XÂY DỰNG QUI TRÌNH KIỂM TRA KHÁNG SINH ĐỒ CỦA VI KHUẨN GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA (PANGASIANODON HYPOPHTHALMUS) TRONG ĐIỀU KIỆN THỰC ĐỊA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
*****K*J*****

NGUYỄN THỊ BẠCH MAI

XÂY DỰNG QUI TRÌNH KIỂM TRA KHÁNG SINH ĐỒ CỦA
VI KHUẨN GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ
TRÊN CÁ TRA (PANGASIANODON HYPOPHTHALMUS)
TRONG ĐIỀU KIỆN THỰC ĐỊA

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 11/2010


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
*****K*J*****

NGUYỄN THỊ BẠCH MAI

XÂY DỰNG QUI TRÌNH KIỂM TRA KHÁNG SINH ĐỒ
CỦA VI KHUẨN GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ
TRÊN CÁ TRA (PANGASIANODON HYPOPHTHALMUS)
TRONG ĐIỀU KIỆN THỰC ĐỊA
Chuyên ngành: Nuôi trồng thuỷ sản
Mã số: 60.62.70

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Hướng dẫn khoa học:
TS. NGUYỄN HỮU THỊNH

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 11/2010


XÂY DỰNG QUI TRÌNH KIỂM TRA KHÁNG SINH ĐỒ CỦA VI KHUẨN
GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA (PANGASIANODON
HYPOPHTHALMUS) TRONG ĐIỀU KIỆN THỰC ĐỊA

NGUYỄN THỊ BẠCH MAI

Hội đồng chấm luận văn:
1. Chủ tịch:

PGS. TS. LÊ THANH HÙNG
Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM

2. Thư ký:

TS. NGUYỄN TẤT TOÀN
Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM

3. Phản biện 1:

TS. LÊ HỒNG PHƯỚC
Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy Sản II

4. Phản biện 2:

PGS. TS NGUYỄN NGỌC TUÂN
Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM

5. Ủy viên:

TS. NGUYỄN HỮU THỊNH
Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
HIỆU TRƯỞNG


LÝ LỊCH CÁ NHÂN
Tôi tên là Nguyễn Thị Bạch Mai sinh ngày 27 tháng 12 năm 1977 tại huyện
Bình Đại, tỉnh Bến Tre. Con ông Nguyễn Kim Chi và bà Trương Bạch Liên.
Tốt nghiệp tú tài tại trường trung học phổ thông Nguyễn Thị Minh Khai,
Thành phố Hồ Chí Minh năm 1994.
Tốt nghiệp Đại học ngành Nuôi trồng Thủy Sản hệ chính quy năm 2000 tại
trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
Sau đó làm việc tại Khoa Thủy Sản - trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí
Minh.
Tháng 9 năm 2007 theo học Cao học ngành Nuôi trồng Thủy Sản tại trường
Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
Tình trạng gia đình: kết hôn với Phan Thương Huy năm 2004; con gái Phan
Nguyễn Mai Hân sinh năm 2005.
Địa chỉ liên lạc: 44/3 Đường 79 phường Tân Quy, Quận 7, TP.HCM.
Điện thoại: 0913673349
Email:

ii


LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công
bố trong bất cứ công trình nào khác
Ký tên

Nguyễn Thị Bạch Mai.

iii


LỜI CẢM ƠN
Con xin chân thành cảm ơn ba mẹ và gia đình đã luôn ở bên cạnh, động viên,
hỗ trợ về mặt tinh thần và vật chất để con hoàn tất quá trình học tập và thực hiện đề
tài.
Xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm
thành phố Hồ Chí Minh.
Tôi cũng gởi lời cám ơn đến Ban chủ nhiệm Khoa Thủy Sản cùng tất cả quý
thầy cô đã tận tình giúp đỡ, truyền đạt kiến thức, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi
trong suốt quá trình học hập, làm đề tài.
Đặc biệt, xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Tiến sĩ Nguyễn Hữu Thịnh đã tận
tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Chân thành cảm ơn các bạn đồng nghiệp Khoa Thủy Sản đã tận tình hỗ trợ
tôi trong suốt thời gian học tập và hoàn tất luận văn; cảm ơn bạn Nguyễn Thị Ri,
nhân viên Phòng Xét nghiệm Thủy Sản của công ty Vĩnh Thịnh và các bạn sinh
viên khoa Thủy Sản đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Xin chân thành cảm ơn!

Tp.Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2010
Nguyễn Thị Bạch Mai

iv


TÓM TẮT
Đề tài được thực hiện với ba mục tiêu là xác định mật độ vi khuẩn E. ictaluri
trong huyền phù có OD550 0,125 và Mc-Farland 0,5; xác định mật độ vi khuẩn trong
gan, thận, lách và trong dịch mẫu thu từ gan, thận, lách cá tra gây bệnh thực nghiệm
bởi E. ictaluri và xây dựng qui trình làm kháng sinh đồ cho bệnh gan thận mủ trên
cá tra tại thực địa.
Kết quả đề tài cho thấy:
- Mật độ vi khuẩn trong huyền phù (X ± SE) có OD550 0,125 và Mc-Farland
0,5 tương đương nhau (lần lượt là 1,4 × 108 ± 0,3 × 108 và 1,3 × 108 ± 0,3 × 108
cfu/mL).
- Mật độ vi khuẩn ở gan, thận, lách cá tra nhiễm bệnh thực nghiệm tăng dần
theo thời gian, cao nhất vào ngày thứ 7 đối với cá 2 – 5 g, > 50 g và ngày thứ 8 đối
với cá 10 – 20g. Mật độ vi khuẩn trong gan, thận, lách ở cỡ cá 2 – 5 g và > 50 g đạt
trên 108 cfu/g từ ngày thứ 6 đến ngày thứ 8 sau khi gây bệnh và ở cỡ cá 10 – 20 g là
từ ngày thứ 6 đến ngày thứ 9 sau khi gây bệnh.
- Dịch mẫu thu từ thận cá tra 2 – 5 g nhiễm bệnh thực nghiệm bởi E. ictaluri
vào ngày thứ 7 đạt được mật độ vi khuẩn trên 108 cfu/mL.
- Trong cùng phương pháp thực hiện, cùng cơ quan kiểm tra: không có sự
khác biệt có ý nghĩa (P >0,05) về đường kính vòng kháng khuẩn của doxycyclin ở
24 và 48 giờ; có sự khác biệt có ý nghĩa (P < 0,05) về đường kính vòng kháng
khuẩn của amoxicillin và tetracyclin giữa 24 giờ và 48 giờ. Tuy nhiên, kết quả phân
tích thống kê cho thấy không có sự sai khác có ý nghĩa (P > 0,05) về kết quả nhận

v

định tính nhạy cảm của E. ictaluri ở 24 và 48 giờ đối với 4 kháng sinh thử nghiệm ở
tất cả các cơ quan kiểm tra và các phương pháp thực hiện.
- Kết quả đánh giá tính nhạy cảm với kháng sinh ở 24 giờ của E. ictaluri giữa
phương pháp Bauer Kirby với các phương pháp thực địa trong cùng cơ quan kiểm
tra, cùng loại kháng sinh không có sự khác biệt có ý nghĩa.
- Cả 3 phương pháp thực địa có thể dùng làm kháng sinh đồ trong việc xác
định sự nhạy cảm của vi khuẩn E. ictaluri đối với kháng sinh tại thực địa

vi


ABSTRACT
Study was conducted with three objectives: to determine a concentration of
Edwardsiella ictaluri in bacterial suspension with OD550 of 0.125 and 0.5 Mc
Farland standard turbidity; to determine a concentration of Edwardsiella ictaluri in
liver, kidney and spleen and in liver, kidney and spleen suspension of fish which
were artificially infected with Edwardsiella ictaluri; to develop a field antibiogram
test in comparison with the standard antibiogram test for Edwardsiella ictaluri on
catfish.
The results of the present study indicated that:
- Bacteria concentration in suspension with OD550 of 0,125 (1,4 x 108 ± 0,03
x 108 cfu/mL) was similar to that in 0.5 Mc-Farland standard suspension (1,3 x 108
± 0,06 x 108 cfu/mL).
- Bacteria concentration in liver, kidney and spleen of experimental fish
increased by experimental time and reached the highest values on the 7th and 8th
experimental days for fish with 2-5g and >50g and for 10-20g fish respectively. The
bacteria concentration of above 108 cfu/g was observed on fish with 2-5g and >50g
from the 6th – 8th days, and on fish with 10-20g from the 6th – 9th days.

- Bacteria concentration of above 108 cfu/mL was also observed in kidney
suspension of 2-5g fish on the 7th experimental day.
- There was no significant difference (P>0.05) in diameter of zone of
inhibition between 24 and 48 hours for doxycyclin when testing on the same organ
with the same method whereas there were significant differences (P<0.05) in that
for amoxicillin and tetracyclin. However, there was no statistical difference in
antibiotic sensitivity of E. ictaluri between 24 and 48 hours to the four antibiotics
tested on all of the organs with the applied methods.

vii


- There were no significant differences in antibiotic sensitivity at 24 hours of
E. ictaluri between Bauer Kirby method and the field methods when testing the
same antibiotic on the same organ.
- All of three field method could be applied as antibiogram test in identifying
sensitivity of E. ictaluri to antibiotic in the field.

viii


MỤC LỤC
CHƯƠNG

TRANG

Trang tựa
Trang Chuẩn Y

i

Lý lịch cá nhân

ii

Lời cam đoan

iii

Lời cảm ơn

iv

Tóm tắt

v

Abstract

vii

Mục lục

ix

Danh sách các chữ viết tắt

xiii

Danh sách các hình

xiv

Danh sách các bảng

xv

1. GIỚI THIỆU

1

1.1 Đặt vấn đề

1

1.2 Mục tiêu đề tài

3

1.3 Mục đích đề tài

3

2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

4

2.1 Sơ lược về bệnh gan, thận mủ

4

2.1.1 Tác nhân gây bệnh

4

2.1.2 Đường truyền lây

6

2.1.3 Triệu chứng, bệnh tích

6

2.1.3.1 Triệu chứng

7

2.1.3.2 Bệnh tích

7

2.2 Các phương pháp gây nhiễm nhân tạo cho cá

9

ix


2.2.1 Gây cảm nhiễm nhân tạo bằng phương pháp tiêm

9

2.2.2 Gây cảm nhiễm nhân tạo bằng phương pháp ngâm

9

2.3 Nghiên cứu về sự nhạy cảm và tính kháng kháng sinh của E. ictaluri

10

2.3.1 Trong nước

10

2.3.2 Nước ngoài

12

2.4 Phương pháp thu mẫu và thực hiện kháng sinh đồ trong thủy sản

13

2.4.1 Thu mẫu cá

13

2.4.2 Thu mẫu bệnh

13

2.4.3 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn

14

2.4.4 Kháng sinh đồ trong phòng thí nghiệm

16

2.4.5 Kháng sinh đồ tại thực địa

17

3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

19

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

19

3.2 Nội dung nghiên cứu

19

3.3 Dụng cụ và thiết bị

19

3.4 Vật liệu dùng trong nghiên cứu

20

3.4.1 Cá

20

3.4.2 Vi khuẩn

20

3.4.3 Môi trường

21

3.4.4 Đĩa giấy tẩm kháng sinh

21

3.4.5 Bộ test sinh hóa định danh vi khuẩn

22

3.5 Phương pháp nghiên cứu

22

3.5.1 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn

22

3.5.1.1 Mật độ vi khuẩn trong huyền phù

22

3.5.1.2 Mật độ vi khuẩn trong dịch nghiền và dịch mẫu thu bằng tăm bông 24
3.5.2 Phương pháp định danh vi khuẩn

25

3.5.2.1 Định danh vi khuẩn bằng bộ test IDS-14GNR

25

3.5.2.2 Định danh vi khuẩn bằng bộ test API-20E

26

3.5.3 Phương pháp kháng sinh đồ

27

x


3.5.3.1 Phương pháp kháng sinh đồ trong phòng thí nghiệm

27

3.5.3.2 Phương pháp kháng sinh đồ tại thực địa

28

3.6 Phương pháp bố trí thí nghiệm

30

3.6.1 Thí nghiệm 1: Xác định mật độ vi khuẩn E. ictaluri trong huyền phù
có OD550 = 0,125 và Mc-Farland 0,5

30

3.6.2 Thí nghiệm 2: Xác định mật độ vi khuẩn trong gan, thận, lách và
dịch mẫu thu từ gan, thận, lách cá tra nhiễm bệnh thực nghiệm

30

3.6.2.1 Mật độ vi khuẩn trong gan, thận, lách cá tra

30

3.6.2.2 Mật độ vi khuẩn trong dịch mẫu ở gan, thận, lách cá tra thu bằng
tăm bông

32

3.6.3 Thí nghiệm 3: Xây dựng qui trình làm kháng sinh đồ cho cá tra bệnh
gan thận mủ tại thực địa và so sánh với qui trình trong phòng thí nghiệm

33

3.7 Xử lý số liệu

34

4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

35

4.1 Thí nghiệm 1: Xác định mật độ vi khuẩn E. ictaluri trong huyền phù có
OD550 0,125 và Mc-Farland 0,5

35

4.2 Thí nghiệm 2: Xác định mật độ vi khuẩn trong gan, thận, lách và
dịch mẫu thu từ gan, thận, lách cá tra nhiễm bệnh thực nghiệm

36

4.2.1 Xác định mật độ vi khuẩn trong gan, thận, lách cá tra

36

4.2.2 Xác định mật độ vi khuẩn trong dịch mẫu thu từ gan, thận, lách cá tra 43
4.3 Thí nghiệm 3: Xây dựng qui trình làm kháng sinh đồ cho cá tra bệnh
gan, thận mủ tại thực địa và so sánh với qui trình trong phòng thí nghiệm

47

4.3.1 Kết quả kháng sinh đồ ở 24 và 48 giờ

47

4.3.1.1 Kết quả kháng sinh đồ (ĐKVKK) ở 24 và 48 giờ

47

4.3.1.2 Kết quả đánh giá tính nhạy cảm với kháng sinh của E. ictaluri

51

4.3.2 So sánh kết quả kháng sinh đồ ở 24 giờ của các phương pháp

53

4.3.2.1 Kết quả kháng sinh đồ (ĐKVKK)

53

4.3.2.2 Kết quả đánh giá tính nhạy cảm với kháng sinh của E. ictaluri

55

4.3.3 Các trường hợp đặc biệt

57

xi


4.3.4 Thao tác thực hiện – Ưu, nhược điểm của các qui trình thực hiện

kháng sinh đồ tại thực địa

61

4.3.4.1 Qui trình nghiền

61

4.3.4.2 Qui trình tăm bông

62

4.3.4.3 Qui trình phết

63

5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

65

5.1 Kết luận

65

5.2 Đề nghị

66

xii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
A. hydrophila

Aeromonas hydrophila

API-20E

Identification system for Enterobacteriaceae and other nonfastidious Gram-negative Rods

AX

Amoxicillin

BHIA

Brain Heart Infusion Agar

BHIB

Brain Heart Infusion Broth

CFU

Colony forming Units

CLSI

Clinical and Laboratory Standards Institute

DXC

Doxycycline

ĐKVKK

Đường kính vòng kháng khuẩn

IDS14GNR

Identification system with 14 biochemical reaction for
identification of non-fastidious Gram-negative Rods

NMSL

Nước muối sinh lý

E. ictaluri

Edwardsiella ictaluri

ESC

Enteric Septicemia Catfish

FFC

Florfenicol

MHA

Muller-Hinton Agar

NCCLS

National Committee for Clinical Laboratory Standards

OD

Optical Density

OIE

Office International des Epizooties

SE

Standard error

TB

Tăm bông

TC

Tetracycline

TSA

Tryptone Soya Agar

xiii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
HÌNH

TRANG

Hình 3.1 Khuẩn lạc của vi khuẩn E. ictaluri được phân lập từ cá bệnh ở
Vĩnh Long

20

Hình 3.2 Các loại kháng sinh dùng trong thí nghiệm

21

Hình 3.3 Phương pháp pha loãng mẫu theo dãy thập phân

23

Hình 3.4 Qui trình định lượng vi khuẩn E. ictaluri

25

Hình 3.5 Bộ định danh IDS 14 GNR

26

Hình 3.6 Kết quả test API-20E

27

Hình 3.7 Cá bệnh gan thận mủ trong ao nuôi ở Vĩnh Long

28

Hình 3.8 Bố trí thí nghiệm đối với cá 10 – 20 g

31

Hình 3.9 Nghiền mẫu bệnh phẩm trong eppendorf bằng chày nhựa

32

Hình 3.10 Thu mẫu bệnh bằng tăm bông vô trùng

33

Hình 4.1 Cá tra 10 – 20 g bị xuất huyết sau khi gây nhiễm thực nghiệm

37

Hình 4.2 Cá tra > 50 g bị gan thận mủ và xuất huyết sau khi gây nhiễm
thực nghiệm

41

Hình 4.3 Cá tra có gan, thận, lách bị mủ

42

Hình 4.4 Kết quả kháng sinh đồ của E. ictaluri ở lách cá bệnh theo 3 phương
pháp thực địa

53

Hình 4.5 Kết quả kháng sinh đồ có sự hiện diện của khuẩn lạc A. hydrophila

58

Hình 4.6 Kết quả kháng sinh đồ chỉ thấy vòng vô khuẩn của A. hydrophila

58

Hình 4.7 Kết quả kháng sinh đồ của phương pháp phết có vòng kháng khuẩn
bị méo

59

Hình 4.8 Khuẩn lạc E. ictaluri phát triển vào trong vòng kháng khuẩn

60

Hình 4.9 Khuẩn lạc mọc quá ít khó xác định vòng vô khuẩn

60

xiv

DANH SÁCH CÁC BẢNG
BẢNG

TRANG

Bảng 3.1 Tiêu chuẩn đường kính vòng vô khuẩn

22

Bảng 4.1 Chất lượng nước của bể thí nghiệm xác định mật độ vi khuẩn
trong gan, thận, lách cá tra

36

Bảng 4.2 Mật độ vi khuẩn trong gan, thận và lách cá cỡ 2 – 5 g

38

Bảng 4.3 Mật độ vi khuẩn trong gan, thận và lách cá tra cỡ 10 – 20 g

39

Bảng 4.4 Mật độ vi khuẩn trong gan, thận và lách cá tra cỡ > 50 g

40

Bảng 4.5 Trọng lượng của gan, thận và lách cá (g/cá hoặc g/5 cá)

43

Bảng 4.6 Chất lượng nước của bể thí nghiệm xác định mật độ vi khuẩn trong
dịch mẫu thu từ gan, thận, lách cá tra

43

Bảng 4.7 Mật độ vi khuẩn trong dịch mẫu thu từ gan, thận, lách cá tra cỡ 2 – 5 g 44
Bảng 4.8 Mật độ vi khuẩn trong dịch mẫu thu từ gan, thận, lách cá tra cỡ
10 – 20 g

45

Bảng 4.9 Mật độ vi khuẩn trong dịch mẫu thu từ gan, thận, lách cá tra trên 50 g 46
Bảng 4.10 Kết quả kháng sinh đồ trên gan cá sau 24 và 48 giờ ủ ở 30oC

48

Bảng 4.11 Kết quả kháng sinh đồ trên thận cá sau 24 và 48 giờ ủ ở 30oC

49

Bảng 4.12 Kết quả kháng sinh đồ trên lách cá sau 24 và 48 giờ ủ ở 30oC

50

Bảng 4.13 Kết quả đánh giá sự nhạy cảm với kháng sinh của E. ictaluri trên
gan, thận, lách cá tra sau khi ủ ở 30oC

51

Bảng 4.14 Kết quả kháng sinh đồ (ĐKVKK) của E. ictaluri ở các phương pháp
sau khi ủ ở 30oC, 24 giờ

54

Bảng 4.15 Kết quả đánh giá sự nhạy cảm với kháng sinh của E. ictaluri trên gan,
thận, lách cá tra sau khi ủ ở 30oC, 24 giờ

xv

56


Chương 1
GIỚI THIỆU
1.1 Đặt Vấn Đề
Trong những năm gần đây nghề nuôi cá tra ở nước ta phát triển rất nhanh đã
góp phần tích cực vào việc nâng cao nguồn thu nhập của cộng đồng và tăng kim
ngạch xuất khẩu. Tuy nhiên, khi nghề nuôi được thâm canh hóa nhất là nuôi với mật
độ cao thì vấn đề dịch bệnh xảy ra thường xuyên hơn và thiệt hại cũng nhiều hơn.
Cá tra nuôi thường gặp phải bệnh nghiêm trọng là gan thận mủ, bệnh này gây thiệt
hại rất lớn cho nghề nuôi. Đây là bệnh do vi khuẩn nên hướng điều trị chủ yếu là sử
dụng kháng sinh. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh không đúng đã gây nên hiện
tượng kháng thuốc. Kháng sinh đồ thực hiện trên vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ và
xuất huyết trên cá tra nuôi tại các trang trại thuộc các tỉnh Cần Thơ, An Giang, Vĩnh
Long, Trà Vinh, Hậu Giang và Bến Tre cho thấy mức độ nhạy của thuốc trên vi
khuẩn gây bệnh ngày càng giảm dần. Kết quả nghiên cứu kháng sinh đồ từ 1/2006–
3/2008 cho thấy sự nhạy cảm với kháng sinh của đa số vi khuẩn được khảo sát ngày
càng giảm dần chứng tỏ vi khuẩn gây bệnh ngày càng kháng thuốc nên dẫn đến tỷ lệ

thành công thấp trong điều trị (Nguyễn Đức Hiền, 2008).
Xác định chính xác nguyên nhân gây bệnh, đưa ra phác đồ điều trị chính xác
là một yếu tố rất quan trọng trong quá trình trị bệnh cho cá. Xác định đúng nguyên
nhân gây bệnh thì hiệu quả điều trị bệnh sẽ được tăng cao. Phác đồ điều trị bệnh
chính xác giúp khống chế bệnh một cách nhanh chóng và tiết kiệm chi phí cho
người nuôi; tránh được trường hợp dùng thuốc, hóa chất bừa bãi, sử dụng không
đúng cách, quá liều dẫn đến tình trạng vi khuẩn kháng thuốc, cá tích lũy thuốc, hóa
chất trong cơ thể. Để xác định tính kháng kháng sinh của vi khuẩn cần thực hiện thử

1


nghiệm kiểm tra kháng sinh đồ. Phương pháp kháng sinh đồ được sử dụng hiện nay
là phương pháp Bauer Kirby. Đây là phương pháp đòi hỏi người thực hiện phải có
kỹ thuật tốt và mẫu bệnh phải được chuyển tới các phòng thí nghiệm được trang bị
đầy đủ máy móc và trang thiết bị. Bên cạnh đó, ngoài thời gian chuyển mẫu bệnh từ
ao nuôi về phòng thí nghiệm còn phải tốn thêm 6 – 7 ngày để xác định được tính
kháng của vi khuẩn. Như vậy, để biết được chính xác nguyên nhân gây bệnh phải
mất hơn 7 ngày. Thời gian chờ đợi trước khi điều trị này là quá lâu đối với người
nuôi cá; một khi dịch bệnh bùng phát thì thiệt hại do bệnh là rất lớn (tỷ lệ cá chết có
thể lên đến 90% trên cá tra giống và 50% trên cá tra nuôi thịt) (Nguyễn Hữu Thịnh
và Trương Thanh Loan, 2007). Vì vậy, để có kết quả kiểm tra kháng sinh đồ của vi
khuẩn gây bệnh trong thời gian ngắn hơn và đáng tin cậy là nhu cầu chính đáng từ
thực tiễn sản xuất.
Hiện nay, các phòng xét nghiệm của các Công ty thuốc Thủy sản và các
Công ty Nuôi trồng Thủy Sản thực hiện kháng sinh đồ trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm
bằng cách sử dụng dịch nghiền từ thận cá bệnh. Bên cạnh đó, kháng sinh đồ trực
tiếp từ mẫu bệnh phẩm còn được thực hiện bằng cách sử dụng dịch mẫu thu bằng
tăm bông vô trùng từ thận cá bệnh (Furones, 2001). Các phương pháp kiểm tra
nhanh sự nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh này đã góp phần nâng cao hiệu quả

điều trị bệnh bằng việc sử dụng kháng sinh phù hợp trong giai đoạn bệnh mới bắt
đầu. Tuy nhiên, việc áp dụng các phương pháp này còn tùy tiện và chưa có nghiên
cứu kiểm chứng. Do đó, việc nghiên cứu xây dựng một phương pháp làm kháng
sinh đồ nhanh, đơn giản nhưng kết quả đáng tin cậy là một việc làm cần thiết.
Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên, đề tài “XÂY DỰNG QUI TRÌNH KIỂM
TRA KHÁNG SINH ĐỒ CỦA VI KHUẨN GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ
TRA (PANGASIANODON HYPOPHTHALMUS) TRONG ĐIỀU KIỆN THỰC ĐỊA”

đã được thực hiện.

2


1.2 Mục tiêu đề tài
Xây dựng qui trình làm kháng sinh đồ cho bệnh gan thận mủ trên cá tra
(Pangasianodon hypophthalmus) trong điều kiện thực địa nhanh, đơn giản.
1.3 Mục đích đề tài
Góp phần nâng cao hiệu quả điều trị bệnh gan thận mủ bằng việc sử dụng
kháng sinh hợp lý.

3


Chương 2
TỔNG QUAN

2.1 Sơ lược về bệnh gan thận mủ
Năm 1979, nghề nuôi cá da trơn (Ictalurus punctatus) ở Mỹ đương đầu với
một dịch bệnh nghiêm trọng, đó là bệnh nhiễm trùng máu và viêm ruột (Enteric
Septicemia Catfish: ESC). Bệnh này được xem là một trong những bệnh ảnh hưởng

nghiêm trọng nhất về phương diện kinh tế trong những trang trại nuôi cá da trơn
công nghiệp ở miền Nam nước Mỹ (Francis-Floyd và ctv, 1987).
Ở Việt Nam, bệnh gan thận mủ trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)
lần đầu tiên được mô tả ở đồng bằng sông Cửu Long vào năm 1998 (Ferguson và
ctv, 2001). Bệnh này gây hại nghiêm trọng cho nghề nuôi cá tra ở nước ta. Bệnh
gan thận mủ thường xảy ra nhiều vào mùa mưa lũ kéo dài đến mùa khô. Thời điểm
phát triển bệnh và mức độ thiệt hại khác nhau theo từng năm.
2.1.1 Tác nhân gây bệnh
Edwardsiella ictaluri (E. ictaluri) là tác nhân gây nên bệnh ESC trên cá da
trơn Mỹ (Hawke, 1979; Hawke và ctv, 1981) và bệnh gan thận mủ trên cá tra nuôi ở
Indonesia (Yuasa và ctv, 2003) và ở Việt Nam (Crumlish và ctv, 2002).
E. ictaluri thuộc họ Enterobacteriaceae, có dạng hình que mảnh, gram âm,
kích thước 1 × 2 – 3 μm, không sinh bào tử, chuyển động nhờ vành tiêm mao. E.

4


ictaluri là vi khuẩn yếm khí tùy nghi cho phản ứng catalase dương tính, cytochrome
oxidase âm tính và lên men trong môi trường O/F glucose (Đỗ Thị Hòa, 2004).
Chúng có khả năng di động yếu ở 25 – 30oC nhưng không di động ở 37oC, có khả
năng lên men và sinh hơi ở 20 – 30oC nhưng không sinh hơi ở 37oC (Plumb, 1994).
Theo Speyerer và Boyle (1987) và Newton và ctv (1988), có 1 - 3 plasmid
liên kết với E. ictaluri (trích dẫn bởi Plum, 1994). Chức năng của chúng vẫn chưa
được làm rõ, nhưng có giả thuyết cho rằng chúng quan trọng trong việc nâng cao
tính kháng đối với kháng sinh của E. ictaluri. E. ictaluri là một trong những loài
khó phát triển của giống Edwardsiella và tăng trưởng chậm trên môi trường nuôi
cấy. Trên môi trường BHIA (Brain Heart Infusion Agar) ở 26oC chúng cần 3 ngày
để mọc thành các khuẩn lạc hình tròn màu trắng (Baxa và ctv, 1990) hoặc cần từ 36
– 48 giờ ở 28 – 30oC để phát triển trên BHIA và vi khuẩn tăng trưởng chậm hoặc
không tăng trưởng khi ủ ở 37oC (Plumb, 1994).

Khi trong môi trường nuôi cấy có sự hiện diện của một loài vi khuẩn phát
triển nhanh hơn E. ictaluri (như Aeromonas sp.), chúng sẽ ức chế hoặc làm cho E.
ictaluri phát triển rất chậm (Plumb, 1994). Shotts và Waltman (1990) đã nghiên cứu
một môi trường có tính chọn lọc cho E. ictaluri là Edwardsiella ictaluri agar (EIA)
giúp tăng tính chính xác khi phán đoán sự có mặt của E. ictaluri trong lần phân lập
vi khuẩn đầu tiên.
Khi dịch bệnh ESC được đề cập đến lần đầu tiên vào năm 1977, người ta cho
rằng E. ictaluri là mầm bệnh bắt buộc vì nó không thể tồn tại ở môi trường ngoài ký
chủ (Hawke, 1979). Tuy nhiên, nghiên cứu của Plumb và Quinlan (1986) chứng
minh rằng chúng có thể tồn tại trong bùn đáy ao trên 90 ngày ở 25oC.

5


2.1.2 Đường truyền lây
E. ictaluri có thể lây nhiễm cho cá qua nhiều con đường khác nhau:
(1) Vi khuẩn trong nước có thể xâm nhập vào cơ thể cá thông qua đường mũi,
đến dây thần kinh khứu giác rồi đến màng não (Miyazaki và Plumb, 1985; Shotts và
ctv, 1986; Morrision và Plum, 1994). Sự nhiễm trùng bắt đầu và lan rộng từ màng
não đến hộp sọ và vùng da trên sọ tạo thành một lổ lõm ở đầu (Plumb, 1994). Vi
khuẩn này tấn công vào mũi làm giảm chức năng của niêm mạc mũi ở lớp màng
nhầy. Khi quan sát dưới kính hiển vi nhận thấy có sự hiện diện E. ictaluri trên bề
mặt màng nhầy và trong biểu mô.
(2) E. ictaluri cũng có thể xâm nhập qua đường tiêu hóa. Đầu tiên vi khuẩn
qua đường miệng phát triển ở ruột, gan, thận và cơ trong vòng 2 tuần gây cảm
nhiễm làm ruột trương to, đầy hơi (Fracis-Floyd và ctv, 1987). Vi khuẩn từ đường
tiêu hóa xâm nhập qua niêm mạc ruột vào máu gây nhiễm trùng máu (Shotts và ctv,
1986).
(3) E. ictaluri cũng xâm nhập qua mang. Thí nghiệm chứng minh trong suốt
quá trình ngâm, vi khuẩn phát triển thành tập đoàn trên biểu bì mang với số lượng

lớn. Sau đó xâm nhập vào cơ thể cá qua biểu mô che phủ mang (Nusbaum và
Plumb, 1996).
Tóm lại, vi khuẩn E. ictaluri có thể xâm nhập từ môi trường nước vào cơ thể
cá qua mũi, mang và qua miệng bằng đường thức ăn gây bệnh cho cá.
2.1.3 Triệu chứng, bệnh tích
Bệnh thường xảy ra trên cá giống và cá thịt. Tỷ lệ chết lên đến 100% sau 5
ngày phát bệnh đối với cá giống, cá nuôi thương phẩm chết 30 - 50% trong 1 đợt
dịch.

6


2.1.3.1 Triệu chứng
Cá bệnh do nhiễm vi khuẩn E. ictaluri thường kém ăn hoặc bỏ ăn, gầy yếu,
bụng chướng to, xung quanh miệng có các đám xuất huyết, gốc vây xuất huyết, mắt
lồi. Giải phẫu bên trong, một số cơ quan nội tạng như gan, thận, lách bị hoại tử tạo
thành những đốm màu trắng đục đường kính 0,5 – 2 mm (Đỗ Thị Hòa và ctv, 2004)
2.1.3.2 Bệnh tích
Bệnh tích đại thể
Gan, thận cá bệnh sưng rất to, thận có hiện tượng nhũn, lách sưng ít hơn.
Trên gan, thận, lách xuất hiện đốm trắng hoại tử. Khi bệnh nặng, chúng phát triển
thành đốm trắng tròn có chứa dịch hơi đặc (mủ), đường kính khoảng 1 – 3 mm khắp
bề mặt và cả bên trong gan, thận, lách (Từ Thanh Dung và ctv, 2003).
Cá bị bệnh thường tích dịch viêm ở xoang bụng có màu hơi vàng và có thể
lẫn máu. Cá nhiễm E. ictaluri thường bỏ ăn do đó ruột trống không chứa thức ăn,
lòng ruột có chứa dịch lẫn máu. Đồng thời còn thấy cá bị xuất huyết điểm trên ruột,
cơ và mô mỡ (Plumb, 1994).
Bệnh tích vi thể
Bệnh tích vi thể ở gan: Quan sát tiêu bản gan có đốm trắng dưới kính hiển vi
cho thấy đây là vùng hoại tử. Các tế bào gan không còn sát nhau như ở mô gan bình

thường mà tách rời ra từng tế bào hoặc thoái hóa thành một vùng không còn nhận ra
được cấu trúc với nhiều mức độ. Giai đoạn đầu có hiện tượng sung huyết động
mạch và tĩnh mạch gan, đặc biệt là hệ thống xoang mao mạch giữa các dãy tế bào
gan làm cho toàn bộ tổ chức gan bị sưng to. Sau đó, do quá trình sung huyết kéo dài
dẫn đến vỡ mạch máu và giải thoát nhiều enzyme (protease, lipase,...) làm các tế
bào ở vùng viêm bị hủy hoại dẫn đến hoại tử. Lúc này quan sát thấy những tế bào

7


đã tách rời nhau, nhân tế bào co lại và vỡ vụn, cuối cùng những tế bào này bị tiêu
hủy.
Khi cá bệnh nặng, những tổn thương lan rộng làm gan không còn chức năng
khử độc và lọc máu, các chất độc tích tụ trong cơ thể kết hợp với những yếu tố khác
làm cá chết. Ngoài ra, do tổ chức gan bị hư hại làm mất khả năng tiết mật của gan.
Một số cá mới chết khi mổ ra thấy túi mật bị vỡ, dịch mật lan tràn khắp nội quan.
Điều này có thể do khi gan bị hoại tử, ống dẫn mật và túi mật cũng bị hoại tử và túi
mật bị vỡ, dịch mật thoát ra ngoài.
Bệnh tích vi thể ở thận: Cấu trúc vi thể của thận bị hủy hoại trầm trọng, các
phản ứng sưng viêm xảy ra ở toàn bộ tổ chức. Thận sưng to đồng thời bị nhũn do
sung huyết, một phần có thể do tích tụ nước trong thận mà không đào thải được do
hệ thống tiểu cầu thận và ống thận bị hư hại. Phản ứng viêm kéo dài gây hoại tử và
làm mất chức năng các đơn vị cấu tạo nên thận. Mô tạo máu nằm xen kẽ với các tế
bào nội tiết của thận cũng bị hoại tử làm cho máu trong cơ thể bị giảm sút. Khi thận
bị hoại tử, chức năng bài tiết chất thải trong quá trình trao đổi chất bị ngưng trệ.
Trong khi đó quá trình trao đổi chất lại đặc biệt tăng mạnh do cơ thể cá huy động
các tổ chức nhằm đào thải các tác nhân gây bệnh. Ngoài ra, hai loại hormone tuyến
thượng thận là adrenalin và noradrenalin không được sản xuất khi thận bị hoại tử
cũng góp phần làm rối loạn chức năng sinh lý của cá.
Bệnh tích vi thể ở lách: Cùng với gan và thận, lách cũng là cơ quan bị hủy

hoại nặng khi cá bị bệnh gan thận mủ. Những đốm trắng trên lách là những vùng
mô hoại tử với nhiều mức độ khác nhau.
Đối với cá bệnh nặng, nhiều vùng hoại tử dạng hạt lan rộng, phá hủy các
tiểu thể hình elip là vùng chức năng của lách, nơi tiêu hủy các vật lạ và vi khuẩn
xâm nhập vào cơ thể. Khi tác nhân gây bệnh xâm nhập quá nhiều sẽ gây ra tình
trạng quá tải đến một lúc nào đó tế bào sẽ mất chức năng và thoái hóa. Quá trình
hoại tử ở lách bắt đầu từ quá trình thoái hóa và hoại tử các tiểu thể lách làm mất

8