Nghiên cứu chiết tách, chuyển hóa hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học của các triterpenoid từ cây rau má Centella asiatica (L.) Urban, Họ hoa tán Apiaceae) (LA tiến sĩ)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

VÕ THỊ QUỲNH NHƢ

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, CHUYỂN HÓA HÓA HỌC VÀ THĂM
DÕ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC TRITERPENOID TỪ CÂY
RAU MÁ [CENTELLA ASIATICA (L.) URBAN] HỌ HOA TÁN
(APIACEAE)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

HÀ NỘI - 2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

VÕ THỊ QUỲNH NHƢ
NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, CHUYỂN HÓA HÓA HỌC VÀ THĂM
DÕ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC TRITERPENOID TỪ CÂY

RAU MÁ [CENTELLA ASIATICA (L.) URBAN] HỌ HOA TÁN
(APIACEAE)
Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
Mã số: 62 44 01 14
LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:

1. GS.TSKH. Trần Văn Sung
2. TS. Trần Văn Lộc

HÀ NỘI - 2017


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự
hướng dẫn khoa học của GS.TSKH. Trần Văn Sung và TS. Trần Văn Lộc. Các số
liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công
trình nào khác.

Hà Nội, ngày

tháng

năm 2017

Tác giả luận án

Võ Thị Quỳnh Như

LỜI CẢM ƠN
Luận án này được hoàn thành tại Phòng Tổng hợp hữu cơ, Viện Hóa học,
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Trong quá trình nghiên cứu, tôi đã
nhận được nhiều sự giúp đỡ chân tình của các thầy cô, các nhà khoa học cũng như
đồng nghiệp, bạn bè và người thân.
Với lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất, tôi xin gửi đến GS. TSKH. Trần
Văn Sung và TS. Trần Văn Lộc – những người thầy đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, tận
tình hướng dẫn và có nhiều góp ý quý báu trong thời gian thực hiện luận án.
Tôi cũng xin cảm ơn đến các cán bộ nghiên cứu phòng Tổng hợp hữu cơ –
Viện Hóa học đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực nghiệm và hoàn thành bản
luận án.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, các nhà khoa học Viện Hóa học đã
giảng dạy, hướng dẫn tôi hoàn thành các học phần và các chuyên đề trong chương
trình đào tạo.
Tôi trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Trường THPT Gio Linh cùng Ban lãnh
đạo Viện Hóa học, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên đã tạo mọi điều kiện thuận
lợi cho tôi trong thời gian học tập.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến toàn thể gia đình, đồng
nghiệp và bạn bè đã ủng hộ và động viên tôi hoàn thành tốt luận án.
Luận án được thực hiện với sự tài trợ kinh phí từ đề tài nghiên cứu cơ bản của
Quỹ Phát triển Khoa học Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED), mã số 104.01-2012.33 do
TS. Trần Văn Lộc làm chủ nhiệm.

Tôi xin trân trọng cảm ơn!

Hà nội, ngày

tháng

năm 2017

Võ Thị Quỳnh Như


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ................................................. v
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ......................................................................................... x
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 2
1.1. Tổng quan các kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học của cây rau má và
hoạt tính sinh học của chúng ...................................................................................2
1.1.1. Đặc điểm thực vật học và ứng dụng của cây rau má trong y học dân gian 2
1.1.1.1. Đặc điểm thực vật .................................................................................2
1.1.1.2. Phân bố và sinh thái...............................................................................2
1.1.1.3. Tác dụng, công dụng .............................................................................2
1.1.2. Các thành phần hóa học của cây rau má.....................................................3
1.1.2.1. Các hợp chất terpenoid ..........................................................................3
1.1.2.2. Các hợp chất polyphenol .......................................................................8
1.1.2.3. Các lớp chất khác ..................................................................................9
1.2. Một số kết quả nghiên cứu chiết tách triterpene và triterpene glycoside từ cây
rau má Centella asiatica (L.) Urban .......................................................................9
1.3. Hoạt tính sinh học của cây rau má .................................................................15
1.3.1. Hoạt tính kháng khuẩn ..............................................................................15
1.3.2. Hoạt tính giảm đau và kháng viêm ...........................................................15
1.3.3. Hoạt tính chống oxy hóa...........................................................................16
1.3.4. Tác dụng bảo vệ thần kinh ........................................................................16
1.4.5. Hoạt tính chống xơ vữa động mạch ..........................................................16
1.4. Hoạt tính sinh học của asiatic acid, madecassic acid và các dẫn xuất ...........17
1.4.1. Hoạt tính gây độc tế bào và kháng ung thƣ ..............................................17

1.4.2. Hoạt tính làm lành vết thƣơng ..................................................................19
1.4.3. Hoạt tính chống trầm cảm ........................................................................20
1.4.4. Hoạt tính bảo vệ gan .................................................................................20
1.4.5. Các hoạt tính khác ....................................................................................20
i


1.5. Một số chuyển hóa của asiatic acid ................................................................21
1.5.1. Một số chuyển hóa hóa học của asiatic acid.............................................21
1.5.2. Chuyển hóa bằng phƣơng pháp sinh học..................................................29
1.6. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc ...................................................................30
Chƣơng 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................................................... 34
2.1. Các phƣơng pháp chiết xuất và phân lập chất ................................................34
2.2. Các phƣơng pháp phổ ....................................................................................34
2.3. Các phƣơng pháp tổng hợp hữu cơ ................................................................34
2.4. Phƣơng pháp thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro ........................................35
2.5. Phƣơng pháp thử hoạt tính bảo vệ gan trên động vật thực nghiệm ...............35
2.6. Nghiên cứu, dự đoán hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất tổng hợp đƣợc
trên hai loại enzyme SIRT1 và 17β-HSD1 (docking phân tử) ..............................35
Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM ..................................................................................... 37
3.1. Nguyên liệu ....................................................................................................37
3.1.1. Mẫu cây rau má ........................................................................................37
3.1.2. Dung môi, hóa chất ...................................................................................37
3.2. Phân lập chất ..................................................................................................37
3.2.1. Phân lập các thành phần hóa học của cây rau má thu tại Thành phố Hồ
Chí Minh .............................................................................................................37
3.2.1.1. Phân lập các chất .................................................................................37
3.2.1.2. Các số liệu phổ của các chất phân lập đƣợc ........................................38
3.2.2. Nghiên cứu định lƣợng các thành phần triterpene acid chính trong mẫu
rau má thu thập ở một số tỉnh thuộc Bắc bộ và Nam bộ ....................................40

3.2.2.1. Xác định hàm lƣợng asiatic acid bằng phƣơng pháp HPLC ...............40
3.2.2.2. Xác định hàm lƣợng asiatic acid và madecassic acid bằng sắc ký cột 42
3.2.3. Nghiên cứu ảnh hƣởng của các điều kiện chiết xuất đến hiệu quả thu hồi
asiatic acid và madecassic acid ...........................................................................42
3.2.3.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ ......................................................................42
3.2.3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ cồn ...............................................................43
3.2.3.3. Ảnh hƣởng của thời gian chiết ............................................................44
ii


3.2.4. Phân lập asiatic acid và madecassic acid từ cây rau má Centella asiatica
(L.) Urban làm nguyên liệu để điều chế các dẫn xuất ........................................44
3.3. Tổng hợp các dẫn xuất của asiatic và madecassic acid ..................................47
3.3.1. Tổng hợp các dẫn xuất của asiatic acid ....................................................47
3.2.2. Tổng hợp các dẫn xuất của madecassic acid ............................................63
3.4. Thăm dò hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất tổng hợp đƣợc ..................72
3.4.1. Hoạt tính gây độc tế bào in vitro ..............................................................72
3.4.2. Hoạt tính bảo vệ gan trên động vật thực nghiệm (in vivo) .......................73
Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 75
4.1. Phân lập chất ..................................................................................................75
4.1.1. Nghiên cứu thành phần hóa học của cây rau má thu tại Thành phố Hồ Chí
Minh (RMHCM).................................................................................................75
4.1.2.1. Định lƣợng asiatic acid và madecassic acid trong một số mẫu rau má
bằng phƣơng pháp HPLC .................................................................................78
4.1.2.2. Định lƣợng asiatic acid và madecassic acid trong ba mẫu rau má bằng
phƣơng pháp CC ...............................................................................................79
4.2. Điều kiện chiết xuất cho hiệu suất cao nhất từ mẫu rau má...........................80
4.3. Chuyển hóa hóa học của asiatic acid và madecassic acid ..............................80
4.3.1. Chuyển hóa của asiatic acid .....................................................................80
4.3.1.1. Chuyển hóa nhóm COOH (C-28) ........................................................80

4.3.1.2. Chuyển hóa vòng A của asiatic acid ...................................................98
4.3.2. Các dẫn xuất của madecassic acid ..........................................................103
4.4. Thử hoạt tính sinh học..................................................................................113
4.4.2. Hoạt tính gây độc tế bào in vitro ............................................................113
4.4.2.1. Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của các dẫn xuất của asiatic acid .113
4.4.2.2. Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của các dẫn xuất của madecassic acid
........................................................................................................................115
4.5.2. Hoạt tính bảo vệ gan trên động vật thực nghiệm (in vivo) .....................118
4.6. Nghiên cứu, dự đoán hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất tổng hợp trên
mô hình tế bào (docking phân tử) .......................................................................119
iii


Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................. 121
5.1. Kết luận ........................................................................................................121
5.2. Kiến nghị ......................................................................................................122
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN .......................................................123
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ..............................................124
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................125

iv


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Các phƣơng pháp sắc ký
CC
Column Chromatography
HPLC High Performance Liquid Chromatography
TLC
Thin Layer Chromatography

Các phƣơng pháp phổ
1
H-NMR
Proton Nuclear Magnetic Resonance
Spectroscopy
13
C-NMR
Carbon-13 Nuclear Magnetic
Resonance Spectroscopy
GC-MS
Gas Chromatography-Mass
Spectrometry
COSY
Correlation Spectroscopy

Sắc ký cột thƣờng
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Sắc ký bản mỏng

DEPT

Phổ cộng hƣởng từ hạt
nhân proton
Phổ cộng hƣởng từ hạt
nhân carbon 13
Sắc ký khí ghép nối khối
phổ
Phổ tƣơng tác hai chiều
1
H-1H

Phổ DEPT

NOESY

Phổ khối ion hóa phun
mù điện tử
Phổ tƣơng tác dị hạt nhân
qua nhiều liên kết
Phổ khối phân giải cao
ion hóa phun mù điện tử
Phổ tƣơng tác dị hạt nhân
qua một liên kết
Phổ hồng ngoại
Hằng số tƣơng tác tính
bằng Hz
Phổ NOESY

Distortionless Enhancement by
Polarisation Transfer
ESI-MS
Electron Spray Ionization Mass
Spectrometry
HMBC
Heteronuclear Multiple Bond
Correlation
HR-ESI-MS High Resolution - Electron Spray
Ionization - Mass Spectrometry
HSQC
Heteronuclear Single Quantum
Coherence

IR
Infrared Spectroscopy
J (Hz)

UV
δ (ppm)
s
d
t

singlet
doublet
triplet

Nuclear Overhauser Effect
Spectroscopy
Ultraviolet Spectroscopy
(ppm = part per million)
q
quint
dd

quartet
quintet
double doublet

v

Phổ tử ngoại
Độ dịch chuyển hóa học

tính bằng phần triệu
dt double triplet
br broad
m multiplet


Các dòng tế bào
HeLa
Human cervical adenocarcinoma Ung thƣ cổ tử cung
HepG2
Human hepatocellular
Ung thƣ gan
carcinoma
KB
Human epidermoid carcinoma
Ung thƣ biểu mô
MCF-7
Human breast adenocarcinoma
Ung thƣ vú
MDA-MB-231 Metastatic human breast cancer Ung thƣ vú
Lu
Human lung carcinoma
Ung thƣ phổi
LTB
Lymphotoxin-beta
SIRT1
Enzyme deacetylase sirtuin-1
17β-HSD1
Enzyme 17β-hydroxysteroid
dehydrogenase type 1

Các ký hiệu viết tắt khác
IC50
Inhibitory Concentration 50% Nồng độ ức chế 50%
Mp
Melting point
Điểm chảy
AA
Asiatic acid
MA
Madecassic acid
RMST
Rau má Sơn Tây
RMND
Rau má Nam Định
RMHCM Rau má Hồ Chí Minh
DMAP
4-Dimethylaminopyridine
PCC
Pyridinium chlorochromate
PDC
Pyridinium dichromate
CTPT
Công thức phân tử
TEA
Triethanolamine
DCM
Dichloromethane
MDA
Malon dialdehyde
nn-Butanol

Ac
Acet
BuOH
CHCl3
Chloroform
Bz
Benzoyl
DMSO Dimethylsulfoxide
OMe Methoxy
EtOAc Ethyl acetate
Ph
Phenyl
MeOH Methanol
Et
Ethyl
TBAI
tetrabutylammonium iodide
Me
Methyl
TMS
Tetramethylsilane
THF Tetrahydrofuran
AIF
apoptosis-inducing factor
TPA 12-Otetradecanoylphorbol13-acetate
Ghi chú: Tên các hợp chất, lớp chất, nhóm thế, chức hóa học được viết theo nguyên
bản Tiếng Anh để đảm bảo tính thống nhất và chính xác.
vi

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1. 1. Cây rau má Centella asiatica (L.) Urban ...................................................3
Hình 1. 2. Các monoterpenoid thu đƣợc từ tinh dầu cây rau má ................................5
Hình 1. 3. Các sesquiterpenoid thu đƣợc từ tinh dầu cây rau má ...............................5
Hình 1. 4. Các triterpene và triterpene saponin khung ursane đƣợc phân lập từ cây
rau má ..........................................................................................................................6
Hình 1. 5. Các triterpene và triterpene glucoside khung oleanane đƣợc phân lập từ
cây rau má ...................................................................................................................7
Hình 1. 6. Công thức các hợp chất phenolic phân lập từ cây rau má .........................8
Hình 1. 7. Các thành phần hóa học khác đƣợc phân lập từ cây rau má ......................9
Hình 1. 8. Các triterpene và triterpene glycoside đƣợc Yoshida M phân lập từ cây
rau má trồng tại Nhật Bản và hoạt tính kháng tế bào ung thƣ của chúng .................12
Hình 1. 9. Các triterpene và triterpene glycoside đƣợc Rumalla phân lập từ cây rau
má trồng tại Mỹ .........................................................................................................13
Hình 1. 10. Các triterpene và triterpene glycoside đƣợc Weng phân lập từ cây rau
má trồng tai Trung Quốc ...........................................................................................13
Hình 1. 11. Một số sản phẩm thuốc và mỹ phẩm có chứa rau má ............................17
Hình 1. 12. Một số sản phẩm từ cây rau má Việt Nam .............................................30

Hình 3. 1. Đƣờng chuẩn asiatic acid .........................................................................41

Hình 4. 1. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 2α,3β,23-triacetoxy-urs-12ene-28-oic acid (145) ................................................................................................83
Hình 4. 2. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất N-(2α,3β,23-triacetoxyurs-12-ene-28-oyl)-n-heptylamine (147) ..................................................................84
Hình 4. 3. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất N-(2α,3β,23-triacetoxyurs-12-ene-28-oyl)-n-propanol (150) ........................................................................86
Hình 4. 4. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất N-(2α,3β,23-triacetoxyurs-12-ene-28-oyl)-methylhydrazine (154)...............................................................87
Hình 4. 5. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất N-(2α,3β,23-triacetoxyurs-12-ene-28-oyl)-n-propyl acetate (157)................................................................89
vii


Hình 4. 6. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất N-(2α,3β,23-triacetoxyurs-12-ene-28-oyl)-n-heptylacetamide (158) ............................................................90

Hình 4. 7. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất N-(2α,3β,23-triacetoxyurs-12-ene-28-oyl)-n-nonylacetamide (159) .............................................................92
Hình 4. 8. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 2α,3β,23-trihydroxy-urs12-ene-28-oyl)-n-heptylamine (162).........................................................................94
Hình 4. 9. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 2α,3β,23-trihydroxy-urs12-ene-17-nitrile (170) ..............................................................................................97
Hình 4. 10. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 2α-hydroxy-3β,23isopropylidenedioxy-urs-12-ene-28-oic acid (171) ................................................100
Hình 4. 11. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 2α-succinoyl-3β,23isopropylidenedioxy-urs-12-ene-28-oic acid (172) ................................................101
Hình 4. 12. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 2α-acetoxy-3β,23dihydroxy-urs-12-ene-28-oic acid (174) .................................................................103
Hình 4. 13. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 6β-hydroxy-2α,3β,23triacetoxy-urs-12-ene-28-amide (180) ....................................................................106
Hình 4. 14. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất N-(6β-hydroxy2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-oyl)-n-heptylamine (181) ...............................107
Hình 4. 15. Phổ 1H NMR (500 MHz, DMSO) của hợp chất N,N-(2α,3β,6β,23tetrahydroxy-urs-12-ene-28-oyl)-ethanol (186) ......................................................110
Hình 4. 16. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất N-(2α,3β,6β,23tetrahydroxy-urs-12-ene-28-oyl)-n-nonylamine (190) ...........................................112

viii


DANH MỤC CÁC BIỂU BẢNG
Bảng 3. 1. Giá trị HPLC của asiatic acid ..................................................................41
Bảng 3. 2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hiệu quả chiết. ...........................................43
Bảng 3. 3. Ảnh hƣởng của nồng độ dung môi chiết đến hiệu quả chiết asiatic acid và
madecassic acid .........................................................................................................43
Bảng 3. 4. Khảo sát thời gian chiết mẫu rau má khô ................................................44

Bảng 4. 1. Tổng hàm lƣợng asiatic acid và madecassic acid trong ba mẫu rau má
xác định theo phƣơng pháp HPLC ............................................................................79
Bảng 4. 2. Tổng hàm lƣợng asiatic acid và madecassic acid trong ba mẫu rau má
xác định theo phƣơng pháp CC .................................................................................79
Bảng 4. 3. Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các dẫn xuất
tổng hợp của asiatic acid .........................................................................................114
Bảng 4. 4. Hoạt tính gây độc tế bào của dẫn xuất madecassic acid ........................117
Bảng 4. 5. Sự thay đổi các chỉ số AST ( UI/ L) và ALT (UI/L) ở các lô thí nghiệm.....118
Bảng 4. 6. Khối lƣợng gan chuột (g/10g cơ thể) ở các lô thí nghiệm .....................118

Bảng 4. 7. Hàm lƣợng MDA trong gan chuột thí nghiệm ......................................119
Bảng 4. 8. Kết quả dự đoán hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất tổng hợp theo
phƣơng pháp docking phân tử của asiatic acid .......................................................119
Bảng 4. 9. Kết quả dự đoán hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất tổng hợp theo
phƣơng pháp docking phân tử của madecassic acid ...............................................120

ix


DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1. 1. Chuyển hóa các dẫn xuất của AA tại vị trí C-2 ......................................22
Sơ đồ 1. 2. Tổng hợp dẫn xuất C2- oxo của asiatic acid ...........................................22
Sơ đồ 1. 3. Chuyển hóa ở C2 (khử oxy) của asiatic acid ..........................................23
Sơ đồ 1. 4. Chuyển hóa ở vị trí C-2, C-3, C-23, C-11 và C-28 của asiatic acid .......23
Sơ đồ 1. 5. Tổng hợp dẫn xuất 3-oxo-23-andehyde và các dẫn xuất ........................24
Sơ đồ 1. 6. Tổng hợp dẫn xuất C2-benzyloxy, C3,23-diacetoxy của acid methyl
ester. ..........................................................................................................................24
Sơ đồ 1. 7. Tổng hợp C11-keto asiatic acid. .............................................................25
Sơ đồ 1. 8. Tổng hợp C28-hydroxymethyl asiatic acid. ...........................................26
Sơ đồ 1. 9. Chuyển hóa ở vị trí C-2, C-3, C-23 của asiatic acid ...............................26
Sơ đồ 1. 10. Chuyển hóa ở vị trí C2,3,28 của asiatic acid ........................................27
Sơ đồ 1. 11. Sơ đồ tổng hợp các dẫn suất amino axit từ asiatic acid ........................28
Sơ đồ 1. 12. Sơ đồ tổng hợp các dẫn suất amide từ asiatic acid ...............................29
Sơ đồ 1. 13. Tổng hợp một số dẫn xuất của AA bằng con đƣờng sinh học..............30

Sơ đồ 3. 1. Sơ đồ phân lập các chất từ cây rau má [C. asiatica (L.) Urban] thu hái
tại Thành phố Hồ Chí Minh ......................................................................................38

Sơ đồ 4. 1. Tổng hợp các dẫn xuất của asiatic acid (1) .............................................81
Sơ đồ 4. 2. Tổng hợp các dẫn xuất của asiatic acid (2) .............................................98

Sơ đồ 4. 3. Tổng hợp các dẫn xuất của madecassic acid ........................................103

x


MỞ ĐẦU
Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học lý thú đã và đang đƣợc sử
dụng rộng rãi trong các lĩnh vực y dƣợc, nông nghiệp và đời sống. Có nhiều loại
thuốc hoàn toàn phải dựa vào thiên nhiên để chữa các bệnh thông thƣờng cũng nhƣ
các bệnh hiểm nghèo. Một trong những hƣớng nghiên cứu quan trọng hiện nay
đƣợc các nhà khoa học nƣớc ta và trên thế giới rất quan tâm là: Từ các hợp chất
thiên nhiên ban đầu ngƣời ta bán tổng hợp, thay đổi cấu trúc hoá học của chúng để
tìm ra các hợp chất mới có hoạt tính và tính chất ƣu việt hơn những hợp chất ban
đầu. Cách tiếp cận này có tính kinh tế tốt hơn, phù hợp hơn với cơ thể sống và thân
thiện môi trƣờng hơn.
Trong số các hợp chất thiên nhiên, các triterpene có khung ursane nhƣ nhóm
ursolic acid và các dẫn xuất của ursolic acid có nhiều hoạt tính sinh học lý thú nên
ngày càng đƣợc quan tâm nghiên cứu về mặt hoá học và dƣợc lý học. Trong đó hoạt
tính gây độc với tế bào khối u phổi dòng A-549, cũng nhƣ với tế bào bạch cầu
lympho P-388 và L-1210, hoạt tính gây độc với tế bào khối u KB và khả năng ức
chế phát triển khối u trên da chuột đã đƣợc khẳng định [1].
Trong quá trình tìm hiểu về các cây thuốc cổ truyền Việt Nam, chúng tôi
thấy cây rau má, có tên khoa học là Centella asiatica (L.) Urban thuộc họ Hoa tán
(Apiaceae), có chứa nhiều hợp chất triterpene thuộc khung ursane nhƣ: asiatic acid,
asiaticoside, madecassic acid, madecassoside… với hàm lƣợng khá cao có hoạt tính
độc với tế bào ung thƣ [2]. Để tận dụng nguồn nguyên liệu này và góp phần nghiên
cứu, tìm kiếm các chất mới có hoạt tính cao, chúng tôi đặt mục đích sử dụng các
triterpene tách đƣợc từ cây rau má để chuyển hóa chúng tạo thành các dãy dẫn xuất
mới và thăm dò hoạt tính kháng ung thƣ của các chất thu đƣợc.
Từ những lí do trên, chúng tôi đề xuất đề tài: “Nghiên cứu chiết tách,

chuyển hóa hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học của các triterpenoid từ cây
rau má [Centella asiatica (L.) Urban], họ Hoa tán (Apiaceae)”. Đề tài đƣợc thực
hiện với ba mục tiêu:
1. Nghiên cứu chiết tách và tinh chế các thành phần hóa học chính của cây
rau má Centella asiatica (L.) Urban thu tại một số vùng của Việt Nam.
2. Nghiên cứu chuyển hóa hóa học asiatic acid và madecassic acid phân lập
đƣợc từ cây rau má thành các dẫn xuất mới của chúng.
3. Thăm dò hoạt tính sinh học của các dẫn xuất tổng hợp đƣợc để tìm kiếm
các chất có hoạt tính sinh học mới và tìm mối tƣơng quan cấu trúc – hoạt tính của
chúng.
1


Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan các kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học của cây
rau má và hoạt tính sinh học của chúng
1.1.1. Đặc điểm thực vật học và ứng dụng của cây rau má trong y học dân
gian
- Tên tiếng việt: cây rau má
- Tên khoa học: Centella asiatica (L.) Urb., thuộc họ hoa tán (Apiaceae)
- Tên khác: Tích huyết thảo, Liên tiền thảo.

1.1.1.1. Đặc điểm thực vật
Cây rau má là loại cây thảo nhỏ, cao 7-10 cm, thân mảnh, mọc bò, hơi có
lông khi còn non, bén rễ ở các mấu. Lá mọc so le, nhƣng thƣờng tụ họp 2-5 cái ở
một mấu, phiến lá nhẵn, hình thận hoặc gần tròn, mép khía tai bèo, cuống lá mảnh,
dài 3-5 cm, có khi đến 7-8 cm. Cụm hoa gồm những tán đơn mọc riêng lẻ hoặc 2-5
cái ở kẽ lá, mỗi tán mang 1-5 hoa (thƣờng là 3) màu trắng hoặc phớt đỏ, hoa giữa
không có cuống, tổng bao có 2-3 mảnh hình trái xoan, nhị có chỉ nhị ngắn, bao phấn
hình mắt chim, bầu hình cầu. Quả màu nâu đen, đỉnh lõm, có 7-9 cạnh lồi, nhẵn

hoặc có lông, vỏ có vân mạng. Mùa hoa quả: tháng 4-6 [1-3].

1.1.1.2. Phân bố và sinh thái
Rau má thƣờng mọc ở những nơi ẩm ƣớt nhƣ thung lũng, bờ mƣơng vùng
nhiệt đới nhƣ: Việt Nam, Lào, Campuchia, Indonesia, Malaysia, Srilanka, Ấn Độ,
Pakistan, và Madagascar [4,5,6].
Ở nƣớc ta, rau má đƣợc trồng từ Bắc vào Nam, đặc biệt là các tỉnh duyên hải
miền Trung, nơi khí hậu có độ ẩm cao và có loại đất sét pha cát rất thích hợp cho
loại cây này phát triển.

1.1.1.3. Tác dụng, công dụng
Theo y học cổ truyền, rau má có vị đắng, hơi ngọt, tính bình, có tác dụng
dƣỡng âm, thanh nhiệt, nhuận gan, giải độc, lợi tiểu, thƣờng đƣợc dùng để làm
thuốc bổ dƣỡng, sát trùng, chữa thổ huyết, tả lỵ, khí hƣ, bạch đới, mụn nhọt, rôm
sảy. Dân gian thƣờng dùng rau má trị cảm mạo, phong nhiệt, thuỷ đậu, sởi, sốt da
vàng mặt, viêm họng, viêm khí quản, ho, viêm đƣờng tiết niệu, đái dắt, đái buốt,
còn dùng trị thổ huyết, chảy máu cam, tả lỵ, khí hƣ, bạch đới, giải độc lá ngón [1,2].
2


Rau má đƣợc dùng ăn sống hoặc ép lấy nƣớc pha đƣờng uống cho mát. Có
thể giã lấy nƣớc uống hoặc sắc uống làm thuốc giải nhiệt hoặc giải độc, lợi tiểu,
cầm máu, trị kiết lỵ, táo bón. Dùng ngoài đắp chữa các vết thƣơng do ngã gãy
xƣơng, bong gân và làm tan mụn nhọt. Rau má (300g) và phèn chua (3g) giã nhỏ,
hoà nƣớc dừa, vắt lấy nƣớc uống trị kinh nguyệt không đều, đau lƣng, tức ngực, đau
bụng máu, khô da, nhức đầu, nóng lạnh, bạch đới. Ngƣời ta đã chế rau má thành
những dạng kem để chữa các vết thƣơng phần mềm cho mau liền da, liền sẹo.
Mặc dù cây rau má đã đƣợc biết đến từ rất lâu, nhƣng hiện nay vẫn có rất
nhiều tài liệu, công trình mới công bố về thành phần hóa học và tác dụng sinh học
của nó.

Hình 1. 1. Cây rau má Centella asiatica (L.) Urban
1.1.2. Các thành phần hóa học của cây rau má
Cây rau má là một trong những cây thảo dƣợc rất phổ biến ở các nƣớc Đông
Á, Đông Nam Á và đã đƣợc ứng dụng trong các bài thuốc dân gian ở nhiều nƣớc để
điều trị bệnh. Có rất nhiều nghiên cứu đã đƣợc tiến hành nhằm làm sáng tỏ các
thành phần hóa học và mối liên quan với ứng dụng của chúng. Các nghiên cứu đã
xác định đƣợc trong cây rau má có các thành phần hóa học rất phong phú về cấu
trúc cũng nhƣ về tác dụng sinh học.

1.1.2.1. Các hợp chất terpenoid
Các hợp chất terpenoid đƣợc cho là có vai trò chính quyết định ứng dụng của
cây rau má. Một số thành phần chính của lớp chất này nhƣ: monoterpene,
sesquiterpene, triterpene ở dạng tự do hoặc dạng glycoside.
Monoterpenoid, sesquiterpenoid

3


Ở Nam Phi cây rau má đƣợc dùng để chữa nhiều bệnh. Tinh dầu của cây rau
má Nam Phi có chứa 11 hợp chất monoterpene hydrocarbon (chiếm 20,20% tinh
dầu), 9 hợp chất monoterpene chứa oxy (chiếm 5,46%), 14 hợp chất sesquiterpene
hydrocarbon (68,80%), 5 hợp chất sesquiterpene chứa oxeny (3,90%), một số hợp
chất sesquiterpene chứa lƣu huỳnh (0,76%). Trong số các hợp chất chính của tinh
dầu rau má thì: α-humulene chiếm 21,60%, β-caryophyllene chiếm 19,08%, bicyclo
germacrene chiếm 11,22%, germacrene B chiếm 6,29% và myrcene chiếm 6,55%.
Tinh dầu rau má Nam Phi có hoạt tính kháng khuẩn rộng đối với vi khuẩn Gramdƣơng nhƣ Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus và vi khuẩn Gram âm nhƣ
Escherichia coli, Pseudoneonas aeruginosa, Shigella sonnei [7]. Theo tài liệu tham
khảo [4] thì hàm lƣợng tinh dầu trong rau má là xấp xỉ 0,1% tính theo khối lƣợng
khô. Thành phần monoterpene chính gồm: α-pinene, β-pinene, myrcene, γterpinene, borneol, bornyl acetate, các sesquiterpene chính gồm: α-copaene, βelemene, β-caryophyllene, trans-β-farnesene, germacrene và bicycloelemene.

Các monoterpene tìm thấy trong thành phần tinh dầu rau má tồn tại dƣới
dạng mạch hở, đơn vòng, hoặc hai vòng (bicyclic). Các sesquiterpene cũng có cấu
trúc mạch hở, đơn vòng, hai vòng (bicyclic) và ba vòng (tricyclic). Nhóm tác giả
Qin L.P., Ding R.X. Zhang W.D. và cộng sự đã dùng phƣơng pháp GC - MS để
nghiên cứu thành phần tinh dầu cây rau má, qua đó đã xác định 45 chất có trong
tinh dầu rau má. Caryophyllene, farnesol và elemene là thành phần chính của tinh
dầu rau má [8]. Từ tinh dầu cây rau má sinh trƣởng ở Nam Phi, nhóm tác giả này đã
tìm 11 monoterpenoid, 9 monoterpenoid chứa oxy, 14 sesquiterpenoid, 5
sesquiterpenoid chứa oxy, và 1 sesquiterpenoid sulfid. α-humulen, β-caryophyllene
và bicyclo-germacrene là các chất chính trong tinh dầu cây này [9].
Dƣới đây là một số hợp chất monoterpenoid và sesquiterpenoid thƣờng gặp
trong tinh dầu rau má (Hình 1.2, và 1.3).

4


Hình 1. 2. Các monoterpenoid thu đƣợc từ tinh dầu cây rau má

Hình 1. 3. Các sesquiterpenoid thu đƣợc từ tinh dầu cây rau má
Triterpenoid
Triterpenoid đƣợc xác định là thành phần quan trọng nhất của cây rau má,
quyết định sự ứng dụng của cây thuốc này trong dân gian. Chất lƣợng của cây rau má
đƣợc đánh giá bởi hàm lƣợng của các triterpenoid có trong cây. Các triterpenoid đƣợc
xác định là các pentacyclic triterpenoid acid dạng tự do và dạng glycoside. Lớp chất
triterpenoid trong rau má chủ yếu có các khung ursane hoặc khung oleanane nhƣ:
asiatic acid, asiaticoside, madecassic acid, madecassoside, brahmoside, brahmic acid,
brahminoside, thankuniside, isothankuniside, betulinic acid [9,10]

5

Hình 1. 4. Các triterpene và triterpene saponin khung ursane đƣợc phân lập từ
cây rau má

6


Hình 1. 5. Các triterpene và triterpene glucoside khung oleanane đƣợc phân
lập từ cây rau má
Theo Dƣợc điển Châu Âu, về dƣợc liệu rau má thì phần trên mặt đất sấy khô
của cây rau má phải chứa không dƣới 6,0% triterpenoid tổng số (bao gồm
triterpenoid tự do và triterpenoid glucoside) tính theo asiaticoside (C48H78O19,
M=958) [11]. Theo tài liệu tham khảo [4] thì triterpene saponin trong rau má chiếm
từ 1-8%, trong đó có thành phần chính là asiaticoside, madecassoside, các thành
phần phụ bao gồm centelloside, bramoside, braminoside và centellasaponine B,C,D.
Hình 1.4 và Hình 1.5 trình bày cấu trúc của một số triterpene và triterpene saponin
đƣợc phân lập từ cây rau má.
Các nghiên cứu về thành phần hóa học của cây rau má cho thấy loài cây này
chứa các thành phần phong phú và phức tạp. Thành phần hóa học của loài Centella
asiatica ở các địa điểm, châu lục khác nhau đều cho thấy triterpenoid là thành phần
chủ đạo. Aziz và cộng sự đã công bố một bài tổng quan về thành phần hóa học của
Centella asiatica trong khoảng thời gian 50 năm trở lại đây [10].
Brinkhaus và cộng sự đã tóm tắt các công thức hóa học của cây rau má trƣớc
năm 2000 [12]. Shukla và cộng sự đã tách đƣợc triterpenoid khung ursane mới từ
cây rau má [13]. Sau đó, Matsuda và cộng sự đã phân lập đƣợc một olean-13-ene
triterpenoid mới, centellasapogenol A,và oligoglycoside từ cây rau má trồng ở Việt
Nam [14,15]. Từ dịch chiết n-BuOH của cây rau má, Jiang và cộng sự đã tách đƣợc
4 triterpenoid glycoside mới là asiaticoside C, D, E, F [16].
Từ cây rau má Centella asiatica (Linn.) Urb., ở Srilanka, nhóm tác giả ngƣời
Nhật (Hisashi Matsuda - Trƣờng đại học Dƣợc, Kyoto-Nhật Bản) đã phân lập đƣợc

8 triterpene glycoside là: centellasaponin A (26), centellasaponin B (13),
centellasaponin C (15), centellasaponin D (31), madecassoside (14), asiaticoside
(3), asiaticoside B (22) và sceffoleoside (5) [13].
Wan-Joo-Kim và các cộng sự - Trƣờng đại học Seoun, Hàn Quốc đã phân
lập đƣợc 4 triterpenoid từ cây rau má của Indonesia là: madecassoside (14),
asiaticoside, asiatic acid (1) và madecassic acid (10), với hàm lƣợng khá cao [17].
Từ cây rau má Yu Q.L. và cộng sự đã phân lập đƣợc một hợp chất mới là 2α,3β20,23-tetrahydroxy-urs-12-en-28-oic acid (24) [18].
7


Năm 2007, nhóm này còn phân lập đƣợc docosyl ferulat, bayogenin,
3β,6β,23-trihydroxy-olean-12-en-28-oic acid (33), 3β,6β,23-trihydroxy-urs-12-en28-oic acid (24), D-gulonic acid (47). Đây là những chất lần đầu tiên đƣợc tìm thấy
ở cây rau má [19].
Trong một nghiên cứu khác, Y. Quan Lin còn phân lập thêm đƣợc một
triterpene mới là 2α,3β,23-trihydroxy-urs-20-en-28-oic acid (20) và một saponin
mới là dẫn xuất ester của chất 16 - [17: 28-O- β -L-rhamnopyranosyl (1→4)-O- β D-glucopyranosyl-(1→6)-O-

β -D-glucopyranosyl ester] (21) [20].

1.1.2.2. Các hợp chất polyphenol
Các nghiên cứu của nhóm tác giả Zainol cho thấy cây rau má cũng chứa các hợp
chất nhóm phenolic nhƣ: quercetin và kaempferol, catechin, rutin và naringin [21].
Các phenolic acid
Một số hợp chất thuộc nhóm phenolic acid trong cây rau má đã đƣợc xác
định nhƣ tannin, phlobatannin, castillicetin, isochlorogenic acid, 3,5-di-O-caffeoyl
quinic acid, 1,5-di-O-caffeoyl quinic acid, 3,4-di-O-caffeoyl quinic acid, 4,5-di-Ocaffeoyl quinic acid, rosmarinic acid, chlorogenic acid, isochlorogenic acid [10].

Các hợp chất flavonoid
Lớp chất flavon đã đƣợc xác định có trong cây rau má ở cả dạng tự do hoặc
gắn kết với các gốc đƣờng qua nhóm chức hydroxyl nhƣ: quercetin-3-O-β-Dglucuronid, kaempferol, quercetin, kaempferol-3-O-β-D-glucoside, quercetin-3-O-βD-glucoside

[10].

Hình 1. 6. Công thức các hợp chất phenolic phân lập từ cây rau má
8


1.1.2.3. Các lớp chất khác
Ngoài các lớp chất chính đã đƣợc trình bày ở trên, trong cây rau má còn có
các hợp chất dạng polysaccharide, hợp chất polyacetylen (45) [22] olefin, acid béo,
alkaloid, sterol, carotenoid, chlorophyl, pectin, một số khoáng chất nhƣ: phospho,
kali, canxi, magie, mangan, sắt, kẽm, natri, đồng, các amino acid nhƣ: alanin,
prolin, tyrosin, valin, methionin, cystin, isoleucin, leucin, phenylalanin, lysine.

Hình 1. 7. Các thành phần hóa học khác đƣợc phân lập từ cây rau má
1.2. Một số kết quả nghiên cứu chiết tách triterpene và triterpene
glycoside từ cây rau má Centella asiatica (L.) Urban
Nghiên cứu về thành phần hóa học của cây rau má ngƣời ta thƣờng quan tâm
chủ yếu đến các triterpenoid. Rất nhiều triterpene pentacyclic cũng nhƣ glycoside
của chúng đã đƣợc phân lập từ cây rau má Centella asiatica [23,24], trong đó asiatic
acid (1) và asiaticoside (3) cũng nhƣ madecassic acid (10) và madecassoside
(braminoside) (14) là các triterpene và glycoside chính.
Công dụng chữa bệnh phong của cây rau má đã thu hút sự quan tâm của các
nhà hóa học nhằm làm sáng tỏ vai trò thành phần chính có trong cây. Từ những năm

9


cuối 1940 và đầu 1950 các nhà khoa học Pháp đã nghiên cứu phân lập và xác định
đƣợc cấu trúc hóa học của asiaticoside cũng nhƣ aglycone của nó [25,26,27,28,29].

Những năm 1967-1969, hai nhóm nghiên cứu của Boiteau và Pinhas ở Pháp
đã công bố một số công trình phân lập và xác định cấu trúc của madecassoside (14)
cùng các madecassic acid (10) và madasiatic acid (17) từ cây rau má thu ở
Madagascar [30,31,32].
Năm 1989, Sahu đã phân lập đƣợc từ rau má Ấn Độ 2 triterpenoid
trisaccharid là asiaticoside A (3) và asiaticoside B (22) [33]. Cấu trúc của
asiaticoside

A

đƣợc

xác

định

là

[O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-O-β-Dester

glucopyranosyl-(1→6)]-O-β-D-glucopyranososyl

của

2α,3β,6α,23-

tetrahydroxy-urs-12-ene-28-oic acid. Cấu trúc của asiaticoside B đƣợc xác định là
[O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)]-O-β-Dglucopyranososyl ester của 2α,3β,6β,23-tetrahydroxyolean-12-ene-28-oic acid.
Asiaticoside B đƣợc xác định là hợp chất mới, còn asiaticoside A chính là hợp chất
madecassoside đã biết từ 1969 [10].

Năm 2001 nhóm tác giả Hisashi Matsuda (Trƣờng đại học Dƣợc, KyotoNhật Bản) từ dịch chiết EtOAc rau má trồng tại Việt Nam, qua sắc ký cột silica gel
và HPLC đã phân lập hợp chất mới khung olean-13-ene là: centellasapogenol A
(32) và các oligoglycoside của chúng centellasaponin A (26), madecassoside (14),
asiaticoside (3). Ngoài ra, nhóm tác giả cũng đã tách đƣợc một số triterpene đã biết
là madecassic acid (10), asiatic acid (1), 2α,3β,23-trihydroxyolean-12-en-28-oic
acid (34) [14].
Cũng trong năm 2001 Hisashi Matsuda đã phân lập đƣợc từ cao chiết nƣớc
cây rau má Sri Lanka một số triterpene oligoglycoside khung ursane và oleanane là
centellasaponin B (13), centellasaponin C (15) và centellasaponin D (31). Cấu trúc
của

centellasaponin

B

đƣợc

xác

định

là

madecassic

acid

28-O-β-D-

glucopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosid. Cấu trúc của centellasaponin C đƣợc

xác

định

là

madasiatic

acid

28-O-α-L-rhamnopyranosyl

(1→4)-β-D-

glucopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosid và cấu trúc của centellasaponin D đƣợc
xác

định

là

3β,6β,23-trihydroxyolean-13(18)-en-28-oic

acid

28-O-α-L-

rhamnopyranosyl(1→4)-β-D-glucopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosid. Ngoài ra
các tác giả còn phân lập đƣợc các triterpene và triterpene oligoglycoside:
10

madecassoside (14), asiaticoside (3), asiaticoside B (22), scheffoleoside A (26),
madecassic acid (10), asiatic acid (1) [15].
Năm 2005 Jiang Z.Y. từ dịch chiết n-BuOH của rau má Trung Quốc đã phân
lập đƣợc bốn triterpenoid glycoside mới là asiaticoside C (4), asiaticoside D (5),
asiaticoside E (6) và asiaticoside F (7). Ngoài ra, các tác giả này còn phân lập đƣợc
một số hợp chất đã biết nhƣ asiaticoside (3), madecassoside (14) và scheffurosid B
(21) [16]. Cấu trúc của asiaticoside C đƣợc xác định là O-α-L-rhamnopyranosyl(1→4)-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl

ester

của

2α,3β,-

dihydroxy-23-acetyloxy-urs-12-en-28-oic acid. Cấu trúc của asiaticoside D đƣợc
xác định là O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-Dglucopyranosyl ester của 2α,3β –dihydroxy-urs-12-en-28-oic acid. Cấu trúc của
asiaticoside E đƣợc xác định là O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl
ester của asiatic acid. Cấu trúc của asiaticoside F đƣợc xác định là O-α-Lrhamnopyranosyl-(1→4)-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl

ester

của 3β-23-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid.
Năm 2005, từ rau má trồng tại vƣờn trƣờng Đại Học Fukuoka-Nhật Bản,
Yoshida M và cộng sự đã phân lập đƣợc hợp chất lactone của ursolic acid , usolic
acid (49, 50), pomolic acid (51), 2α,3α-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid (52), 3epimaslinic acid (53), asiatic acid (1), corosolic acid (54) và thử hoạt tính sinh học
nhƣ kháng tế bào ung thƣ dạ dày ngƣời (MK-1), ung thƣ biểu mô tử cung (HeLa),
và các tế bào khối u ác tính ở chuột (B16F10). Các giá trị IC50 tƣơng ứng đƣợc đƣa
trong ngoặc bên cạnh các công thức [34].

11