnh diện di kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi KL5/KL6………………..38
H nh 3.7. Ảnh diện di kết quả tối ưu thời gian gắn mồi KL5/KL6……………….39
H nh 3.8. Ảnh diện di kết quả tối ưu thời gian gắn mồi KL1/KL2…………….….40
H nh 3.9. Ảnh diện di kết quả tối ưu chu kỳ phản ứng……………………………40
H nh 3.10. Ảnh diện di độ nhạy phản ứng PCR hai lần trên vi khuẩn C. trachomatis……43

H nh 3.11. Kết quả xét nghiệm trên m u bệnh phẩm…………………………..…45
ảng 3.1. Thành phần phản ứng PCR lần thứ nhất……………………………..…41
ảng 3.2. Chu tr nh nhiệt của phản ứng PCR lần thứ nhất…………………….….42
ảng 3.3. Thành phần phản ứng PCR lần 2…………………………………….…42
ảng 3.4. Chu tr nh nhiệt của phản ứng PCR lần 2……………………………….43
ảng 3.5. Kết quả xét nghiệm C.trachomatis…………………………………….45
ảng 3.6. T lệ nhiễm C.trachomatis theo độ tu i………………………………..46
ảng 3.7. T lệ nhiễm C.trachomatis theo khu vực……………………………….47
4


Li cm n
Trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này
tôi đã nhận đ-ợc sự dạy bảo tận tình của các thầy cô, sự giúp đỡ của các
bạn đồng nghiệp, sự động viên to lớn của gia đình và những ng-ời thân.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, Tôi xin trân trọng cảm ơn
GS. TS. L-ơng Xuân Hiến- ng-ời thầy mẫu mực tận tâm đã trực tiếp
h-ớng dẫn, dìu dắt tôi từng b-ớc tr-ởng thành trên con đ-ờng học tập,
nghiên cứu khoa học cũng nh- trong cuộc sống.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Phạm Ngọc Khái, ThS
Nguyễn Nam Thắng và các cán bộ trong Trung tâm Dịch vụ Khoa học
kỹ thuật Y d-ợc- tr-ờng Đại học Y Thái Bình đã tận tình chỉ bảo và cho
tôi những ý kiến quí báu trong quá trình thực hiện luận văn.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể các thầy, cô giáo, các đồng
nghiệp và bạn bè đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và
nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi xin dành tất cả tình yêu th-ơng và lòng biết ơn sâu
nặng nhất cho cha mẹ, chồng và những ng-ời thân trong gia đình- những
ng-ời luôn ở bên tôi, luôn hết lòng vì tôi.

Trần Thị Hòa

5


BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

C. trachomatis

Chlamydia trachomatis

DFA

Direct Fluorescent Antibody

EIAs

Enzyme Immuno Assays

LPS

Lipopolysaccharide

MOMP

Major Outer Membrane Protein

NAATs

Nucleic Acid Amplication Tests

PCR

Polymerase Chain Reaction

TPHA

Treponema Pallidum Hemagglutination Assay

6


MỞ ĐẦU
Hiện nay, một trong các vấn đề nóng bỏng về chăm sóc sức khỏe sinh sản mà
các nước trên thế giới đang đối mặt là bệnh l y truyền qua đường t nh dục. Viêm
đường sinh dục do Chlamydia trachomatis đư c coi là bệnh l y truyền qua đường t nh
dục đứng đầu trên thế giới. Nhiễm Chlamydia trachomatis thường g y viêm niệu đạo,
viêm c tử cung. Tuy nhiên nếu không điều trị có thể d n đến các biến chứng như
viêm phần phụ, đau vùng chậu mãn t nh, thai ngoài tử cung, vô sinh do t n thư ng ống
d n trứng, viêm mào tinh đòi hỏi phải chăm sóc y tế với ph t n cao.
T

chức Y tế thế giới ước t nh hàng năm có khoảng 90 triệu ca nhiễm

Chlamydia trachomatis đư c phát hiện mới [34]. ệnh do Chlamydia trachomatis hay
gặp ở những người trẻ tu i, trong độ tu i sinh đẻ.
Các nghiên cứu mới đ y cho thấy, t lệ mắc bệnh này đang tăng lên. Tại Châu
Âu từ năm 1996-2003, số bệnh nh n nhiễm Chlamydia trachomatis đã tăng gấp đôi,
tại Hoa Kỳ con số này cũng tăng 14% trong giai đoạn 2000-2005 [15, 18].
Ở Việt Nam trong khoảng vài năm gần đ y vấn đề nhiễm khuẩn do Chlamydia

trachomatis mới đư c chú ý. Một vài nghiên cứu đưa ra t lệ khoảng 30% các trường
h p đến khám phụ khoa có tiết dịch đường m đạo bất thường là do Chlamydia
trachomatis. Nguy hiểm nhất của nhiễm Chlamydia trachomatis qua đường sinh dục là
có tới 75% nữ giới và 50% nam giới mắc bệnh mà không có triệu chứng, người bệnh
hoàn toàn không biết m nh nhiễm vi khuẩn [2,9].
Để chẩn đoán nhiễm Chlamydia trachomatis người ta thường dùng xét nghiệm
nuôi cấy- tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán xác định nhiễm Chlamydia trachomatis. Tuy
nhiên xét nghiệm này có hạn chế là phải bảo đảm vi khuẩn còn sống trong quá tr nh
vận chuyển đến phòng xét nghiệm, thời gian xét nghiệm dài.
Khuếch đại acid nucleic (nucleic acid amplification tests – NAATs) là kỹ thuật
sinh học ph n tử đã đư c ứng dụng rộng rãi trong y học để phát hiện sự tồn tại của các
vi sinh vật trong các m u bệnh phẩm. Phản ứng chuỗi trùng h p (Polymerase Chain
Reaction– PCR) là một NAATs có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao, nhiều nghiên cứu
đã xem PCR là một tiêu chuẩn vàng để khảo sát giá trị của các xét nghiệm chẩn đoán
7


khác. Đối với bệnh nhiễm Chlamydia trachomatis, xét nghiệm này cho phép xác định
sự tồn tại của vi khuẩn trong dịch m đạo, tử cung của bệnh nh n.
Với mong muốn đóng góp vào công tác chăm sóc sức khỏe nói chung và công
tác chăm sóc sức khỏe sinh sản nói riêng, chúng tôi thực hiện đề tài “

n

u ng

dụn kỹ t uật PCR tron

ẩn đoán v m âm đạo, ổ tử un do C lamyd a

tra omat s tạ Bện v ện Đạ

ọ Y T á Bình” với mục tiêu:

- Chuẩn hóa được quy trình kỹ thuật thực hiện phản ứng PCR phát hiện vi
khuẩn Chlamydia trachomatis.
- Xác đ nh được tỷ lệ nhi m Chlamydia trachomatis ở bệnh nhân viêm âm đạo,
c t cung.

8


Chƣơng 1: TỔNG QUAN
1.1. Vi khuẩn Chlamydia trachomatis.
Chlamydia trachomatis thuộc chi Chlamydia, họ Chlamydiaceae, lớp
Chlamydiae, ngành Chlamydiae, giới Bacteria [2, 9].
Về h nh thái khi quan sát dưới k nh hiển vi quang học, vi khuẩn có h nh cầu
hoặc h nh bầu dục, k ch thước khác nhau, là vi khuẩn Gram âm có màng là
lipopolisaccharide. Vì thiếu một số enzyme t ng h p các h p chất cao năng sử dụng
cho tế bào, vi khuẩn này phải ký sinh nội bào bắt buộc, không có khả năng sống sót
bên ngoài tế bào.
Hệ gen của Chlamydia trachomatis gồm ph n tử DNA dài 1.042.519 nucleotide
với 894 tr nh tự mã hóa cho protein.

Hình 1.1. Cấu trúc hệ gen của vi khuẩn Chlamydia trachomatis
( Theo Deborah Dean et al., (2009) Predicting Phenotype and Emerging Strains
among Chlamydia trachomatis Infections, CDC Home Vol. 15.(9))
Chlamydia trachomatis (C.trachomatis) chứa 7 đến 10 bản sao của plasmid có
k ch thước 7.5 kb. Tr nh tự nucleotide của plasmid là tr nh tự bảo thủ cao (có dưới 1%
nucleotide thay thế), chứa 8 khung đọc mở (Open Reading Frame) mã hoá các gen và

các kháng nguyên. Mặc dù chức năng của plasmid còn chưa xác định hết nhưng tr nh

9


tự nucleotide và sự có mặt của plasmid trong tế bào chứng tỏ nó có vai trò quan trọng
đối với vi khuẩn C.trachomatis.
C.trachomatis đư c chia thành 15 loại tuýp huyết thanh khác nhau bao gồm:
Tuýp huyết thanh (A-K), L1, L2, L3, a, Da, Ia và L2a. Trong đó tuýp A, B, Ba và C
g y bệnh mắt hột. Tuýp D, E, F, G, H, I, J và K g y bệnh viêm đường sinh dục. Tuýp
L1, L2 và L3 g y bệnh lympho hạt, một bệnh viêm hạch bạch huyết hoa liễu ở bẹn
[2,9].
Chu kỳ phát triển của C.trachomatis trong bào tư ng tế bào kéo dài 48-72 giờ
[34]. Vòng đời của C.trachomatis gồm 2 giai đoạn: Thể c bản và thể lưới.
- Thể c bản (Elementary Body- EB) là những tế bào tròn có đường k nh
khoảng 0.3m, nh n đậm. Thể này x m nhập vào các tế bào theo kiểu thực bào.
- Thể lưới (Reticulate Body- RB): Sau khi x m nhập vào tế bào C.trachomatis
chuyển hóa nhờ tế bào và tạo thành thể lưới (đường k nh 1m), sinh sản theo h nh
thức ph n đôi kiểu trực ph n khoảng 2-3 giờ một lần. Sau đó thể lưới lại chuyển thành
thể c bản và giải phóng khỏi tế bào thông qua h nh thức ngoại tiết bào (exocytosis).
Thông thường mỗi thể lưới giải phóng 100-1000 thể c bản rồi tiếp tục x m nhập vào
các tế bào mới.

Hình 1.2. Chu kỳ vòng đời của vi khuẩn C.trachomatis (theo Yvonne Pannekoek).
10


Đường truyền bệnh:
Vi khuẩn C.trachomatis là vi khuẩn ký sinh nội bào bắt buộc, không có khả
năng sống sót ngoài tế bào nên đường truyền chủ yếu là đường t nh dục hoặc l y từ mẹ

sang con khi người mẹ mang thai bị nhiễm C.trachomatis.
Khả năng gây bệnh:
C.trachomatis có khả năng g y nên 2 bệnh ch nh ở người:

ệnh mắt hột và

bệnh nhiễm trùng sinh dục tiết niệu, trong đó bệnh sinh dục tiết niệu do nhiều tuýp (D,
E, F, G, H, I, J và K) g y ra, tăng nhanh số lư ng người mắc.
Trẻ s sinh có thể bị mắc bệnh viêm kết mạc hoặc viêm ph i do C.trachomatis
nếu bị l y từ mẹ.
Ở p ụ nữ
Có tới 75% phụ nữ không có biểu hiện triệu chứng l m sàng và triệu chứng nếu
có cũng không điển h nh [3], nên việc chẩn đoán và sàng lọc nhiễm C.trachomatis đ n
thuần dựa vào triệu chứng l m sàng hoàn toàn không khả thi. Cho đến khi có biểu hiện
viêm vùng chậu hoặc khi bệnh nh n khám vô sinh phát hiện có t n thư ng ống d n
trứng th C.trachomatis đã g y biến chứng khó phục hồi. V vậy cần thiết phải có
những phư ng pháp chẩn đoán ch nh xác và phù h p giúp phát hiện C.trachomatis
nhằm ngăn chặn những hậu quả mà nó g y ra.
Ở nữ giới, vi khuẩn C.trachomatis có thể g y viêm m đao, c tử cung và niệu
đạo. Các biến chứng thường gặp ở bệnh nh n nhiễm C.trachomatis mạn t nh bao gồm:
- Tắ vò tr n ở p ụ nữ: Một trong những nguyên nh n g y tắc vòi trứng là
do viễm nhiễm ở vòi trứng, buồng trứng, d y chằng quanh tử cung vòi trứng do
C.trachomatis.
- C ửa n oà tử un : Nguyên nhân viêm nhiễm vòi trứng do C.trachomatis
khiến phôi thai tắc ngay tại điểm hẹp. Phôi thai lớn dần lên, đến một mức nào đó sẽ
phá v các mạch máu n i nó đậu lại trên vòi trứng, g y chảy máu dữ dội trong

bụng,

có thể làm thai phụ tử vong nhanh chóng. Nhiều thống kê cho thấy có tới 9% phụ nữ

nhiễm C.trachomatis bị chửa ngoài tử cung.
11


- Viêm vùn

ậu: Phần lớn, viêm vùng chậu do vi khuẩn lậu và C.trachomatis

gây ra. Viêm vùng chậu là một bệnh thầm lặng, nhiều tác giả thống kê cho thấy có tới
40% phụ nữ nhiễm C.trachomatis bị viêm nhiễm vùng tiểu khung, trong số đó có 20%
bị vô sinh làm ảnh hưởng không nhỏ tới chất lư ng cuộc sống.
- C.trachomatis có thể kết h p cùng với HPV (Human papilloma virus) – một
virus g y u nhú có khả năng đưa đến ung thư c tử cung.
Ở nam

ớ

Ở nam giới triệu chứng l m sàng của nhiễm C.trachomatis càng mờ nhạt h n,
biểu hiện đầu tiên là viêm niệu đạo có mủ mà giới chuyên khoa gọi là viêm niệu đạo
không do lậu, sau đó có thể d n đến viêm mào tinh hoàn. Tại túi tinh, vi khuẩn g y độc
cho tinh trùng, làm giảm số lư ng tinh trùng, đời sống tinh trùng ngắn lại, chất lư ng
giảm xuống. Đ y ch nh là lý do g y vô sinh nam.
Tuy nhiên, vì C.trachomatis l y qua đường t nh dục nên nam giới nhiễm bệnh
nếu không đư c phát hiện và điều trị sẽ là nguồn tái nhiễm cho bạn t nh. Ngoài ra, một
số nghiên cứu còn cho thấy C.trachomatis ở nam giới có khả năng bám vào tinh trùng
và theo tinh trùng đi qua c tử cung lên ống d n trứng, giúp phát tán C.trachomatis
trong vòi trứng của phụ nữ.
1.2. Các xét nghiệm chẩn đoán vi khuẩn Chlamydia trachomatis [32]
1.2.1. Nuô ấy
Để phát hiện C.trachomatis, người ta có thể dùng biện pháp nuôi cấy để chờ vi

khuẩn gia tăng số lư ng. C.trachomatis không phát triển ngoài tế bào sống đư c nên
không thể nuôi cấy theo phư ng pháp thường dùng mà phải tiến hành nuôi cấy trên
các tế bào như McCoy hoặc Hela 229, tế bào nhau thai...
- Đối với bệnh mắt hột, người ta lấy nang bằng cách nạo các nang rồi cấy vào
các tế bào nhau thai người để phát hiện các hạt vùi trong nguyên sinh chất của tế bào.
- Đối với bệnh viêm sinh dục– tiết niệu: lấy mủ chất tiết niệu đạo (nam giới);
chất tiết c tử cung, m đạo (nữ giới) nuôi cấy trong môi trường có chứa tế bào
McCoy hoặc Hela 229 ở 370C- 5% CO2. Quan sát t nh chất x m nhiễm sau 48 giờ nuôi
12


cấy và phát hiện C.trachomatis bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang: ủ với kháng thể
đánh dấu huỳnh quang đặc hiệu cho kháng nguyên vỏ lipopolysaccharide (LPS) hoặc
protein màng (major outer membrane protein- MOMP).
Xét nghiệm này đư c đánh giá là tiêu chuẩn vàng trong nhóm xét nghiệm vì có
độ đặc hiệu rất cao (100%), cho phép lưu giữ vi khuẩn làm kháng sinh đồ phát hiện
chủng kháng thuốc. Như c điểm của phư ng pháp này là đòi hỏi thời gian dài, phải
bảo đảm vi khuẩn còn sống trong quá tr nh vận chuyển đến phòng thí nghiệm, đội ngũ
cán bộ thành thạo về nuôi cấy tế bào.

ên cạnh đó xét nghiệm này có độ nhạy thấp

(70-85%), thấp h n so với khuếch đại nucleic acid (nucleic acid amplification tests–
NAATs) [32].
1.2.2. Kỹ t uật m ễn dị

ắn enzyme (enzyme immunoassays– EIAs)

Phư ng pháp này dựa trên phản ứng hóa miễn dịch giúp phát hiện kháng
nguyên LPS của C.trachomatis bằng kháng thể đ n dòng hoặc đa dòng đư c đánh dấu

bằng enzyme, phức h p kháng nguyên - kháng thể sẽ hoạt hóa enzyme chuyển c chất
không màu thành có màu, phát hiện đư c bằng phản ứng tạo màu hay đo bằng quang
ph kế.
Khi m u xét nghiệm đư c thêm vào màng, kháng nguyên của C.trachomatis sẽ
gắn với kháng thể đư c phủ sẵn trên màng. Sau đó b sung kháng thể đặc hiệu với
C.trachomatis liên kết với kháng nguyên đã đư c bắt giữ bởi kháng thể trên màng.
Dung dịch enzyme đư c thêm vào sẽ liên kết với kháng thể đặc hiệu của
C.trachomatis. ước tiếp theo là rửa để loại bỏ các thành phần không gắn với màng.
sung c chất đặc hiệu với enzyme vào màng. Nếu có kháng nguyên, c chất phản
ứng với enzyme tạo sự thay đ i màu sắc phát hiện và đo đư c bằng máy quang ph kế.
Xét nghiệm này có hiệu quả với quy mô sàng lọc lớn, không đòi hỏi vi khuẩn
còn sống, rẻ tiền h n nuôi cấy và yêu cầu kỹ năng xét nghiệm vừa phải. Tuy vậy nó có
như c điểm là không sử dụng đư c với nhiều loại m u lấy từ đại tràng, c quan hô hấp
và m đạo do giảm độ nhạy và độ đặc hiệu với các m u này, đư c sử dụng sàng lọc
quần thể có t lệ dư ng t nh thấp (≤ 5%) [32]. Xét nghiệm này có độ nhạy thấp h n
NAATs và độ đặc hiệu thấp h n nuôi cấy tế bào.

13


1.2.3. Kỹ t uật k án t ể uỳn quan trự t ếp (direct fluorescent antibody- DFA)
Phư ng pháp này sử dụng kháng thể đ n dòng hay đa dòng đặc hiệu đư c đánh
dấu huỳnh quang để phát hiện trực tiếp kháng nguyên vỏ LPS hay kháng nguyên mã
hóa protein màng MOMP.
M u bệnh phẩm đư c thu thập, m u đư c đánh dấu tên và địa chỉ bệnh nh n. Sau
đó, m u đư c phết nhẹ nhàng lên lam k nh và đư c cố định ngay lập tức bằng
methanol. Sau khi đư c làm khô trong không kh từ 2 đến 3 phút, lam k nh đư c vận
chuyển đến phòng th nghiệm, nhuộm bằng kháng thể đánh dấu huỳnh quang đặc hiệu
với C.trachomatis. Kháng thể liên kết đặc hiệu với C.trachomatis có trong m u. Tiếp
đó là bước rửa để loại bỏ những kháng thể không liên kết. Quan sát dưới k nh hiển vi

huỳnh quang, m u dư ng t nh C.trachomatis dạng c bản màu xanh táo tư ng phản
với màu đỏ đất của tế bào.
Xét nghiệm áp dụng đư c cho nhiều loại m u khác nhau, không yêu cầu vi khuẩn
còn sống, đòi hỏi kỹ năng xét nghiệm vừa phải, th ch h p chẩn đoán trên các đối tư ng
có nguy c cao. Sự thành công của kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang phụ thuộc vào
nhiều yếu tố: Có kháng thể đánh dấu huỳnh quang đặc hiệu với C.trachomatis, đủ
kháng thể để kết h p, k nh hiển vi huỳnh quang chất lư ng tốt. Kỹ thuật này không
th ch h p cho số lư ng m u lớn và đối tư ng có nguy c thấp, độ nhạy thấp h n
NAATs và độ đặc hiệu thấp h n nuôi cấy tế bào [32].
1.2.4. Kỹ t uật k uế

đạ nu le acid (nucleic acid amplification tests– NAATs).

NAATs là kỹ thuật sinh học ph n tử đã đư c ứng dụng rộng rãi trong y học để
phát hiện sự tồn tại của các vi sinh vật trong các m u bệnh phẩm, độ nhạy trên 90%,
độ đặc hiệu tư ng đư ng với nuôi cấy tế bào. Kỹ thuật NAATs có ưu điểm là có thể áp
dụng ở những n i không có khả năng nuôi cấy, xét nghiệm không đòi hỏi vi khuẩn còn
sống, thời gian xét nghiệm ngắn (trong 1 ngày).
Phản ứng chuỗi trùng h p (Polymerase Chain Reaction– PCR) là xét nghiệm có
độ nhạy và độ đặc hiệu cao th ch h p cho sự phát hiện C.trachomatis [21]. Nhiều
nghiên cứu đã xem PCR là một tiêu chuẩn vàng để khảo sát giá trị của các xét nghiệm
chẩn đoán khác. Đối với bệnh nhiễm C.trachomatis, xét nghiệm này cho phép xác định
14


sự tồn tại của vi khuẩn trong dịch quết c tử cung hoặc trong m u nước tiểu của bệnh
nhân với các cặp mồi trên plasmid, trên gen mã hóa protein màng hoặc trên rRNA.
Tuy nhiên, xét nghiệm này có thể giảm độ nhạy do sự có mặt các chất ức chế có trong
m u hoặc không đủ độ nhạy để phát hiện m u chứa quá t dạng c bản của vi khuẩn C.
trachomatis. Do vậy có thể tạo ra sản phẩm m t nh giả. Theo Saiki và cộng sự (1985)

[23], để phát hiện 25 ng DNA trên gel agarose nhuộm ethidium bromide sau 35 chu kỳ
khuếch đại từ 10 ph n tử ban đầu ở m u cần hiệu quả khuếch đại cao h n 90%.
Nested PCR là kỹ thuật sử dụng hai cặp mồi thay v một cặp mồi như kỹ thuật
PCR c điển. Cặp mồi thứ hai đư c thiết kế nằm trong đoạn gen mà cặp mồi thứ nhất
khuếch đại. Quá tr nh chạy PCR lần đầu không khác g PCR thông thường. Sản phẩm
của phản ứng PCR lần đầu sẽ làm khuôn cho phản ứng PCR lần thứ hai cùng với cặp
mồi thứ hai. Kết quả sau hai lần PCR thu đư c sản phẩm đặc hiệu h n nhiều. Kỹ thuật
này có độ nhạy rất cao, có thể phát hiện vi khuẩn ở mật độ rất thấp mà các phư ng
pháp thông thường khó có thể phát hiện đư c (1-5 ký sinh trùng/1 µl máu). Đ y đư c
xem là “tiêu chuẩn vàng” mới trong phát hiện vi khuẩn trong các m u bệnh phẩm do
độ nhạy và độ đặc hiệu cao của nó. Theo Pamela Cribb và cộng sự (2002) [22], xét
nghiệm này có thể phát hiện DNA tư ng ứng với nhỏ h n 10 dạng c bản (EB) của vi
khuẩn C.trachomatis trong hỗn h p phản ứng, cho phép phát hiện kết quả m t nh giả
và đáp ứng đư c với sự thay đ i ở các phòng th nghiệm khác nhau.
M u đư c xử lý để tách DNA của C.trachomatis. Các thành phần của phản ứng
PCR đư c thiết lập gồm primer, dNTP, Taq polimerase, MgCl2. Các primer liên kết
với DNA đ ch đặc hiệu của C.trachomatis. Enzym Taq polymerase kéo dài mỗi tr nh
tự DNA sử dụng các nucleotide tự do để tạo tr nh tự DNA b sung. Quá tr nh khuếch
đại này xảy ra khi hỗn h p phản ứng đư c ủ trong máy lu n nhiệt. Mỗi chu kỳ làm
tăng số lư ng DNA đ ch theo hàm mũ. Sau khi khuếch đại, sản phẩm lần 1 đư c sử
dụng làm khuôn cho phản ứng PCR lần 2. Sau phản ứng PCR lần 2, sản phẩm đư c
điện di trên gel agarose 1%, nhuộm ethidium bromide và ph n t ch trên hệ thống chụp
ảnh gel .
Xét nghiệm này có thể phát hiện vi khuẩn C.trachomatis trên m u nước tiểu
(độ nhạy của m u này thấp h n m u dịch phết), nhiều loại m u lấy từ đại tràng, c
quan hô hấp và m đạo.
15


Xét nghiệm này độ nhạy trên 90%, độ đặc hiệu tư ng đư ng với nuôi cấy tế

bào, có ưu điểm là có thể áp dụng ở những n i không có khả năng nuôi cấy, không đòi
hỏi vi khuẩn còn sống, thời gian xét nghiệm ngắn (trong 1 ngày) [13, 17]. Như c điểm
của xét nghiệm này là yếu tố ngoại nhiễm cao, tuy vậy có thể tránh bằng cách sử dụng
đầu côn lọc và dùng enzyme uracil- N- glycosylase trong phản ứng.
1.3. Các nghiên cứu về Chlamydia trachomatis trên thế giới và trong nƣớc
1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới

Số người
nhiễm
trên
100.000

Năm

Hình 1.3. Tỷ lệ nhi m Chlamydia trachomatis ở một số nước Châu Âu
Theo ECDC năm 2009 [15], t lệ dư ng t nh C.trachomatis ở một số nước
Châu Âu thay đ i từ năm 1998 đến năm 2007. Ở Thụy Điển và Phần Lan, n i những
nghiên cứu đư c tiến hành từ đầu những năm 90, t lệ này giảm ở đầu những năm 90
(tư ng tự với t lệ các bệnh l y truyền qua đường t nh dục khác ở Châu Âu) do sự thay
đ i thói quen sinh hoạt t nh dục và mối lo từ hiểm họa AIDS. T lệ này tăng lên từ
năm 1995. Tại Anh và Đan Mạch, t lệ này tăng dần theo mỗi năm, nguyên nhân có
thể do không đư c nghiên cứu từ đầu những năm 90, sử dụng các chẩn đoán có độ
nhạy cao h n, đối tư ng nghiên cứu nằm trong các nhóm có nguy c cao.
Theo một nghiên cứu về t lệ nhiễm vi khuẩn này tại Châu Âu [20] cho thấy:
16


Phần Lan
Nghiên cứu 298 phụ nữ tu i từ 18 đến 40, từ năm 1977 đến năm 1980 tại một
trung t m y tế sinh viên tại Đại học Helsinki. Những phụ nữ trên đư c chăm sóc y tế

về các biện pháp tránh thai, vấn đề nội tiết và vô sinh hoặc đã đư c kiểm tra dịch phết
c tử cung định kỳ (đối với bệnh nh n có triệu chứng). Các xét nghiệm đư c sử dụng
là nuôi cấy dịch niệu đạo và dịch phết c tử cung. ỏ qua mô tả về cách lựa chọn, t lệ
đáp ứng, lý do đáp ứng và loại trừ. T lệ dư ng t nh C.trachomatis là 6%.
Thụy Điển
Nghiên cứu thứ nhất (Persson et al., 1991) liên quan đến 306 phụ nữ tu i từ 12
đến 25 (trung bình 22 tu i) tại một phòng khám thai từ năm 1989 và 1990. Nuôi cấy
đư c sử dụng làm phư ng pháp xét nghiệm, t lệ dư ng t nh C.trachomatis là 6%.
Nghiên cứu thứ hai (Svensson et al., 1994) đã so sánh hai nhóm phụ nữ nghiên cứu
vào năm 1991- 1992. Nhóm A bao gồm 751 học sinh trung học với độ tu i 16 đến 20
năm (trung bình 18 tu i). Các t lệ đáp ứng là 77%. Nhóm

bao gồm 619 phụ nữ đến

khám tại phòng khám kế hoạch hóa gia đ nh thanh thiếu niên và độ tu i phù h p với
nhóm A. Cả hai nhóm đã đư c thử nghiệm bằng cách sử dụng xét nghiệm EIA. T lệ
dư ng t nh C.trachomatis là 2% trong nhóm A và 6% trong nhóm B.
Vương quốc Anh
Nghiên cứu đư c tiến hành đầu tiên (Smith et al., 1991) liên quan đến 197 phụ
nữ tu i từ 19 đến 58 (trung bình 30 tu i) tại một phòng khám soi c tử cung. Nghiên
cứu cho thấy không có sự khác biệt giữa phụ nữ có dịch phết c tử cung b nh thường
và bất thường.

ệnh phẩm dịch phết c tử cung đư c sử dụng để nuôi cấy. T lệ

dư ng t nh C.trachomatis là 12%. Nghiên cứu thứ hai (Thompson và Wallace, 1994)
liên quan đến 287 phụ nữ từ 15 tu i đến 40. Các m u dịch phết c tử cung đã đư c xét
nghiệm bằng kỹ thuật DFA. T lệ nhiễm C.trachomatis ở phụ nữ nhỏ h n 30 tu i là
3.5% (5/145). T lệ dư ng t nh C.trachomatis chung là 1.7%. Nghiên cứu thứ ba
(Hopwood và Mallinson, năm 1999) đánh giá trên các phụ nữ 16 đến 25 tu i bằng xét

nghiệm DFA. T lệ nhiễm C.trachomatis là 3.9%. Nghiên cứu thứ tư (Kirkwood et
al., 1999) nghiên cứu phụ nữ độ tu i nhỏ h n 20 tại phòng khám kế hoạch hóa gia
đ nh. Các m u đư c kiểm tra bằng kỹ thuật PCR. C m u là 97 với 65 phụ nữ đến từ
17


thành phố. T lệ nhiễm vi khuẩn này ở phụ nữ thành phố là 3% và thị trấn nông thôn
12.5%. T lệ dư ng t nh C.trachomatis t ng thể là 6.2%.
Sự ph biến của C.trachomatis phụ nữ không có triệu chứng ở Châu Âu dao
động từ 1.7 đến 17% tùy thuộc vào bối cảnh và quốc gia. T

lệ dư ng t nh C.

trachomatis là 6% ở phụ nữ sử dụng biện pháp tránh thai và 4% với đối tư ng phụ nữ
xét nghiệm dịch phết c tử cung [15].
James B. Mahony và cộng sự (1992) nghiên cứu t lệ dư ng t nh C.trachomatis
ở nam giới ở những địa điểm đư c lựa chọn tại Hoa Kỳ [18]. Sự sàng lọc phụ thuộc
một phần vào chi ph sàng lọc C.trachomatis cũng như phư ng pháp sàng lọc. Sàng
lọc ở những địa điểm có t lệ nam giới dư ng t nh cao sẽ n ng cao chất lư ng chư ng
trình kiểm soát C.trachomatis. Đánh giá các chư ng tr nh sàng lọc vi khuẩn này trong
số những người đàn ông không có triệu chứng tại các phòng khám từ năm 1995 đến
tháng 6 năm 2007, thông qua PubMed thu đư c kết quả: T lệ dư ng t nh trung bình
t ng thể là 5.1%. Mức cao nhất đư c quan sát thấy ở nam giới thử nghiệm tại các c
sở giam giữ trẻ vị thành niên (7.9%) và người lớn (6.8%), ở người da đen (6.7%), 1519 tu i (6.1%) và 20-24 tu i (6.5%). T lệ nhiễm C.trachomatis trên nam giới cao ở
những địa điểm nhất định.
C.trachomatis là bệnh l y truyền qua đường t nh dục ph biến nhất ở Canada
[27]. Có gần 63.000 trường h p nhiễm C.trachomatis đư c báo cáo vào năm 2004, con
số cao nhất kể từ khi vi khuẩn này đư c đề cập vào năm 1990. T

lệ nhiễm

C.trachomatis ở Canada đã tăng h n 70% từ năm 1997. Tuy nhiên, những con số này
đánh giá thấp gánh nặng thực sự của bệnh như một số bệnh nhiễm trùng (40% đến
70% các bệnh nhiễm trùng) là không có triệu chứng nên không bị phát hiện. Có một sự
khác biệt giới t nh trong t lệ nhiễm C.trachomatis, phụ nữ chiếm h n hai phần ba các
trường h p đư c báo cáo vào năm 2004. Trong khi số lư ng các bệnh nhiễm trùng
C.trachomatis báo cáo ở phụ nữ cao h n nam giới, t lệ lây nhiễm đang gia tăng nhanh
h n ở nam giới. Từ năm 1997, t lệ ở nam giới nhiều h n gấp đôi, từ 59 đến 129.5 trên
100.000 người, trong khi t lệ ở phụ nữ tăng t h n một nửa, từ 168 đến 263 trên
100.000. Sự chênh lệch giới t nh có thể một phần là do số phụ nữ đư c sàng lọc vi
khuẩn C.trachomatis lớn h n. Việc cải thiện công nghệ chẩn đoán có thể sử dụng m u
nước tiểu để xét nghiệm dự đoán sẽ làm tăng số lư ng đàn ông kiểm tra. T lệ thanh
18


thiếu niên nhiễm C.trachomatis cũng không tư ng xứng, gần 70% của tất cả các
trường h p đư c báo cáo xảy ra ở tu i từ 15 đến 24 trong nghiên cứu. Trong năm
2004, t lệ nhiễm trong thanh thiếu niên từ 15 đến 19 tu i là 847 trên 100.000. T lệ là
1.087 trên 100.000 trong độ tu i 20-24. Các vùng lãnh th phía

ắc nói riêng phải

chịu t lệ nhiễm C.trachomatis cao, trung bình năm 2003 là gần 8 lần so với toàn
quốc. Nunavut có t lệ nhiễm C.trachomatis cao nhất ở Canada vào năm 2003 (2.520
trên 100.000) trên 13 lần mức trung b nh toàn quốc [27].
Năm 2004 ở Trinidad và Tobago bằng phư ng pháp nested multiplex PCR với
các cặp mồi HO1, HO3, Chlam5/Chlam3, KL1/KL2 và Gon 5/Gon 3, các tác giả đã
phát hiện đồng thời hai loại vi khuẩn lậu và C.trachomatis trong m u nước tiểu của
phụ nữ mang thai [19]. Các m u nước tiểu đư c thu thập từ tháng 3 đến tháng 9 năm
2004 từ 273 phụ nữ mang thai khỏe mạnh ở các phòng khám tư nh n và bệnh viện. Tất

cả phụ nữ mang thai có mặt trong phòng khám tại thời điểm lấy m u đã đư c mời
tham gia. 15-20 ml m u nước tiểu đầu dòng đư c thu thập, bảo quản ở 4°C, vận
chuyển đến phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ, và bảo quản ở -20°C cho đến khi
DNA đư c tách chiết (trong vòng hai tháng). DNA từ nước tiểu đư c chuẩn bị bằng
cách sử dụng Chelex 100 (Sigma Chemical Co, St Louis, Hoa Kỳ). Phản ứng PCR thứ
nhất và nested multiplex PCR đư c tối ưu hóa ở các nồng độ MgCl2 1.5; 2 và 3 mM, ở
nhiệt độ thay đ i từ 45°C đến 65°C (sử dụng máy Gradient Master Cycler Eppendorf)
với mồi phát hiện vi khuẩn lậu hoặc C.trachomatis. Để tránh nhiễm, sử dụng bốn
phòng riêng biệt, một để pha mix, một để chuẩn bị m u và PCR lần 1, một tạo phản
ứng nested PCR và một phòng điện di. Sản phẩm khuếch đại đư c điện di trên gel
agarose 2%, nhuộm ethidium bromide và quan sát. Phản ứng PCR đầu tiên dùng 0.2
mM mỗi loại dNTP; 3 mM MgCl2; 0.5 pmol/µl mỗi mồi HO1, HO3, Chlam5 (5'CATTATGT-CGGAGTCTG-AGC- 3’), Chlam3 (5'-GGATGACTCAAGGAATAGTCG- 3’), 1 µl Internal Amplification Control (IAC), 0.4 pmol/µl mồi IAC (5'TGTTTGACAGCTTATCAT), 5 µl DNA m u, 0.5 U Taq polymerase, và nước khử
ion đến 25 µl với chu tr nh nhiệt 94°C/15s, 60°C/30s, 72°C/60s, 40 chu kỳ. Phản ứng
nested PCR chứa 0.2 mM mỗi loại dNTP; 2 mM MgCl2; 0.5 pmol/µl mỗi mồi KL1,
KL2, Gon5 (5'-GTTCT-TGACGCTCC-ATATCG- 3’) và Gon3 (5'-ACGAGGCATTGAAGCAAAGC- 3’); 0.4 pmol/µl IAC; 1 µl sản phẩm PCR lần 1; 0.5 U Taq
polymerase, nước khử ion đến 25 µl, chu tr nh nhiệt 94°C/15s, 58.5°C/30s,72°C/30s,
19


40 chu kỳ. Kết quả ở PCR lần 1 là 21 m u dư ng t nh C.trachomatis và 1 m u nhiễm
cả C.trachomatis và lậu. Kết quả phản ứng nested multiplex PCR thu đư c m u dư ng
tính C.trachomatis là 57 m u (20.9%), trong đó 5 m u nhiễm cả hai loại vi khuẩn trên.
Kết quả này chứng tỏ multiplex nested PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao h n hẳn
phản ứng PCR đ n.
Farhad B. Hashemi, Babak Pourakbari và Javad Zaeimi Yazdi [16] nghiên cứu
t ng cộng 123 phụ nữ đã kết hôn (tu i từ 20-55) với triệu chứng viêm c tử cung đến
khám tại phòng khám sản phụ khoa của bệnh viện Mirza Kouchek Khan ở Tehran,
Iran, từ giữa tháng 12/2004 đến tháng 6/2005, chủ yếu do đau vùng chậu và (hoặc) tiết
dịch m đạo. Tất cả những phụ nữ điều trị kháng sinh trong vòng ba tuần trước khi đến
khám đư c loại trừ khỏi nghiên cứu. Người tham gia đồng ý hoàn thành một bảng c u

hỏi về nh n khẩu học và lịch sử bệnh l y truyền qua đường t nh dục trước khi kiểm tra
c tử cung. Sau khi loại bỏ chất nhầy c tử cung, m u dịch c tử cung đư c thu thập,
lưu trữ ở -20°C. DNA chiết xuất bằng DIAtom Prep100 kit (IsoGene Inc, Moscow,
Nga) và bảo quản tại -20°C cho đến khi sử dụng. Phản ứng PCR khuếch đại đoạn 377
bp của cryptic plasmid với chu tr nh nhiệt: 94°C/3.5 phút; (94°C/30s, 52°C/30s,
72°C/3 phút) x 30 chu kỳ trong 25 μl đệm phản ứng PCR (bao gồm 10 mmol/l Tris,
pH 8,3; 50 mmol/l KCl; 2.5 mmol/l MgCl2 và 0.1% gelatin); 0.2 mmol/l mỗi loại
dNTP; 2.5 U Taq DNA polymerase, và 0.5 μmol/µl mỗi loại mồi
AACCGTTTTTAATAGTGGCA-3’) và

P1 (5’-

P2 (5’-TTCTGGCCAAGAATTATCC-3’).

T lệ nhiễm trùng sinh dục do C.trachomatis trên phụ nữ đã kết hôn ở Iran là 17%
(cao h n t lệ 7% báo cáo tại nước này vào đầu những năm 1980). Mặc dù các bệnh
nh n trong nghiên cứu không phải là đại diện chung d n số (bao gồm cả phụ nữ không
có triệu chứng), hiện tại t lệ nhiễm C.trachomatis cao h n so với t lệ 4-11% tại
Slovenia, Hà Lan, Colombia, Canada, và Hoa Kỳ. Sự khác biệt t lệ trong nghiên cứu
này so với gần đ y báo cáo từ Tehran có thể liên quan đến sự cải thiện độ nhạy của xét
nghiệm cũng như đối tư ng bệnh nh n và các m u ph n t ch. Kết quả cần đư c khẳng
định bởi c m u lớn h n.
Theo các công tr nh nghiên cứu của Gaydos CA, Svensson LO [20], tần suất
nhiễm C.trachomatis cao gặp ở đối tư ng trẻ dưới 25 tu i, có lẽ do nam nữ thanh niên
các nước Châu Âu thường có quan hệ t nh dục tự do ngoài hôn nh n, v vậy họ dễ mắc
các bệnh l y truyền qua đường t nh dục trong đó có nhiễm C.trachomatis. T lệ nhiễm
20


vi khuẩn này ở người lớn tại Nam Thái

20%, Nhật ản 7%, Senegan 7%.

nh Dư ng là 73%, Papua New Guinea là

Một nghiên cứu của Achchhe L Patel và cộng sự [11] trường đại học y khoa
Indiana, Ấn Độ sử dụng các phư ng pháp phát hiện vi khuẩn C.trachomatis như
Roche Amplicor test, DFA và PCR. Trong suốt quá tr nh nghiên cứu (2003–2009), t
lệ bệnh nh n nhiễm C.trachomatis dao động từ 24.0% đến 30.0%. Các phụ nữ hành
nghề mại d m ở Surat, Ấn Độ, có t lệ dư ng tính (xét nghiệm bằng PACE2 test) là
8.5%, trong khi ở Ahmedabad, t

lệ này tăng gấp đôi. T

lệ bệnh nh n nhiễm

C.trachomatis trong quần thể nghiên cứu ở thủ đô của Ấn Độ chỉ chiếm 4.0% mặc dù
t lệ mắc bệnh l y truyền qua đường t nh dục là 36.5%. T lệ này tư ng tự với các
nghiên cứu trên bệnh nh n ở Azerbaijan 3.1% và Bangladesh 3.4%. T lệ nhiễm cao
đư c đề cập ở Manila 23.3%, Cebu, Philippines 37.0% và 14.0% ở Nicaragoa [11] .
Anahita Jenab và cộng sự (năm 2008) [12] nghiên cứu giá trị chẩn đoán PCR và
ELISA trên vi khuẩn C.trachomatis ở phụ nữ không có triệu chứng và triệu chứng tại
Isfahan, Iran nhằm xác định sự hiện diện của C.trachomatis bằng phản ứng chuỗi
trùng h p polymerase (PCR) và ELISA. M u đư c thu thập sau khi có sự đồng ý bằng
văn bản từ 80 bệnh nh n khám phụ khoa tại bệnh viện Shahid eheshti ở Isfahan, Iran.
ệnh phẩm đư c thu thập từ 80 phụ nữ, 22 người trong số họ không có triệu chứng và
58 người có triệu chứng. 58 phụ nữ có triệu chứng khác nhau, từ 20-60 tu i (có nghĩa
là 36.3 ± 8.8 năm) và 22 phụ nữ không có triệu chứng khác nhau, từ 19 đến 56 tu i (40
± 10.5 năm). Tất cả các phụ nữ này đư c kiểm tra l m sàng kỹ lư ng. Độ tu i trung
b nh của phụ nữ ở cả hai nhóm là 37.5 ± 9.4 năm. Những người đã dùng kháng sinh
trong vòng 4 tuần qua đư c loại trừ khỏi nghiên cứu. Các m u đã đư c kiểm tra bằng

phư ng pháp PCR đư c thiết kế để phát hiện C.trachomatis bằng cặp mồi KL1, KL2
trên cryptic plasmid của vi khuẩn này. Huyết thanh IgG và IgA kháng thể kháng
C.trachomatis sử dụng phát hiện bằng phư ng pháp ELISA. Một tăm bông chứa dịch
phết c tử cung của mỗi bệnh nh n đư c đặt vào một lọ nhựa 15 ml có chứa 5 ml dung
dịch đệm (P S) vô trùng và lưu trữ ở -70ºC cho đến khi tách chiết DNA. Ngoài ra,
5ml máu ngoại vi đư c thu thập từ mỗi bệnh nh n để điều tra huyết thanh học. Kit
ELISA đư c sử dụng trong nghiên cứu rất cụ thể để phát hiện C.trachomatis và không
có bất kỳ phản ứng chéo nào với các các loài khác của Chlamydia. Do đó, nó chỉ cho
phép phát hiện các kháng thể kháng C.trachomatis trong m u, tức là IgG, IgA. Phát
21


hiện C.trachomatis bằng phư ng pháp PCR: Để phát hiện sự hiện diện của
C.trachomatis trong m u dich phết c tử cung, đoạn gen 241 bp trên plasmid vi khuẩn
đã đư c khuếch đại nhờ cặp mồi KL1 (5’-TCCGGAGCGAGTACGAAGA-3’) và
KL2 (5’-AATCAATGCCCGGGATT GGT-3’). Phản ứng PCR đư c thực hiện trên 5
μl chiết xuất DNA m u trong một hỗn h p phản ứng cuối cùng là 25 μl. Hỗn h p phản
ứng cuối cùng có 3 mM MgCl2, 0.28 mM dNTP, 16 pmol của mỗi loại mồi và 1 U Taq
polymerase. Chu tr nh nhiệt đã đư c thực hiện như sau: (94ºC/1 phút, 55ºC/1 phút,
72ºC/1 phút) × 40 chu kỳ, 72ºC trong 8 phút. Các sản phẩm PCR đư c ph n t ch bằng
điện di trên gel agarose 1.5%. Kết quả: t lệ nhiễm C.trachomatis khi xét nghiệm bằng
phư ng pháp PCR là 27.2% ở phụ nữ không có triệu chứng và 18.9% trên đối tư ng
có triệu chứng. Kiểm tra huyết thanh học đư c thực hiện trên tất cả các m u cho kết
quả nhiễm C.trachomatis là 29.4% và 17.6% tư ng ứng [12].
Theo CDC, số các trường h p chẩn đoán đã gia tăng đến 19% ở đàn ông và
25% ở phụ nữ giữa năm 2008 và 2009. Theo một điều tra mới đ y với quy mô lớn, các
bệnh g y nên bởi C.trachomatis có thể có một vai trò quan trọng trong nguy c sinh
non. H n 4000 phụ nữ có thai đã tham dự vào điều tra này bằng bảng c u hỏi và lấy
m u nước tiểu xét nghiệm C.trachomatis bằng kỹ thuật sinh học ph n tử (PCR). Kết
quả có 4% các phụ nữ dư ng t nh với vi khuẩn này [15]. Mặc dầu có t nh đến những

yếu tố khác (tu i dưới 21, nhiều bạn t nh), nhưng nguy c sinh non, sinh con từ 35
tuần thai nghén ở các trường h p nhiễm trùng do C.trachomatis cao gấp đôi. V vậy,
điều tra phát hiện các phụ nữ có nguy c và sử dụng thuốc kháng sinh th ch h p trong
thời kỳ thai nghén sẽ cho phép làm giảm nguy c này. Nhiễm C.trachomatis có xu
hướng ngày càng tăng, t lệ phát hiện tại Mỹ năm 1987 là 50.8 ca (trong 100.000 dân);
đến năm 2007 là 370.2 ca. Chi phí dành cho điều trị khoảng 3 t USD/năm [18].
Hầu hết các phư ng pháp khuếch đại phát hiện C.trachomatis trong m u dịch
niệu đạo, c tử cung và nước tiểu đã chứng minh là có độ nhạy cao h n so với nuôi
cấy tế bào hoặc các phư ng pháp phát hiện kháng nguyên ( lack 1997). Các phư ng
pháp hiện đang có sẵn, chẳng hạn như Amplicor CT PCR, Roche phát hiện sản phẩm
khuếch đại bằng cách sử dụng peroxidase (HRP). Các phư ng pháp thư ng mại có l i
thế quan trọng, nhưng chi ph cao, không th ch h p với nhiều phòng th nghiệm. Một
số phư ng pháp khuếch đại phi thư ng mại cũng đư c mô tả. Hầu hết bao gồm một
22


phản ứng PCR đ n có sản phẩm đư c ph n t ch dựa vào sản phẩm điện di trên gel
agarose và nhuộm với ethidium bromide. Tuy nhiên phư ng pháp này giảm độ nhạy
do các chất ức chế có trong các m u l m sàng. Ngay cả trong trường h p không có
chất ức chế, phản ứng PCR có thể không đủ nhạy để phát hiện m u có chứa số lư ng
quá t thể c bản (E ) của C.trachomatis.
Theo nghiên cứu của Pamela Cribb, Juan Pablo Scapini và Esteban Serra [22],
phản ứng nested PCR sử dụng hai cặp oligonucleotides (KL5/KL6 và KL1/KL2) làm
mồi có tr nh tự b sung với các đoạn nằm trên cryptic plasmid của C.trachomatis và
sau hai vòng khuếch đại tạo ra một sản phẩm cuối cùng 241 bp.

an đầu, phản ứng

đầu tiên đã đư c chuẩn bị trong thể t ch cuối cùng 50 µl có chứa 10 mM Tris (pH 9,0),
50 mM KCl, 3.5 mM MgCl2, 5 nmol mỗi loại dNTP, 20 pmol mỗi mồi KL5 (5TTGCCTTAACCCCACCATT-3) và KL6 (5-CGTCCTTCCTAAAAGAG-CTA-3) và

1.25 U Taq polymerase (Promega). Sau 35 chu kỳ bao gồm 1 phút ở 94ºC, 1 phút ở
55°C, và 1 phút ở 72°C và một bước kéo dài trong 7 phút ở 72°C; 1 µl sản phẩm của
phản ứng PCR đầu tiên đã đư c chuyển sang một ống phản ứng thứ hai với cùng thành
phần ngoại trừ mồi là 20 pmol mỗi loại mồi KL1 (5-TCCGGAGCGAGTTACTAAGA-3) và KL2 (5-ATCAATGCCCGGGATTGGT- 3) đã đư c thêm vào
hỗn h p phản ứng, và 35 chu kỳ mới đư c thực hiện. Các sản phẩm đư c ph n t ch bởi
điện di trên gel agarose và nhuộm ethidium bromide. Độ nhạy của nested PCR đư c
xác định bằng cách sử dụng số lư ng DNA của C.trachomatis giảm dần. Khảo nghiệm
đã có thể phát hiện DNA tư ng ứng với một E trong phản ứng. Tuy nhiên, độ nhạy
theo thử nghiệm l m sàng có thể thấp h n do chất ức chế PCR bị loại bỏ không hoàn
toàn trong quá tr nh tách chiết DNA. Các kết quả độ nhạy trong thực nghiệm khác
nhau dao động từ 1 đến 10 thể c bản (EB) mỗi phản ứng. Để t m những điều kiện tốt
nhất cho các xét nghiệm, thử nghiệm nồng độ khác nhau cho các thành phần của phản
ứng, khối lư ng và số chu kỳ khuếch đại. Kết quả tối ưu đạt đư c với phản ứng PCR
đầu tiên trong 30 µl thể t ch cuối cùng, có chứa 2.5 nmol dNTP mỗi loại, KL5/KL6 6
pmol mỗi mồi và 25 chu kỳ, tiếp theo với 50 µl của hỗn h p phản ứng thứ hai và 35
chu kỳ. Cuối cùng, để xác định xem phản ứng có là một thử nghiệm chung xác định
C.trachomatis hay không, các th nghiệm tiến hành bằng cách sử dụng các m u khác
để xét nghiệm. Kiểm tra cho thấy độ nhạy tư ng tự đối với m u nước tiểu, dịch niệu
đạo, dịch nhày mũi họng, và bệnh phẩm từ mắt. Kết quả cho thấy nested PCR đối với
23


phát hiện của C.trachomatis trong các m u l m sàng là rất nhạy, có thể phát hiện t
h n 10 E mỗi phản ứng trong các m u sinh học khác nhau; loại bỏ đến mức thấp nhất
việc phát hiện các kết quả m t nh giả bằng cách sử dụng một kiểm soát nội bộ khuếch
đại; đủ mạnh để đối phó với các điều kiện thay đ i trong các phòng th nghiệm khác nhau.
1.3.2. Cá n

n

u tron nướ

Tại Thành phố Hồ Ch Minh, một số nghiên cứu trong cộng đồng cho thấy t lệ
nhiễm C.trachomatis ở phụ nữ thay đ i từ 18% đến 32.5%, trong đó một số yếu tố
nguy c đư c nhận diện như số bạn t nh, độ tu i bắt đầu quan hệ t nh dục, tiền căn
bệnh phụ khoa.
Năm 1995, khảo sát t lệ hiện mắc bệnh l y truyền qua đường t nh dục đư c Vụ
Sức Khỏe à Mẹ Trẻ Em và Kế Hoạch Hóa Gia Đ nh của ộ Y Tế thực hiện ở Việt
Nam [29]. Đối tư ng là các phụ nữ đến khám tại Trung T m Sức Khỏe à Mẹ Trẻ Em
và Kế Hoạch Hóa Gia Đ nh thành phố Hồ Ch Minh trong 10 tuần gồm 812 phụ nữ ở
độ tu i 15 đến 39. Chẩn đoán bệnh lậu dựa trên nuôi cấy và xác nhận bằng một xét
nghiệm kháng thể đ n dòng đặc hiệu cho N.gonorrhoea. Sự hiện diện của
C.trachomatis đư c xác định bằng kỹ thuật ELISA phát hiện kháng nguyên (IDEIA)
trong bệnh phẩm nội mạc c tử cung. TPHA đư c thực hiện cho tất cả các m u máu để
t m bệnh giang mai. T lệ bệnh l y truyền qua đường t nh dục phát hiện đư c ở giang
mai 0.5%, lậu 0.7% và C.trachomatis 2.5%.
Một nghiên cứu cắt ngang về nhiễm HIV và các yếu tố nguy c ở phụ nữ mại
d m tại ph a nam Việt Nam đã đư c Nguyễn Thị Thanh Thủy, Võ Tuyết Nhung,
Nguyễn Văn Thục, Trư ng Xu n Liên và Hạ á Khiêm thực hiện vào 1995-1996 [24].
T ng cộng 968 phụ nữ mại d m ở thành phố Hồ Ch Minh, Cần Th và An Giang
đư c làm xét nghiệm. Các xét nghiệm bệnh l y truyền qua đường t nh dục đư c thực
hiện là: nuôi cấy để ph n lập N.gonorrhoeae, ELISA (Sanofi, Organon) để phát hiện
nhiễm HIV đư c xác nhận bằng Western

lot, TPHA cho giang mai, DIF cho

C.trachomatis và ELISA H sAg cho H V. T lệ hiện mắc của các bệnh l y truyền
qua đường t nh dục đư c phát hiện là 40.4% cho giang mai, 3.3% cho lậu, 5.8% cho
C.trachomatis, 5.2% cho HIV và 9% cho HBV.

24


Trong thời gian từ tháng 2/1998 đến 3/1999, các tác giả đã khảo sát 415 phụ nữ
từ 15-49 tu i có gia đ nh đang sống tại huyện Hóc Môn thành phố Hồ Ch Minh [3].
Các đối tư ng đư c chọn một cách ng u nhiên, nếu có đủ điều kiện nghiên cứu thì lập
danh sách theo phư ng pháp ng u nhiên đ n, sau đó gửi thư mời đối tư ng đến trạm y
tế xã khám phụ khoa và lấy m u. Cách xử lý bệnh phẩm cũng như cách đọc kết quả
đư c tu n theo quy tr nh hướng d n của bộ xét nghiệm do io Merieux cung cấp. Kết
luận dư ng t nh với C.trachomatis khi có h n 10 thể phát huỳnh quang trên quang
trường với vật k nh 40; bệnh phẩm m t nh khi không có thể C.trachomatis phát huỳnh
quang và t nhất phải có h n 50 tế bào thư ng b trên bề mặt của giếng. Kết quả 75
nguời có hiện diện của C.trachomatis trên bệnh phẩm phết c tử cung, như vậy tần
suất lưu hành của viêm c tử cung do C.trachomatis là 18.07%.
T lệ viêm c tử cung do C.trachomatis ở phụ nữ đi khám phụ khoa là 32.5%
của Trần Thị L i tiến hành năm 1999 [8].
Năm 2001-2002, Huỳnh Thị Trọng, Nguyễn Quốc Chinh và Nguyễn Văn Tú đã
thực hiện một nghiên cứu cắt ngang với phư ng pháp chọn m u xác suất với c m u
để xác định t lệ hiện mắc các nhiễm khuẩn đường sinh sản dưới của 2234 phụ nữ đã
kết hôn, ở lứa tu i mang thai, sống tại thành phố Hồ Ch Minh [25]. Các xét nghiệm
đư c thực hiện là: nuôi cấy để ph n lập N.gonorrhoea, Smart Check Chlamydia cho
C.trachomatis. T lệ hiện mắc lậu là 0.2%, C.trachomatis là 0.6%,
Năm 2002-2003, Ủy an D n Số, Gia Đ nh và Trẻ Em Việt Nam – Cục Phòng Chống
AIDS ộ Y Tế và Viện Pasteur thành phố Hồ Ch Minh đã tiến hành nghiên cứu bệnh
l y truyền qua đường t nh dục ở phụ nữ mãi d m tại 5 tỉnh biên giới Lai Ch u, Quảng
Trị, Đồng Tháp, An Giang và Kiên Giang [26]. Có tất cả 703 phụ nữ mãi d m của 5
tỉnh tham gia vào nghiên cứu cắt ngang này. Xét nghiệm bệnh lậu và C.trachomatis
qua m u nước tiểu bằng kỹ thuật Roch Amplicor. T lệ mắc lậu, C.trachomatis,
lậu/C.trachomatis tại Lai Châu 2.0%, 1.0%, 27.3%; Quảng Trị 1.0%, 12.9%, 32.7%;
Đồng Tháp 4.7%, 11.4%, 16.0%; An Giang 7.0%, 10.7%, 11.3% và Kiên Giang 4.0%,

13.4%, 24.4%.
Năm 2003, Trung t m phòng chống bệnh tật Hoa Kỳ (CDC) cùng Viện Da Liễu
trung ư ng tiến hành một cuộc điều tra về t lệ lưu hành STI/HIV của các nhóm quần
25