ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI

 

 

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
….WUX….

NGUYỄN THANH TÙNG

ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN
ESCHERICHIA COLI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 12/2010

 


 

 

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
….WUX….

NGUYỄN THANH TÙNG

ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN
ESCHERICHIA COLI

Chuyên ngành: Thú Y
Mã số: 60.62.50
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Hướng dẫn khoa học:
TS. VÕ THỊ TRÀ AN
PGS. TS. NGUYỄN NGỌC TUÂN

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 12/2010
 
 

 


 

ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN
ESCHERICHIA COLI

NGUYỄN THANH TÙNG

Hội đồng chấm luận văn:
1. Chủ tịch:

2. Thư ký:

3. Phản biện 1:

4. Phản biện 2:

5. Ủy viên:

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
HIỆU TRƯỞNG

 

i


 

LÝ LỊCH CÁ NHÂN

Tôi tên là Nguyễn Thanh Tùng, sinh ngày 25 tháng 03 năm 1979 tại Tân
Uyên – Bình Dương, con ông Nguyễn Hoàng Xuân và bà Nguyễn Thị Gái.
Tốt nghiệp tú tài tại trường Trung học phổ thông Bình Long – Bình Phước
năm 1997.
Tốt nghiệp Đại học ngành Thú y hệ chính qui tại trường Đại học Nông Lâm,
Thành phố Hồ Chí Minh năm 2003.
Sau đó tôi làm việc tại Bình Dương.
Tháng 09 năm 2006, tôi theo học cao học ngành Thú y tại trường Đại học
Nông Lâm, Thành phố Hồ Chí Minh.
Tình trạng gia đình: vợ Huỳnh Thị Mỹ Diệu.
Địa chỉ liên lạc: tổ 4, khu phố Bình Ninh 2, phường Hưng Chiến, thị xã Bình

Long, Bình Phước.
Điện thoại: 0906 747 719
Email:

 

ii


 

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan những công bố trong luận văn này là trung thực và là một
phần trong đề tài của IFS (International Foundation for Science) mã số B/4464-1
do TS. Võ Thị Trà An làm chủ nhiệm. Những số liệu trong luận văn được phép
công bố với sự đồng ý của chủ nhiệm đề tài.

Nguyễn Thanh Tùng

 

iii


 

LỜI CẢM TẠ
Chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ
Chí Minh, Ban Chủ nhiệm Khoa Chăn nuôi – Thú y và Phòng Đào tạo Sau Đại học

đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.
Kính tri ân Quí Thầy Cô đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt những kiến
thức, kinh nghiệm quí báu cho tôi trong quá trình học tập cũng như trong thời gian
thực hiện đề tài.
Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến Thầy Nguyễn Ngọc Tuân đã tận tình
hướng dẫn, động viên và cung cấp nhiều tài liệu quí báu giúp tôi hoàn thành đề tài này.
Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến Cô Võ Thị Trà An đã cho tôi tham
gia nghiên cứu với IFS (International Foundation for Science), tận tình hướng dẫn,
động viên, cung cấp tài liệu và kinh phí cho tôi hoàn thành đề tài này.
Xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Chi cục Thú y Thành phố Hồ Chí
Minh, trạm Thú y Thủ Đức. Anh Chiếu, anh Long và các anh chị – Bộ Môn Vi sinh,
chú Lợi, chị Thẩm – Trạm Chẩn đoán và Xét nghiệm, Chi cục Thú y Thành phố Hồ
Chí Minh. Cảm ơn bác Bích – trưởng Khoa Nhi, cô Hải trưởng khoa, chị Tuyết và
các anh chị – Khoa Vi sinh, Bệnh viện Nhân dân Gia Định Thành phố Hồ Chí
Minh. Cảm ơn Cô Kim Hoàng – Bộ môn Vi sinh, Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí
Minh. Cảm ơn Thầy Hiền, anh Ngọc, em Trang, Tuyền, Thành, Thức – Phòng Thực
hành Kiểm nghiệm Thú sản – Môi trường và Sức khỏe Vật nuôi, Khoa Chăn nuôi Thú y. Cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ môi trường,
các anh, chị, em Phòng Công nghệ Sinh học Động vật. Cảm ơn em Hưng, Lẫm,
Phương và anh Bá – bộ môn Công nghệ Sinh học, cảm ơn em Bình, Dương, Lê,
Phi, Thơ lớp cao học Công nghệ Sinh học 2006, trường Đại học Nông Lâm Thành
phố Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu.
Xin cảm ơn tất cả mọi người trong gia đình và những người bạn tốt đã hỗ trợ,
giúp đỡ và động viên tôi hoàn thành đề tài này. Xin cảm ơn người vợ Huỳnh Thị
Mỹ Diệu của tôi với tấm lòng chân thành và tình yêu thương tha thiết, em đã luôn ở
bên tôi, giúp tôi có thêm sức mạnh và ý chí để vượt qua những khó khăn trong quá
trình học tập cũng như trong cuộc sống.

 

iv

 

TÓM TẮT
Đề tài “Đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Escherichia coli”được tiến hành
tại trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, trong thời gian từ tháng 9
năm 2008 đến tháng 5 năm 2010. Đề tài được thực hiện nhằm phát hiện kiểu hình
và kiểu gene đề kháng kháng sinh có liên quan đến integron lớp 1 của vi khuẩn
Escherichia coli (E. coli) phân lập được từ các bệnh phẩm phân, máu, đàm và nước
tiểu của bệnh nhân ở Bệnh viện Nhân dân Gia Định và từ thịt heo (ở lò mổ và Chi
cục Thú y) ở Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam. Integron là một hệ thống bẫy bắt
gene, chủ yếu là các gene đề kháng kháng sinh, đóng vai trò quan trọng trong sự lan
tràn của đề kháng kháng sinh hiện nay. Tổng cộng 197 gốc E. coli (81 gốc phân lập
được từ người bệnh và 116 gốc phân lập được từ thịt heo) được thử nghiệm với 12
loại kháng sinh phổ biến trong thú y và nhân y. Mức độ mẫn cảm với kháng sinh
được thực hiện bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch, theo hướng dẫn của
CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute). Kết quả cho thấy có 86,3 %
(n=170) gốc E. coli phân lập được đề kháng với ít nhất 1 loại kháng sinh. Gần 75 %
(n=147) gốc E. coli phân lập được có kiểu hình đa đề kháng (đề kháng từ 2 loại
kháng sinh trở lên). Có 11 (5,6 %) gốc nhạy cảm hoàn toàn với cả 12 loại kháng
sinh thử nghiệm. Các gốc E. coli từ thịt heo có tỉ lệ đề kháng 90,5 %, cao hơn so với
E. coli từ người bệnh (80,2 %). Các gốc E. coli đề kháng với ceftazidime (Cephalosporin thế hệ thứ 3: TGC) được thử nghiệm tìm sự hiện diện ESBL (Extended
spectrum β-lactamase, men beta-lactamase phổ rộng) bằng double disk test và
AmpC disk test. Có 5 (2,5 %) gốc dương tính với double disk test và các gốc này
đều có nguồn gốc từ người bệnh.
Các gốc E. coli đề kháng với ít nhất 1 kháng sinh được kiểm tra sự hiện diện
của integron lớp 1 bằng PCR. Có 136 (80 %) gốc E. coli đề kháng kháng sinh có
integron. Tỉ lệ các gốc E. coli (đề kháng kháng sinh) phân lập được từ người bệnh
có mang integron lớp 1 là 87,7 % (n=57), cao hơn so với các gốc E. coli (đề kháng

kháng sinh) phân lập được từ thịt heo là 75,2 % (n=79). Với 41,9 % gốc E. coli

 

v


 

mang integron lớp 1 có các gene cassette khuếch đại được bằng PCR. Tỉ lệ khuếch
đại được gene cassette trong integron ở các gốc E. coli từ người bệnh cao hơn các
gốc E. coli từ thịt heo (56,1 % so với 31,6 %). Khuếch đại được các gene cassette
với 3 kiểu kích thước. Phân loại các gene cassette này bằng RFLP với 2 loại
enzyme cắt giới hạn (BclI và HpaII) và giải trình tự một số gene đại diện cho thấy
integron có các gene cassette dfrA7, dfrA12, dfrA17, aadA1, aadA2 và aadA5 mã
hóa cho đề kháng trimethoprim, streptomycin và spectinomycin.

 

vi


 

ABSTRACT
The study “Antimicrobial resistance of Escherichia coli” was carried out to
determine the phenotypes and genotypes of antimicrobial resistance of Escherichia
coli (E. coli) isolates from 09/2008 to 05/2010. In this study, E. coli isolates from
patients at Nhan Dan Gia Dinh hospital, and from pork (retail fresh pork and pork at
slaughterhouse) in Ho Chi Minh City, Vietnam to determine the prevalence of

anitimicrobial resistance, class 1 integron, phenotypes and gene patterns of resistance. An integron is a gene capture system that capable capturing mobile gene
cassettes (most commonly antimicrobial-resistance genes). A total of 197 isolates,
included 81 isolates from patients and 116 isolates from pork were tested for
resistance to 12 antimicrobial agents. The antimicrobial susceptibility of the isolates
was determined according to the guidelines of the CLSI (Clinical and Laboratory
Standards Institute), using the disk diffusion method on Mueller-Hinton agar.
Overall, 86.3 % of E. coli isolated were resistance to at least one of 12 antimicrobials tested. Up to 75 % (n=147) of the isolates were multidrug-resistant
(resistant against ≥ 2 antimicrobials). Eleven (5.6 %) E. coli isolates were fully
susceptible to all 12 antimicrobials tested. All 30 ceftazidime resistant E. coli
isolates from patients (n=28) and pork (n=2) were screeened for the presence of
ESBL (Extended spectrum β-lactamase) by double disk test and AmpC disk test. No
ESBL producing isolates was found from AmpC disk test. Five isolates (2.5 %)
were positive tested in the double disk test. They are all human origins.
The presence of class 1 integron was determined by PCR and sequenced for
patterns inserted of gene cassette. Class 1 integrons were detected in 136 (80 %)
E.coli isolates. Integrons were found predominantly in human isolates (n=57;
87.7%) compared to swine isolates (n=79; 75.2 %). Gene cassette amplification was
detected in 57 (41.9 %) class 1-integron-positive-isolates. Three kinds of profiles in
class 1 integron profiles could be defined based on the number and size of the
amplifications obtained. Using BclI and HpaII restriction enzyme, the RFLP

 

vii


 

patterns of these amplicons were found. Sequencing of the representative amplicons
of each pattern, resistance genes were dfrA7, dfrA12, dfrA17, aadA1, aadA2 and

aadA5 which encoding resistance to trimethoprim, spectinomycin and streptomycin.

 

viii


 

MỤC LỤC
Trang
Trang tựa
Trang chuẩn y................................................................................................... i
Lý lịch cá nhân ................................................................................................ii
Lời cam đoan ................................................................................................. iii
Cảm tạ ............................................................................................................ iv
Tóm tắt ............................................................................................................ v
Abstract .........................................................................................................vii
Mục lục ........................................................................................................... ix
Danh sách các chữ viết tắt .............................................................................. xi
Danh sách các bảng và hình ......................................................................... xiii
Danh sách các biểu đồ và sơ đồ ....................................................................xiv
Danh sách các phụ lục .................................................................................... xv
CHƯƠNG
1. MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1
Đặt vấn đề ............................................................................................................. 1
Mục tiêu ................................................................................................................ 2
Yêu cầu ................................................................................................................. 3
2. TỔNG QUAN ................................................................................................ 4
Kháng sinh, đề kháng kháng sinh và integron ...................................................... 4

Kháng sinh ............................................................................................................ 4
Cơ chế tác động của kháng sinh ........................................................................... 5
Đề kháng kháng sinh ............................................................................................. 9
Cơ chế đề kháng kháng sinh ................................................................................. 9
Nguồn gốc gene đề kháng .................................................................................. 16
Integron và đa đề kháng kháng sinh ................................................................... 17
Vi khuẩn Escherichia coli ................................................................................. 18
Kỹ thuật phân tử ................................................................................................ 20
Kỹ thuật PCR ...................................................................................................... 21

 

ix


 

Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) .................................. 22
Kỹ thuật giải trình tự gene (sequencing) ............................................................. 24
Lược duyệt một số công trình nghiên cứu có liên quan .................................... 25
Công trình nghiên cứu trong nước ...................................................................... 25
Công trình nghiên cứu nước ngoài ..................................................................... 26
3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................. 30
Thời gian và địa điểm ......................................................................................... 30
Nội dung ............................................................................................................. 30
Xác định kiểu hình đề kháng của E. coli với các loại kháng sinh phổ
biến ........................................................................................................... 30
Vật liệu và thiết bị thí nghiệm ........................................................................... 30
Phương pháp nghiên cứu ................................................................................... 31
Chỉ tiêu theo dõi ................................................................................................ 35

Xác định kiểu gene đề kháng kháng sinh của E. coli liên quan đến
integron lớp 1 ........................................................................................... 35
Vật liệu và thiết bị thí nghiệm ........................................................................... 36
Phương pháp nghiên cứu ................................................................................... 36
Chỉ tiêu theo dõi ................................................................................................ 39
Xử lý số liệu ....................................................................................................... 39
4. KẾT QUẢ THẢO LUẬN .............................................................................. 40
4.1 Kiểu hình đề kháng của E. coli với một số kháng sinh phổ biến .................. 40
4.2 Kiểu gene đề kháng kháng sinh của E. coli liên quan đến integron lớp 1..... 49
4.2.1 Integron lớp 1 ............................................................................................. 49
4.2.2 Các gene cassette trong integron lớp 1 ....................................................... 53
4.2.2.1 Phát hiện gene cassette trong integron lớp 1 ........................................... 53
4.2.2.2 Phân loại gene cassette ............................................................................ 54
4.2.2.3 Xác định gene cassette............................................................................. 56
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 61
5.1 Kết luận.......................................................................................................... 61

 

x


 

5.2 Đề nghị .......................................................................................................... 61
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 62
PHỤ LỤC ........................................................................................................... 70

 

xi


 

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

 

AFLP

Amplified Fragment-Length Polymorphism

attI

Attachment site for the gene cassette

CLSI

Clinical and Laboratory Standards Institute

dNTP

deoxyribonucleotide triphosphate

ESBL

Extended Spectrum Beta-Lactamase

ERSC

Enterobacteriaceae reduced susceptibility to cephalosporins

ETEC

Enterotoxigenic Escherichia coli

int

integrase

intI1

class 1 integron integrase

IMViC

Indol, Methyl Red, Voges-Proskauer, Simmon Citrat

RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphism

RE

Restriction enzyme

PCR

Polymerase chain reaction

PBP

Penicillin-binding protein

TGC

Third generation cephalosporin

xii


 

DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ HÌNH
Bảng

Trang

Bảng 3.1: Trình tự nucleotide của các primer sử dụng trong PCR ........................ .38
Bảng 3.2: Enzyme giới hạn sử dụng trong RFLP. .. ............................................... .38
Bảng 4.1: Kết quả kháng sinh đồ của các gốc E. coli thu thập được ...................... .40
Bảng 4.2: Kiểu đề kháng phổ biến với kháng sinh của E. coli từ thịt heo .............. .43
Bảng 4.3: Kiểu đề kháng của các gốc E. coli dương tính với double disk test ........ 44
Bảng 4.4: Phân bố kích thước các gene cassette trong integron
của vi khuẩn E. coli ................................................................................. .53
Bảng 4.5: Các kiểu gene cassette trong integron lớp 1 của E. coli ......................... .56
Bảng 4.6: Gene cassette trong integron lớp 1 của E. coli......................................... 57
Bảng 4.7: Phân bố kiểu hình đề kháng kháng sinh của E. coli có integron
mang gene cassette ................................................................................... 59

Hình

Trang

Hình 2.1: Cấu trúc tế bào eukaryote (nhân thực) và prokaryote (nhân sơ) ............... .5
Hình 2.2: Đích tác động của kháng sinh trên tế bào vi khuẩn .................................. .6
Hình 2.3: Cơ chế đề kháng kháng sinh của vi khuẩn ............................................... 10
Hình 2.4: Integron lớp 1 và gene cassette ............................................................... 18
Hình 4.1: Vòng vô khuẩn của vi khuẩn E. coli với kháng sinh thử nghiệm .......... ..42
Hình 4.2: E. coli dương tính với double disk test ................................................... 43
Hình 4.3: Sản phẩm intI - PCR của vi khuẩn E. coli .............................................. .50
Hình 4.4: Gene cassette trong integron lớp 1 của vi khuẩn E. coli .........................54
Hình 4.5: Sản phẩm 700 bp bị cắt và không bị cắt bởi HpaII ...…………………..55
Hình 4.6: Sản phẩm 1.700 bp bị cắt bởi enzyme HpaII ..........................................55
Hình 4.7: Sản phẩm 1.000 bp bị cắt bởi BclI ..........................................................56
Hình 4.8: Sản phẩm 1.000 bp bị cắt bởi HpaII........................................................56

 

xiii


 

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ VÀ BIỂU ĐỒ
Sơ đồ

Trang

Sơ đồ 2.1: Enzyme cắt tạo đầu bằng ...................................................................... 24

Sơ đồ 2.2: Enzyme cắt tạo đầu so le .................................................................... …24
Sơ đồ 3.1: Quy trình kiểm tra mẫu thu thập từ Chi cục Thú y và Bệnh viện... ........ 31
Sơ đồ 3.2: Quy trình phân lập vi khuẩn E. coli mẫu ở lò mổ ................................. .32
Sơ đồ 3.3: Quy trình xác định kiểu gene đề kháng của vi khuẩn E. coli ................. 36
Sơ đồ 3.4: Quy trình nhiệt của phản ứng intI – PCR .............................................. .37
Sơ đồ 3.5: Quy trình nhiệt của phản ứng CS – PCR ............................................... 38
Biểu đồ

Trang

Biểu đồ 4.1: Số gốc E. coli từ người bệnh (N) và từ thịt heo (H) đề kháng
với số kháng sinh................................................................................. .41
Biểu đồ 4.2: Tỉ lệ đề kháng với các kháng sinh của các gốc E. coli
từ người bệnh ...................................................................................... 41
Biểu đồ 4.3: Tỉ lệ đề kháng với các kháng sinh của các gốc E. coli
từ thịt heo ........................................................................................... .42
Biểu đồ 4.4: Tỉ lệ integron của các gốc E. coli đề kháng kháng sinh ...................... 49
Biểu đồ 4.5: Tỉ lệ integron của E. coli (đề kháng kháng sinh) từ người bệnh ......... 49
Biểu đồ 4.6: Tỉ lệ integron của E. coli (đề kháng kháng sinh) từ thịt heo ............... 50

 

xiv


 

DANH SÁCH CÁC PHỤ LỤC
Phụ lục

Trang

Phụ lục 1: Kiểu đề kháng kháng sinh của các gốc E. coli thu thập được ................ 70
Phụ lục 2: Trình tự DNA các mẫu đại diện ............................................................. 73
Phụ lục 3: Mix mẫu PCR ........................................................................................ 80
Phụ lục 4: Quy trình tinh sạch DNA (sản phẩm PCR) ............................................ 81
Phụ lục 5: Quy trình thực hiện enzyme cắt ............................................................. 83
Phụ lục 6: Một số môi trường nuôi cấy vi khuẩn E. coli ........................................ 84
Phụ lục 7: Quy trình phân lập E. coli của Bệnh viện Nhân Dân Gia Định.............. 87
Phụ lục 8: Quy trình phân lập E. coli của Chi cục Thú y Tp HCM ......................... 88

 
 
 
 
 

 

xv


 

Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Việc sử dụng kháng sinh trong phòng ngừa và điều trị nhiễm trùng do vi
khuẩn trong nhân y và thú y đã tạo áp lực chọn lọc trên vi khuẩn gây bệnh và vi
khuẩn sống thường trú. Vi khuẩn thường trú đề kháng với kháng sinh có thể là

nguồn tích trữ tính trạng đề kháng kháng sinh trong hệ thống di truyền và truyền
gene đề kháng của chúng cho vi khuẩn gây bệnh khác. Sự gia tăng đề kháng kháng
sinh ở vi khuẩn gây bệnh là mối lo ngại rất lớn trên thế giới vì làm hạn chế sự thành
công trong điều trị. Hiểu biết đúng đắn về tình hình đề kháng kháng sinh của vi
khuẩn là cần thiết để góp phần xây dựng chương trình kiểm soát và quản lý việc sử
dụng kháng sinh.
Trong các cơ chế đề kháng với nhiều loại kháng sinh của vi khuẩn, các nhà
khoa học đã phát hiện integron. Integron là một hệ thống bẫy bắt gene, chủ yếu là
các gene đề kháng kháng sinh. Integron được tìm thấy trong plasmid và trong nhiễm
sắc thể. Integron đi kèm với yếu tố có khả năng đổi chỗ như transposon hay các
plasmid có khả năng tiếp hợp. Như vậy, integron đóng vai trò quan trọng trong sự
lan tràn của đề kháng kháng sinh hiện nay. Chúng có thể mang các gene cassette và
chèn vào gene của vi khuẩn. Gene cassette là một yếu tố di truyền, có khả năng
chuyển vị. Cấu trúc của gene cassette gồm một gene mã hóa cho một kiểu hình nhất
định, thường là đề kháng kháng sinh. Đã có 4 loại integron được phát hiện. Tuy
nhiên, integron lớp 1 (class 1 integron) được cho là phổ biến nhất và là yếu tố chính
tạo nên đa đề kháng kháng sinh của họ vi khuẩn đường ruột (Hall và cs, 2003).
Escherichia coli (E. coli) là vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae. E. coli
vừa là vi khuẩn thường trú của hệ vi sinh vật đường ruột, vừa là vi khuẩn gây bệnh.

 

1


 

Phần lớn các chủng vi khuẩn E. coli không gây bệnh, nhưng một số chủng có thể
gây bệnh trên nhiều cơ quan của cơ thể như tuyến vú, tử cung, đường ruột... phổ
biến nhất là bệnh tiêu chảy trên thú và người. Hiện nay, kháng sinh đang được sử

dụng một cách tự do trong ngành thú y. Trong chăn nuôi, đặc biệt là chăn nuôi heo
hàng ngày sử dụng một lượng lớn thuốc kháng sinh. Ngay từ khi còn theo mẹ, heo
con đã được tiếp xúc với kháng sinh từ việc điều trị cho heo mẹ, phòng ngừa cho
heo con... cứ theo tiến trình đó thì thời gian tiếp xúc với kháng sinh của E. coli và
sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn cũng tăng theo. Sẽ rất nguy hiểm cho sức khỏe
của cộng đồng khi các chủng vi khuẩn này vấy nhiễm vào quầy thịt, thực phẩm và
nhiễm cho người tiêu dùng.
Ở Việt Nam, hiện nay kháng sinh không chỉ được bán một cách tự do trong
thú y mà còn cả trong nhân y (hầu như không cần có sự kê toa của bác sĩ điều trị).
Vấn đề sử dụng kháng sinh không hợp lý thường xảy ra khi bệnh nhân tự ý ngưng
thuốc khi triệu chứng thuyên giảm, hoặc dùng không đúng liều. Đã có nghiên cứu
về E.coli trên trẻ em tiêu chảy ở Hà Nội, Việt Nam cho thấy E. coli đề kháng đến
88,3 % với sulfamethazole/trimethoprim, 86,4 % với ampicillin, hơn 77 % với chloramphenicol (Nguyen và cs, 2005). Điều này cho thấy khả năng đề kháng kháng
sinh của vi khuẩn ở người cũng rất cao. Các nghiên cứu về đề kháng kháng sinh của
vi khuẩn E. coli ở Việt Nam đa số là xác định kiểu hình, ít đi sâu vào xác định kiểu
gene đề kháng. Với mục tiêu xác định kiểu hình và kiểu gene đề kháng kháng sinh
của vi khuẩn E. coli, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Đề kháng kháng sinh
của vi khuẩn Escherichia coli” dưới sự hướng dẫn của PGS. TS. Nguyễn Ngọc
Tuân và TS. Võ Thị Trà An.
Kết quả nghiên cứu sẽ góp phần làm tăng sự hiểu biết về đề kháng kháng
sinh của vi khuẩn E. coli ở Việt Nam. Dữ liệu sẽ cung cấp thông tin và phương
hướng cho sự lựa chọn trong việc sử dụng kháng sinh.
1.2 Mục tiêu
Xác định kiểu hình đề kháng với các loại kháng sinh phổ biến của vi khuẩn
E. coli phân lập được từ người bệnh và từ thịt heo, xác định kiểu gene đề kháng có
liên quan đến integron lớp 1.

 

2

 

1.3 Yêu cầu
Phân lập các gốc E. coli từ người bệnh và từ thịt heo.
Thử kháng sinh đồ để xác định kiểu hình đề kháng kháng sinh của các gốc
E.coli phân lập được.
Xác định sự hiện diện enzyme β-lactamase bằng double disk test và AmpC
disk test cho các gốc đề kháng với ceftazidime.
Thực hiện PCR xác định sự hiện diện của integron lớp 1 và gene cassette.
Thực hiện RFLP để phân loại các gene cassette trong integron lớp 1.
Giải trình tự đoạn nucleotide của các gene cassette đại diện để xác định kiểu
gene đề kháng kháng sinh.

 

3


 

Chương 2
TỔNG QUAN
2.1 Kháng sinh, đề kháng kháng sinh và integron

2.1.1 Kháng sinh
Kháng sinh là tất cả những chất hóa học, không kể nguồn gốc (chiết xuất từ
môi trường nuôi cấy vi sinh vật, bán tổng hợp hay tổng hợp) có khả năng kìm hãm
sự phát triển của vi khuẩn hoặc tiêu diệt vi khuẩn bằng cách tác động chuyên biệt

trên một giai đoạn chuyển hóa cần thiết của vi sinh vật. Với định nghĩa này, nhiều
chất trước đây xếp vào nhóm chất kháng khuẩn tổng hợp (như sulfonamide, quinolone) bây giờ cũng được xếp loại là kháng sinh (Võ Thị Trà An, 2007).
Kháng sinh là những chất có khả năng tiêu diệt hoặc kìm hãm sự phát triển
của vi sinh vật nhưng không nguy hại hoặc nguy hại rất ít đến cơ thể con người.
Hiện tượng này gọi là sự lựa chọn đặc tính độc dựa trên sự khác nhau về cấu trúc và
biến dưỡng giữa tế bào vật chủ và vi sinh vật. Kháng sinh tác động lên vị trí đích và
vị trí này chỉ có trên vi sinh vật mà không có trên tế bào vật chủ (Yao và Moellering, 2005).
Những kháng sinh đầu tiên được mô tả và giới thiệu vào điều trị lâm sàng là
những hợp chất được chiết xuất từ vi sinh vật như penicillin và aminoglycoside.
Ngày nay, số lượng và chủng loại kháng sinh rất nhiều và đa dạng. Có nhiều cách
phân loại kháng sinh: phân loại theo cấu trúc hóa học, theo cơ chế tác động và theo
tác động kháng khuẩn. Theo cấu trúc hóa học thì kháng sinh được phân loại thành
các nhóm sau: nhóm β-lactam (penicillin, ampicillin, amoxicillin,...), nhóm aminoglycoside (streptomycin, gentamicin, kanamycin, neomycin...), nhóm polypeptide
(colistin, bacitracin, polymycin...), nhóm tetracycline (tetracycline, oxytetracycline,
chlotetracycline, doxycycline...), nhóm phenicol (chloramphenicol, thiamphenicol,

 

4


 

florphenicol...), nhóm macrolide (erythromycin, spiramycin, tulathromycin, josamycin, tylosin…), nhóm sulfonamide (sulfaguanidin, sulfacetamid, sulfamethoxazole...), nhóm diaminopyrimidine (trimethoprim, diaveridin…), nhóm quinolone
(acid nalidixic, flumequin, norfloxacin, ciprofloxacin...), và các nhóm khác
(glycopeptide, nitrofurane, pleuromutilin, polyetherionophore...) (Võ Thị Trà An,
2007).

Hình 2.1: Cấu trúc tế bào eukaryote (nhân thực) và prokaryote (nhân sơ)
(Phạm Thành Hổ, 1996)

2.1.2 Cơ chế tác động của kháng sinh
Để hiểu rõ cơ chế đề kháng kháng sinh thì sự hiểu biết về cơ chế tác động
của kháng sinh là rất quan trọng. Cho đến nay, con người đã tìm ra rất nhiều nhóm
kháng sinh với những cơ chế tác động khác nhau nhưng nhìn chung gồm có các cơ
chế sau: Ức chế tổng hợp thành tế bào; Ức chế chức năng ribosome; Ức chế tổng
hợp acid nucleic; Ức chế biến dưỡng folate; Ức chế chức năng màng tế bào
(Byarugaba, 2010).
Ức chế tổng hợp thành tế bào: khác với tế bào động vật hữu nhũ, tế bào vi
khuẩn có áp suất thẩm thấu bên trong tế bào cao hơn nên chúng có thành (vách) bên
ngoài màng tế bào (Hình 2.1). Thành tế bào có cấu tạo từ peptidogycan (mucopeptid; murein) gồm nhiều dây polysaccharide thẳng dọc và những đoạn ngang

 

5


 

penta-peptide. Polysaccharide gồm nhiều phân tử đường chứa gốc amin: N-acetylgluco-samine và N-acetyl-muramic (chỉ có ở tế bào vi khuẩn).
Tiến trình hình thành thành tế bào bắt đầu bằng sự chuyển đổi L-alanin thành
D-alanin. Sau đó 2 D-alanin kết hợp với nhau. Cyscloserin ức chế giai đoạn này nên
nó tác động trên cả vi khuẩn G+ và G-.

Hình 2.2: Đích tác động của kháng sinh trên tế bào vi khuẩn (Andersson, 2004)
Tiếp đến D-alanin dipeptide nối với 3 acid amine khác và N-acetyl muramic
acid để tạo thành đường pentapeptide. Sau đó, pentapeptide lại cặp đôi với một
đường mang amine khác là N-etylglucosamine. Toàn bộ cấu trúc này lại kết hợp với
một phân tử isoprenyl phosphate rồi di chuyển từ tế bào chất ra ngoài màng tế bào.
Tại đây chúng kết hợp với nhau để kéo dài thành chuỗi peptidoglycan. Bacitracin
ngăn cản tiến trình này bằng cách gắn với isoprenyl phosphate tạo phức hợp vô

dụng. Vancomycin ngăn cản sự di chuyển đường pentapeptide thành chuỗi đa phân
tử bên ngoài màng tế bào.
Giai đoạn cuối là hình thành chuỗi ngang giữa các chuỗi peptidoglycan bằng
cách nối D-alanin của một chuỗi với diaminopimelic acid của chuỗi kế cận nhờ

 

6


 

enzyme transpeptidase. Penicillin ức chế giai đoạn này do cấu trúc của nó giống Dalanyalanin (1 vị trí trên peptidoglycan mà enzyme gắn vào) (Võ Thị Trà An, 2007).
Ức chế chức năng màng tế bào: màng tế bào có nhiệm vụ bao bọc và ngăn
cách dịch tương bào với vỏ tế bào. Nó có tính thấm chọn lọc, điều hòa sự trao đổi
với môi trường bên ngoài. Cả tế bào động vật và tế bào vi khuẩn đều có các yếu tố
như protein, lipid nhưng lipid của vi khuẩn là phospholipid còn nấm mốc là sterol.
Kháng sinh thuộc nhóm polypeptide (colistin, polymycin) và polyen (chất
kháng nấm) gắn kết trên các chất hóa học riêng biệt làm xáo trộn chức năng thẩm
thấu làm cho các chất trong bào tương như Mg2+, K+, Ca2+ thoát ra ngoài (Võ Thị
Trà An, 2007).
Ức chế tổng hợp acid nucleic: sự nhân đôi DNA bắt đầu bằng phản ứng tách
chuỗi DNA ra làm hai, mỗi bên là một khuôn để gắn nucleotid thích hợp theo
nguyên tắt bổ sung. DNA polymerase xúc tác sự tổng hợp các liên kết giữa các
nucleotid; DNA gyrase nối các DNA trong quá trình tổng hợp và tạo thành các vòng
xoắn.
Sự sao mã là quá trình tổng hợp RNA do DNA làm khuôn theo nguyên tắc
bổ sung nhờ enzyme RNA polymerase và ion Mg2+. Quinolone (acid nalidixic và
các fluoroquinolone) ức chế mạnh sự tổng hợp DNA trong giai đoạn nhân đôi do ức
chế DNA gyrase. Trong khi đó rifampin ức chế tổng hợp RNA do ức chế RNA

polymerase.
Quá trình tổng hợp acid nucleic bắt đầu từ việc tổng hợp acid folic rồi thành
purin nhờ vào một số enzyme như dihydropteroat synthetase, dihydrofolat reductase...Cho nên ức chế biến dưỡng folate cũng là ức chế tổng hợp acid nucleic (Võ
Thị Trà An, 2007).
Ức chế biến dưỡng acid folic: vi khuẩn sử dụng acid folic để tổng hợp DNA
và amino acid. Khác với động vật hữu nhũ, vi khuẩn không có hệ thống thu nhận
acid folic từ môi trường do đó chúng phải tự tổng hợp. Sulfonamide đối kháng cạnh
tranh với PABA (p-aminobenzoic acid) một tiền chất để tổng hợp acid folic. PABA
kết hợp với pteroic acid hoặc glutamic acid để tạo pteroylglutamic acid (PGA), là

 

7


 

một phần của phân tử B12 có liên quan đến sự biến dưỡng của acid amin và purin.
Do đó khi thiếu PABA sẽ gây thiếu purin, acid amin và vi khuẩn không phát triển
được. Trimethoprim ức chế dihydrofolat reductase ngăn quá trình chuyển hóa
dihydro-folate thành tetrahydrofolate (dạng hoạt động của acid folic) (Võ Thị Trà
An, 2007; Huovinen, 2001).
Ức chế chức năng ribosome: khác với tế bào động vật (ribosome 80S), tế
bào vi khuẩn có ribosome 70S, gồm 2 tiểu đơn vị là 30S và 50S. Quá trình tổng hợp
protein của tế bào vi khuẩn xảy ra thông qua việc chuyển giao thông tin di truyền đã
được mã hóa trên mRNA. Đơn vị chức năng của quá trình này là ribsome. Quá trình
này có 3 giai đoạn là khởi đầu, kéo dài và kết thúc. Ở giai đoạn khởi đầu, nhờ nhiều
yếu tố khởi đầu khác nhau mà tiểu đơn vị 30S sẽ gắn với mRNA (RNA thông tin)
và tRNA (RNA vận chuyển) mang acid amin (amino acyl-tRNA). Sau đó gắn với
tiểu đơn vị 50S hình thành ribosome 70S. tRNA từ vị trí A (amino acyl) dịch

chuyển sang vị trí P (peptidyl) giải phóng vị trí A cho tRNA kế tiếp. Tiến trình trên
được lặp lại cho đến khi đọc hết đoạn di truyền và protein được hình thành (giai
đoạn kéo dài). Ở giai đoạn kết thúc, các yếu tố kết thúc khác nhau liên quan đến sự
phóng thích chuỗi protein. Các tiểu đơn vị là 30S và 50S tách rời nhau ra, tham gia
vào tập hợp những tiểu đơn vị tự do trước khi tái kết hợp với một đoạn gene mới.
Kháng sinh nhóm aminoglycoside (streptomycin, gentamicin, kanamycin)
gắn chặt với tiểu đơn vị 30S, phong bế hoạt động bình thường của phức hợp khởi
đầu làm cho tiến trình giải mã không thực hiện được. Các kháng sinh này cũng tiếp
cận tRNA của ribosome 30S, ngăn cản tiến trình giải mã, tạo ra các protein không
hoàn chỉnh. Chúng cũng can thiệp bằng cách chèn các acid amin sai vào chuỗi polypeptide, từ đó hình thành các protein không có chức năng.
Kháng sinh nhóm tetracycline cũng gắn vào tiểu đơn vị 30S và phong bế sự
kết hợp của tRNA với mRNA. Kháng sinh nhóm phenicol gắn với tiểu đơn vị 50S,
ức chế enzyme peptidyl transferase không cho acid amin gắn vào chuỗi polypeptide. Chloramphenicol có ái lực với cả ribosome của động vật hữu nhũ. Kháng sinh
nhóm macrolide (erythromycin, tylosin...) tranh giành vị trí gắn ở ribosome và ngăn

 

8