Nghiên cứu sự biến đổi chỉ số hàm lượng diệp lục và prolin của một số giống đậu xanh trong điều kiện Stress muối

Khoá luận tốt
nghiệp
LỜI CẢM ƠN
Trước hết em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến cô
giáo, Thạc sĩ Điêu Thị Mai Hoa - người đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi
điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình thực hiện khoá luận này.
Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong tổ Sinh lý thực
vật, Ban chủ nhiệm khoa, các cô chú trong phòng thí nghiệm, thư viện và
các bạn trong khoa Sinh - KTNN đã động viên, giúp đỡ em hoàn thành tốt
khoá luận tốt nghiệp của mình.
Sinh viên
Trần Thị Thanh Huyền

Trần Thị Thanh
Huyền
K29C

1

Lớ
p


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là kết quả nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu
trình bày trong khoá luận là trung thực, không trùng lặp với bất cứ công trình
nghiên cứu nào khác đã công bố.
Xuân Hoà, ngày 4 tháng 5 năm 2007
Tác giả
Trần Thị Thanh Huyền

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU...........................................................................................................4
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU...........................................................8
1.1.Giới thiệu về cây đậu xanh......................................................................8
1.2.Tác động của muối và tính chịu mặn của cây trồng................................9
1.2.1.Tác động của mặn.................................................................................9
1.2.2.Vai trò của axit amin prolin đối với tính chống chịu của thực vật......10
CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.........12
2.1.Vật liệu nghiên cứu............................................................................... 12
2.1.1.Nguyên liệu thực vật...........................................................................12
2.1.2.Hoá chất và máy móc......................................................................... 13
2.2.Phƣơng pháp nghiên cứu......................................................................13
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN........................16
3.1.Hàm lƣợng axit amin prolin trong rễ của một số giống đậu xanh........16
3.2.Hàm lƣợng axit amin prolin trong lá của một số giống đậu xanh.........21
3.3.Hàm lƣợng diệp lục trong lá của một số giống đậu xanh..................... 26
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ............................................................................. 31
TÀI LIỆU THAM KHẢO...............................................................................32


MỞ ĐẦU
Trong quá trình sống thực vật luôn chịu tác động của các nhân tố ngoại
cảnh. Trong số đó có những nhân tố không thuận lợi cho hoạt động sống của
thực vật nhƣ: khô hạn, giá rét, đất chua, mặn, ngập úng, sâu bệnh v.v…Để tồn
tại cây đã có những thích ứng khác nhau đối với điều kiện không thuận lợi
của môi trƣờng. Mức độ thích ứng đƣợc những tác động không thuận lợi của
ngoại cảnh ở những loài cây khác nhau hay ở cùng một loài, ở những thời kì
sinh trƣởng và phát triển khác nhau cũng khác nhau. Một trong những nhân tố
bất lợi của môi trƣờng đáng đƣợc quan tâm đó là tác động của muối. Hàm

lƣợng muối cao trong đất là một trong những nguy cơ lớn nhất hạn chế năng
xuất và phẩm chất cây trồng ở nhiều nơi trên thế giới, đặc biệt nghiêm trọng
là ở các nƣớc đang phát triển. Hiện nay, có khoảng 230 triệu ha đất (sản xuất
gần 50% sản lƣợng lƣơng thực trên thế giới) bị nhiễm mặn. Riêng ở Việt
Nam và Đông Nam Á ƣớc tính có khoảng 54 triệu ha đất bị nhiễm mặn.
Phần lớn diện tích đất mặn chƣa đuợc sử dụng. Một số ít diện tích đất mặn
đã đƣợc sử dụng song cho năng suất chƣa cao [1]. Chính vì thế việc nghiên
cứu khả năng chịu mặn ở cây trồng nói chung và đậu xanh nói riêng có ý
nghĩa thực tiễn đặc biệt quan trọng trong sản xuất nông nghiệp góp phần
mở rộng diện tích canh tác, nâng cao năng suất cây trồng ở những vùng
nhiễm mặn.
Những nghiên cứu về tác động của mặn lên sự sinh trƣởng và phát triển
của cây trồng cho thấy cây trồng có khả năng thích ứng trong một giới hạn
nhất định với tác động của mặn. Cây trồng tích luỹ và duy trì nồng độ cao các
chất hoà tan trong tế bào nhằm đảm bảo sức cạnh tranh với nƣớc, với môi
trƣờng nhiễm muối. Nhóm hợp chất có khả năng tham gia điều chỉnh áp suất
thẩm thấu ở tế bào thực vật bao gồm: các axit amin (đáng chú ý là prolin),
nhóm hợp chất amon bậc 4 (glycinebetain, prolinbetain, B-alaninbetain và


choline-oxy-sufate) và nhóm hợp chất 3-dimethylsulfonipropionate (DMSP).
Prolin đƣợc tích luỹ trong lá, thân và rễ đặc biệt với hàm lƣợng prolin cao khi
cây gặp hạn. Có thể xem sự tích luỹ prolin là biểu hiện phản ứng thích nghi
của thực vật với điều kiện cung cấp nƣớc khó khăn [8]. Ngoài ra, muối còn có
tác động kìm hãm sự tổng hợp chất hữu cơ ở thực vật trong đó có hàm lƣợng
diệp lục trong lá khi cây gặp điều kiện bất lợi. Sự biến đổi hàm lƣợng diệp lục
trong lá cũng là một chỉ số quan trọng đánh giá khả năng chịu mặn của thực
vật nói chung và cây đậu xanh nói riêng.
Đối tƣợng nghiên cứu đƣợc sử dụng trong đề tài này là cây đậu xanh,
đây là cây trồng có vai trò quan trọng trong đời sống con ngƣời. Đậu xanh có

tên khoa học là Vigna radiata, thuộc họ đậu (Fabaceae), có nguồn gốc từ Ấn
Độ, Trung Á, đƣợc phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới và á nhiệt đới [6].
Thành phần dinh dƣỡng của hạt đậu xanh rất phong phú. Hàm lƣợng protein
có thể đạt tới 24% khối lƣợng khô của hạt. Trung bình 100g bột đậu xanh
chứa: 24,5g protein; 59,9g hidrat cacbon; 1,2g lipit; 7,5mg Ca; 405mg P;
8,5mg Fe; 49mg caroten; 0,72mg B1; 0,15mg B2 và 348Kcal [6]. Protein của
đậu xanh có giá trị không chỉ về hàm lƣợng mà còn về chất lƣợng bởi trong
thành phần có chứa đầy đủ các axit amin không thay thế nhƣ: lizin,
methionin, triptophane...Hạt đậu xanh là nguyên liệu chế biến bánh kẹo, đồ
uống, giá đỗ, xôi, chè....Đặc biệt là nhân của bánh trƣng - một món ăn truyền
thống mang đậm đà bản sắc văn hoá của ngƣời Việt. Không những thế, hạt
đậu xanh còn đƣợc dùng trong một số bài thuốc nam chữa các chứng bệnh
nhƣ phù thũng, sƣng quai hàm, hạ khí, giải nhiệt, giải độc...[3]. Giống nhƣ
các loại cây họ đậu khác, cây đậu xanh có vai trò quan trọng trong việc cải tạo
đất, sự cộng sinh giữa rễ cây và vi khuẩn Rhizobium đã góp phần làm tăng
lƣợng đạm cho đất mà không gây ô nhiễm môi trƣờng, gây chai cứng đất nhƣ


các loại phân bón hoá học (lƣợng đạm này khoảng từ 30 - 70 kgN/ha có thể
lên đến 100 kgN/ha).
Tình hình sản xuất đậu xanh trên thế giới thì theo kết quả điều tra của
Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển rau quả Châu Á ( AVRDC) năm 1986,
hằng năm trên thế giới có ít nhất 23 nƣớc sản xuất đậu xanh (Sureoh
Chandrababu và cty, 1988). Ở Việt Nam, đậu xanh là một trong 3 cây đậu đỗ
chính, đậu xanh đứng sau lạc và đậu tƣơng. Gần đây, do những thay đổi về
năng suất và sản lƣợng của cây lƣơng thực và thực phẩm tăng lên, đậu xanh
đã và đang đƣợc phát triển rộng trong hệ thống cây trồng ở các vùng sản xuất
[2], [7]. Tuy diện tích trồng đậu xanh từ năm 1983 đến nay đã tăng nhƣng
năng suất và sản lƣợng lại tăng chậm và không liên tục. Những yếu tố hạn chế
năng suất đậu xanh hiện nay là: đậu xanh đƣợc trồng chủ yếu trên đất xấu,

thiếu giống phù hợp với các vùng sinh thái, trình độ thâm canh và đầu tƣ còn
thấp [6].
Gần đây, để đáp ứng nhu cầu sản xuất và sử dụng đậu xanh ngày càng
cao của con ngƣời, nhiều nhà khoa học đã đầu tƣ nghiên cứu chọn tạo giống
mới và các biện pháp thâm canh, cùng với sự quan tâm của nhà nƣớc trong
công tác nhập nội nguồn gen đậu xanh đã làm xuất hiện nhiều giống đậu xanh
có năng suất khá cao. Tuy nhiên, để đƣa các giống mới này vào trồng ở các
vùng sinh thái khác nhau, nhất là các vùng bị nhiễm mặn, nắng hạn đã gặp
không ít khó khăn. Vì vậy, để nâng cao năng xuất đậu xanh cùng với công tác
chọn tạo giống thì việc nghiên cứu, lựa chọn những giống thích hợp với từng
vùng sinh thái khác nhau là việc làm có ý nghĩa thực tiễn sâu sắc đặc biệt là
những vùng bị nhiễm mặn đến nay chƣa đƣợc trồng phổ biến.
Xuất phát từ các vấn đề lý luận và thực tiễn nêu trên, chúng tôi tiến
hành đề tài “Nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hoá của một số giống


đậu xanh trong điều kiện stress muối (NaCl)” với mục tiêu và nội dung
nhƣ sau:
Mục tiêu nghiên cứu
+ Sự biến đổi hàm lƣợng axit amin prolin trong lá và rễ đậu xanh của
một số giống đậu xanh trong điều kiện stress muối so với đối chứng.
+ Sự biến đổi hàm lƣợng diệp lục trong lá của một số giống đậu xanh
trong điều kiện stress muối so với đối chứng.
+ Góp phần khẳng định vai trò của axit amin prolin đối với khả năng
chịu mặn của thực vật nói chung và của đậu xanh nói riêng.
Nội dung nghiên cứu
+ Trồng đậu xanh trong xô nhựa với hai nền thí nghiệm: đối chứng và
gây stress muối NaCl, sau đó xem xét sự biến đổi hàm lƣợng diệp lục trong lá
của một số giống đậu xanh.
+ Tách chiết axit amin prolin trong rễ và lá của đậu xanh, so sánh sự

biến đổi hàm lƣợng prolin ở hai nền thí nghiệm.
Phạm vi nghiên cứu
Tiến hành nghiên cứu trên 4 giống đậu xanh trong đó có 3 giống mới:
V123, KPS1, T135 do Viện khoa học nông nghiệp Việt Nam (VKHNNVN)
cung cấp và giống địa phƣơng Tiêu Xuân Hoà. Thời gian tiến hành từ 12/9
đến tháng 12 năm 2006 tại khu vƣờn thí nghiệm của khoa Sinh – KTNN.
Ý nghĩa lí luận và thực tiễn
Nghiên cứu góp phần tìm hiểu sâu mối quan hệ giữa các quá trình sinh
lý, sinh hoá và khả năng chống chịu của đậu xanh, đồng thời so sánh đặc điểm
sinh lý tính chống chịu của một số giống đậu xanh quốc gia với giống địa
phƣơng Tiêu Xuân Hoà, từ đó rút ra kết luận về khả năng chịu muối giúp định
hƣớng gieo trồng ở những vùng lâu nay chƣa sử dụng do bị nhiễm mặn.


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về cây đậu xanh
Cây đậu xanh là loại cây trồng cạn, thu hạt, rễ thuộc loại rễ cọc gồm: rễ
cái và rễ con. Rễ cái sâu khoảng 20 - 30cm, rễ con thƣờng có độ 30 - 40 cái,
dài 20 - 25cm tập chung chủ yếu ở lớp đất sâu 25cm. Điểm giao nhau của rễ
cái và rễ nhánh thƣờng có nhiều nốt sần (30 - 40 nốt sần/cây). Thân thuộc
loại thân thảo hằng năm, cao 40 - 70cm, có lớp lông mịn màu nâu sáng. Trên
thân đƣợc chia thành 7 đốt, các đốt gần mặt đất thƣờng phát sinh cành cấp 1,
các đốt phía trên là vị trí hình thành các chùm quả. Lá kép mọc cách, lá chét
có 3 thuỳ với nhiều hình dạng nhƣ: ô van, thuôn dài, lƣỡi mác. Hoa có màu
tím hoặc vàng nhạt. Khi cây có lá thứ 5 nụ hoa đƣợc hình thành. Hoa đậu
xanh là loại hoa lƣỡng tính, mọc thành chùm trên trục hoa, tự thụ phấn cao, tỷ
lệ hoa nở thành quả từ 10 - 20%. Quả chín có màu đen hoặc vàng nâu. Mỗi
cây có từ 8 - 35 quả, mỗi quả có từ 7 - 14 hạt [6], [2].
Đậu xanh là cây ngắn ngày, nhiệt độ tối ƣu cho sinh trƣởng và phát
0

triển là 20 - 30 C. Ở Việt Nam, Đậu xanh có thể trồng vào các vụ xuân hè, hè
thu và thu đông [2].


1.2. Tác động của muối và tính chịu mặn của cây trồng
1.2.1. Tác động của mặn
Nồng độ chất hoà tan trong dung dịch càng cao thì tiềm năng hoá học
trong dung dịch đó càng thấp. Điều đó có nghĩa là khả năng khuếch tán của
nƣớc càng nhỏ khi nồng độ chất hoà tan trong dung dịch càng cao.
Nồng độ muối cao trong đất nên dịch đất có áp suất thẩm thấu rất cao,
có khi đạt tới 300 - 400 atm, ảnh hƣởng rất rõ rệt đến sự hút nƣớc của cây.
Mà nƣớc là yếu tố giới hạn đối với cây trồng, là sản phẩm quan trọng khởi
đầu, trung gian và cuối cùng của các quá trình chuyển hoá sinh hoá, là môi
trƣờng để các phản ứng trao đổi chất xảy ra. Nƣớc có ý nghĩa sinh thái, sinh
lý quyết định trong đời sống thực vật. Ảnh hƣởng của sự thiếu nƣớc trƣớc hết
là đến sự mất nƣớc của tế bào và mô. Bất kỳ sự mất nƣớc nào cũng dẫn đến
sự vi phạm chế độ nƣớc và hình thành độ thiếu hụt nƣớc trong tế bào. Sự
thiếu hụt nƣớc càng lớn thì ảnh hƣởng càng xấu. Thiếu nƣớc nhẹ chỉ ảnh
hƣởng đến quá trình sinh trƣởng. Thiếu nƣớc nặng hơn gây nên biến đổi hệ
keo nguyên sinh chất, làm cho cây bị héo. Khi bị khô, nguyên sinh chất bị đứt
vỡ cơ học dẫn đến tế bào và mô bị tổn thƣơng và chết.
Tác động thứ hai của mặn liên quan đến tính gây độc của các ion có
trong đất. Các sản phẩm độc có thể là điamin: putreexin (trên nền đất giàu
clo) và caclaverin (trên nền đất giàu sulfat) gây rối loại quá trình trao đổi chất.
Những chất này trong điều kiện đất nhiễm mặn sẽ không biến đổi thành
alcaloit là nguồn dự trữ nitơ của cây mà bị oxy hoá thành NH3 gây độc cho
cây. Bên cạnh đó, nồng độ cao của Natri làm cản trở sự xâm nhập của cation
++

+

quan trọng khác vào tế bào nhƣ: Ca , K .
Những nghiên cứu về tác động của muối nên sinh trƣởng và phát triển
của cây trồng nhƣ: lúa mạch ( Abdou và CS, 1971), về trao đổi ion ở lúa (Cho
và CS, 1996) cho thấy cây trồng có khả năng thích ứng trong một giới hạn


nhất định với tác động của muối, mức độ đó rất phụ thuộc vào kiểu gen của
đối tƣợng nghiên cứu [1].
1.2.2.Vai trò của axit amin prolin đối với tính chống chịu của thực vật
Axit amin prolin (gọi tắt là prolin) đƣợc tổng hợp từ glutamine bởi
ezym chìa khoá deltal-pyrroline-5-carboxylate synthetase [12]. Prolin hay
α pirolidin cacboxilic có công thức cấu tạo là:
COO
H2N

CỏH

H2C

CH2

-

CH2
Trong phân tử axit amin prolin có một mạch bên hydrocacbua. Nhƣng
khác với các axit amin khác là prolin có sự kết hợp giữa nhóm amin bậc 1 với
Cα và với mạch bên tạo thành vòng pirolidin. Do đó, prolin là một axit
amin chứa nhóm amin bậc 2, còn gọi axit imino.

Sự tích luỹ prolin là một phản ứng thông thƣờng của thực vật bậc cao
tới sự thiếu hụt nƣớc và áp lực muối và đó cũng là vấn đề đƣợc nghiên cứu
rất nhiều trong suốt 20 năm gần đây (Stewart và Larher 1980; Thompson
1980; Stewart 1981;....)[14].
Các nghiên cứu chỉ ra rằng, prolin bảo vệ màng tế bào, chống lại ảnh
hƣởng bất lợi của sự tập trung cao các ion vô cơ và nhiệt độ cực [17]. Prolin
đƣợc xem nhƣ là một chất điều hoà áp suất thẩm thấu ở trế bào thực vật. Hiện
tƣợng này đƣợc tìm thấy ở tảo và thực vật bậc cao dƣới điều kiện bất lợi của
môi trƣờng [12].
Nhiều nghiên cứu cho thấy: sự tăng cƣờng nồng độ prolin trong cây
chịu áp lực thẩm thấu có liên quan đến sự ức chế oxi hoá và phân huỷ prolin
hoặc do sự tăng cƣờng khả năng tổng hợp prolin nhanh chóng ở thực vật
(Brunett và Naylor 1966, Morissetla 1969) [10].


Theo Wyn Tones (1977) những hợp chất đƣợc coi là tác nhân cạnh
tranh thẩm thấu, trong đó đáng kể nhất là prolin, đƣợc xem nhƣ đóng vai trò
chủ đạo trong sự thích ứng thẩm thấu tế bào chất của thực vật nhằm phản ứng
lại áp lực thẩm thấu [14].
Sự tích luỹ prolin và tập trung axit abscisic (ABA) ở mô phân sinh đỉnh
là một chuyển hoá thông thƣờng của thực vật bậc cao nhằm phản ứng lại sự
thiếu hụt nƣớc do áp lực muối cao. Prolin đƣợc tích luỹ trong mô lá, mô phân
sinh chồi của thực vật chịu áp lực nƣớc (Barnet và Naylor 1966, Boggess
1976, Jones 1980 ) và trong mô phân sinh chóp của thực vật mọc ở nơi có thế
năng nƣớc thấp (Voetberg và Sharp 1991) [13].
Nghiên cứu về sự thay đổi của hàm lƣợng prolin và nồng độ axit
abxisic của những cây đậu tƣơng mẫn cảm và chống chịu điều kiện áp suất
thẩm thấu của ZhengYi - Zhi và Li Tian cũng kết luận rằng: phản ứng với áp
lực khô hạn và nồng độ muối, cây đậu tƣơng tích kuỹ hàm lƣợng prolin cao,
đó dƣợc xem nhƣ một phản ứng thích nghi [19].

Nghiên cứu của Nanjo và cộng sự cho thấy: những cây bị đột biến về
hình dạng (có sự bất thƣờng về biểu bì, tế bào mô mềm và hệ mạch) có hàm
lƣợng P5CS (enzym tham gia vào quá trình tổng hợp prolin) thấp rất mẫn cảm
với áp lực thẩm thấu. Những biến đổi kiểu hình này có thể ức chế bằng sự
tăng cƣờng prolin ngoại bào.
Bằng công nghệ gen, Kishor (1995) đã thành công trong việc chuyển
gen mã hoá enzym P5CS vào cây thuốc lá và nhận thấy cây này có tính chống
chịu tốt với các bất lợi về nƣớc. Lƣợng prolin tăng từ 8-10 lần so với đối
chứng [16].
Theo nghiên cứu của thạc sĩ Điêu Thị Mai Hoa, Nguyễn Thị Thu
Hƣơng, Nguyễn Đạt Kiên và Bùi Văn Thắng (Viện công nghệ sinh học) về


vai trò của axit amin prolin đối với tính chịu hạn của cây đậu xanh cho rằng:
hàm lƣợng prolin tăng lên trong lá và mầm đậu xanh [4].

CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu thực vật
Bảng 2.1. Danh sách một số giống đậu xanh nghiên cứu
TT Tên giống

Đặc điểm

Nguồn gốc

Thuộc loại hình thâm canh cao, lá
mần có màu xanh vàng, hạt màu
xanh đậm, tổng số lá trên cây là 9,
1

V123

thời gian sinh trƣởng 70 ngày, là loại
hình chín tập trung trồng 3vụ /1

Viện
KHNNVN

năm, khối lƣợng 1000 hạt là 60g;
Năng suất 14 - 16 tạ/ha.
2

T135

Thuộc loại hình thâm canh cao, sinh

Viện


trƣởng khoẻ, bộ lá phát triển mạnh

KHNNVN

vỏ hạt xanh mốc, ruột vàng khối
lƣợng 1000 hạt là 61,5g; Năng
suất 13-16 tạ/ha.
Giống có vỏ hạt xanh mỡ, thích hợp
vùng ven biển có cơ cấu luân canh
3

KPS1

tăng vụ, giống có khả năng chống đổ
tốt, kháng sâu đục quả và đốm lá

Viện
KHNNVN

khá.
4

Tiêu Xuân
Hoà

Vỏ hạt xanh hơi vàng, ít mốc, ruột
vàng, khối lƣợng 1000 hạt 41,6g;

Vĩnh Phúc

Năng suất 8-10 tạ/ha.

2.1.2. Hoá chất và máy móc
+ Hoá chất: dung dịch axit axetic, dung dịch axit ninhidrin (gồm 30ml
axit axetic và 1,25g ninhidrin), dung dịch axit sulfosalicylic 3%, toluen.
+ Thiết bị máy móc: cân điện Sartorius, cối chày sứ, máy li tâm, tủ lạnh,
máy đo quang phổ UV-visible.
2.2.Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp bố trí thí nghịêm
+ Bố trí thí nghiệm: dựa theo phƣơng pháp nghiên cứu của Shabina

Syeed and Khan N.K [18].
- Chuẩn bị các xô nhựa 12 lit, đổ gần đầy đất đã trộn với lƣợng phân bón
thích hợp, đều nhau giữa các mẫu.


- Chọn hạt giống đều, khoẻ, khả năng nảy mầm trên 90%, gieo hạt vào các xô
đã chuẩn bị (15 hạt/xô, nhắc lại 3 lần).
- Chia các xô nhựa làm 2 lô:
* Lô thí nghiệm: hằng ngày tƣới nƣớc máy với một lƣợng đều nhau.
* Lô đối chứng chia làm 2 lô phụ: lô thí nghiệm 50 (lô TN-50) tƣới dung
dịch NaCl 50mM, lô thí nghiệm 100 (lô TN-100) phun dung dịch NaCl
100mM. Ngày đầu tiên sau khi gieo hạt bắt đầu phun dung dịch NaCl thay
cho nƣớc. Sau đó cứ 1 tuần phun một lần vào một ngày nhất định (ngày này
không tƣới nƣớc, các ngày khác tƣới nƣớc bình thƣờng).
+ Các chỉ tiêu nghiên cứu
Sau khi gieo đƣợc 30 ngày tuổi, xác định các chỉ tiêu:
- Hàm lƣợng axit amin prolin trong lá và rễ của cây.
- Hàm lƣợng diệp lục trong lá của cây.
Làm tƣơng tự khi cây đạt 40 ngày tuổi.
2.2.2. Phương pháp xác định hàm lượng prolin
Theo phƣơng pháp của Bates (1973) và Đinh Thị Phòng [5].
+ Cân 0,5g mẫu nghiền kỹ với 5ml dung dịch axit sulfosalicylic 3%.
+ Thêm 5ml axit sulfoxalicylic, trộn đều, tráng cối chày bằng 5ml dung
dịch axit sulfoxalicylic trộn đều toàn bộ hỗn hợp .
+ Quay li tâm 7000 vòng/phút trong thời gian 20 phút , thu lấy dịch nổi.
+ Lấy 2ml dịch chiết cho vào bình, thêm 2ml axit axetic và 2ml axit
0

ninhydrin, đậy kín ủ trong nƣớc nóng 100 C trong 1 giờ, lấy mẫu ra để nhiệt
độ phòng cho nguội bớt sau đó ủ trong khay đá 5 phút.

+ Bổ sung vào bình phản ứng 4ml toluen, lắc đều mạnh, dùng pipet lấy
phần dịch màu hồng ở trên đem đo mật độ quang học (OD) ở bƣớc sóng 520
nm trên máy quang phổ, dung dịch đối chứng dùng để đo là toluen.


+ Xây dựng đƣờng chuẩn prolin: pha dãy dung dịch prolin chuẩn ở các
nồng độ (mg/ml): 0,01 - 0,03 - 0,07 - 0,1 - 0,2 - 0,3 đo OD (optical density)
tƣơng ứng; lập đƣờng chuẩn bằng phần mềm Exel.
Hàm lƣợng axit amin prolin đƣợc tính theo công thức
sau: Y=1,4083.X + 0,014

2

R =0,9991

Trong đó:
Y: hàm lƣợng proline (mg/l)
X: giá trị OD đo đƣợc ở bƣớc sóng 520nm.
2

R : hệ số tƣơng quan
Sau đó tính ra hàm lƣợng prolin bằng mg/g mẫu.
2

2.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng diệp lục ( mg/cm )
Hàm lƣợng diệp lục tổng số đƣợc xác định nhờ máy CCM-200 của
hãng ADC Anh. Các thao tác tiến hành theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất.
Diệp lục có phổ hấp phụ quang học đặc trƣng. Diệp lục hấp thụ ánh
sáng mạnh nhất ở các dải ánh sáng màu đỏ và xanh tím nhƣng không hấp thụ
ánh sáng ở dải hồng ngoại và xanh lá cây. Đánh giá hàm lƣợng diệp lục thông

qua khả năng hấp thụ năng lƣợng ánh sáng ở vùng đỏ và xanh tím.
2.2.4. Xử lý thống kê các kết quả thực nghiệm
Các kết quả nghiên cứu đƣợc đánh giá theo phƣơng pháp toán thống kê
2

sinh học qua các thông số: giá trị trung bình số học ( X ), phƣơng sai (S ), sai
số trung bình số học (m), tiêu chuẩn độ tin của hiệu (t) so sánh hai trung bình
mẫu. Tiêu chuẩn độ tin của hiệu (t) đƣợc so với bảng phân phối Student với
số bậc tự do: (n1 + n2 - 2), mức ý nghĩa α = 0,05. Các thông số này đƣợc
tính toán bằng phần mềm Excel-WindowsXP.


CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Hàm lƣợng axit amin prolin trong rễ của một số giống đậu xanh
Kết quả xác định hàm lƣợng prolin đƣợc trình bày ở bảng 3.1 và hình
3.1.


Bảng 3.1. Hàm lƣợng axit amin prolin trong rễ đậu xanh (mg/g mẫu)

30 ngày tuổi

40 ngày tuổi

Lô thí nghiệm

Lô thí nghiệm
Lô

Lô đối

Giống

T135

V123

KPS1
Tiêu
Xuân
Hoà

chứng

0847 ±
a

0,07

0,791 ±
0,065

ab

0,689 ±
0,073

b

0,678 ±
0,057

c

Lô
TN-50

0,512 ±
0,023

a

0,419 ±
0,02

b

0,386 ±
0,014

c

0,574 ±
0,014

a

% so

Lô

% so

Lô đối

với

TN-

với

chứng

ĐC

100

ĐC

60,45

53,0

55,2

84,64

0,408 ±
0,014

a

0,411 ±
0,045

b

0,292 ±
c

0,017

0,453 ±
0,048

a

48,15

51,94

41,91

66,79

3,484 ±
0,665

a

4,633 ±

0,065

b

1,746 ±
0,304

c

6,371 ±
0,034

d

Lô
TN-50

8,306 ±
a

1,225

5,123 ±
0,346

b

2,794 ±
0,428

c

7,576 ±
0,501

d

% so

% so

với

với

ĐC

ĐC

238,41

110,58

160,01

118,92

8,272 ±
1,411a
5,622 ±

0,445b
2,999 ±
0,363c
7,824 ±
0,513

d

237,44

121,34

171,79

122,81

Ghi chú: TN (thí nghiệm); ĐC (đối chứng); Trong mỗi cột, số liệu kèm theo các chữ cái giống nhau thể hiện
sự sai khác không có ý nghĩa thống kê, các chữ cái khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê với độ
tin cậy > 95%.


Hình 3.1. Biểu đồ so sánh axit amin prolin trong rễ của một số giống đậu
xanh ở 2 lần đo
* Đo ở thời điểm 30 ngày tuổi
Kết quả cho thấy, ở lô đối chứng hàm lƣợng axit amin prolin trong rễ ở
mỗi giống cũng khác nhau. Trong 4 giống nghiên cứu, T135 có hàm lƣợng
axit amin prolin trong rễ cao nhất (0,847 mg/g). Tiêu Xuân Hoà có hàm lƣợng
prolin trong rễ thấp nhất (0,678 mg/g).
Ở lô TN-50, hàm lƣợng axit amin prolin trong rễ của một số giống đậu
xanh dao động từ 0,386 - 0,574 mg/g và đều giảm so với đối chứng. Trong 4

giống nghiên cứu, V123 có hàm lƣợng axit amin prolin giảm nhiều nhất so
với đối chứng (chiếm 53% so với đối chứng), tiếp đó là KPS1 (chiếm 55,25%
so với đối chứng). Tiêu Xuân Hoà có hàm lƣợng axit amin prolin giảm ít nhất
so với đối chứng (chiếm 84,64% so với đối chứng).
Ở lô TN-100, hàm lƣợng axit amin prolin trong rễ của một số giống đậu
xanh dao động từ 0,292 - 0,453 mg/g và giảm nhiều so với lô đối chứng và lô


TN-50. Trong 4 giống nghiên cứu, KPS1 có hàm lƣợng axit amin prolin giảm
nhiều nhất so với đối chứng (chiếm 41,91% so với đối chứng), tiếp đó là
T135 (chiếm 48,15% so với đối chứng). Giống Tiêu Xuân Hoà có hàm lƣợng
axit amin prolin giảm ít nhất so với đối chứng (chiếm 66,79% so với đối
chứng).
Thời điểm 30 ngày tuổi, hàm lƣợng prolin trong rễ của một số giống đậu
xanh đều giảm ở 2 lô thí nghiệm và mức độ giảm ở lô TN-100 rõ rệt hơn lô
TN-50. Ở lô TN-50, V123 có hàm lƣợng axit amin prolin trong rễ giảm nhiều
nhất so với đối chứng. Lô TN-100, KPS1 có hàm lƣợng axit amin prolin trong
rễ giảm nhiều nhất so với đối chứng. Tiêu Xuân Hoà có hàm lƣợng axit amin
prolin trong rễ cao nhất ở lô đối chứng và trong điều kiện phun muối thì hàm
lƣợng prolin trong rễ có giảm nhƣng giảm ít hơn so với 3 giống còn lại. Có
thể giải thích do Tiêu Xuân Hoà là giống địa phƣơng, có khả năng chịu hạn
khá tốt nên trong điều kiện thiếu nƣớc do muối có thể giống này vẫn có khả
năng tích luỹ axit amin prolin cao trong cây.
Sự giảm hàm lƣợng axit amin prolin trong rễ ở lô thí nghiệm so với đối
chứng có thể đƣợc giải thích do nồng độ cao của các ion trong đất đã tạo nên
một áp suất thẩm thấu cao gây ảnh hƣởng trực tiếp đến sự nảy mầm, sinh
trƣởng của đậu xanh. Áp suất thẩm thấu cao do muối làm cho quá trình hút
nƣớc của rễ bị ảnh hƣởng. Sự hút các chất khoáng của rễ trở nên khó khăn.
Thiếu nƣớc ảnh hƣởng đến sự phân chia và tăng kích thƣớc của tế bào. Biểu
hiện rõ nhất là thời gian nảy mầm ở lô thí nghiệm thƣờng chậm hơn và sự

sinh trƣởng của cây cũng chậm hơn so với đối chứng. Có thể, giai đoạn này
cây còn non nên chƣa phản ứng thích nghi kịp, quá trình tổng hợp các chất có
khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu tích luỹ chƣa nhiều trong đó có prolin.
* Đo ở thời điểm 40 ngày tuổi


Ở lô đối chứng, hàm lƣợng prolin trong rễ của môt số giống đậu xanh đều
tăng so với lần đo ở thời điểm 30 ngày tuổi, dao động từ 1,746 - 6,371 mg/g.
Trong 4 giống nghiên cứu, Tiêu Xuân Hoà có hàm lƣợng prolin trong rễ tăng
mạnh nhất so với lần đo ở thời điểm 30 ngày tuổi (6,371 mg/g), tăng ít nhất là
KPS1 (1,746 mg/g).
Cả 2 lô thí nghiệm (lô TN-50, lô TN-100), hàm lƣợng prolin trong rễ của
môt số giống đậu xanh đều tăng so với đối chứng và so với lần đo ở thời điểm
30 ngày tuổi. Trong đó, giống T135 có hàm lƣợng axit amin prolin trong rễ
tăng nhiều nhất, tiếp đó là KPS1 ở cả 2 lô thí nghiệm. Ở lô TN-50, T135
chiếm 238,41% so với đối chứng, KPS1 chiếm 160,01% so với đối chứng. Ở
lô TN-100, T135 chiếm 237,44% so với đối chứng, KPS1 chiếm 171,79% so
với đối chứng. V123 có hàm lƣợng prolin tăng ít nhất ở cả 2 lô thí nghiệm (lô
TN-50 chiếm 110,5%, lô TN-100 chiếm 121,34% so với đối chứng).
Thời điểm 40 ngày tuổi, ta nhận thấy hàm lƣợng prolin trong rễ của một số
giống đậu xanh đều tăng ở lô đối chứng và lô thí nghiệm so với lần đo ở thời
điểm 30 ngày tuổi và sự chênh lệch hàm lƣợng prolin giữa lô TN-50 và lô
TN-100 là không lớn. T135 có hàm lƣợng prolin tăng mạnh nhất , tiếp đó là
KPS1 ở cả 2 lô thí nghiệm. Nhiều công trình đã thông báo rằng hàm lƣợng
prolin đã tăng lên trong các dòng tế bào chịu NaCl (Pandey và Ganapathy,
1985; Watad và CS, 1983). Theo Pandey và Ganapathy, việc giữ lại NaCl
trong không bào và prolin trong tế bào chất có thể là để tăng khả năng chống
chịu của cây [1].
Một số kết quả nghiên cứu đã tiến hành trên đối tƣợng khác nhƣ lúa,
Arabidopsis thaliana, thuốc lá…cho thấy, có sự tăng mạnh hàm lƣợng prolin

khi sinh trƣởng trong điều kiện cung cấp nƣớc khó khăn. Trong tế bào cây
thuốc lá nuôi cấy đã thích nghi với nồng độ NaCl 428mM, prolin chiếm tới
80% axit amin tự do. Ngƣời ta thừa nhận rằng có sự phân bố đồng đều prolin


trong nƣớc của toàn bộ nội bào, kết quả xác định hàm lƣợng aixt amin này
chỉ ra rằng chúng tồn tại ở mức độ dƣ thừa là 129mM; còn trong tế bào chất
nồng độ prolin có thể đạt tới trên 200mM [9]. Tƣơng tự nhƣ vậy, sự tập
trung prolin nội bào ở tế bào Pistichspicata trong điều kiện stress muối
(xử lí ở nồng độ 200mM NaCl) ƣớc tính tới trên 230mM [15].
Qua 2 lần đo ở thời điểm 30 ngày tuổi và thời điểm 40 ngày tuổi cho thấy
hàm lƣợng prolin có sự khác nhau giữa các giống và giữa hai thời điểm đo.
Lần đo ở thời điểm 30 ngày, hàm lƣợng prolin đều giảm so với đối chứng, lô
TN-100 giảm nhiều hơn so với lô TN-50. Lần đo ở thời điểm 40 ngày, hàm
lƣợng prolin đều tăng ở lô đối chứng và lô thí nghiệm so với thời điểm 30
ngày tuổi. Trong cùng một lô đối chứng hay lô thí nghiệm thì hàm lƣợng
prolin trong rễ ở lần đo thứ hai đều cao hơn so với lần đo thứ nhất. Việc xác
định hàm lƣợng prolin còn đƣợc tiếp tục tiến hành ở lá để một lần nữa khẳng
định vai trò của prolin đối với khả năng chống chịu của thực vật nói chung và
đậu xanh nói riêng.
3.2. Hàm lƣợng axit amin prolin trong lá của một số giống đậu xanh
Kết quả xác định hàm lƣợng prolin đƣợc trình bày ở bảng 3.2 và hình 3.2.
Thao tác tiến hành thí nghiệm cũng tƣơng tự nhƣ ở rễ. Chúng tôi tiến hành thí
nghiệm ở hai thời điểm 30 ngày tuổi và 40 ngày tuổi.


Bảng 3.2. Hàm lƣợng axit amin prolin trong lá đậu xanh (mg/g mẫu)
Sau 30 ngày

Sau 40 ngà y

Lô thí nghiệm
Lô đối
chứng

Giống
T135

0,586 ± 0,056

V123

KPS1
Tiêu Xuân
Hoà

Lô 50

% so
với ĐC

Lô 100

Lô th
% so

Lô đối
Lô 50

với ĐC

% so
với ĐC

0,355
± 0,056a

60,56

0,605 ± 0,025c

103,37

4,917
± 0,343a

5,036
± 0,490a

102,42

0,653
± 0,017b

0,349
± 0,006b

53,43

0,442

± 0,025b

67,66

3,718
± 0,975b

4,205
± 0,572b

113,11

0,493
± 0,087a

0,400
± 0,028b

81,13

0,417
± 0,079a

84,56

1,718 ± 0,293c 3,940
± 0,633c

229,34

0,856
± 0,084c

0,555 ± 0,
c
093

64,79

0,442
± 0,065ab

51,63

2,867
± 0,327d

a

3,275± 0,487d

Ghi chú: TN (thí nghiệm); ĐC (đối chứng); Trong mỗi cột, số liệu kèm theo các chữ cái giống nhau thể hiện
sự sai khác không có ý nghĩa thống kê, các chữ cái khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê với
độ tin cậy > 95%.

114,25


300

282,33

250
229,
34

200

150

135,47

102,
42

103,
37

100
60,5
6

50

53,4
3

81,1
67,6 3
6

84,5
6

64,7
9

109,57
110,68

113,11

L« 50
L« 100

114,25

51,6
3

0
T135

V123

KPS1

Tiªu XH

T135

V123

30 ngày

KPS1

Tiªu XH

40 ngày

Hình 3.2. Biểu đồ so sánh hàm lượng axit amin prolin trong lá của một số
giống đậu xanh ở 2 lần đo
* Đo ở thời điểm 30 ngày tuổi
Lô đối chứng, hàm lƣợng prolin trong lá ở mỗi giống cũng khác nhau.
Giống Tiêu Xuân Hoà có hàm lƣợng prolin trong lá cao hơn hẳn so với 3
giống còn lại đạt 0,856 mg/g, kết quả này lại ngƣợc với kết quả đo hàm lƣợng
prolin trong rễ. Điều đó chứng tỏ dƣờng nhƣ không có sự tƣơng quan cụ thể
nào về hàm lƣợng prolin trong rễ và lá. Giống KPS1 có hàm lƣợng prolin
trong lá thấp nhất đạt 0,493 mg/g.
Lô TN-50, hàm lƣợng prolin của một số giống đậu xanh dao động từ
0,349 - 0,555 mg/g và đều giảm so với đối chứng. Trong 4 giống nghiên cứu,


V123 có hàm lƣợng prolin giảm nhiều nhất so với đối chứng (chiếm 53,43%
so với đối chứng), tiếp đó là T135 (chiếm 60,56% so với đối chứng).
Lô TN-100, hàm lƣợng prolin trong lá của một số giống đậu xanh dao
động từ 0,417-0,605 mg/g và đều giảm so với đối chứng (trừ giống T135).
Hàm lƣợng prolin trong lá giảm nhiều nhất là Tiêu Xuân Hoà (chiếm 51,63%
so với đối chứng). Hai giống V123 và KPS1 có giảm nhƣng không nhiều.

Thời điểm 30 ngày tuổi, kết quả cho thấy hàm lƣợng prolin trong lá của
một số giống đậu xanh đều giảm so với đối chứng và mức giảm của lô TN-50
nhiều hơn lô TN-100 so với đối chứng (trừ Tiêu Xuân Hoà). Sự giảm hàm
lƣợng prolin trong lá của một số giống đậu xanh có thể đƣợc giải thích tƣơng
tự nhƣ sự giảm prolin trong rễ.
* Đo ở thời điểm 40 ngày tuổi
Lô đối chứng, hàm lƣợng prolin trong lá của một số giống đậu xanh đều
tăng hơn nhiều so với đo ở thời điểm 30 ngày tuổi dao động từ 1,718-4,917
mg/g. Trong đó, T135 có hàm lƣợng prolin tăng mạnh nhất, tiếp đó V123.
Hàm lƣợng prolin tăng ít nhất là KPS1.
Lô TN-50 và lô TN-100, hàm lƣợng prolin trong lá của một số giống đậu
xanh đều tăng nhiều so với lô đối chứng và so với lần đo ở thời điểm 30 ngày
tuổi. Trong 4 giống nghiên cứu, KPS1 có hàm lƣợng prolin trong lá tăng
mạnh nhất ở cả 2 lô thí nghiệm, tiếp đó là Tiêu Xuân Hoà. Ở lô TN-50, KPS1
chiếm 229,34%, Tiêu Xuân Hoà chiếm 114,25% so với đối chứng. Ở lô TN100, KPS1 chiếm 282,33%, Tiêu Xuân Hoà chiếm 135,47% so với đối chứng.
Hai giống còn lại có tăng nhƣng không nhiều.
Thời điểm 40 ngày tuổi ta nhận thấy hàm lƣợng prolin trong lá của 4
giống đậu xanh ở lô thí nghiệm đều tăng so với đối chứng và so với đo ở thời
điểm 30 ngày tuổi. Trong cùng một lô đối chứng hay lô thí nghiệm thì hàm
lƣợng prolin trong lá ở lần đo thứ hai cao hơn lần đo thứ nhất. Theo Barret


(1966), Stewart (1974) và Briens (1982) axit amin prolin có khả năng hoà tan
mạnh trong nƣớc đƣợc tích luỹ lá cây của nhiều thực vật bậc cao ƣa mặn.
Prolin đƣợc tích luỹ trong mô lá, mô phân sinh chóp rễ của thực vật đƣợc rèn
luyệ trong stress nƣớc; tích luỹ trong hạt phấn bị khô; tích luỹ ở vùng chóp rễ
đang sinh trƣởng ở nơi thế năng nƣớc thấp và những tế bào thực vật nuôi cấy
trong môi trƣờng huyền phù đã thích nghi với stress nƣớc hay stress muối
NaCl [8], [11].
Qua hai lần đo ở thời điểm 30 ngày tuổi và thời điểm 40 ngày tuổi cho

thấy hàm lƣợng prolin có sự sai khác giữa các giống. Trong cùng một lô đối
chứng hay lô thí nghiệm thì hàm lƣợng prolin trong lá đo ở thời điểm 40 ngày
cao hơn rất nhiều so với đo ở thời điểm 30 ngày tuổi. Lần đo ở thời điểm 30
ngày tuổi, hàm lƣợng prolin ở lô thí nghiệm đều giảm so với lô đối chứng và
lô TN-50 giảm nhiều hơn lô TN-100. Lần đo ở thời điểm 40 ngày tuổi đều
tăng ở lô đối chứng và lô thí nghiệm so với lần đo ở thời điểm 30 ngày tuổi.
Nhƣ vậy, qua kết quả xác định hàm lƣợng prolin trong rễ và lá của 4
giống đậu xanh ta nhận thấy hàm lƣợng prolin giảm so với đối chứng ở thời
điểm đo 30 ngày tuổi và tăng ở thời điểm 40 ngày tuổi. Nhƣng nếu tiếp tục
phun muối thì cây đậu xanh có hiện tƣợng héo và chết. Có thể lí giải rằng ở
giai đoạn từ lúc gieo cho đến 30 ngày tuổi ảnh hƣởng của muối là rõ rệt, cây
đậu xanh đang phải hình thành các phản ứng thích nghi với điều kiện áp suất
thẩm thấu cao trong đất nên quá trình tích luỹ prolin chƣa nhiều. Đến một
ngƣỡng nào đó quá trình tổng hợp prolin lại tăng. Điều đó giải thích tại sao đo
ở thời điểm 40 ngày tuổi hàm lƣợng prolin trong rễ và lá đều tăng. Việc tiếp
tục phun muối làm cho áp suất thẩm thấu tăng liên tục vƣợt quá “ngƣỡng”
chịu đựng của rễ làm cho cây ngừng hút nƣớc dẫn tới héo và chết.
So sánh kết quả về sự tăng cƣờng tổng hợp prolin trong rễ và lá giữa các
giống đậu xanh ở thời điểm 40 ngày tuổi, ta nhận thấy hàm lƣợng prolin trong