NUÔI CẤY MÔ VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA DỊCH CHIẾT CÂY GẤC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH

******************

TƠN TRANG ÁNH

NI CẤY MƠ VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG
KHUẨN CỦA DỊCH CHIẾT CÂY GẤC
(Momordica cochinchinensis L. Spreng)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Thành phố Hồ Chí Minh, Tháng 9/2010

ii


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH

******************

TƠN TRANG ÁNH

NI CẤY MƠ VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG
KHUẨN CỦA DỊCH CHIẾT CÂY GẤC
(Momordica cochinchinensis L. Spreng)

Chuyên ngành : Trồng trọt
Mã số

: 60.62.01

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
LUẬ
N
VĂ
N HỌC
THẠC
SĨ KHOA
NÔN
G NGHIỆ
TRƯỜNG ĐẠI
NƠNG
LÂMHỌ
TP.CHỒ
CHÍ
MINH P
***********
TƠN TRANG ÁNH

Hướng dẫn khoa học:

NI
CẤY MƠ VÀ KHẢO SÁT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA
TS. TRẦN THỊ DUNG
CÂY GẤC (Momordica cochinchinensis L. Spreng)
NUÔI CẤY MƠ VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA DỊCH
CHIẾT CÂY GẤC (Momordica cochinchinensis L. Spreng)
TƠN

ThànhTRANG
phố HồÁNH
Chí Minh
Tháng 9/2010

iii


Hội đồng chấm luận văn:
1. Chủ tịch:

PGS.TS. LÊ QUANG HƯNG
Đại học Nơng Lâm TP.Hồ Chí Minh

2. Thư ký:

TS. VÕ THÁI DÂN
Đại học Nơng Lâm TP.Hồ Chí Minh

3. Phản biện 1:

TS. NGUYỄN HỮU HỔ
Viện Sinh Học Nhiệt Đới

4. Phản biện 2:

TS. BÙI MINH TRÍ
Đại học Nơng Lâm TP.Hồ Chí Minh

5. Ủy viên:

TS. TRẦN THỊ DUNG
Đại Học Tôn Đức Thắng TP. Hồ Chí Minh

ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
HIỆU TRƯỞNG

iv


LÝ LỊCH CÁ NHÂN
Tôi tên là Tôn Trang Ánh sinh ngày 02 tháng 02 năm 1973 tại xã Tịnh Ấn Tây,
huyện Sơn Tịnh, tỉnh Quảng Ngãi. Con ông Tôn Trang Lục và bà Nguyễn Thị Trâm.
Tốt nghiệp phổ thông trung học tại Trường Trung học phổ thông Sơn Tịnh I,
tỉnh Quảng Ngãi năm 1991.
Tốt nghiệp đại học ngành Nông học hệ chính qui tại trường Đại học Nơng
Lâm thành phố Hồ Chí Minh năm 1998.
Q trình cơng tác:
Từ năm 1998 đến năm 2002 làm việc tại Công ty Pouyen, huyện Bình
Chánh, thành phố Hồ Chí Minh.
Từ năm 2002 đến năm 2004 làm việc tại Trung tâm Tư vấn Nông Lâm
nghiệp, Sở Nông nghiệp và PTNT Quảng Ngãi.
Từ năm 2004 đến nay công tác tại Bộ môn Công nghệ Sinh học, trường Đại
học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
Tháng 9 năm 2006 theo học cao học ngành Khoa học cây trồng tại trường
Đại học Nơng Lâm, thành phố Hồ Chí Minh.
Tình trạng gia đình: Chồng: Trần Đình Phong, kết hơn năm 2008
Con: Trần Phương Linh, sinh năm 2008
Địa chỉ liên lạc: Bộ môn Công nghệ Sinh học, trường Đại học Nơng Lâm
thành phố Hồ Chí Minh.

Điện thoại: Cơ quan:
Nhà riêng:
Mobil.

08. 37220295
08. 62597786
0986970375

Email:

v


LỜI CAM ĐOAN
Tơi cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu,
kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai
công bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.

Tơn Trang Ánh

vi


LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành luận văn này, tơi xin gửi lời cảm ơn đến:
● Ban Giám Hiệu, phòng Sau Đại Học trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí
Minh đã tạo điều kiện và tận tình hướng dẫn tơi trong suốt khóa học.
● Q thầy cơ tham gia giảng dạy lớp Cao học Trồng trọt 2006, đã giảng dạy, truyền
đạt cho tơi những kiến thức vơ cùng q báu.
● Bộ môn Công nghệ Sinh học Trường Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh

đã tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành khóa học này.
● ThS. Dương Thị Mộng Ngọc, Trung Tâm Sâm và Dược Liệu thành phố Hồ Chí
Minh đã tận tình giúp đỡ tơi trong quá trình thực hiện đề tài.
● Các bạn đồng nghiệp, bạn cùng lớp đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời
gian học tập và nghiên cứu.
● Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn đến TS. Trần Thị Dung, đã trực tiếp hướng dẫn
khoa học để tôi hoàn thành đề tài này.
● Bộ Giáo dục và Đào tạo đã cấp một phần kinh phí để tơi thực hiện đề tài nghiên cứu
này.
● Cuối cùng con xin gửi lời cảm ơn đến Bố Mẹ và những người thân trong gia đình
đã tạo điều kiện về vật chất, động viên tinh thần giúp con có được thành quả ngày
hơm nay.

vii


TĨM TẮT
Đề tài “Ni cấy mơ và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết cây gấc
(Momordica cochinchinensis L. Spreng)” được tiến hành tại Bộ môn Công nghệ Sinh học,
trường Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh từ tháng từ tháng 06 năm 2009 đến
tháng 9 năm 2010 tại phịng thí nghiệm ni cấy mơ, phịng thí nghiệm vi sinh – Bộ
mơn Cơng nghệ Sinh học, Phịng Hố lý – Viện Cơng nghệ Sinh học và Mơi trường
trường Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh. Các thí nghiệm được bố trí theo
kiểu đơn yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại. Kết quả thu được như sau:
Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất điều hồ sinh trưởng đến
q trình hình thành mô sẹo của cây gấc in vitro gồm 13 nghiệm thức là 13 loại mơi
trường có thành phần cơ bản là MS có bổ sung các chất điều hịa sinh trưởng 2,4-D (0
-3mg l-1) phối hợp với BA (0,1 – 0,3 mg l-1). Kết quả đạt được: môi trường có bổ
sung chất điều hịa sinh trưởng 2,4-D (1,0 mg l-1) phối hợp với BA (0,3 mg l-1)
thích hợp nhất cho việc tạo mô sẹo từ lá cây gấc in vitro (100% mẫu tạo sẹo, trọng

lượng tươi (5,18gr), chất lượng sẹo tốt sau 6 tuần ni cấy).
Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất điều hoà sinh trưởng đến
quá trình hình thành chồi của cây gấc in vitro gồm 13 nghiệm thức là 13 loại mơi
trường có thành phần cơ bản là MS có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng BA (0 –
2 mg l-1), và Kn (0 – 2 mg l-1) phối hợp với NAA (0 – 0,2 mg l-1). Kết quả đạt được: môi
trường có bổ sung BA 2,0 mg l-1 phối hợp với NAA 0,2 mg l-1 cho số chồi cao nhất
(16,0 chồi), số lá nhiều nhất (5,55 lá) và cây sinh trưởng phát triển tốt sau 6 tuần
ni cấy.
Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất điều hoà sinh trưởng đến
quá trình ra rễ của cây gấc in vitro gồm 8 nghiệm thức là 8 loại mơi trường có thành
phần

viii


cơ bản là MS và ½ MS có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng NAA (0,5 – 1,5 mg l-1).
Kết quả đạt được: mơi trường ½ MS bổ sung NAA (0,5 mg l-1) cho số rễ (8,15 rễ)
và chiều dài cao nhất (75,78 mm) sau 8 tuần nuôi cấy.
Thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các dịch chiết từ cây gấc, thí
nghiệm gồm 8 nghiệm thức là những dịch chiết các bộ phận như thân, lá, rễ của cây
ngo tự nhiên, cây in vitro, mơ sẹo và đối chứng là dung môi ethanol. Kết quả đạt
được: dịch chiết rễ gấc ngồi tự nhiên có hoạt tính kháng mạnh nhất trên cả ba
chủng vi khuẩn thử nghiệm so với các nghiệm thức cịn lại.
Thí nghiệm xác định thành phần hố thực vật có trong cao chiết kháng khuẩn
mạnh nhất. Sau khi phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của rễ cây ngồi tự
nhiên Kết quả đạt được: trong rễ cây gấc ngoài tự nhiên tồn tại một số hợp chất:
acid hữu cơ, alkaloid, đường khử, polyuronic, saponin, tinh dầu, saponin
triterpenoid; kết hợp các phản ứng sinh hóa và sắc ký lớp mỏng cho kết quả:
saponin triterpenoid là chất chính trong rễ gấc ngồi tự nhiên.
Đề tài này đã xây dựng được qui trình nhân giống in vitro cây gấc có thể áp

dụng để nhân nhanh giống gấc phục vụ cho sản xuất trên qui mô lớn. Ngồi ra, việc
tìm ra bộ phận và chất chính có khả năng kháng khuẩn mạnh của rễ cây gấc ngồi
tự nhiên có thể ứng dụng cho những nghiên cứu sâu góp phần chiết xuất, tinh sạch
các chất sử dụng trong điều trị bệnh cho con người.

vi


ABSTRACT
The study titled “Tissue culture protocol and assessment of antibacterial
activity of sweet gourd extract (Momordica cochinchinensis L. Spreng)” was
carried out at Plant Tissue Culture and Microbiological Laboratories of Department
of Biotechnology; Biochemical analytical laboratory, Research institute of
Biotechnology and Environment, Nong Lam University Ho Chi Minh City, from
June 2009 to September 2010. Single-factor randomized experimental design was
applied for the experiments with 3 times of replication, of which results are outlined
as follows:
Effect of plant growth regulators on callus formation of in vitro sweet gourd
was investigated. The experiment involved 13 treatments utilizing MS media
supplemented with different concentrations of 2,4-D (0-3 mg.l-1) and benzyladenine
(BA: 0.1 – 0.3 mg.l-1). The most effective medium for callus formation from the in
vitro leaves is MS supplemented with 1.5 mg.l-1 2,4-D and 0.3 mg.l-1 BA.
Effect of plant growth regulators on shoot formation of in vitro sweet gourd
was investigated with 13 treatments utilizing MS supplemented with BA (0 – 2 mg.l-1),
Kinetin (Kn: 0 – 2 mg.l-1) and naphthaleneacetamide (NAA: 0 – 0.2 mg.l-1). The
treatment containing 2.0 mg.l-1 BA and 0.2 mg.l-1 NAA showed to be the most
effective medium for shoot formation after 6 weeks of propagation.
Effect of plant growth regulators on root formation of in vitro sweet gourd
was observed with 8 treatments using MS and half-strenghth MS supplemented
with NAA (0.5 – 1.5 mg.l-1). Half-strength MS supplemented with 0.5 mg.l-1 NAA proved

to be the effective medium for root generation in the period of 8 weeks.
Investigation of antibacterial activity of sweet gourd extracts was carried out
in 8 treatments with extracts from different parts of both field-grown and in vitro
plants such as stem, leaf, root, calli (in case of in vitro plants), and ethanol as the
control. The obtained results showed that root extract from field-grown sweet gourd
had the highest antimicrobial activity on three tested strains of bacteria.

vii


Identification of chemical components contained in the root extract from
field-grown plant was performed, which showed the existence of organic acids,
alkaloid, polyuronic, saponine, fine oil and saponin triterpenoid. Additionally,
biochemical tests and thin layer chromatography have revealed that saponin
triterpenoid is the main chemical content in roots of sweet gourd in natural
conditions.
Eventually, the protocol for in vitro propagation of sweet gourd was
achieved, which can be applied in rapid multiplication for large-scale production of
sweet gourd. Moreover, the identification of plant part and the chemical content
which contribute to the activity against microbes of field-grown sweet gourd is
applicable in futher researches on extraction and purification of natural substances
for human therapies.

viii


MỤC LỤC
CHƯƠNG

TRANG

Trang tựa
Trang chuẩn y ............................................................................................................... i
Lý lịch cá nhân ............................................................................................................ii
Lời cam đoan ............................................................................................................. iii
Lời cảm ơn ................................................................................................................. iv
Tóm tắt ........................................................................................................................ v
Abstract .....................................................................................................................vii
Mục lục....................................................................................................................... ix
Danh sách các chữ viết tắt ....................................................................................... xiii
Danh sách các bảng ..................................................................................................xiv
Danh sách các hình.................................................................................................... xv
Chương 1. Mở đầu .................................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề ............................................................................................................. 1
1.1 Mục tiêu ................................................................................................................ 2
1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn............................................................................... 3
Chương 2. Tổng quan tài liệu...............................................................................

4

2.1 Sơ lược về cây gấc ................................................................................................ 4
2.1.1 Phân loại thực vật ............................................................................................. 4
2.1.2 Nguồn gốc phân bố ............................................................................................ 4
2.1.3 Điều kiện ngoại cảnh .......................................................................................... 4
2.1.4 Đặc tính thực vật học ........................................................................................ 5
2.1.5 Thành phần hoá học và tác dụng sinh học của gấc ............................................ 6
2.1.5.1 Màng hạt gấc ................................................................................................... 7

ix

2.1.5.2 Hạt gấc .......................................................................................................... 11
2.1.5.3 Rễ gấc ............................................................................................................ 11
2.1.5.4 Thân và lá gấc ............................................................................................... 12
2.2 Tình hình nghiên cứu về cây gấc ........................................................................ 12
2.3 Các yếu tố ảnh hưởng trong nuôi cấy in vitro ..................................................... 13
2.3.1 Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng thực vật ................................ 13
2.3.1.1 Auxin ............................................................................................................. 13
2.3.1.2 Cytokinin .................................................................................................... 15
2.3.2 Ảnh hưởng của agar và độ pH ......................................................................... 18
2.3.3 Ảnh hưởng của đường ..................................................................................... 18
2.3.4 Ảnh hưởng của khoáng đa lượng và vi lượng .................................................. 18
2.3.5 Ảnh hưởng của vitamin .................................................................................... 19
2.3.6 Ảnh hưởng của các điều kiện vật lý ................................................................ 20
2.4 Nhân giống in vitro cây gấc ................................................................................ 20
2.5 Các nghiên cứu về quá trình nhân giống in vitro cây họ bầu bí ......................... 21
2.6 Một số hợp chất hữu cơ tự nhiên ........................................................................ 22
2.6.1 Alkaloid ............................................................................................................ 22
2.6.2 Flavonoid.......................................................................................................... 22
2.6.3 Saponin .................................................................................................. 23
2.7 Sơ lược đặc tính của các vi khuẩn thử nghiệm ................................................... 24
2.7.1 Escherichia coli (E.coli)................................................................................... 24
2.7.2 Salmonella typhimurium .................................................................................. 25
2.7.3 Staphylococus aureus ............................................................................. 26
2.8 Một số nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của thực vật................................. 26
2.9 Giới thiệu về sắc ký lớp mỏng ............................................................................ 28
Chương 3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu ............................................... 33
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu....................................................................... 33
3.2 Nội dung ............................................................................................................. 33
3.2.1 Nội dung 1 ........................................................................................................ 33

x


3.2.2 Nội dung 2 ........................................................................................................ 33
3.3 Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................. 34
3.3.1 Mẫu thí nghiệm ................................................................................................ 34
3.3.2 Mơi trường ni cấy ......................................................................................... 34
3.3.3 Hố chất dùng trong thí nghiệm khảo sát tính kháng khuẩn ................................. 34
3.3.3.1 Hố chất dùng trong thử nghiệm sinh hố .................................................... 34
3.3.3.2 Hóa chất dùng cho nuôi cấy vi sinh .............................................................. 34
3.4 Phương pháp nghiên cứu..................................................................................... 34
3.4.1 Bố trí thí nghiệm và xử lý thống kê ................................................................. 34
3.4.2 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất điều hoà sinh trưởng
2,4-D, BA, NAA đến q trình hình thành mơ sẹo của cây gấc in vitro ..........................35
3.4.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất điều hoà sinh trưởng
BA và Kinetin đến quá trình hình thành chồi của cây gấc in vitro ........................................ 37
3.4.4 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất điều hồ sinh
trưởng NAA đến q trình ra rễ của cây gấc in vitro................................................ 38
3.4.5 Thí nghiệm 4: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các dịch chiết thơ từ cây gấc ........ 39
3.4.6 Thí nghiệm 5:Xác định thành phần hố thực vật của cao chiết
có tác dụng kháng khuẩn mạnh nhất ......................................................................... 41
3.4.6.1 Xử lý nguyên liệu .......................................................................................... 41
3.4.6.2 Phân tích sơ bộ thành phần hóa học thực vật của cao MeOH....................... 41
3.4.6.3 Định tính saponin .......................................................................................... 47
Chương 4. Kết quả và thảo luận ............................................................................ 50
4.1 Nội dung 1: Nuôi cấy mô cây gấc ....................................................................... 50
4.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất điều hoà sinh trưởng
2,4D, BA, NAA đến q trình hình thành mơ sẹo của cây gấc in vitro.................... 50
4.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất điều hoà sinh trưởng

BA và Kinetin đến quá trình hình thành chồi của cây gấc in vitro ................ 56
4.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất điều hồ sinh trưởng
NAA đến q trình ra rễ của cây gấc in vitro ........................................................... 63

xi


4.2 Nội dung 2: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và xác định thành phần
hố thực vật có trong cao chiết có tác dụng kháng khuẩn ....................................... 66
4.2.1 Thí nghiệm 4: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các dịch chiết thô
từ cây gấc................................................................................................................................ 66
4.2.1.1 Khả năng kháng khuẩn của dịch chiết từ lá, thân, rễ cây gấc
ngoài tự nhiên ............................................................................................................ 66
4.2.1.2 Khả năng kháng khuẩn của dịch chiết từ lá, thân, rễ, mô sẹo cây gấc in vitro ........ 69
4.2.2 Thành phần hóa thực vật trong dịch chiết của rễ gấc ngồi tự nhiên............... 73
4.2.2.1 Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của rễ gấc ngồi tự nhiên ............ 73
4.2.2.2 Phân tích xác định hợp chất saponin trong rễ gấc
ngoài tự nhiên bằng phản ứng hóa học ..................................................................... 80
4.2.2.4 Định tính hợp chất saponin tồn phần trong rễ gấc ngoài tự nhiên
bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM) ................................................................................. 81
Chương 5. Kết luận và đề nghị .............................................................................. 83
5.1 Kết luận ............................................................................................................... 83
5.1.1 Nuôi cấy mô cây gấc ........................................................................................ 83
5.1.2 Các loại dịch chiết thô từ các bộ phận của cây gấc
có tác dụng kháng khuẩn ........................................................................................... 83
5.1.3 Thành phần hóa thực vật trong dịch chiết kháng khuẩn mạnh nhất ................ 84
5.2 Đề nghị ................................................................................................................ 84
Tài liệu tham khảo .................................................................................................. 84
Phụ lục

xii


DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
BA

6-Benzyl aminopurin

BHI

Brain Heart Infirm

Cfu/ml

Colony Forming Unit/ mililit

ĐC

đối chứng

EtOH

Ethanol

GA3

Acid gibberellic

IAA

Indole – 3 acetic acid

IBA

Indole – 3 butyric acid

Kn

Kinetine

Mea

Melastoma affine

MeOH

Methanol

MIC

Minimum Inhibitory Concentration

MS

Môi trường Murashige và Skoog (1962)

NAA

α – Napthalene acetic acid

Nm

nanomet

NT

nghiệm thức

NTN

ngoài tự nhiên

RCD

Completely Randomized Design

Rf

Retention factor

TDZ

Thidiazuron

TLC

Thin Layer Chromatography

UV

Ultraviolet Radiation

2,4-D

2,4 – dichlorophenoxyacetic acid

viii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng của khô bã gấc ........................................................ 10
Bảng 2.2 Thành phần axit béo của dầu màng gấc ......................................................... 11
Bảng 3.1 Nồng độ các chất điều hoà sinh trưởng 2,4D, BA, NAA sử dụng
trong tạo sẹo cây gấc in vitro ....................................................................................... 36
Bảng 3.2. Nồng độ chất điều hoà sinh trưởng BA, Kn và NAA sử dụng
trong tạo chồi cây gấc in vitro......................................................................................................................... 38
Bảng 3.3. Nồng độ chất điều hoà sinh trưởng NAA sử dụng trong tạo rễ
của cây gấc in vitro ....................................................................................................... 39
Bảng 4.1 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng ảnh hưởng đến việc tạo sẹo
cây gấc in vitro ................................................................................................................ 51
Bảng 4.2 Chồi gấc sau 4 và 6 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung
chất điều hịa sinh trưởng ............................................................................................................ 57
Bảng 4.3 Ảnh hưởng của nồng độ chất điều hoà sinh trưởng NAA đến khả năng
tạo rễ của cây gấc in vitro sau 4 và 8 tuần nuôi cấy.............................................................. 63
Bảng 4.4 Đường kính vịng vơ khuẩn của dịch chiết từ lá, thân, rễ
cây gấc ngoài tự nhiên .......................................................................................................... 66
Bảng 4.5 Đường kính vịng vơ khuẩn của dịch chiết từ lá, thân, rễ, mô sẹo
cây gấc in vitro ............................................................................................................... 69
Bảng 4.6 Kết quả phân tích định tính thành phần hóa thực vật trong rễ
gấc ngoài tự nhiên .......................................................................................................... 73

Bảng 4.7 Kết quả phân tích định tính xác định hợp chất saponin
trong rễ gấc ngoài tự nhiên .............................................................................. 82

ix


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Sơ đồ 3.1: Chuẩn bị các dịch chiết trong phân tích sơ bộ ......................................... 44
Hình 4.1 Mơ sẹo sau 4 tuần ni cấy trên mơi trường có bổ sung
chất điều hịa sinh trưởng cảm ứng tạo mơ sẹo ........................................................................54
Hình 4.2 Mơ sẹo sau 8 tuần ni cấy trên mơi trường có bổ sung
chất điều hịa sinh trưởng cảm ứng tạo mơ sẹo ........................................................................ 55
Hình 4.3 Chồi gấc sau 4 tuần ni cấy trên mơi trường có bổ sung
chất điều hòa sinh trưởng cảm ứng tạo chồi từ mơ sẹo............................................. 59
Hình 4.4 Chồi và số lá sau 6 tuần ni cấy trên mơi trường có bổ sung
chất điều hịa sinh trưởng cảm ứng tạo chồi từ mơ sẹo............................................. 61
Hình 4.5 Chiều cao chồi sau 6 tuần ni cấy trên mơi trường có bổ sung
chất điều hịa sinh trưởng cảm ứng tạo chồi từ mơ sẹo............................................. 62
Hình 4.6 Số rễ và chiều dài rễ sau 4 tuần nuôi cấy trên mơi trường MS
có bổ sung chất điều hịa sinh trưởng NAA .............................................................. 64
Hình 4.7 Số rễ và chiều dài rễ sau 8 tuần ni cấy trên mơi trường MS
có bổ sung chất điều hịa sinh trưởng NAA .............................................................. 65
Hình 4.8 Vịng vơ khuẩn của dịch chiết lá gấc ngồi tự nhiên trên
ba chủng vi khuẩn thử nghiệm. ................................................................................. 66
Hình 4.9 Vịng vơ khuẩn của dịch chiết thân gấc ngồi tự nhiên
trên ba chủng vi khuẩn thử nghiệm ........................................................................... 67
Hình 4.10 Vịng vơ khuẩn của dịch chiết rễ gấc ngồi tự nhiên
trên ba chủng vi khuẩn thử nghiệm ........................................................................... 68
Hình 4.11 Vịng vơ khuẩn của dịch chiết lá gấc in vitro trên ba chủng
vi khuẩn thử nghiệm.................................................................................................. 69

xiii


Hình 4.12 Vịng vơ khuẩn của dịch chiết thân gấc in vitro trên ba chủng
vi khuẩn thử nghiệm.................................................................................................. 70
Hình 4.13 Vịng vơ khuẩn của dịch chiết rễ gấc in vitro trên ba chủng
vi khuẩn thử nghiệm.................................................................................................. 71
Hình 4.14 Vịng vơ khuẩn của dịch chiết mô sẹo in vitro trên ba chủng
vi khuẩn thử nghiệm.................................................................................................. 71
Hình 4.15 Biểu đồ so sánh đường kính vịng vơ khuẩn ............................................ 72
Hình 4.16 Phản ứng định tính acid hữu cơ ............................................................... 75
Hình 4.17 Phản ứng định tính alkaloid ..................................................................... 75
Hình 4.18 Phản ứng định tính anthraglycosid........................................................... 76
Hình 4.19 Phản ứng định tính carotenoid ................................................................. 76
Hình 4.20 Phản ứng định tính chất béo ..................................................................... 77
Hình 4.21 Phản ứng định tính đường khử ................................................................. 77
Hình 4.22 Thí nghiệm định tính coumarin ................................................................ 78
Hình 4.23 Phản ứng định tính flavonoid ................................................................... 78
Hình 4.24 Phản ứng định tính polyuronic ................................................................. 79
Hình 4.25 Phản ứng định tính saponin ...................................................................... 79
Hình 4.26 Phản ứng định tính saponin triterpen ....................................................... 80
Hình 4.27 Phản ứng tạo bọt Phản ứng Liebermann – burchard
Phản ứng Fontan-Kaudel........................................................................................... 81
Hình 4.29 Sắc đồ saponin triterpen trong rễ gấc ngoài tự nhiên............................... 81

1


Chương 1

MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Ngày nay, khi xã hội phát triển, nhu cầu của cuộc sống ngày càng được
nâng cao thì con người càng quan tâm đến sức khoẻ của mình. Thực phẩm sạch,
rau sạch, giàu dinh dưỡng là yếu tố then chốt giúp cho con người sống khoẻ,
đẹp và phịng chống được bệnh tật. Bên cạnh đó, các nhà khoa học đã và đang
tích cực tìm hiểu, nghiên cứu, chiết xuất và sản xuất thuốc chữa bệnh từ những
loại cây dược liệu có trong tự nhiên, dễ tìm, hoạt tính sinh học cao, ít có những
tác dụng phụ nhằm bảo vệ sức khoẻ con người.
Cây gấc (Momordica cochinchinensis L. Spreng) không chỉ được biết
đến là một loại cây lấy quả thông thường, dùng trong thực phẩm đơn thuần mà
gấc cịn là một cây dược liệu q được giới y học trong và ngoài nước quan
tâm. Sau nhiều nghiên cứu cho thấy, các bộ phận của cây gấc từ thân, lá, quả
đến rễ đều có cơng dụng là những vị thuốc chữa bệnh. Màng hạt gấc và hạt gấc
chứa ß – caroten, lycopen với hàm lượng lớn hơn gấp nhiều lần các cây rau quả
khác như cà rốt hay cà chua. Thân và hạt còn chứa nhiều hợp chất ngăn ngừa
khả năng oxi hố dùng trong điều trị, phịng chống ung thư như A-spinateral và
sesquibenihol. Các hợp chất hữu cơ thuộc nhóm saponin được tìm thấy ở rễ,
thân có công dụng là thuốc kháng viêm, giảm đau chống co thắt và giảm hàm
lượng đường trong máu cho bệnh nhân tiểu đường như momordine, acid
oleanolic. Thời gian qua, trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về các hoạt
tính sinh học ở thực vật, cao chiết thực vật hay tinh dầu của chúng có khả năng
kháng vi sinh vật được ưu tiên sử dụng như một hoạt chất trị liệu để điều trị các
bệnh nhiễm trùng và góp phần giải quyết vấn đề kháng kháng sinh nhân tạo của
vi sinh vật.

2


Ở nước ta, cây gấc được trồng ở nhiều vùng sinh thái khác nhau như

vùng Đông Bắc Bộ, Duyên Hải miền Trung và vùng Đông Nam Bộ với qui mô
nhỏ.
Hiện nay, cây gấc đã được qui hoạch trồng trên diện rộng ở các tỉnh phía Bắc
như Hưng Yên, Hải Dương có sự hỗ trợ về kỹ thuật và bao tiêu sản phẩm của
một số cơng ty như VnpoFood, Nuga.
Gấc có thể được trồng bằng hạt hoặc giâm cành, tuy nhiên nếu trồng
bằng hạt tỉ lệ phân ly đực, cái rất cao (50-70%), thời gian nảy mầm lâu và hệ số
nhân giống thấp. Phương pháp nhân giống gấc được áp dụng phổ biến hiện nay
là trồng bằng hom. Ưu điểm của phương pháp này là nhân giống nhanh hơn
trồng bằng hạt, tuy nhiên cành giâm khó ra rễ, yêu cầu kỹ thuật cao và cành
giâm rất dễ bị thối nếu trồng vào mùa mưa. Vì vậy, nhân giống cây bằng
phương pháp nuôi cấy mô sẽ khắc phục được các nhược điểm của hai phương
pháp nhân giống trên, với hệ số nhân giống cao, nuôi cấy mô cây gấc sẽ cho số
lượng lớn cây con trong thời gian ngắn. Do đó, nếu chọn được một giống gấc
tốt thì ni cấy mơ là phương pháp nhân giống đồng loạt, phục tráng giống, từ
đó nhân rộng và cung cấp cho sản xuất.
Nhận thấy rõ vai trò của cây gấc trong đời sống con người và để khắc phục
được các nhược điểm trong công tác nhân giống cây trồng, đề tài: “Nuôi cấy
mô và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết cây gấc (Momordica
cochinchinensis L. Spreng)” được thực hiện
1.2. Mục tiêu
- Xác định nồng độ các chất điều hoà sinh trưởng tối ưu cho q trình ni cấy
mơ cây gấc
- Xác định loại dịch chiết thô từ các bộ phận của cây gấc có tác dụng kháng
khuẩn
- Xác định thành phần hố thực vật trong dịch chiết kháng khuẩn mạnh nhất
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

3

- Kết quả của đề tài xây dựng được qui trình ni cấy mơ và là cơ sở cho các
nghiên cứu tiếp theo về phát hiện, chiết xuất và tinh sạch các hoạt chất có khả
năng trị bệnh của cây gấc.
- Ứng dụng kết quả của nghiên cứu này để chủ động nguồn giống trong sản
xuất và góp phần nâng cao năng suất và phẩm chất của cây gấc.

4


Chương 2
TỔNG QUAN
2.1 Sơ lược về cây gấc
2.1.1 Phân loại thực vật
Giới(regnum): Plantae
Bộ (Ordo): Cucurbitales
Họ (family): Cucurbitaceae
Chi (genus): Momordica
Loài (Species): M. cochinchinensis
Tên khoa học: Momordica cochinchinensis (Lour.) Spreng.
Tên tiếng Anh: Spiny bitter-cucumber, Chinese bitter-cucumber, Chinese-cucumber
Tên tiếng Việt: Gấc
2.1.2 Nguồn gốc phân bố
Năm 1790, linh mục Loureiro (Bồ Đào Nha) đặt tên cây gấc là Muricia
cochinchinensis. Sau đó, Sprengel kết luận rằng cây gấc thuộc chi Momordica và
đổi tên khoa học cây gấc là Momordica cochinchinensis (1826)
Cây gấc xuất xứ ở Việt Nam và cũng có nguồn gốc ở khắp Châu Á như Trung
Quốc, Thái Lan, Lào, Campuchia, Nhật Bản, Burma, Malaysia, Banglades,
Australia, Myanmar và Châu Úc.
2.1.3 Điều kiện ngoại cảnh

Ánh sáng: cây gấc là cây ưa ánh sáng ngày ngắn, ưa khí hậu ấm áp và ẩm độ cao.
Cây sinh trưởng tốt trong điều kiện cường độ chiếu sáng mạnh nhưng quả phát triển
tốt trong điều kiện chiếu sáng giảm. Giai đoạn quả đang lớn nếu gặp ánh sáng chiếu
trực tiếp quả rất dễ bị rám, thối hoặc sớm rụng. Chính vì vậy, trồng gấc tốt nhất nên
làm giàn để nâng cao chất lượng cũng như phẩm chất quả.

4


- Nhiệt độ: nhiệt độ trung bình cho gấc phát triển là từ 25 – 27OC, hạt gấc có thể nảy
mầm ở nhiệt độ 13 – 15 OC , nhưng tốt nhất ở 25 OC.
- Ẩm độ: gấc là cây có khả năng chịu được hạn tốt hơn chịu được úng. Giai đoạn từ
khi mới trồng đến trước khi ra hoa yêu cầu độ ẩm đất đạt 65 – 70%. Giai đoạn ra
hoa kết quả yêu cầu độ ẩm đạt 75%. Gấc là cây chịu úng rất kém, vì vậy khi trồng
tốt nhất nên làm vồng, ụ hay trồng ở nơi có khả năng tiêu thốt nước tốt.
Cây gấc cần nước nhiều nhất ở giai đoạn ra hoa và phát triển trái. Thiếu nước trong
giai đoạn này sẽ làm hoa rụng, trái phát triển kém, năng suất thấp.
- Cao độ: gấc có thể phân bố ở độ cao từ 0 đến 1500m so với mặt nước biển. Để gấc
cho nhiều quả nhất thiết phải làm giàn, càng có điều kiện vươn xa và ánh sáng mặt
trời thì gấc càng cho nhiều quả.
2.1.4 Đặc tính thực vật học
- Thân: gấc là cây thân thảo, dây leo, đa niên, đơn tính biệt chu, có tua cuốn ở nách
lá, thân cây có tiết diện góc và chiều dài thân có thể lên đến 15 m. Thân lá gấc có
mùi hơi nên ít bị sinh vật khác phá hoại, có khả năng thích nghi với mọi địa hình và
có thể trồng gấc trên nhiều loại đất khác nhau.
- Lá: lá gấc mọc so le, nhẵn, có màu xanh biếc, to bằng bàn tay và xòe kiểu chân vịt.
Phiến lá xẻ 3 -5 thùy, dài 8 - 18 cm, chia thuỳ khía sâu tới 1/3 hay 1/2 phiến lá.
- Hoa: mùa hoa tháng 4 - 5, cánh hoa màu vàng nhạt, sắc hoa tươi. Hoa đực, hoa cái
riêng biệt, mọc riêng rẽ ở nách lá, cánh hoa màu vàng nhạt, đài sắc xanh. Hoa đực
và hoa cái có thể mọc trên cùng một dây, cũng có khi cây chỉ có hoa đực hoặc chỉ

có hoa cái. Hoa đực có lá bắc to, tràng hoa màu vàng cịn hoa cái có lá bắc nhỏ.
Hoa gấc giống như hoa họ bầu bí, việc thụ phấn chủ yếu nhờ gió và cơn trùng. Vì
vậy để tăng khả năng đậu quả thì cũng cần phải thụ phấn nhân tạo bằng cách dùng
hoa đực úp lên đầu nhụy của hoa cái khi hoa nở.
- Quả: mùa quả tháng 6 đến tháng 2 năm sau, quả hình bầu dục dài độ 15 - 20cm,
đáy nhọn, ngồi có nhiều gai, sắc xanh, khi chín màu vàng đỏ đẹp tươi, thịt gấc màu

5


đỏ cam. Vỏ trái gấc chiếm khoảng 63%, tùy theo trái mà vỏ có độ dày từ 1 - 3 cm.
Vỏ gấc có nhiều gai nhọn, màu trắng ngà, mềm, xốp. Mỗi quả thường có 6 múi và
hạt xếp thành hàng dọc. Khi quả to đường kính đạt 30 - 40 cm tiến hành chọn quả,
nên chọn những quả tròn cân đối, các gai phân bố đều, tươi, loại bỏ những quả xấu
và sâu bệnh để cây tập trung dinh dưỡng nuôi các quả tốt.
- Hạt gấc màu nâu thẫm, hình dẹp, cứng, mép có răng cưa. Bên ngồi, hạt gấc được
bao bọc bởi màng màu đỏ máu, tươi, trong hạt có nhân trắng có chứa nhiều dầu.
Mỗi quả gấc có khoảng 3 – 4 hạt đực, hạt đực nhỏ và mỏng hơn hạt cái.
Mùa thu hoạch là từ tháng 9 năm trước đến tháng 3 năm sau. Ở miền Nam do thời
tiết ấm nên gấc có trái quanh năm.
Tuổi thọ của cây gấc có thể kéo dài từ 15 – 20 năm. Vì là cây biệt chu thụ phấn tự
do nên trồng theo kiểu giâm cành sẽ có được những cây mang đặc tính tốt từ cây
mẹ, nhanh cho quả và nhiều quả hơn so với trồng bằng hạt.
2.1.5 Thành phần hoá học và tác dụng sinh học của gấc
Ngày nay, theo nhiều tài liệu nghiên cứu cho thấy màu đỏ của lycopen và màu vàng
của beta caroten có hàm lượng cao gấp 15,1 lần so với cà rốt và 68 lần so với cà
chua. Gấc là cây cung cấp nguồn carotenoids với những chất ở dạng hấp thụ sinh
học cao, nhờ đó con người khi sử dụng gấc có thể phịng chống các gốc tự do có hại
cho cơ thể. Gấc được tinh chế thành một loại thực phẩm chức năng dùng chữa bệnh
và làm đẹp, phòng trị nhồi máu cơ tim, ung thư tiền liệt tuyến, ung thư vú, dạ dày,

ung thư gan, xơ gan và phòng bệnh mạn tính, kéo dài tuổi thọ nhờ các chất có tác
dụng quét loại các gốc tự do, gốc peroxyd trong cơ thể. Ngồi ra, gấc cịn giúp cho
trẻ em phát triển sớm về trí tuệ và thể lực nhờ vitamin E và lycopen cùng với lutein,
zeaxanthin, beta cryptoxanthin trong quả gấc ở dạng thiên nhiên. Khi phân tích giá
trị dinh dưỡng của màng hạt gấc, nhóm nghiên cứu Vương Lệ Thuý và cộng sự của
trường Đại học Hawaii (2005) báo cáo rằng hàm lượng carotenoid tổng số trung
bình là 497,4 μg/g chất tươi và α -tocopherol là 76,3 μg/g chất tươi.

6


2.1.5.1 Màng hạt gấc: màng của hạt gấc có hàm lượng lycopen là 380 mg/g, cao
gấp 10 lần nồng độ của các loại trái cây và rau quả được xem là nguồn giàu
lycopen.
Khi ép màng đỏ hạt gấc sấy khô được sản phẩm dầu gấc màu đỏ sẫm, sánh, trong,
vị béo, mùi thơm đặc trưng, 100g dầu có trên 1446mg carotenoid, 422mg β-caroten,
138,5mg α – tocopherol và 364,8mg lycopen. Các carotenoid (gồm chủ yếu: β –
caroten, lycopen) có mặt trong gấc liên kết với các axit béo mạch dài làm cho nó có
tính hoạt hóa sinh học cao hơn. Thành phần carotenoid có trong gấc phụ thuộc rất
nhiều vào giống, đất trồng với hàm lượng dao động 3.768,3-7.516µg/g.
Carotenoid: là những hợp chất tetratecpen, có màu từ vàng đến đỏ, phổ biến trong
các loại rau quả, cây xanh với hơn 600 các thành phần polyisoprenoid khác nhau ở
các dạng đồng phân cis hoặc trans. Các hợp chất của carotenoid như: caroten,
lycopen, xantophyl trong đó caroten chiếm một vị trí quan trọng.
Carotenoid có nhiều trong các loại rau và các loại quả, là hợp chất có khả năng
chống oxi hố rất mạnh. Carotenoid là nhóm tiền sinh tố A đối với động vật có vú,
giữ chức năng sinh học rất quan trọng trong quá trình phát triển cơ thể. Tác động
chủ yếu của carotenoid khơng phải là tham gia q trình oxi hố, oxi hố khử, mà là
trao đổi thơng tin từ tế bào đến tế bào, tác động tới cấu trúc và chức phận của màng
tế bào và tăng sự đáp ứng miễn dịch đối với cơ thể. Chính vì vậy mà carotenoid

được xác định là những chất điều hoà dinh dưỡng (Vuong L.T và ctv, 2002).
β – caroten:
- Công thức phân tử (C40H56), trọng lượng phân tử: 536,9.
- Công thức cấu tạo:

- Tên khoa học: (all E)-3,7,12,16-tetramethyl-1,18-bis (2,6,6-trimethyl cyclohex-1enyl) octadeca-1,3,5,7,9,11,13,15,17- nonaen.

7