Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, hàm lượng, men giống, nồng độ (NH4)2SO4 tới quá trình lên men vang táo mèo

Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết

Mở đầu
Hàng năm trên thế giới sản xuất khoảng 29 tỷ lít r-ợu vang. Trong đó
các n-ớc sản xuất nhiều nhất là: Pháp, I-tali-a, Angie-ri [12]. Tuyệt đại đa
số các loại r-ợu vang sản xuất từ quả nho nên danh từ Vang nho đồng nghĩa
với danh từ Vang. ở các n-ớc nhiệt đới nóng ẩm nh- n-ớc ta, diện tích đất
trồng nho còn hạn hẹp và chất l-ợng nho còn thấp. Ng-ợc lại, chúng ta có thể
sản xuất r-ợu vang từ các loại quả khác nh-: vải, táo, dâu có chất l-ợng
và h-ơng vị đặc tr-ng cho từng loại quả [4].
ở Việt Nam, việc sản xuất vang nho bắt đầu xuất phát từ một số cơ sở
nhỏ, lẻ, sau đó phát triển thành các nhà máy nh- nhà máy vang Thăng Long,
Gia Lâm, Thanh Ba, Đà Lạt Trong sản xuất r-ợu vang tuỳ ph-ơng thức
sản xuất và loại quả chế biến mà cho ra các loại vang khác nhau. N-ớc ta do
khí hậu nhiệt đới nên các loại cây hoa quả phong phú, trong đó nhiều loại
quả có thể là nguồn nguyên liệu tốt cho sản xuất r-ợu vang. Miền núi phía
Bắc n-ớc ta có cây táo mèo cho quả có vị và h-ơng thơm rất đặc tr-ng.
Hiện nay, quả táo mèo vẫn chủ yếu là ăn t-ơi, ngâm r-ợu, ngâm dịch si
rô. Tổng diện tích trồng táo mèo khoảng 40.000 ha [14,15]. Nơi có diện tích
cây táo mèo nhiều là các tỉnh Yên Bái, Lạng Sơn, Sơn La, Điện Biên, Lai
Châu. Nh-ng hiện nay có một số vấn đề tồn tại là sản l-ợng quả hàng năm rất
lớn mà số l-ợng mang đi tiêu thụ là không đáng kể (khoảng 35%). Số còn lại
th-ờng bị bỏ phí do không có nguồn tiêu thụ tại chỗ, vận chuyển khó khăn
hoặc giá thành quá rẻ. Trong khi đó, đời sống bà con các dân tộc ở những
vùng này còn gặp rất nhiều khó khăn.
Ngành sản xuất r-ợu vang ở Việt Nam đang phát triển và có nhiều sản
phẩm bán trên thị tr-ờng. Tuy nhiên, đây là ngành sản xuất khá mới, đang trên
đ-ờng tìm kiếm nguồn nguyên liệu phù hợp. Trong khi đó, n-ớc ta lại có

Tr-ờng ĐHSP Hà Nội 2

1

K29B - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết

nguồn táo mèo lớn nên nếu tận dụng đ-ợc loại quả này sẽ đem lại nguồn
nguyên liệu lớn. Hơn nữa nó sẽ góp phần nâng cao thu nhập cho ng-ời dân
các dân tộc vùng cao.
Vì vậy, việc nghiên cứu sử dụng quả táo mèo để sản xuất r-ợu vang
theo chúng tôi là có triển vọng phù hợp với thực tiễn Việt Nam. Chúng tôi đã
chọn và tiến hành công trình nghiên cứu: Nghiên cứu ảnh h-ởng của nhiệt
độ, hàm l-ợng men giống, nồng độ (NH4)2SO4 tới quá trình lên men vang
táo mèo.
* Mục tiêu của đề tài
- Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang táo
mèo.
- Nghiên cứu một số nhân tố nhiệt độ, hàm l-ợng men giống, nồng độ
(NH4)2SO4 đ-ợc dùng cho lên men vang táo mèo, lên men vang táo mèo với
quy mô phòng thí nghiệm.
- Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất r-ợu vang từ quả táo mèo.
* Đối t-ợng nghiên cứu
- Quả táo mèo (Docynia indica), họ hoa hồng (Rosaceae).
- Chủng nấm nem Saccharomyces cerevisiae thuần chủng phân lập
đ-ợc từ quả táo mèo. Chúng tôi đã tiến hành phân lập đ-ợc 38 mẫu và chọn ra

đ-ợc một chủng Saccharomyces cerevisiae D2.
* ý nghĩa khoa học của đề tài
Công trình nghiên cứu của chúng tôi nhằm đáp ứng yêu cầu khoa học
về ý nghĩa lý luận và thực tiễn nh- sau:

Tr-ờng ĐHSP Hà Nội 2

2

K29B - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết

Nghiên cứu nhằm đi sâu tìm hiểu hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hoá
của chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae D2 có khả năng lên men vang
táo mèo.
Tận dụng nguồn nguyên liệu có sẵn nhằm sản xuất một loại r-ợu vang
phù hợp với thị hiếu ng-ời tiêu dùng, góp phần làm phong phú thị tr-ờng vang
trong n-ớc.
Công trình của chúng tôi còn mang ý nghĩa thực tế đó là tạo nguồn tiêu
thụ quả táo mèo nhằm nâng cao thu nhập cho bà con các dân tộc vùng cao.

Tr-ờng ĐHSP Hà Nội 2

3

K29B - Sinh

Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết

Ch-ơng 1. Tổng quan tài liệu
1.1. Khái quát chung về r-ợu vang
1.1.1. Thành phần của r-ợu vang
Thành phần chủ yếu của r-ợu vang bao gồm:
Cồn (etanol): do lên men tự nhiên từ dịch trái cây vì vậy không lẫn
aldehit, este. Độ cồn của r-ợu vang từ 10 -> 12 độ nên nhiều ng-ời uống đ-ợc.
Chất bổ d-ỡng: đ-ờng trong vang có từ 62 132g/l, chủ yếu là fructoza,
glucoza, và một ít galactoza.
Axit vô cơ và axit hữu cơ: axit malic, axit tartaric, axit xitric, axit oxalic
hàm l-ợng axit tổng số từ 4 7g/l (quy ra axit tartaric).
R-ợu vang giàu vitamin: vitamin có trong n-ớc quả không bị quá trình
lên men phân huỷ mà nó chỉ điều chỉnh lại thành phần.
1.1.2. Phân loại vang
Có nhiều cách phân loại khác nhau có thể căn cứ vào màu sắc của sản
phẩm mà phân thành các loại: vang đỏ, vang hồng, vang trắng và t-ơng ứng
các loại vang này đều có các chỉ tiêu giới hạn về màu sắc nhất định. Chẳng
hạn vang đỏ là vang có màu đỏ, đỏ lựu, đỏ thắm; vang trắng là vang có màu
vàng rơm đến vàng ánh; vang hồng có màu hồng đến đỏ t-ơi.
Căn cứ vào độ r-ợu, hàm l-ợng đ-ờng, hàm l-ợng axit có trong
vang mà phần thành các loại vang: vang khô, vang dịu, vang ngọt
Xu h-ớng chung thì vang phân thành hai nhóm chính là vang không có
gas (trong vang thành phẩm không có CO2) và vang có gas (trong vang thành
phẩm có CO2).

Tr-ờng ĐHSP Hà Nội 2

4

K29B - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết

1.1.3. Nguyên liệu sản xuất r-ợu vang
Nguyên liệu để sản xuất là dịch trái cây từ các loại quả: Mơ, táo mèo,
vài, dứa, lê, nho (Bảng 1.1.3).
Bảng 1.1.3. Thành phần hoá học của các loại quả

Thành phần hoá học
Tên quả
N-ớc

Đ-ờng

Axit tổng số

Pectin

Tanin

Nho ngọt

73,1

9,88

0,56

0,092

0,07

Vải

84,28

16,1

5,16

0,249

0,83

Dứa

54,3

3,9

0,6

-

-

Mơ

73,8

9,0

1,1

-

-

Dâu

84,74

9,19

0,49

0,31

0,035

1.1.4. Thành phần hoá học cơ bản của dịch táo mèo
Theo kết quả phân tích thành phần cơ bản của quả táo mèo đ-ợc tiến

hành tại Viện công nghiệp thực phẩm thì quả táo mèo bao gồm các thành phần
cơ bản sau:
Bảng 1.1.4. Thành phần cơ bản của quả táo mèo
Nơi thu mẫu
STT

Thành phần hoá học

Đơn vị

1

Đ-ờng tổng số

2

Trung bình

Yên Bái

Sơn La

%

4,8

4,82

4,81

Axit tổng số

%

1,45

1,48

1,47

3

VitaminC

mg/l

11,0

11,4

11,22

4

N-ớc

%

84,0

85,1

84,6

5

Protein toàn phần

0,92

0,92

0,92

6

pH

2,8

3,0

2,9

Tr-ờng ĐHSP Hà Nội 2

5

K29B - Sinh

Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết

Qua bảng trên chúng tôi nhận thấy các chỉ tiêu cơ bản nh- hàm l-ợng
đ-ờng: 24,81%; pH = 2,9; axit tổng số:1,47% của quả táo mèo phù hợp với
yêu cầu lựa chọn làm nguyên liệu để lên men r-ợu vang.
1.1.5. T ng trữ r-ợu vang
Vang đ-ợc t ng trữ từ 1 đến 5 năm hoặc có thể t ng trữ hàng trăm năm.

Trong thời gian này xảy ra quá trình oxy hoá - khử màu tím sang màu đỏ tía,
vang trắng chuyển sang vang vàng thậm chí đỏ nâu. Thành phần axit tăng, độ
cồn giảm, este và h-ơng vị tăng lên [4,8].
1.2. Một số đặc tính sinh học của tế bào nấm men
1.2.1. Sơ l-ợc về nấm men Saccharomyces
Nấm men (Yearst) là tên chung chỉ nhóm nấm th-ờng có cấu tạo đơn
bào, sinh sản bằng lối nảy chồi. Từ năm 1857, Pasteur đã nghiên cứu khá tỷ
mỉ về r-ợu vang.
Nấm men phân bố khá rộng rãi trong tự nhiên (trong đất, n-ớc, không
khí, thực phẩm, hoa quả), nhiều loại nấm men có khả năng lên men r-ợu. Vì
vậy, từ lâu con ng-ời đã sử dụng nấm men để sản xuất r-ợu, bia. Nấm men
sinh sản nảy chồi nhanh chóng, sinh khối của chúng giàu protein, vitamin. Vì
vậy, chúng còn đ-ợc dùng rộng rãi trong các ngành công nghiệp thực phẩm.
Nấm men cũng đ-ợc sử dụng làm nở bột mì, gây h-ơng n-ớc chấm, sản xuất
một số d-ợc phẩm, gần đây còn đ-ợc sử dụng để sản xuất lipit [4].
Tuy nhiên, bên cạnh những nấm men có ích cũng có một số loại gây
bệnh cho ng-ời, gia súc hoặc làm hỏng thực phẩm.
1.2.2. Hình thái và kích th-ớc của tế bào nấm men Saccharomyces
Tế bào nấm men có cấu tạo hình cầu, hình trứng hoặc hình ô van. Kích

th-ớc của tế bào khoảng 3 10 mm x 5 12 mm. Hình dạng kích th-ớc tế bào
điển hình chỉ đ-ợc tạo ra trong điều kiện môi tr-ờng phù hợp. Khi điều kiện

Tr-ờng ĐHSP Hà Nội 2

6

K29B - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết

bất lợi thì hình dạng, kích th-ớc tế bào sẽ bị biến dạng (khi môi tr-ờng nghèo
dinh d-ỡng nấm men có hình đế giày).
Nấm men có cấu tạo đơn bào nh-ng phức tạp hơn vi khuẩn. Về mặt hoá
học có sự phân bố rõ ràng. Tế bào Saccharomyces đ-ợc bao bọc bởi lớp thành
tế bào, thành tế bào là cơ quan bảo vệ và duy trì hình dạng tế bào. Thành tế
bào có khả năng kết dính, có ý nghĩa lớn trong công nghệ sản xuất bia. Bên
trong là màng nguyên sinh ăn sâu vào màng l-ới nội chất.
Cấu tạo chủ yếu của tế bào là hemixenluloza chiếm 70% trọng l-ợng
khô (trong đó 31% manman, 29% glucan) ngoài ra chứa 1- 3% kitin, 6 10%
protein, 8,5% lipit, 7% chất khoáng.
Không giống với tế bào vi khuẩn, tế bào nấm men đã có ty thể. Ty thể
của nấm men có dạng hạt, có thể thay đổi tùy điều kiện nuôi cấy cũng nhtrạng thái sinh lý của tế bào, kích th-ớc ty thể khoảng 0,2 0,6 mm, có màng
bọc trong suốt, mỏng 60 80, có tính thấm cao. Màng có cấu tạo hai lớp, lớp
trong hình thành nếp gấp hoặc ống nhỏ hình răng l-ợc. Lớp ngoài có cấu trúc
bằng nhiều đơn vị hình thái. Ty thể có cấu tạo chủ yếu bằng hợp chất protein,
lipit trong đó chiếm một l-ợng lớn nucleoprotein, photpho lipit. Số l-ợng ty

thể trong tế bào nấm men khoảng từ 10 20, chúng tham gia vào quá trình
sinh tr-ởng tế bào, sự hình thành và nảy chồi của bào tử.
Ngoài ra, trong tế bào nấm men còn chứa một hệ thống không bào đ-ợc
hình thành từ thể golgi hay mạng l-ới nội chất. Không bào có tính thấm cao
và là nơi tích luỹ các sản phẩm của trao đổi chất. Không bào chứa một hệ
thống keo trong đó bao gồm cả điện tử, enzym, protein, hydrocacbon, các
muối canxi, kali, phenolflavin, riboflavin, axit nucleic. Hình dạng của không
bào th-ờng thay đổi do sự co rút của chất nguyên sinh. Trong không bào
th-ờng xảy ra phản ứng oxy hoá - khử nhờ hệ thống xitocrom oxidaza trong

Tr-ờng ĐHSP Hà Nội 2

7

K29B - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết

không bào. Trong môi tr-ờng giàu hydrocacbon tế bào dự trữ glicogen,
glicogen của tế bào nấm men đ-ợc tích luỹ nhiều.
Khác với tế bào vi khuẩn, tế bào nấm men có nhân thật. Nhân có hình ô
van, hình tròn gần không bào trung tâm với kích th-ớc khoảng 2,4 mm. Nhân
tế bào đ-ợc bao bọc bởi hai lớp màng, mỗi màng có cấu trúc gần nh- màng cơ
sở gồm 3 lớp phân tử. Những lớp này có liên hệ ở gần lỗ màng nhân. Lỗ màng
nhân tham gia việc kiểm tra quá trình trao đổi chất ở tế bào.
1.2.4. Sinh sản của tế bào nấm men Saccharomyces
Trong điều kiện bình th-ờng, tế bào nấm men sinh sản bằng lối nảy

chồi. Trong điều kiện không thuận lợi, một số có thể chuyển sang sinh sản
bằng bào tử.
Sinh sản nảy chồi ở nấm men là hình thức phổ biến nhất. Khi tế bào
phát triển đến mức độ nhất định thì trên cơ thể nó đâm ra một chồi nhỏ gọi là
mầm (chồi). Mầm (tế bào con) đâm ra ở vị trí lệch tâm trên một đầu của tế
bào mẹ. Cùng một lúc, tế bào mẹ có thể đâm ra nhiều chồi ở nhiều phía khác
nhau, ở mỗi chồi sẽ nhận đ-ợc một phần chất nhân và chất nguyên sinh của tế
bào mẹ.
Sau khi nảy mầm, tế bào con có thể tách khỏi tế bào mẹ sống độc lập,
cũng có thể không tách khỏi tế bào mẹ để tạo ra một tập hợp tế bào nấm men
hình cành cây. Trong điều kiện thuận lợi, tế bào con hoàn chỉnh và tách khỏi
tế bào mẹ là 20 30 phút.
Nấm men Saccharomyces có khả năng hình thành bào tử, bào tử túi
đ-ợc sinh ra trong những túi nhỏ gọi là túi nang, mỗi túi nang chứa 1 8 bào
tử. Nấm men Saccharomyces đ-ợc hình thành theo lối sinh sản vô tính. Đó là
quá trình tạo bào tử trực tiếp từ một tế bào riêng rẽ không qua tiếp hợp. Bào tử
túi sau khi ra khỏi túi gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển thành một tế bào
nấm men. Tiếp theo, bào tử này lại sinh sản theo lối nảy chồi.

Tr-ờng ĐHSP Hà Nội 2

8

K29B - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết

1.3. Các biến động sinh lý, sinh hoá, vi sinh khi lên men r-ợu vang
Quá trình sản xuất r-ợu vang đ-ợc bắt đầu bằng công đoạn ép n-ớc
quả. Trong quá trình lên men r-ợu vang, giai đoạn đầu nấm men bắt đầu sinh
sản. Môi tr-ờng dịch quả ban đầu vẫn còn oxy, kích thích sự phát triển của
nấm men. Sau đó tạo điều kiện cho lên men etylic yếm khí nhanh chóng đ-ợc
thiết lập, cacbonic tạo ra chiếm chỗ toàn bộ khoảng không.
Quá trình lên men r-ợu etylic và CO2 đ-ợc hình thành mạnh mẽ th-ờng
đ-ợc hình thành sau vài ngày.
Sự lên men r-ợu etylic đ-ợc biểu diễn theo ph-ơng trình hoá học:
C6H12O6 đ 2C2H5OH + 2CO2 + 33 kcal
Năng l-ợng sinh ra phục vụ cho hoạt động sống của tế bào nấm men
hoặc tổn thất d-ới dạng nhiệt khi lên men r-ợu.
Sự lên men r-ợu xảy ra qua 5 giai đoạn:
* Giai đoạn 1: Là giai đoạn hoạt hoá phân tử hecxoza.
Biến đổi glucoza thành fructoza 1.6 diphotphat d-ới xúc tác của enzim
hecxokinase và izomerase.
*Giai đoạn 2: Quá trình biến đổi fructoza 1.6 diphotphat tạo thành 3
photphoglixeraldehit và photphodioxiaxetol nhờ xúc tác của enzym aldolase.
*Giai đoạn 3: Tr-ớc hết là 3 photpho glixeraldehit biến đổi thành
glyxeraldehit nhờ xúc tác của enzym photpho glyxeromutase. Giai đoạn cuối
của quá trình này là sự biến đổi 2 photpho glyxerat thành axit pyruvic nhờ
xúc tác của enzym aldolase và photphopherase.
*Giai đoạn 5: Tạo thành etanol từ axetaldehit có xúc tác của enzym
alcoldehidrogenaza.

Tr-ờng ĐHSP Hà Nội 2

9

K29B - Sinh

Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết

Trong giai đoạn cuối cùng của sự lên men, vì đ-ờng còn lại ít trong môi
tr-ờng nên nấm men sẽ sử dụng các glycogen đã đ-ợc tích luỹ trong đó. Do
đó hàm l-ợng glycogen trong tế bào giảm dần. Với mỗi loại đ-ờng khác nhau
thì tốc độ lên men của chủng Saccharomyces khác nhau. Tốc độ lên men
đ-ờng glucoza và fructoza nhanh hơn đ-ờng saccaroza.
Tốc độ lên men đ-ợc xác định bằng l-ợng CO2 bay ra từ một thể tích
môi tr-ờng nhất định trong một đơn vị thời gian.
Kết quả của quá trình lên men r-ợu có thành phần rất phức tạp, những
vật chất của dịch quả đã chịu sự biến đổi lớn, đạm cùng chịu nhiều biến đổi
hoá học. Từ các axit amin t-ơng ứng tạo ra các r-ợu bậc cao nh- amylic,
propylic, izobutylic. Những r-ợu bậc cao có trong vang với số l-ợng không
lớn nh-ng đóng vai trò quyết định trong quá trình tạo h-ơng r-ợu vang. Sự cân
bằng của những sản phẩm lên men đ-ợc Pasteur nghiên cứu và cho kết quả:
100g glucoza tạo ra 40g etylic; 46,5g CO2; 3,3g glixeryl; 0,6g axit xucxinic;
1,2g axit lactic và axit axetic.
Thực tế, r-ợu etylic tạo ra luôn thấp hơn lý thuyết khoảng 5%. Đ-ờng
tiêu thụ để tạo sản phẩm phụ và 1% nuôi nấm men.
1.4. Vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men r-ợu vang, bệnh vang
1.4.1. Nấm men
Nấm men phổ biến đ-ợc dùng rộng rãi nhất trong sản xuất là loài
Saccharomyces cerevisiae. Nấm men chứa trung bình 75% n-ớc, 25% chất
khô.
Theo quan điểm kinh tế, ng-ời ta chia nấm men thành các chủng:
- Chủng lên men với hiệu suất cao, ở thời gian tối -u sản xuất tới 20%

V cồn.

Tr-ờng ĐHSP Hà Nội 2

10

K29B - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết

- Chủng chịu thời gian thấp sản sinh 8 -12% V cồn, thậm chí ở nhiệt độ
thấp 4 100C không bị kìm hãm.
- Chủng chịu nồng độ cồn cao, lên men đ-ợc trong r-ợu vang d-ới 30%
đ-ờng với sản l-ợng cồn 10 13%V.
1.4.2. Vi khuẩn
Trong n-ớc hoa quả và r-ợu vang có thể phát triển những dạng vi khuẩn
có tính ổn định lớn với r-ợu và axit hữu cơ.
Chúng có thể là nguyên nhân gây nên những biến đổi sâu sắc trong
r-ợu vang về vị chua, mùi, có loài còn gây đục vang.
Đó th-ờng là các loại vi khuẩn Acetobacter xyllium, Acetobacter aceti,
lactic, axetic Pasteur đã tìm ra cơ chế làm hỏng vang trong các vi sinh vật khi
r-ợu vang tiếp xúc với không khí nhiễm vi khuẩn Bacillus [4,14].
Do vậy, để bảo quản r-ợu vang, ng-ời ta dùng ph-ơng pháp thanh trùng
Pasteur nh-ng nó lại làm giảm chất l-ợng r-ợu vang. Ngoài ra, ng-ời ta còn
dùng ph-ơng pháp vi lọc hoặc dùng một số chất bảo quản phổ biến nh- SO2
(75 120mg/l).
1.4.3. Nấm mốc

Nấm mốc phát triển ở quả, chất bã của sản xuất r-ợu vang, thùng chứa
thiết bị hoặc do bụi không khí đ-a đến nh- nấm mốc thuộc chi Rhizopus,
Aspergillus [6,9,14].
1.4.4. Bệnh vang
Bệnh vang luôn là vấn đề phải quan tâm của các nhà sản xuất r-ợu
vang. Vấn đề bệnh vang đ-ợc khám phá đầu tiên bởi Pasteur. Bệnh vang làm
cho r-ợu bị chua, mùi vị khó chịu và phẩm chất r-ợu giảm rất nhanh [4,7].

Tr-ờng ĐHSP Hà Nội 2

11

K29B - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết

1.5. Các yếu tố ảnh h-ởng tới quá trình sinh tr-ởng, phát triển của nấm
men
1.5.1. Nguồn cacbon
Cacbon có trong tế bào chất, thành tế bào, trong tất cả các phản ứng
enzym, axit nucleic và các sản phẩm trao đổi chất. Vì vậy, những hợp chất
cacbon chiếm vị trí hàng đầu cho sự sống của vi sinh vật. Nguồn thức ăn chủ
yếu của nấm men là hidrat cacbon. Nó đáp ứng 3 nhu cầu sau của nấm men:
- Sản sinh năng l-ợng.
- Tạo thành những tiền chất.
- Thực hiện quá trình oxi hoá - khử.
1.5.2. Nguồn nitơ vô cơ và nguyên tố khoáng

Trong quá trình sống, nấm men cần nitơ để kiến tạo tế bào. Do đó môi
tr-ờng cung cấp nấm men phải cung cấp đầy đủ nitơ mà nấm men có thể đồng
hoá.
Các nguyên tố khoáng nh- S, P đóng vai trò quan trọng trong trao đổi
chất của tế bào nấm men. Ion Fe+3, Mg+2 nằm trong thành phần của enzym
hoạt động [4].
1.5.3. ảnh h-ởng của oxi đến gây giống và lên men
Trong lên men, giai đoạn đầu cần oxi để tăng sinh khối tế bào nấm
men. Sau đó, quá trình lên men r-ợu diễn ra ở điều kiện yếm khí để tăng hiệu
quả cồn.
1.6. Các yếu tố ảnh h-ởng đến quá trình lên men vang
1.6.1. ảnh h-ởng của nhiệt độ

Tr-ờng ĐHSP Hà Nội 2

12

K29B - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết

Nhiệt độ ảnh h-ởng trực tiếp đến sự sinh tr-ởng và phát triển của nấm
men và chất l-ợng của vang.
- Nhiệt độ < 200C: Sự lên men chậm chạp, độ r-ợu tạo thành thấp.
- Nhiệt độ < 100C: Không diễn ra quá trình lên men.
- Nhiệt độ ở 350C: Nguy hiểm cho quá trình lên men, nấm men không
chết nh-ng mất tác dụng.

- Nhiệt độ > 350C: Quá trình lên men dừng lại, l-ợng đ-ờng sót cao, vi
khuẩn hoạt động, đặc biệt nhiều vi khuẩn chuyển hoá đ-ờng thành axit axetic
gây chua, giảm chất l-ợng vang.
Nhiệt độ thích hợp nhất cho nấm men phát triển là 26 280C [8].
1.6.2. ảnh h-ởng của nồng độ cồn
Khả năng chịu cồn cao và lên men đ-ợc trong môi tr-ờng có nồng độ
cồn hợp lý là một trong những yêu cầu của chủng lên men r-ợu vang vì trong
quá trình lên men luôn sinh ra cồn. Nếu nồng độ cồn cao sẽ làm tê liệt hoạt
động sống của tế bào nấm men, ức chế, kìm hãm quá trình đồng hoá hydrat
cacbon và nitơ.
Nồng độ cồn thích hợp cho r-ợu vang phát triển tốt là 9 14% V.
1.6.3. ảnh h-ởng của pH
pH ở các độ khác nhau thì quá trình lên men diễn ra với tốc độ khác
nhau, pH: 2 3 thì quá trình lên men yếu, pH: 6,4 7,5 thì quá trình lên men
dừng lại.
pH thích hợp cho sự lên men là 4 5.
1.6.4. ảnh h-ởng của hàm l-ợng giống

Tr-ờng ĐHSP Hà Nội 2

13

K29B - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết

Hàm l-ợng giống tế bào nấm men có trong dịch lên men càng thấp, thì

thời gian nhân giống và lên men kéo dài hơn, dễ bị nhiễm khuẩn, ng-ợc lại
hàm l-ợng men giống trong dịch lên men càng cao thì thời gian lên men sẽ
ngắn hơn và hạn chế đ-ợc khả năng nhiễm khuẩn cho sự áp đảo thay đổi
thành của nấm men. Nh-ng hàm l-ợng men giống quá cao sẽ làm thay đổi
thành phần môi tr-ờng lên men, sẽ không có lợi cho quá trình lên men và chất
l-ợng r-ợu vang.
Nhìn chung, hàm l-ợng nấm men giống thích hợp nhất trong dịch lên
men từ 4 10 triệu tế bào /1 ml dịch lên men.
1.6.5. ảnh h-ởng của hàm l-ợng đ-ờng
Hàm l-ợng đ-ờng phù hợp cho quá trình lên men vang là 12 25%.
Hàm l-ợng đ-ờng 30% V sẽ ức chế quá trình lên men. Các kết quả
nghiên cứu cho thấy, khi hàm l-ợng đ-ờng trong dịch lên men tăng thì hàm
l-ợng axit trong vang cũng cao. Mặt khác, tỉ lệ các loại đ-ờng có trong dịch
lên men cũng ảnh h-ởng không nhỏ tới tốc độ và hiệu suất lên men. Kết quả
nghiên cứu của nhiều tác giả cho thấy: glucoza là loại đ-ờng phù hợp nhất cho
sự sinh sản và phát triển của tế bào nấm men cũng nh- quá trình tạo r-ợu,
tiếp đó là đ-ờng fructoza và đ-ờng sacaroza. Vì vậy, quả có chứa hàm l-ợng
đ-ờng khử cao càng có lợi cho quá trình lên men và chất l-ợng của vang thành
phẩm [ 4,6,8,14].

Tr-ờng ĐHSP Hà Nội 2

14

K29B - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết

Ch-ơng 2. Đối t-ợng và ph-ơng pháp
nghiên cứu
2.1. Đối t-ợng nghiên cứu
2.1.1. Đối t-ợng nghiên cứu
- Quả táo mèo (Docynia indica) đ-ợc thu nhận từ hai tỉnh Yên Bái
(Trạm Tấu) và Sơn La.
- Các chủng nấm men nghiên cứu đ-ợc phân lập từ dịch quả táo mèo có
vị trí phân loại theo Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty
(1997) sau đây:
Lớp: Hemiascomycetes
Bộ: Endomycetales
Họ: Saccharomycetaceae
Giống: Saccharomyces
Loài: Cerevisiae
2.1.2. Hoá chất
Các loại đ-ờng chuẩn ( hãng BDH Anh) saccaroza, fructoza, glucoza.
Một số chất vô cơ, hữu cơ MgSO4.7H2O, KH2PO4, (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4,
NaOH, HCl, axit xitric. R-ợu etylic, pepton, agar, phenolphtalein.
2.1.3. Dụng cụ và thiết bị
- Dụng cụ: Hộp lồng, ống nghiệm, pipet, bàn trang thuỷ tinh, phễu thuỷ
tinh, que cấy, đèn cồn, cốc thuỷ tinh.

Tr-ờng ĐHSP Hà Nội 2

15

K29B - Sinh

Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết

- Thiết bị: Bình cầu, bình tam giác, nồi hấp, buồng cấy vô trùng, tủ sấy,
cân phân tích, máy lắc, đ-ờng kế, kính hiển vi quang học có độ phóng đại
1000 lần.
2.1.4. Môi tr-ờng
Dựa vào kết quả phân tích tính chất của nấm men Saccharomyces
cerevisiae chúng tôi chọn môi tr-ơng vô cơ theo tỷ lệ sau:
2.1.4.1. Môi tr-ờng Hansen (MT1) g/l
1. Đ-ờng glucoza: 50g
2. Pepton: 5g
3. MgSO4.7H2O: 0,5g
4. KH2PO4: 1g
5. (NH4)2SO4: 1g
6. Thạch aga: 20g
7. N-ớc: 1000ml
2.1.4.2. Môi tr-ờng nhân giống (MT2) g/l
1. Đ-ờng glucoza: 50g
2. Pepton: 5g
3. MgSO4.7H2O: 0,5g
4. KH2PO4: 1g
5. (NH4)2SO4: 1g
6. N-ớc: 1000ml
2.1.4.3. Môi tr-ờng lên men (MT3) g/l
1. Dịch sirô hoa quả: 200ml

Tr-ờng ĐHSP Hà Nội 2

16

K29B - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết

2. MgSO4.7H2O: 0,5g
3. KH2PO4: 1g
4. (NH4)2SO4: 1g
5. N-ớc: 1000ml
2.1.4.4. Môi tr-ờng nitơrat (MT4)g/l
1. Glucoza: 20g
2. MgSO4. 7H2O: 0,5g
3. Thạch: 20g
4. KH2PO4: 1g
5. N-ớc cất: 1000ml
6. KNO3: 0,78g
2.2. Ph-ơng pháp nghiên cứu
Trong công trình này chúng tôi đã sử dụng một số ph-ơng pháp nghiên
cứu sau đây:
2.2.1. Ph-ơng pháp vi sinh
Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men dựa trên việc nghiên cứu hình
thái tế bào nấm men, xác định số l-ợng tế bào nấm men, hoạt lực lên men.
2.2.2. Ph-ơng pháp hoá lý
Xác định hàm l-ợng đ-ờng tổng số bằng khúc xạ kế, hàm l-ợng đ-ờng
sót bằng ph-ơng pháp DNS, hàm l-ợng cồn bằng ph-ơng pháp bicromatkali,
hàm l-ợng axit tổng số theo axit tartaric, dựa vào nguyên tắc trung hoà axit

bằng dung dịch NaOH 0,1N, xác định pH bằng máy đo pH.

Tr-ờng ĐHSP Hà Nội 2

17

K29B - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết

2.2.3. Ph-ơng pháp phân tích cảm quan
2.2.4. Ph-ơng pháp xử lý các kết quả thu đ-ợc bằng thống kê toán
học
- Giá trị trung bình số học:
n

ồ
X=

Xi

i= 1

n

- Độ lệch chuẩn:

ồ

S=

ồ

S=

(Xi - X)
n- 1

2

( nếu n < 30)

2

(Xi - X)
( nếu n 30)
n

- Sai số trung bình học:
m=

S
n

- Hệ số biến thiên:
S
C% =

X

. 100%

Trong đó:
n: Số lần nhắc lại.
Xi: Giá trị của lần thứ i.
2.3. Phạm vi nghiên cứu
Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae tuyển chọn trên đối t-ợng là
quả táo mèo thu đ-ợc từ Trạm Tấu (Yên Bái), Sơn La.
2.4. Địa điểm nghiên cứu
Phòng thí nghiệm Vi sinh, khoa Sinh KTNN, tr-ờng ĐHSP Hà Nội 2.

Tr-ờng ĐHSP Hà Nội 2

18

K29B - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết

Ch-ơng 3. Kết quả nghiên cứu
và thảo luận
3.1. Phân lập, tuyển chọn, xác định tên khoa học của chủng nấm men lên
men vang táo mèo
3.1.1. Phân lập chủng nấm men có khả năng lên men vang táo mèo

Nguyên liệu dùng để sản xuất r-ợu vang ở đây là quả táo mèo. Quả sau
khi thu hoạch về thì lựa chọn quả đã chín, loại bỏ quả non, dập nát, thối rữa
sau đó rửa sạch để ráo n-ớc, khía các đ-ờng nhỏ quanh quả rồi cho vào các
ang thùng ngâm đ-ờng theo tỷ lệ 1:1 sau 2 ngày khuấy trộn một lần. Sau một
tháng, ta thu đ-ợc một l-ợng sirô có nồng độ đ-ờng từ 60 80% và nhiều
d-ỡng chất khác đ-ợc chiết ra từ dịch quả.
Từ dịch quả tự nhiên, chúng tôi tiến hành phân lập trên hộp pêtri đ-ợc
38 mẫu nấm men. Từ 38 mẫu này, chúng tôi tiến hành tuyển chọn đ-ợc ba
khuẩn lạc có đ-ờng kính lớn, trơn, nhẵn, bóng, lồi, bờ không có răng c-a làm
đối t-ợng nghiên cứu tiếp theo. Các chủng này đ-ợc kí hiệu là D1, D2, D3.
Sau đây là ảnh chụp khuẩn lạc và tế bào nấm men S. cerevisiae

Tr-ờng ĐHSP Hà Nội 2

19

K29B - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết

ảnh 3.1.1.a. ảnh chup của khuẩn lạc nấm men S. cerevisiae
trên môi tr-ờng thạch đĩa.

Tr-ờng ĐHSP Hà Nội 2

20

K29B - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết

ảnh 3.1.1.b. ảnh chụp tế bào nấm men S. cerevisiae trên
kính hiển vi quang học x 1000
3.1.2. Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang táo mèo
Nấm men đóng vai trò quan trọng đối với toàn bộ quy trình sản xuất và
chất l-ợng của vang. Vì vậy, khi tuyển chọn phải lấy đ-ợc chủng tốt nhất. Từ
đó, chúng tôi lựa chọn chủng nấm men dựa vào các chỉ tiêu sau:
- Chịu đ-ợc độ đ-ờng và độ axit cao.
- Có hiệu suất lên men cao.
- Có khả năng kết lắng tốt và làm trong sản phẩm.
- Tạo đ-ợc h-ơng thơm đặc tr-ng, không có vị lạ, không sinh độc tố, ổn
định lâu dài trong sản xuất.
3.1.2.1. Nghiên cứu hoạt lực lên men của ba chủng nấm men đã tuyển
chọn
Trong quá trình lên men thì hoạt lực lên men đ-ợc đánh giá bằng l-ợng
CO2 thoát ra. L-ợng CO2 thoát ra càng nhiều chứng tỏ hoạt lực lên men càng
lớn. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên môi tr-ờng là dịch sirô táo mèo có bổ
sung cao men và đ-ợc pha loãng để đạt nồng độ đ-ờng là 20%. Tiến hành lên
men trong các bình tam giác ở quy mô 150ml với thời gian là 36h. Chúng tôi
thu đ-ợc kết quả thể hiện trong bảng 3.2.2.1.
Bảng 3.2.2.1. Thử hoạt lực lên men của ba chủng nấm men
STT
1

độ pH

Chủng
D1

3

3,5

4

4,5

5

+

+

+ +

+ +

+

2

D2

+ +

+ + +

+ + + +

+ + + +

+ + +

3

D3

+ +

+ +

+ + +

+ + + +

+ +

Tr-ờng ĐHSP Hà Nội 2

21

K29B - Sinh

Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết

Trong đó : + + + +: Hàm l-ợng CO2 tạo ra > 30g/l dịch lên men.
+ + +: Hàm l-ợng CO2 từ 15 25g/l dịch lên men.
+ + : Hàm l-ợng CO2 từ 10 15g/l dịch lên men.
+: Hàm l-ợng CO2 < 10 g/l dịch lên men.
Từ kết quả cho thấy:
Các chủng đều có khả năng sinh tr-ởng và phát triển tốt ở pH: 4 4,5.
Chủng có hoạt lực lên men mạnh nhất D2.
3.1.2.2. Nghiên cứu khả năng lên men đ-ờng
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên môi tr-ờng dịch sirô táo mèo có
hàm l-ợng đ-ờng 240g/l, pH: 4, nhiệt độ lên men là 28 320C, số l-ợng giống
ban đầu (3,8 0,2)x 106 tb/ml. Sau khi kết thúc qúa trình lên men r-ợu (15
17 ngày), chúng tôi tiến hành phân tích một số chỉ tiêu hoá lý để xác định khả
năng lên men của các chủng nấm men và kết quả thí nghiệm đ-ợc dẫn ra ở
bảng 3.1.2.2.
Bảng 3.1.2.2. Khả năng lên men của ba chủng nấm men
Chỉ tiêu đánh giá

Đơn vị

Đ-ờng tổng số

Chủng nấm men
D1

D2

D3

g/l

75

50

70

Đ-ờng khử

g/l

0,75

0,45

0,7

Độ cồn

%V

9,76

11,17

9,84

Hiệu suất lên men

%

76,2

87,1

76,6

Từ kết quả trên, ta thấy rằng chủng D2 có hiệu suất lên men và độ cồn
cao nhất, l-ợng đ-ờng khử thấp nhất.
Chúng tôi tiếp tục nghiên cứu khả năng kết lắng, khả năng tạo h-ơng
thơm và độ trong của sản phẩm.

Tr-ờng ĐHSP Hà Nội 2

22

K29B - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết

3.1.2.3. Khả năng tạo h-ơng thơm
Sau khi kết thúc lên men (90 ngày), chúng tôi xác định khả năng tạo
h-ơng thơm bằng ph-ơng pháp cảm quan bằng cách mở nút từng bình lên men
sau đó đ-a gần lên mũi so sánh độ thơm của các bình. Chúng tôi thu đ-ợc kết

quả dẫn ra ở bảng 3.1.2.3.
Bảng 3.1.2.3. Khả năng tạo h-ơng thơm của ba chủng nấm men
Tên chủng nấm men
STT

Chỉ tiêu đánh giá

1

Độ thơm

D1
ít thơm

D2

D3

Thơm

Thơm

Kết quả phân tích cho thấy, chủng D2 , D3 đạt h-ơng thơm tốt hơn
chủng D1.
Tổng hợp các kết quả nghiên cứu của ba chủng nấm men, chúng tôi thu
đ-ợc kết quả sau:
Bảng 3.1.2. Tổng hợp kết quả tuyển chọn chủng nấm men
Chủng
STT

Chỉ tiêu đánh giá

1

D1

D2

D3

Khả năng lên men ở pH thấp

1

3

2

2

Hiệu suất lên men

1

3

2

3

H-ơng thơm của sản phẩm

1

2

3

4

Đánh giá chung

2

3

1

5

Tổng điểm

5

11

8

Nh- vậy, chủng mang nhiều đặc điểm tốt nhất đạt số là D2. Vì vậy,
chúng tôi quyết định chọn chủng D2 cho các nghiên cứu tiếp theo.

Tr-ờng ĐHSP Hà Nội 2

23

K29B - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết

3.1.3. Xác định tên khoa học của chủng D2
Chúng tôi tiến hành xác định tên khoa học của chủng D2 dựa vào các
đặc tính sinh học của chủng nấm men nh-:
- Khả năng lên men đ-ờng.
- Khả năng đồng hóa muối nitrat.
- Quan sát hình dạng tế bào trên kính hiển vi.
3.1.3.1. Khả năng lên men các loại đ-ờng
Để xác định khả năng lên men các loại đ-ờng của chủng nấm men S.
cerevisiae D2 chúng tôi sử dụng ph-ơng pháp lên men trong các bình tam giác
250ml bằng cách cấy chủng D2 vào 6 môi tr-ờng khác nhau (mỗi môi tr-ờng
ứng với một loại đ-ờng) với số l-ợng tế bào nấm men ban đầu nh- nhau là 4,8
x106 tb/ml. Kết quả thu đ-ợc trình bày ở bảng 3.1.3.1
Bảng 3.1.3.1. Khả năng lên men các loại đ-ờng của chủng D2
Loại đ-ờng

Khả năng lên men

Loại đ-ờng

Khả năng lên men

D-glucoza

++

Sacaroza

+

D-galactoza

+

Lactoza

+

Mantoza

+

Dextrin

-

Trong đó: ++: lên men mạnh
+: Có khả năng lên men nh-ng không mạnh
-: Không có khả năng lên men

Tr-ờng ĐHSP Hà Nội 2

24

K29B - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết

Nh- vậy, chủng nấm men D2 không có khả năng lên men ở môi tr-ờng
có đ-ờng Dextrin nh-ng có khả năng lên men ở môi tr-ờng có đ-ờng
Sacaroza, Lactoza, Mantoza, D-galactoza và lên men tốt nhất ở môi tr-ờng có
đ-ờng D-glucoza.
3.1.3.2. Khả năng sử dụng nitrat làm nguồn nitơ duy nhất.
Để xác định khả năng sử dụng nitrat của chủng nấm men D2 chúng tôi
tiến hành làm thí nghiệm trên môi tr-ờng nitơrat (MT4) bằng cách đổ môi
tr-ờng vào các ống nghiệm sau đó hấp thanh trùng (không để nghiêng sau khi
khử trùng) và bố trí các thí nghiệm theo 2 lô khác nhau.
+ Lô thứ nhất: Mẫu đối chứng
+ Lô thứ hai: Bổ sung nitơ (pepton = 1g/l) lên bề mặt. Dùng que cất có
đầu nhọn để cấy chủng D2 chích sâu vào bề mặt thạch và tiến hành nuôi cấy ở
nhiệt độ 28 300C trong thời gian 2 3 ngày.
Kết quả: Lô thứ nhất: Không có sự phát triển của chủng D2.
Lô thứ hai: Chủng D2 đều phát triển rất tốt trong các ống
nghiệm tạo khuẩn lạc rất đặc tr-ng.
Tóm lại, chủng nấm men D2 không có khả năng sử dụng nitrat làm
nguồn nitơ duy nhất.

Dựa vào khoá phân loại của Lodder năm (1971) và kết quả nghiên cứu
đối với chủng D2 có đặc tính:
- Sinh sản bằng nảy chồi nhiều phía.
- Không đồng hoá nitrat.
- Tế bào hình trứng, hình ô van, hình cầu.
- Lên men glucoza mạnh.
- Lên men saccaroza, galactoza, mantoza.

Tr-ờng ĐHSP Hà Nội 2

25

K29B - Sinh