Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn ACETOBATER XYLINUM cho màng mỏng

Kho¸ luËn tèt

Chuyªn ngµnh Vi

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH – KTNN
---------------------***---------------------

TRẦN THỊ THOA

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI KHUẨN ACETOBACTER
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật học

HÀ NỘI - 2007

TrÇn ThÞ

Líp 29a Khoa Sinh -


Lêi c¶m ¬n
Để hoàn thành đề tài nghiên cứu này em đã nhận được sự hướng dẫn,
chỉ bảo tận tình của TS. Đinh Thị Kim Nhung, các thầy cô giảng dạy bộ môn
Vi sinh. Đồng thời em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong
Khoa Sinh - KTNN đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt đề tài
nghiên cứu này. Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó.
Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2007
Sinh viên thực hiện
Trần Thị Thoa
Lớp 29A – Khoa Sinh – KTNN

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin khẳng định đây là kết quả nghiên cứu của riêng cá nhân tôi, đề
tài nghiên cứu này không trùng với công trình nghiên cứu của các tác giả
khác.
Tác giả
Trần Thị Thoa


MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn
Bản cam đoan
Mục lục
Danh mục bảng và hình
Đặt vấn đề

5

Nội dung

7

Chương 1. Tổng quan tài liệu

7

1.1.

Lược sử nghiên cứu và phân loại vi khuẩn Acetobacter.........................7

1.2.

Đặc điểm chung của vi khuẩn Acetobacter........................................... 10

1.3.

Một số đặc điểm của các nhóm vi khuẩn Acetobacter..........................14

Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

18

2.1. Đối tượng nghiên cứu.............................................................................. 18
2.2. Trang thiết bị và hóa chất......................................................................... 18
2.3. Môi trường............................................................................................... 19
2.4. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 19
Chương 3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận

24

3.1. Phân lập vi khuẩn axetic từ một số nguồn nguyên liệu............................ 24
3.2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum...................................29
cho màng mỏng
3.3. Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum …………… 34
Chương 4. Kết luận và kiến nghị

37

4.1. Kết luận

…………………………………………………………..37

4.2. Kiến nghị

…………………………………………………………..37

Tài liệu tham khảo

38


DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH

Trang

Bảng:
Bảng 1.1. Những đặc điểm phân biệt Acetobacter và.....................................12
Gluconobacter so sánh với Pseudomonas.
Bảng 3.1. Khảo sát khả năng tạo màng của các mẫu......................................29
vi khuẩn axetic.
Bảng 3.2. Khảo sát khả năng tạo màng của một số ……………………….. 33
chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum.

Hình :
Hình 1. Mẫu dịch lên men giấm ……………………………………….......24
Hình 2. Mẫu lên men dịch hoa quả ……………………………………….. 25
Hình 3. Khuẩn lạc phân lập từ giấm................................................................27

Hình 4. Khuẩn lạc phân lập từ dịch hoa quả……………………………… 28
Hình 5. Ảnh vi khuẩn Acetobacter xylinum trên …………………………. 35
kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần.
Hình 6. Vi khuẩn Acetobacter xylinum G11 trên môi trường …………….. 36
thạch

nghiêng.


ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học kĩ thuật và công nghệ,
công nghệ sinh học (CNSH) đã trở thành một ngành kinh tế chủ đạo của nhiều
quốc gia trên thế giới. Là một bộ phận của ngành CNSH, công nghệ vi sinh
vật học đã và đang phát triển mạnh mẽ với những ứng dụng thiết thực vào
nhiều lĩnh vực của cuộc sống như: công nghiệp, nông nghiệp, y học... Bằng
việc ứng dụng các quá trình lên men vi sinh vật vào sản xuất các chế phẩm
chúng ta đã tận dụng và tiết kiệm được chi phí trong việc giải quyết rất nhiều
vấn đề ví dụ như nông nghiệp, công nghiệp, bảo vệ môi trường… Một trong
những chủng vi khuẩn được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ lên men vi
sinh vật học là vi khuẩn Acetobacter (còn gọi là vi khuẩn giấm).
Khi nuôi cấy loại vi khuẩn Acetobacter trên bề mặt môi trường lỏng nó
tạo thành một lớp màng có bản chất là hemixenluloza trên bề mặt thoáng của
dung dịch. Màng này được dùng để làm ra những sợi tơ khỏe và có độ đàn hồi
cao trong môi trường nước nóng. Màng này được xem như một nguyên liệu
mới có tiềm năng ứng dụng để sản xuất micro có độ chính xác cao, sản xuất
thạch dừa, sản xuất giấy chất lượng cao, trong công nghiệp sản xuất đồ ăn
kiêng và đồ ăn tráng miệng… [13]
Trong công nghiệp, nông nghiệp vi khuẩn này được dùng để sản xuất
EM (Effective Micoorganisms) có tác dụng đa hiệu trên nhiều lĩnh vực đặc
biệt trong lĩnh vực xử lý rác thải: EM giúp khử mùi hôi và giảm chi phí 10 lần

so với đốt rác. Trong công nghiệp sản xuất giấy chất lượng cao người ta đã sử
dụng nguyên liệu là màng hemixenluloza tạo thành trong quá trình nuôi cấy vi
khuẩn giấm. Trong công nghiệp thực phẩm, vi khuẩn Acetobacter (chủng
Acetobacter xylinum) được sử dụng để sản xuất thạch dừa - một món ăn giàu
dinh dưỡng và khá phổ biến hiện nay.


Hiện nay, khi nghiên cứu về những tính năng đặc biệt của màng
hemixenluloza cho thấy nó còn có thể thay thế da tạm thời. Công nghệ y học
hiện đại đã công nhận nghiên cứu ứng dụng màng hemixenluloza làm da nhân
tạo là một hướng nghiên cứu triển vọng và có giá trị. Nó có thể thay thế da tạm
thời cho những bệnh nhân bỏng từ cấp độ 1 đến cấp độ 4. Các bác sĩ phẫu
thuật tạo hình, chữa bỏng cho các bệnh nhân bỏng cấp độ 2 ; 3 ; ghép da khi bị
nhiễm trùng đã sử dụng da nhân tạo này và thấy có kết quả tốt như: màng bám
chắc lên bề mặt ngay khi nước bốc hơi, nó không cho nước lỏng thấm qua
nhưng lại cho hơi nước và khí di chuyển qua, màng có độ trong giúp dễ dàng
quan sát sự biến chuyển của vết thương. Đây là những đặc điểm quan trọng
trong ứng dụng y học [13].
Có thể nói vi khuẩn giấm đã và đang được ứng dụng nhiều hơn trong
cuộc sống. Với mong muốn được tìm hiểu thêm về chủng vi khuẩn
Acetobacter và những ứng dụng hữu ích của nó đặc biệt là ứng dụng làm da
nhân tạo trong điều trị bỏng, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập, tuyển
chọn vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng mỏng”.


NỘI DUNG
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Lược sử nghiên cứu và phân loại vi khuẩn giấm
Từ rất lâu trong lịch sử con người đã biết cách làm giấm song chưa hề

nắm được cơ sở khoa học, càng không thể giải thích được bằng cách nào rượu
loãng lại có thể biến thành giấm ăn. Cho đến đầu thế kỷ XIX, khi khoa học kĩ
thuật phát triển, đặc biệt với sự ra đời của kính hiển vi, thế giới vi sinh vật
được khám phá, con người mới biết được giấm là sản phẩm của quá trình lên
men nhờ một nhóm vi sinh vật mà ngày nay người ta gọi chúng là vi khuẩn
Acetobacter hay vi khuẩn axetic [4,5].
Năm 1822, Person đã tiến hành những nghiên cứu đầu tiên về vi khuẩn
Acetobacter từ lớp màng thu được trên bề mặt các bình sản xuất giấm. Ông
khẳng định đó là một loài vi sinh vật và gọi là Mycoderma aceti [7].
Năm 18, Kützing sau khi loại bỏ hết vi sinh vật trong chum làm giấm và
thấy rằng giấm không được tạo thành nữa. Ông đã đưa ra nhận xét: quá trình
lên men giấm nhất thiết phải có mặt vi sinh vật nếu không sẽ không diễn ra sự
chuyển hóa rượu thành giấm. Cũng trong năm 18, Hansen (người Đan Mạch)
đã tách được từ màng giấm ra hai loại vi khuẩn thuần khiết là Mycoderma
aceti và Mycoderma pasteurianum.
Từ năm 1862 đến năm 1868, Pasteur nhờ sự trợ giúp đắc lực của kính
hiển vi đã chứng minh sự đúng đắn trong nhận xét của Kützing và Hansen và
khẳng định bản chất của quá trình lên men giấm. Ông nghiên cứu lớp màng
nhầy xuất hiện trên bề mặt bia, rượu vang và đi đến kết luận: màng đó được
tạo thành do một loại trực khuẩn, và ông cũng gọi trực khuẩn đó là
Mycoderma aceti.


Cùng với những nghiên cứu trên về vi khuẩn Acetobacter, các nghiên
cứu khác cũng như những nghiên cứu sau này đều nhằm tìm hiểu rõ thêm và
tìm cách cải thiện quá trình lên men giấm. Hiện nay, người ta đang đi vào
nghiên cứu những ứng dụng mới của vi khuẩn Acetobacter bằng cách phân lập
các chủng vi khuẩn thuần khiết, nghiên cứu các đặc điểm cấu tạo, sinh lý, sinh
hóa của chúng nhằm tìm ra những chủng tốt nhất cho từng ứng dụng trên cơ sở
đối chiếu với các tiêu chuẩn phân loại đã được đưa ra.

1.1.1. Các tiêu chuẩn phân loại vi khuẩn Acetobacter
+ Địa điểm nơi phân lập: là nơi cư trú có liên quan đến điều kiện môi
trường sống.
+ Đặc điểm hình thái: đó là hình dạng tế bào, cách sắp xếp tế bào, khả
năng di động, màu sắc, sự hình thành tiêm mao, vỏ nhày, màu sắc khi nhuộm
Gram…
+ Đặc điểm nuôi cấy: dựa vào trạng thái vết mọc, đặc điểm vết mọc, đặc
tính vết mọc (trơn, xù xì…), tính chất vết mọc (đục, trong…), màu sắc vết
mọc trên môi trường thạch... Trên môi trường lỏng cần lưu ý tình trạng môi
trường sau thời gian nuôi cấy (đục hay trong, có mùi hay không có mùi).
+ Đặc điểm sinh lý: mối quan hệ với các yếu tố nhiệt độ, pH của môi
trường, khả năng hình thành sắc tố, quan hệ với oxy (thuộc loại hiếu khí hay
kỵ khí…), khả năng lên men axetic, khả năng sử dụng các hợp chất vô cơ và
hữu cơ.
1.1.2. Phân loại vi khuẩn Acetobacter
Việc tiến hành phân loại vi khuẩn Acetobacter được thực hiện từ thế kỉ
XIX. Từ năm 1898 Rothenback đã tiến hành phân loại, tiếp theo là Hoyer
(1899). Cũng trong năm 1899, Beijerink đã phân loại vi khuẩn Acetobacter
dựa vào hai dấu hiệu [6]:


- Một là: Khả năng sử dụng đạm amoni để thực hiện quá trình sinh
trưởng và phát triển của vi khuẩn Acetobacter.
- Hai là: Có hay không có giai đoạn di động trong quá trình phát triển.
Còn Heneberg (1926) lại chia các vi khuẩn axetic thành 4 nhóm dựa vào
nơi sống đặc trưng của chúng:
- Nhóm 1: vi khuẩn không phát triển trên bia vì hoa Hublon độc với
chúng.
- Nhóm 2: vi khuẩn phát triển trên bia.
- Nhóm 3: vi khuẩn phát triển trong dung dịch rượu vang.

- Nhóm 4: vi khuẩn dùng để sản xuất giấm theo phương pháp nhanh.
Năm 1934, theo nghiên cứu của các nhà vi khuẩn học người Hoa Kỳ, vi
khuẩn axetic có khả năng sử dụng các hợp chất tương đối đơn giản của cacbon
và nitơ nên đã kết hợp chúng vào họ Nitrobacteriaceae. Từ đó vi khuẩn axetic
được gọi là Acetobacter.
Năm 1936, Kenyver và Wanniel cùng Staniel đã đề xuất ý kiến ghép vi
khuẩn Acetobacter vào họ Pseudomonas do chúng có hiện tượng ghép cực
xoắn ở phần di động.
Năm 1948, Vaught đã công bố những kết quả thu được khi quan sát sự
di động của nhiều loại vi khuẩn: Acetobacter aceti, Acetobacter oxydans,
Acetobacter zancens, Acetobacter melanognum, Acetobacter pasteurianum.
Ông kết luận những loài trên cùng thuộc một loại có đơn mao ở cực và đã xác
nhận vị trí của vi khuẩn Acetobacter ở trong họ Pseudomonas.
Ngày nay, theo khóa phân loại của Bergeys (1914) và nhiều tác giả khác
vi khuẩn Acetobacter và Gluconobacter – các vi khuẩn acetic - được xếp vào
một họ riêng là Acetobacteriaceae. Trong khóa phân loại của Bergeys, đáng
chú ý nhất là khóa phân loại các loài thuộc giống Acetobacter, ông đã phân
giống Acetobacter thành hai loại:


Loại 1: Oxy hóa axit axetic thành CO2 và H2O. Loại này gồm:
+ Sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất (dung dịch Hoyer), đại
diện là vi khuẩn Acetobacter aceti.
+ Không sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất: trên bề mặt môi
trường dịch thể nuôi cấy có tạo màng nhầy chứa xenluloza, điển hình vi khuẩn
Acetobacter xylinum; trên bề mặt môi trường dịch thể nuôi cấy không tạo
màng nhầy có chứa xenluloza, điển hình: Acetobacter zancens, Acetobacter
pasteurianum, Acetobacter kneizianus.
Loại 2: Không có khả năng oxy hóa axit axetic.
+ Tạo sắc tố nâu trên môi trường glucoza:

- Sắc tố nâu đến đen nhạt: Acetobacter melanogenus.
- Sắc tố hồng: Acetobacter zancens.
+ Không tạo sắc tố:
o

o

o

o

- Nhiệt độ thích hợp nhất là giữa 30 C đến 35 C: Acetobacter
suboxydan.
- Nhiệt độ thích hợp nhất là giữa 18 C đến 21 C: Acetobacter
oxydans.
Năm 1960, Shilwel và Carr nghiên cứu về đặc trưng nuôi cấy sinh hóa
của vi khuẩn Acetobacter và đưa ra kết luận không thể có sự phân loại đồng
nhất vi khuẩn Acetobacter.
Những nghiên cứu về đặc điểm, về sự phân loại vi khuẩn Acetobacter
này đã tạo cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo, đồng thời tạo thuận lợi cho
việc ứng dụng các chủng vi khuẩn đó vào đời sống thực tiễn sau này. Hiện nay
người ta đã sử dụng vi khuẩn giấm một cách rộng rãi trên quy mô công nghiệp
tạo ra rất nhiều sản phẩm có ý nghĩa thực tiễn lớn.


1.2. Đặc điểm chung của vi khuẩn Acetobacter
Như đã nêu ở trên, tác nhân chính của quá trình lên men axetic là vi
khuẩn Acetobacter. Dựa vào đặc điểm đối chiếu với các tiêu chuẩn phân loại
học thấy rằng chúng thuộc vào hai giống vi khuẩn Acetobacter có chu mao
hoặc không và Gluconobacter đơn mao, đó là hai giống vi khuẩn quan trọng

nhất của họ Acetobacteriaceae (Lapent et al – 1990, Bergeys – 1989), chúng
sống phổ biến trong tự nhiên, trên bề mặt lá, hoa quả,… có khả năng tạo ra
axit axetic từ rượu etylic. Trong tế bào Gluconobacter không có chu trình
Tricacbonxylic (ATC) hoạt động nên nó không thể oxy hóa axit axetic song lại
có một chu trình khác thay thế (chu trình Glyoxylat), không oxy hóa axit
axetic nhưng vẫn có chu trình photphoril hóa. Ngược lại trong tế bào
Acetobacter xảy ra các quá trình trên. Khi so sánh vi khuẩn này với vi khuẩn
thuộc giống Pseudomonas thấy chúng có những đặc điểm tương tự. Chúng chỉ
khác Pseudomonas ở chỗ chịu được nồng độ axit cao hơn, khả năng chuyển
hóa pepton yếu, ít di động và không sinh sắc tố. Nhiều loài vi khuẩn
Acetobacter khi phát triển trên môi trường thiếu thức ăn hoặc môi trường đã
nuôi cấy lâu ngày (môi trường già) dễ bị biến đổi hình thái (tế bào phình to,
kéo dài hoặc phân nhánh).
Tuy nhiên, cơ sở để xếp vi khuẩn axetic vào nhóm độc lập là khả năng
oxy hóa rượu etylic thành axit axetic ở pH = 4,5. Ngoài ra, chúng còn thực
hiện quá trình oxy hóa không hoàn toàn các hợp chất hữu cơ khác (các loại
đường và dẫn xuất của chúng) để tạo thành các hợp chất xeton hoặc các axit
hữu cơ tương ứng. Vi khuẩn axetic chỉ phát triển tốt trong điều kiện hiếu khí;
o

o

nhiệt độ thích hợp từ 25 C – 30 C; pH thích hợp từ 4,5 – 6,8; hóa dị dưỡng
hữu cơ.


Bảng 1.1. Những đặc điểm phân biệt Acetobacter và Gluconobacter
so sánh với Pseudomonas.
Đặc điểm so sánh

Gluconobacter

1. Vị trí tiêm mao

Acetobacter

Pseudomonas

Đơn mao ở cực Chu mao hoặc Chu mao ở cực
hoặc không

không có

2. Phát triển ở pH: 4,5

+

+

_

3. Oxy hóa etanol

+

+

_

4. Oxy hóa axit axetic

_

+

+

5. Oxy hóa Lactat

_

+

+

6. Glucoza→Gluconate

+

±

±

7. Sử dụng Gelatin

_

_

±

8. Sử dụng tinh bột

_

_

±

_

_

±

Lactose
9. Sắc tố huỳnh quang
Ghi chú:

Dấu (+)

: có

Dấu (-)

: không

Dấu (±)

: có hoặc không

Về hình dạng tế bào, vi khuẩn Acetobacter là những trực khuẩn hình que
đến elip, kích thước từ 0,6 – 0,8 µm. Các tế bào đứng riêng rẽ hoặc xếp thành
chuỗi hoặc có loại tế bào hình cầu, có loại hình chỉ. Tùy thuộc vào điều kiện môi
trường, nhiệt độ nuôi cấy một số loại có hình bán nguyệt. Vi khuẩn Acetobacter
không có khả năng sinh bào tử, tạo màng nhầy, một số có khả năng di động nhờ
tiêm mao, một số không có khả năng này [1], [2], [3].
Qua nhiều nghiên cứu về khuẩn lạc và màng vi khuẩn Acetobacter trên môi
trường nuôi cấy cho thấy vi khuẩn Acetobacter phát triển tốt nhất trên môi trường
nước bia, môi trường có chứa cao nấm men, glucoza, rượu etylic hoặc manitol.
Trên môi trường đặc chúng phát triển thành những khuẩn lạc tròn,


đều đặn, đường kính trung bình là 3 mm. Một số loại như Acetobacter aceti,
Acetobacter xylinum có khuẩn lạc rất nhỏ (d = 1 mm), bề mặt trơn bóng, phần
giữa khuẩn lạc lồi lên, dày và sẫm màu hơn các vùng xung quanh. Một số loại
khác có khuẩn lạc lớn hơn (d = 4 – 5 mm), không có màu, mỏng như những
hạt sương nhỏ, dễ dàng dùng que cấy gạt ra khỏi môi trường. Có loại tạo thành
khuẩn lạc ăn sâu vào môi trường, khó lấy ra bằng que cấy. Trên môi trường
lỏng vi khuẩn Acetobacter chỉ phát triển trên bề mặt môi trường tạo thành
những màng dày nhẵn và trơn, khi lắc thì chìm xuống đáy bình và thay vào đó
là một lớp màng mới được hình thành, dịch dưới màng này thường trong suốt.
Khi nghiên cứu màng này thấy có sợi xenluloza giống như sợi bông. Loại thứ
hai màng mỏng như giấy xelofan, một số khác trên bề mặt của màng không
nhẵn mà nhăn nheo, một số nữa thì tạo màng mỏng dễ vỡ, bám trên thành bình
và dịch nuôi cấy không trong [8].
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, nhu cầu dinh dưỡng của vi
khuẩn Acetobacter đối với nguồn cacbon, nitơ và các chất kích thích sinh
trưởng là rất đa dạng. Chúng sử dụng chủ yếu đường glucoza hoặc saccaroza,
rượu etylic và các axit hữu cơ khác làm nguồn cacbon; muối amoni làm nguồn

nitơ; muối photphat làm nguồn photpho. Ngoài ra, trong quá trình phát triển
chúng còn có nhu cầu với một số loại axit amin như: valin, alanin, prolin,… và
một số chất kích thích sinh trưởng như: para-aminobenzoic, axit nicotinic, axit
pantoneic, biotin,… các chất này có vai trò quan trọng trong sinh trưởng của vi
khuẩn Acetobacter [9].
Một số vi khuẩn Acetobacter có khả năng tự tổng hợp polisaccarit phân
tử lớn như: xenluloza, đextran và người ta ứng dụng khả năng này trong công
nghiệp. Một số ít loài vi khuẩn Acetobacter có thể tổng hợp được những sợi
xenluloza giống như bông, điển hình là Acetobacter xylinum. Một số loài tổng


hợp được đextran giống như Leuconostoc mesenteroides khi môi trường thiếu
đextran hoặc xenluloza.
Vi khuẩn Acetobacter có khả năng oxy hóa gluxit theo 4 hướng sau:
- Hướng thứ nhất: không có sự photphoril hóa cơ chất với sự tham gia
của các enzym đặc hiệu.
- Hướng thứ hai: oxy hóa các hợp chất đã được photphoril hóa trong con
đường Pentose phosphate
- Hướng thứ ba: theo sơ đồ Enter – Doudroff.
- Hướng thứ tư: theo chu trình Crep ( Krebs) hoặc Glyoxylat.

1.3. Một số đặc điểm của các nhóm vi khuẩn Acetobacter
1.3.1. Acetobacter aceti
Trực khuẩn ngắn, kích thước 0,4 - 0,8 x 1 – 1,2 µm, không di động
được, thường xếp thành chuỗi dài, bắt màu Gram âm, màu vàng với thuốc
nhuộm iôt. Khuẩn lạc to, sáng trên Gelatin với dịch lên men chứa 10% đường
saccaroza tạo thành màng nhầy, nhẵn. Chúng có khả năng phát triển trên môi
trường có nồng độ rượu cao (11%) và có thể tích lũy đến 6% axit axetic trong
môi trường. Chúng thường phát triển trên môi trường bia với nhiệt độ thích
o

hợp là 30 C.
1.3.2. Acetobacter xylinum
Trực khuẩn hình que, kích thước khoảng 2 µm, tế bào đứng riêng rẽ
hoặc xếp thành từng chuỗi, không di động được, các tế bào được bao bởi chất
nhầy tạo váng nhăn và dày: váng có chứa hemixenluloza nên khi gặp H2SO4
và thuốc nhuộm iôt sẽ bắt màu xanh (do phản ứng của hemixenluloza), chúng
có thể tích lũy 4,5% axit axetic trong môi trường. Chúng thường sống chung
với nấm men trong “nấm chè” còn gọi là “thủy hoài sâm”, “hải bảo” hay “vị
bảo” - một loại nước chua có vị thơm dùng để pha nước giải khát trong gia


đình, trên bề mặt nước có một váng vi sinh vật dày được nuôi sống bằng nước
chè đường.
1.3.3. Acetobacter pasteurianum
Có hình dạng tương tự như Acetobacter aceti nhưng váng vi khuẩn có
dạng khô và nhăn nheo, bắt màu xanh với thuốc nhuộm iôt, tế bào xếp dời
nhau thành chuỗi, đôi khi bắt gặp tế bào có dạng hình chùy phồng lên, di dộng
không thường xuyên. Khuẩn lạc trên Genlatin nhỏ, tròn. Nhiệt độ thích hợp để
o

phát triển là 30 C.
1.3.4. Acetobacter acetosum
Trực khuẩn có khích thước 0,4 – 0,8 x 1 µm. Các tế bào xếp riêng rẽ
thành từng chuỗi, không di động được. Nhiệt độ thích hợp nhất cho chúng phát
o

o

triển là 30 C – 36 C.

1.3.5. Acetobacter kützingianum
Có màng nhầy, nhẵn ở mép và được nâng cao lên theo thành bình. Tế
bào dạng trực khuẩn, ngắn, to, thô, không di động. Khuẩn lạc trên Gelatin với
dịch lên men nhớt, nhỏ tạo thành màng xếp nếp to trên môi trường ẩm. Thích
o

hợp phát triển ở 30 C.
1.3.6. Acetobacter shiitzenbacchii
Trực khuẩn khá dài, kích thước khoảng 0,3 – 0,4 x 1,0 – 3,6 µm, thường
xếp đôi hoặc đứng riêng rẽ, có thể tạo váng nhày và không bền vững. Có khả
năng tích lũy trong môi trường đến 11,5% axit axetic do đó thường được sử
dụng để chuyển hóa rượu thành giấm theo phương pháp Đức (phương pháp
nhanh).
1.3.7. Acetobacter lindreni
Trực khuẩn xếp riêng rẽ tạo chuỗi, thỉnh thoảng có tế bào phồng to như
hình cầu, không di động. Khuẩn lạc trên Gelatin với dịch lên men tròn, nhỏ,


màu vàng; trên môi trường lỏng tạo váng màu nâu, nhớt. Thích hợp phát triển
o

ở 25 C.
1.3.8. Acetobacter orleanense
Trực khuẩn dài trung bình, không di động, gặp điều kiện nhiệt độ cao có
thể sinh ra tế bào dị hình kéo dài hoặc phình to ra. Tạo váng vi khuẩn rất dày
trên môi trường lỏng. Có thể phát triển trong môi trường có nồng độ rượu cao
(10% - 12%) và tích lũy đến 9,5% axit axetic. Thường được dùng để chuyển
hóa rượu vang thành giấm theo phương pháp Pháp (phương pháp chậm hay
o

o

phương pháp Orleans). Thích hợp phát triển ở 25 C – 30 C.
1.3.9. Acetobacter suboxydans
Có dạng hình que ngắn, đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi ngắn,
không có khả năng di động, tạo thành những váng mỏng ,dễ vỡ. Có khả năng
chuyển hóa glucoza thành axit gluconic, oxy hóa rượu sobit thành socboza –
dùng để sản xuất axit ascorbic – vitamin C. Loại vi khuẩn này muốn phát triển
bình thường cần được cung cấp một số chất sinh trưởng: axit paraaminobenzoic, axit patoneic, axit nicotinic.
1.3.10. Acetobacter hoshigakii
Trực khuẩn có kích thước 0,7 – 0,9 x 1,5 – 1,8 µm, thường xếp riêng rẽ
không di động. Khuẩn lạc trên thạch với chất chiết rút từ đậu nành nhỏ, tròn,
dạng hạt xám sau đó chuyển thành màu nâu. Khuẩn lạc trên thạch với dịch lên
men tròn, màu trắng sữa, về sau phần giữa khuẩn lạc hóa nâu, phía ngoài màu
vàng nhạt. Có khả năng tạo thành axit gluconic. Nhiệt độ thích hợp cho sự
o

o

phát triển là từ 30 C – 35 C.
1.3.11. Acetobacter ascendens
Trực khuẩn không di động, các khuẩn lạc trên glucoza, genlatin khô
trắng với vành sáng chói. Trên môi trường lỏng tạo thành màng nhày chắc,
o

nâng lên theo thành bình. Thích hợp phát triển ở 25 C.


1.3.12. Acetobacter oxydans
Trực khuẩn có kích thước 0,8 – 1,2 x 2,4 – 2,7 µm, các tế bào rời nhau

hoặc xếp thành chuỗi. Quan sát trong chuỗi thấy có tế bào phồng to lên, di
động. Khuẩn lạc trên gelatin tròn sau trở thành dạng không cân đối với sự
o

o

phân nhánh đặc trưng. Nhiệt độ thích hợp từ 18 C – 21 C.
1.3.13. Acetobacter plicatum
Trực khuẩn có kích thước 0,4 – 0,6 x 1,4 – 1,6 µm, không di động.
Khuẩn lạc trên gelatin rượu vang tròn trịa, hơi nhô lên, sáng, ẩm ướt, nhớt.
o

o

Nhiệt độ thích hợp từ 25 C – 30 C [4].
o

o

Hầu hết các loài Acetobacter thường phát triển tốt nhất ở 25 C – 30 C,
đều có khả năng sử dụng muối photphat, đa số đòi hỏi cung cấp thêm vitamin,
chúng có khả năng oxy hóa rượu thành axit và trong quá trình sinh trưởng,
phát triển chúng tạo ra một lớp màng dày có bản chất hemixenluloza trên bề
mặt môi trường nuôi cấy. Với những nghiên cứu hiện nay cho thấy lớp màng
này có thể được ứng dụng vào rất nhiều nghành quan trọng có ý nghĩa thực
tiễn trong cuộc sống. Đồng thời khả năng tạo màng của các chủng vi khuẩn
trên rất khác nhau vì vậy cần phải tuyển chọn ra những chủng vi khuẩn có khả
năng tạo màng tốt nhất và phù hợp với mục đích sử dụng của từng loại màng.

Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là các chủng vi khuẩn thuần khiết được phân lập
từ màng các nguồn nguyên liệu là giấm, dịch hoa quả loãng trong phòng thí
nghiệm Vi sinh, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2. Từ các chủng phân lập
được tuyển chọn ra những chủng có khả năng cho màng dai, mỏng, trong.

2.2. Trang thiết bị và hóa chất
2.2.1. Trang thiết bị
Khi tiến hành nghiên cứu cần có những thiết bị và dụng cụ như: hộp
lồng, ống nghiệm, bàn trang thủy tinh, phễu thủy tinh, cốc thủy tinh, que cấy,
đèn cồn, lam kính, lamen, bình cầu, bình thủy tinh, bình tam giác, pipet, nồi
hấp cao áp Autoclave, buồng cấy vô trùng, tủ sấy, cân phân tích, kính hiển vi
quang học…
2.2.2. Hóa chất
- Các loại đường chuẩn: glucoza, saccaroza, fructoza, mantoza, manitol.
- Một số hợp chất hữu cơ: rượu etylic (C2H5OH), axit axetic
(CH3COOH), pepton, agar-agar, dịch chiết nấm men (cao nấm men), axit
xucxinic, axit lactic, phenolphtalein.
- Một số hợp chất vô cơ: K2HPO4, KH2PO4,

MgSO4.7H2O,

(NH4)2SO4, (NH4)2HPO4, Na2HPO4.12H2O, CaCO3, NaOH chuẩn.
- Một số loại thuốc nhuộm: tím Gentian, dung dịch Fucshin, dung dịch
Lugol, thuốc nhuộm iôt và H2SO4.


2.3. Môi trường

Chúng tôi đã sử dụng một số môi trường có thành phần như sau:
Thành phần

Môi trường

Môi trường

Môi trường

Môi trường

số 1

số 2

Nước máy

1000ml

1000ml

1000ml

0

(NH4)2SO4

8g

8g

0

0

(NH4)2HPO4

2g

2g

0

0

K2HPO4

5g

5g

0

0

KH2PO4

2g

2g

0

0

C6H12O6

20g

20g

20g

0

MgSO4.7H2O

2g

2g

0

0

CaCO3

10g

0

0

0

Agar-agar

20g

20g

0

0

Pepton

0

5g

5g

0

Na2HPO4.12H2O

0

0

5g

0

Dịch chiết nấm

0

0

5g

0

0

2ml

4ml

0

C2H5OH

2ml

2ml

2ml

0

Nước dừa

0

0

0

1000ml

số 3

số 4

men
CH3COOH

Chú ý: Axit axetic (CH3COOH) và rượu etylic (C2H5OH) bổ sung sau
khi hấp môi trường lần thứ ba [6], [8], [9].

2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phân lập vi khuẩn Acetobacter theo phương pháp của Vinogradski
Để có được những chủng vi khuẩn Acetobacter, chúng tôi tiến hành
phân lập từ các nguồn nguyên liệu là giấm, dịch hoa quả theo phương pháp
phân lập của Vinogradski. Trước hết thực hiện quá trình lên men giấm trên các

nguồn nguyên liệu trên. Vi khuẩn axetic là loại vi khuẩn hiếu khí nên chúng
phát triển trên môi trường lỏng tạo thành một lớp màng dai, màu trắng, màng
đó bao gồm tập hợp các vi khuẩn axetic, lấy màng đó đưa vào môi trường số
3. Môi trường số 3 được pha chế đầy đủ các thành phần, khử trùng trong nồi
hấp Autoclave ở áp suất 0,5 atm, trong ba ngày liên tiếp, để nguội, bổ sung
rượu etylic và axit axetic, chia và các bình cầu hoặc bình tam giác. Sau khi thả
o

o

màng vào giữ trong tủ ấm 28 C – 30 C trong thời gian 7 – 10 ngày (chú ý khi
nút bông các bình không nút quá chặt cũng không quá lỏng) trên bề mặt môi
trường xuất hiện một lớp màng mới. Từ màng này tiến hành phân lập để thu
nhận vi khuẩn Acetobacter.
Khi phân lập cần pha loãng nồng độ sinh vật. Chúng tôi sử dụng
phương pháp pha loãng của Pasteur. Dùng dung dịch NaCl 0,5% vô trùng
hoặc nước cất để pha loãng. Sử dụng pipet vô trùng chia vào các ống nghiệm
vô trùng mỗi ống 9 ml dung dịch NaCl hoặc nước cất, sau đó dùng pipet lấy
1ml dịch lên men cho vào một ống nghiệm có chứa sẵn 9 ml nước cất trên, lắc
-1

đều ta được dung dịch pha loãng với nồng độ 10 . Dùng pipet lấy 1 ml dung
-1

dịch ở ống có độ pha loãng với nồng độ 10 nhỏ vào ống nghiệm thứ hai
-2

(cũng có 9 ml nước), lắc đều ta được dung dịch pha loãng với nồng độ 10 .
-10

Tiếp tục pha loãng như vậy đến nồng độ 10

ta được 10 ống nghiệm chứa
-1

-10

dung dịch lên men hay dung dịch vi khuẩn với các nồng độ từ 10 đến 10 .
Sau đó phân lập trên môi trường thạch đĩa (môi trường 1 đã hấp tiệt trùng và
đổ vào các hộp lồng hay hộp petri, để nguội); nhỏ một giọt dung dịch vi khuẩn
đã pha loãng lên bề mặt môi trường thạch, dùng bàn trang thủy tinh (vô trùng)
o

trang đều một lần khắp mặt thạch. Bao gói cẩn thận và giữ ở nhiệt độ 28 C –
o

30 C, khoảng 5 – 7 ngày sau trên bề mặt môi trường thạch xuất hiện các khuẩn
lạc riêng rẽ. Dựa trên những đặc điểm khuẩn lạc của vi khuẩn Acetobacter so
sánh đối chiếu để chọn ra những khuẩn lạc của vi khuẩn Acetobacter.


2.4.2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn Acetobacter cho màng xenluloza theo
phương pháp của Graxinop
Trước khi tuyển chọn cần phải nhân giống các chủng vi khuẩn bằng
cách: từ mỗi khuẩn lạc đã chọn trên dùng que cấy đầu tròn (đã khử trùng trên
ngọn lửa đèn cồn) gợt lấy khuẩn lạc cấy vào một ống nghiệm đã được đổ môi
trường thạch (môi trường số 2, đặt nghiêng, để nguội) theo đường ziczăc. Mỗi
ống là một mẫu riêng biệt tương ứng với từng khuẩn lạc và được mã hóa bằng
một ký hiệu riêng. Để vào tủ ấm 5 – 6 ngày các vi khuẩn sẽ phát triển theo
đường cấy. Tiếp theo là tuyển chọn các chủng vi khuẩn Acetobacter trong môi

trường oxy hóa. Môi trường oxy hóa dùng để tuyển chọn Acetobacter là môi
trường lỏng.
Dựa vào khả năng tạo màng của các mẫu vi khuẩn trên môi trường dịch
thể tuyển chọn sau ba lần liên tiếp chọn ra những chủng có khả năng tạo màng
dai, mỏng, trong thời gian ngắn.
Để giữ giống cần tiến hành cấy chuyển giống từ ống thạch nghiêng này
sang ống thạch nghiêng khác với chu kì 2 tháng một lần.
2.4.3. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn Acetobacter thuần khiết
Sau khi đã có các chủng vi khuẩn Acetobacter cho màng xenluloza trên
môi trường oxy hóa chúng tôi tiến hành tuyển chọn các chủng vi khuẩn
Acetobacter thuần khiết dựa trên những đối chiếu định loại đặc điểm khuẩn lạc
trên hai môi trường A và B.
Môi trường A: dịch chiết nấm men 3%, CaCO3 2% , Agar-agar 2%,
rượu etylic 15% - 2 ml. Khi nuôi cấy giống vi khuẩn axetic trên môi trường
này nếu là Gluconobacter thì có một vòng sáng xung quanh khuẩn lạc, nếu là
Acetobacter thì vòng sáng rõ hơn và có một lớp cặn đục ở viền khuẩn lạc
hướng về phía vòng sáng.


Môi trường B: dịch chiết nấm men 3%, Agar-agar 2%, rượu etylic
15% - 1 ml, xanh lục bromocresol 2,2% - 1ml. Khi cấy giống vi khuẩn axetic,
nếu là Gluconobacter sẽ làm cho môi trường biến đổi thành màu vàng, nếu là
Acetobacter cũng làm môi trường biến đổi thành màu vàng nhưng có một vành
màu xanh lơ do quá trình oxy hóa các axit.
2.4.4. Phân biệt tế bào vi khuẩn Acetobacter bằng phương pháp nhuộm
gram
Vi khuẩn Acetobacter là các vi khuẩn Gram âm, do đó có thể phân biệt
tế bào vi khuẩn Acetobacter nhờ phương pháp nhuộm Gram (nhuộm kép). Lấy
màng dai màu trắng hoặc dịch nuôi cấy hoặc các chủng đã cấy trong môi
trường thạch nghiêng làm tiêu bản.

Phương pháp nhuộm Gram gồm các bước sau:
- Rửa sạch lam kính bằng NaOH sau đó rửa bằng HCl hoặc H2SO4, rồi
rửa lại bằng cồn, nước cất và lau khô.
- Nhỏ một giọt nước vô trùng lên lam kính, dùng que cấy khử trùng trên
ngọn lửa đèn cồn, để nguội, lấy một ít màng màu trắng hoặc dịch nuôi cấy
hoặc giống vi khuẩn hòa vào giọt nước vô trùng đó, hơ qua trên ngọn lửa đèn
cồn để cố định vết bôi (cách ngọn lửa đèn cồn 10 – 15 cm).
- Đặt lên trên vết bôi miếng giấy lọc, nhỏ dung dịch tím Gentian giữ
trong 1 – 2 phút.
- Lấy miếng giấy lọc ra, nghiêng cho thuốc nhuộm chảy xuống chậu
hứng, nhỏ dung dịch Lugol lên trên vết bôi, giữ trong vòng 5 phút.
- Rửa tiêu bản bằng nước, rửa bằng cồn (20 giây) sau đó rửa tiếp bằng
nước.
- Nhỏ dung dịch Fucshin lên giữ trong 1 – 2 phút.
- Rửa lại tiêu bản bằng nước, hong khô tự nhiên.


Mục đích của phương pháp nhuộm Gram là để phân biệt vi khuẩn gram
-

+

âm (Gr ) với vi khuẩn Gram dương (Gr ). Nếu sau khi nhuộm kép mà tế bào
-

bắt màu hồng thì đó là vi khuẩn Gr . Ngược lại, nếu bắt màu tím thì đó là vi
+

–

+

khuẩn Gr . Khả năng bắt màu của vi khuẩn Gr và Gr khác nhau là do chất
+

nguyên sinh của tế bào vi khuẩn Gr được cấu tạo từ một loại protein đặc biệt
chứa muối Nucleatmagie có khả năng tạo với tím Gentian và Lugol một phức
chất bề khó bị rửa trôi bởi cồn nên khi quan sát trên tiêu bản thấy tế bào của vi
+

–

khuẩn Gr bắt màu tím Gentian. Trong khi đó những vi khuẩn Gr không có
khả năng tạo phức chất bền với thuốc nhuộm Gentian và Lugol nên dễ bị rửa
-

trôi bởi cồn. Do đó, khi nhỏ Fucshin lên tế bào vi khuẩn Gr bắt màu hồng –
màu của Fucshin.
2.4.5. Phương pháp tuyển chọn các chủng vi khuẩn Acetobacter cho màng
mỏng
Mục đích khi tiến hành nghiên cứu này là để chọn ra những chủng vi
khuẩn Acetobacter cho màng mỏng, vì vậy chúng tôi tiến hành tuyển chọn các
chủng cho màng mỏng nhất dựa trên những quan sát cụ thể sau:
- Quan sát quá trình hình thành màng.
- Quan sát đặc điểm màng tạo thành trên môi trường lỏng (dày,
mỏng, trơn, có ăn theo thành bình hay không).
- Dùng thước đo độ dày màng.
- Quan sát đặc điểm môi trường nuôi cấy của các mẫu vi khuẩn
Acetobacter xylinum (đục hay trong).
- Quan sát hình dạng tế bào trên kính hiển vi quang học và trên

kính hiển vi.


Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập vi khuẩn axetic từ một số nguồn nguyên liệu
Để tuyển chọn được các chủng vi khuẩn axetic khác nhau, chúng tôi tiến
hành phân lập từ các nguồn nguyên liệu khác nhau: dịch hoa quả loãng, giấm.
Trước tiên, cần chuẩn bị dịch lên men giấm và dịch hoa quả loãng. Cho
vào bình tam giác hoặc bình cầu có dung tích 500 ml khoảng 200 ml giấm,
hoặc dịch hoa quả, thêm vào đó một vài lát chuối tiêu đã bóc vỏ để cung cấp
thêm nguồn gluxit, vitamin cho vi khuẩn axetic phát triển. Đậy bằng nút bông,
o

o

cho vào tủ ấm nuôi ở 28 C – 32 C. Sau 5 – 7 ngày trên bề mặt thoáng của bình
cầu sẽ xuất hiện lớp màng màu trắng, màng đó chính là tập hợp tế bào vi
khuẩn axetic có trong dịch lên men từ hai nguồn nguyên liệu trên (Hình 1,2).

Hình 1. Mẫu dịch lên men giấm